(Luận văn thạc sĩ) Nghiên cứu chiết tách, xác định cấu trúc và đánh giá hoạt tính kháng khuẩn của một số hợp chất phân lập từ chủng xạ khuẩn Streptomyces alboniger

BỘ GIÁO DỤC

VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC

VÀ ĐÀO TẠO

VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM

HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CƠNG NGHỆ
-----------

Ngơ Văn Hiếu

NGHIÊN CỨU CHIẾT TÁCH, XÁC ĐỊNH CẤU TRÚC VÀ
ĐÁNH GIÁ HOẠT TÍNH KHÁNG KHUẨN CỦA MỘT SỐ
HỢP CHẤT PHÂN LẬP TỪ CHỦNG XẠ KHUẨN
STREPTOMYCES ALBONIGER

LUẬN VĂN THẠC SĨ HÓA HỌC

Hà Nội, 11/2021


BỘ GIÁO DỤC

VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC

VÀ ĐÀO TẠO

VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM

HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CƠNG NGHỆ
-----------

Ngơ Văn Hiếu

NGHIÊN CỨU CHIẾT TÁCH, XÁC ĐỊNH CẤU TRÚC VÀ
ĐÁNH GIÁ HOẠT TÍNH KHÁNG KHUẨN CỦA MỘT SỐ
HỢP CHẤT PHÂN LẬP TỪ CHỦNG XẠ KHUẨN
STREPTOMYCES ALBONIGER

Chuyên ngành: Hóa hữu cơ
Mã số: 8440114
LUẬN VĂN THẠC SĨ HÓA HỌC

CÁN BỘ HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: TS. TRẦN THỊ PHƯƠNG THẢO

Hà Nội, tháng 11 năm 2021


Lời cam đoan

Luận văn này là cơng trình nghiên cứu của tôi dưới sự hướng dẫn
khoa học của TS. Trần Thị Phương Thảo.
Các số liệu, kết quả trong luận văn là trung thực và chưa từng
được công bố trong bất kỳ cơng trình nào khác.
Hà Nội, ngày

tháng 11 năm 2021

Tác giả luận văn

Ngô Văn Hiếu


Lời cảm ơn
Nghiên cứu này được tài trợ kinh phí từ nhiệm vụ Khoa học và
Công nghệ theo Nghị định thư – Bộ Khoa học và Công nghệ (mã số
nhiệm vụ: NĐT.47.KR/18).
Luận văn tốt nghiệp cao học này được hoàn thành, tơi xin bày tỏ
lịng biết ơn chân thành và sâu sắc tới TS. Trần Thị Phương Thảo đã
trực tiếp hướng dẫn tận tình, dìu dắt và giúp đỡ tơi với những chỉ dẫn
khoa học quý giá trong suốt quá trình thực hiện và hồn thành luận văn.
Tơi xin chân thành cảm ơn tập thể phịng Ứng dụng Hóa Sinh Trung tâm Nghiên cứu và Chuyển giao Cơng nghệ, phịng Tổng hợp
Hữu cơ - Viện Hóa học, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt
Nam đã luôn đồng hành và giúp đỡ tơi trong q trình thực hiện luận
văn.
Tơi xin gửi lời cảm ơn tới Ban lãnh đạo và các thầy cô giáo của
Học viện Khoa học và Công nghệ đã trực tiếp giảng dạy, truyền đạt
những kiến thức khoa học chuyên ngành cho tôi trong những năm tháng
qua.
Học viên cao học Ngô Văn Hiếu được tài trợ bởi Tập đồn
Vingroup – Cơng ty CP và hỗ trợ bởi chương trình học bổng đào tạo
thạc sĩ, tiến sĩ trong nước của Quỹ Đổi mới sáng tạo Vingroup (VINIF),
Viện Nghiên cứu Dữ liệu lớn (VinBigdata), mã số VINIF.ThS.107.
Cuối cùng, tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành tới gia đình, đồng
nghiệp, bạn bè, những người đã luôn động viên, chia sẻ, ủng hộ tôi
trong suốt thời gian qua./.
Xin chân thành cảm ơn!

Tác giả luận văn

Ngô Văn Hiếu


Danh mục các ký hiệu và chữ viết tắt
Viết tắt
1

HNMR

13

C-

NMR

Tiếng Anh
Proton nuclear magnetic
resonance spectroscopy

Carbon-13 nuclear magnetic
resonance spectroscopy

Diễn giải
Phổ cộng hưởng từ
hạt nhân
proton
Phổ cộng hưởng từ
hạt nhân
cacbon 13

XK

Xạ khuẩn

VSV

Vi sinh vật

Chất kháng sinh

CKS

Xạ khuẩn đối

XKĐK

kháng

CC

Column chromatography

NB-40

Neurological disease

DEPT

MBC

HL-60
PTP1B

Distortionless enhancement by
polarisation transfer

Sắc ký cột

Phổ DEPT

Minimum bactericidal

Nồng độ diệt khuẩn

concentration

tối thiểu

Human promyelocytic leukemia

Tế bào ung thư máu cấp

cell line

ở người

Protein tyrosine phosphatase 1B

MCF-7

Breast carcinoma cell line

Tế bào ung thư vú
Gram dương

Gr(+)
Hep-G2

Hepatocellular carcinoma cell
line

Tế bào ung thư biểu mô
gan

HMBC

Heteronuclear multiple bond

Phổ tương tác dị hạt

coherence

nhân qua nhiều
liên kết

HSQC

IC50

Heteronuclear single

Phổ tương tác dị hạt

quantum coherence

nhân qua 1 liên
kết

Half maximal inhibitory
concentration

Nồng độ ức chế 50%
đối tượng thử
nghiệm

MIC

Minimum inhibitory

Nồng độ ức chế tối thiểu

concentration
Gr(-)

Gram âm

TLC

Thin layer chromatography

Sắc ký lớp mỏng

ESI-MS

Electronspray ionization mass

Phương pháp khối

spectrum

KB

phổ

Human epidemoid

Tế bào ung thư biểu

carcinoma cell line

mô người


MỤC LỤC
CHƯƠNG I: TỔNG QUAN TÀI LIỆU ...................................................... 3
1.1. GIỚI THIỆU CHUNG VỀ XẠ KHUẨN VÀ CÁC HỢP CHẤT THỨ
CẤP TỪ XẠ KHUẨN .................................................................................. 3
1.1.1. Giới thiệu chung về xạ khuẩn ........................................................... 3

1.1.1.1. Đặc điểm hình thái của xạ khuẩn ............................................... 3
1.1.1.2. Đặc điểm sinh lý – sinh hóa của xạ khuẩn .................................. 5
1.1.1.3. Đặc điểm phân loại xạ khuẩn ..................................................... 6
1.1.1.4. Vai trò của xạ khuẩn .................................................................. 7
1.1.2. Thành phần hóa học và hoạt tính sinh học của các hợp chất thứ cấp
phân lập từ xạ khuẩn................................................................................... 7
1.1.2.1. Các hợp chất kháng sinh ............................................................ 8
1.1.2.2. Các hợp chất kháng lao ............................................................ 10
1.1.2.3. Các hợp chất chống ung thư ..................................................... 11
1.1.2.4. Nghiên cứu thành phần hóa học từ các chủng vi sinh vật tại Việt
Nam...................................................................................................... 14
1.2. CHỦNG XẠ KHUẨN STREPTOMYCES ALBONIGER................... 17
1.2.1. Đặc điểm hình thái của chủng xạ khuẩn Streptomyces alboniger .... 18
1.2.2. Các hợp chất thứ cấp có hoạt tính sinh học được phân lập từ xạ
khuẩn Streptomyces alboniger .................................................................. 20
1.2.2.1. Các hợp chất có hoạt tính kháng ung thư ................................. 20
1.2.2.2. Các hợp chất có hoạt tính kháng sinh ....................................... 21
1.2.2.3. Các hợp chất khác .................................................................... 23
CHƯƠNG II: THỰC NGHIỆM ................................................................ 25
2.1. VẬT LIỆU, HÓA CHẤT, THIẾT BỊ, VÀ PHƯƠNG PHÁP
NGHIÊN CỨU ........................................................................................... 25
2.1.1. Vật liệu ........................................................................................... 25
2.1.2. Hóa chất ......................................................................................... 26
2.1.3. Thiết bị ........................................................................................... 26
2.2. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ....................................................... 26
2.2.1. Phương pháp phân lập các hợp chất từ dịch sinh khối xạ khuẩn ...... 26
2.2.2. Phương pháp xác định cấu trúc của các hợp chất ............................ 29
2.2.3. Phương pháp đánh giá hoạt tính kháng khuẩn và gây độc tế bào..... 29
2.2.3.1. Phương pháp đánh giá hoạt tính kháng khuẩn .......................... 29
2.2.3.2. Phương pháp đánh giá hoạt tính gây độc tế bào ....................... 31

CHƯƠNG III: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN........................................... 33
3.1. KẾT QUẢ ............................................................................................ 33
3.1.1 Phân lập và tạo sinh khối chủng xạ khuẩn Streptomyces alboniger .. 33
3.1.2. Sàng lọc các chủng xạ khuẩn có khả năng kháng Mycobacterium
smegmatis ................................................................................................. 34
3.1.3. Phân loại 5 chủng xạ khuẩn ............................................................ 35
3.2. KẾT QUẢ XÁC ĐỊNH CẤU TRÚC CỦA CÁC CHẤT SẠCH PHÂN
LẬP TỪ CHỦNG VH19-A121 .................................................................. 37
3.2.1. Xác định cấu trúc hóa học của hợp chất VTBE.01 .......................... 37
3.2.2. Xác định cấu trúc hóa học của hợp chất 121CN.02 ......................... 42
3.3. KẾT QUẢ ĐÁNH GIÁ HOẠT TÍNH KHÁNG KHUẨN VÀ GÂY
ĐỘC TẾ BÀO CỦA CÁC CHẤT SẠCH PHÂN LẬP ĐƯỢC................ 48
3.3.1. Hoạt tính kháng lao và kháng vi sinh vật kiểm định .................... 48
3.3.2. Hoạt tính gây độc tế bào ............................................................. 50
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ .................................................................... 51
TÀI LIỆU THAM KHẢO............................................................................. .
PHỤ LỤC ...................................................................................................... .


Danh mục các bảng
Bảng 1. 1: Sự thay đổi của Streptomyces alboniger ở các nhiệt độ khác nhau
[37] .............................................................................................................. 18
Bảng 1. 2: Sự thay đổi của Streptomyces alboniger ở các điều kiện môi
trường khác nhau [37] .................................................................................. 19
Bảng 1. 3: Hoạt tính gây độc tế bào của hợp chất puromycin A (1), puromycin
B (2) và puromycin C (3) [39] ...................................................................... 21
Bảng 1.4. Các hợp chất thuộc khung pamamycin…………………………...22
Bảng 1. 5: Phổ kháng khuẩn của panamycin [41] ......................................... 23

Bảng 3. 1: Các chủng XK được phân lập tại các địa điểm khác nhau ........... 33
Bảng 3. 2: Kết quả hoạt tính kháng M. smegmatis của các chủng XK .......... 34
Bảng 3. 3: Bảng phân loại dựa trên hình thái và 16S rADN ......................... 35
Bảng 3. 4: Số liệu phổ NMR của hợp chất VTBE.01 và obscurolide B2 [53]
..................................................................................................................... 41
Bảng 3. 5: Số liệu phổ NMR của hợp chất 121CN.02 và Chartreusin [54] ... 46
Bảng 3.6: Hoạt tính kháng lao của 2 hợp chất VTBE.01 và 121CN.02…….49
Bảng 3. 7: Kết quả thử hoạt tính kháng vi sinh vật kiểm định của hợp chất
121CN.02 ..................................................................................................... 49
Bảng 3. 8: Hoạt tính gây độc tế bào của hợp chất 121CN.02 ........................ 50


Danh mục các hình
Hình 1. 1: Các kiểu hệ sợi của xạ khuẩn ......................................................... 4
Hình 1. 2: Khuẩn lạc xạ khuẩn ....................................................................... 5
Hình 1.3: Các hợp chất kháng sinh được phân lập từ các chủng vi sinh
vật………………………………………………………………………..........9
Hình 1.4: Các hợp chất kháng lao được phân lập từ các chủng xạ
khuẩn………………………………………………………………………...11
Hình 1.5: Các hợp chất chống ung thư được phân lập từ các chủng vi sinh vật
……………………………………………………………………………….13
Hình 1.6: Các hợp chất kháng lao được phân lập từ các chủng xạ khuẩn tại
Việt
Nam………………………………………………………………………….14
Hình 1.7: Các hợp chất thuộc lớp cyclopeptit từ vi sinh vật biển tại Việt Nam
từ năm 2013-2017. ………………………………………………………….15
Hình 1.8: Các hợp chất thứ cấp được phân lập từ chủng vi sinh vật
Micromonospora sp G019 từ vùng biển Hạ Long…………………………..16
Hình 1. 9: Chủng xạ khuẩn Streptomyces alboniger dưới kính hiển vi điện

tử…….………………………………………………………………………………..17
Hình 1. 10: Hình dạng Streptomyces alboniger trên đĩa thạch tổng hợp……18
Hình 1.11: Các hợp chất có hoạt tính kháng ung thư được phân lập từ chủng
xạ khuẩn Streptomyces alboniger…………………………………………………21
Hình 1.12 : Các hợp chất thuộc khung pamamycin…..………………………..21
Hình 1.13: Các hợp chất khác được phân lập từ chủng xạ khuẩn Streptomyces
alboniger. ……………………………………………………………………………23
Hình 2. 1: Sơ đồ phân lập các chất từ các dịch chiết xạ khuẩn Streptomyces
alboniger…………………………………………………………...………..38
Hình 3. 1: Đặc điểm khuẩn lạc của một số chủng XK được phân lập ........... 33
Hình 3. 2: Ảnh minh họa khả năng kháng M. smegmatis của các chủng XK 34
Hình 3. 3: Hình ảnh khuẩn lạc của 5 chủng XK có hoạt tính kháng M.
smegmatis cao nhất ...................................................................................... 35


Hình 3. 4: Cấu trúc và tương tác HMBC () và 1H-1H COSY (

) của hợp

chất VTBE.01 .............................................................................................. 37
Hình 3. 5: Phổ 1H-NMR của hợp chất VTBE.01………...………………….37
Hình 3.6: Phổ 13C-NMR của hợp chất VTBE.01……………….…………...38
Hình 3. 7: Phổ COSY của hợp chất VTBE.01 .............................................. 39
Hình 3. 8: Phổ HMBC của hợp chất VTBE.01 ............................................. 39
Hình 3. 9: Phổ NOESY của hợp chất VTBE.01 ........................................... 40
Hình 3. 10: Cấu trúc và tương tác HMBC () và 1H-1H COSY (

) của hợp

chất 121CN.02 ............................................................................................. 42

Hình 3.11: Phổ (-)-ESI-MS của hợp chất 121CN.02………………………..42
Hình 3. 12: Phổ 1H-NMR của hợp chất 121CN.02 ....................................... 43
Hình 3. 13: Phổ 13C-NMR của hợp chất 121CN.02 ...................................... 44
Hình 3. 14: Phổ COSY của hợp chất 121CN.02 ........................................... 45
Hình 3. 15: Phổ HMBC của hợp chất 121CN.02 .......................................... 46


1

ĐẶT VẤN ĐỀ
Trong những năm gần đây, do số nhóm vi sinh vật (VSV) kháng thuốc
và độc tính của một số thuốc kháng sinh (KS) bán tổng hợp đang ngày càng
gia tăng, các nhà khoa học đã hướng tới nghiên cứu và tìm kiếm các hợp chất
từ VSV, đặc biệt là xạ khuẩn (XK). Đến nay, với số lượng lớn các hợp chất có
hoạt tính sinh học được phát hiện, XK đã trở thành mục tiêu quan trọng đối
với ngành cơng nghiệp sinh học trên con đường tìm kiếm và sản xuất các loại
thuốc mới, đặc biệt là thuốc kháng sinh [1].
Streptomyces là chi xạ khuẩn lớn nhất của ngành Actinobacteria và là
một chi thuộc nhánh Streptomycetaceae. Có hơn 500 lồi XK thuộc chi
Streptomyces đã được mơ tả. Giống như hầu hết các Actinobacteria khác,
Streptomyces là chủng khuẩn gram dương (Gr(+)), có bộ gen với tỉ lệ G-C
%(tỉ lệ phần trăm Cytosine-Guanine) cao. XK thuộc chi Streptomyces được
tìm thấy chủ yếu trong đất và thảm thực vật mục nát, bùn dưới đáy sông, biển.
Streptomyces sinh bào tử, tạo mùi đặc trưng, là kết quả từ sản sinh geosmin
trong quá trình chuyển hóa các chất, thường sống ở đất có vai trò là VSV
phân hủy. Chủng VSV này sản xuất hơn một nửa số thuốc KS trên thế giới và
đó là sản phẩm có giá trị lớn trong lĩnh vực y tế.
Chủng XK Streptomyces alboniger là một chủng thuộc chi
Streptomyces. Một số nghiên cứu về các hợp chất thứ cấp được sản sinh từ
chủng này cho thấy đây là một chủng hứa hẹn tiềm năng sản sinh ra các hợp

chất kháng sinh như puromycin, paramycin và các hoạt chất có hoạt tính sinh
học thú vị [2].
Việt Nam là một đất nước có địa hình, khí hậu, thổ nhưỡng đa dạng và
phong phú. Vì vậy, các chủng XK cũng sẽ sản sinh ra các hợp chất thứ cấp
rất đa dạng và phong phú. Qua tra cứu tài liệu cho thấy, cho đến nay trên thế
giới có rất ít tài liệu cơng bố về các hợp chất thứ cấp phân lập từ chủng xạ
khuẩn Streptomyces alboniger. Ở Việt Nam chưa có nhóm nghiên cứu nào
cơng bố về thành phần hóa học cũng như hoạt tính sinh học của chủng xạ
khuẩn Streptomyces alboniger.
Vì vậy, chúng tôi tiến hành nghiên cứu đề tài “Nghiên cứu chiết tách,
xác định cấu trúc và đánh giá hoạt tính kháng khuẩn của một số hợp chất


2

phân lập từ chủng xạ khuẩn Streptomyces alboniger” thu tại đỉnh Mây
Bạc, rừng Quốc gia Cúc Phương, Ninh Bình. Kết quả của đề tài sẽ góp phần
vào kho tàng hợp chất thiên nhiên được phân lập từ xạ khuẩn ở Việt Nam.
Mục đích nghiên cứu:
+ Nghiên cứu phân lập và chiết tách các chủng xạ khuẩn từ dịch sinh khối
+ Xác định cấu trúc các chất sạch phân lập được từ chủng xạ khuẩn
Streptomyces alboniger
+ Đánh giá hoạt tính kháng khuẩn của các chất sạch phân lập được


3

CHƯƠNG I: TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1. GIỚI THIỆU CHUNG VỀ XẠ KHUẨN VÀ CÁC HỢP CHẤT THỨ
CẤP TỪ XẠ KHUẨN

1.1.1. Giới thiệu chung về xạ khuẩn
1.1.1.1. Đặc điểm hình thái của xạ khuẩn
Xạ khuẩn (Actinomycetes) là một nhóm vi khuẩn (Bacteria) phân bố rất
rộng rãi trong tự nhiên. Phần lớn XK là các tế bào Gram (+), hiếu khí, hoại
sinh, có cấu tạo dạng sợi, phân nhánh (khuẩn ty) [3]. Các loài liên quan đến
bệnh ở người và động vật bao gồm Nocardia, Gordona, Tsukamurella,
Streptomyces, Rhodococcus, Streptomycetes và Corynebacteria. Các chi kỵ
khí có tầm quan trọng trong y tế bao gồm Actinomyces, Arachnia, Rothia, và
Bifidobacterium [4].
XK có trong đất, nước, rác, phân chuồng, bùn, thậm chí cả trong cơ
chất mà vi khuẩn và nấm mốc không phát triển được. Sự phân bố của XK phụ
thuộc vào khí hậu, thành phần đất, mức độ canh tác và thảm thực vật. Trong
mỗi gam đất thường có trên 1 triệu XK (tính theo số khuẩn lạc mọc trên mơi
trường thạch). XK có cấu trúc tế bào tương tự như vi khuẩn Gram (+), toàn
bộ cơ thể chỉ là một tế bào bao gồm các thành phần chính: thành tế bào, màng
sinh chất, chất nguyên sinh, chất nhân và các thể ẩn nhập [3].
Thành tế bào của XK có kết cấu dạng lưới, dày 10 – 20 µm có tác dụng
duy trì hình dạng của khuẩn ty, bảo vệ tế bào và chủ yếu cấu tạo từ các lớp
glucopeptide bao gồm các gốc N – axetyl glucozamin liên kết với N – axetyl
muramic bởi các liên kết 1,4 – β glucozit, gồm 3 lớp: lớp ngoài cùng dày
khoảng 60 – 120 Å, lớp giữa rắn chắc dày khoảng 50 Å, lớp trong dày khoảng
50 Å. Thành tế bào XK không chứa cellulose và chitin nhưng chứa nhiều
enzym tham gia vào quá trình trao đổi chất và quá trình vận chuyển vật chất
qua màng tế bào [3].
Dưới lớp thành tế bào là màng sinh chất dày khoảng 50 µm được cấu
tạo chủ yếu bởi 2 thành phần là photpholipit và protein. Chúng có vai trị đặc
biệt quan trọng trong quá trình trao đổi chất và quá trình hình thành bào tử
của XK. Tế bào chất của XK có chứa mezoxom, thể nhân, và các vật thể ẩn
nhập gồm các hạt poliphotphat và polisacarit. Nhân của tế bào XK khơng có
cấu trúc điển hình, chỉ là những nhiễm sắc thể khơng có màng. Khi cịn non,

4

tồn bộ tế bào chỉ có 1 nhiễm sắc thể sau đó hình thành nhiều hạt rải rác trong
tồn bộ hệ khuẩn ty [3].
Đa số XK có cấu tạo dạng sợi, các sợi kết với nhau tạo thành khuẩn lạc
có nhiều màu sắc khác nhau: trắng, vàng, nâu, tím, xám ... Màu sắc của XK là
một đặc điểm phân loại quan trọng. Đường kính sợi của XK khoảng từ 0,1 –
0,5 μm. Có thể phân biệt được hai loại sợi khác nhau. Sợi khí sinh là hệ sợi
mọc trên bề mặt môi trường tạo thành bề mặt của khuẩn lạc XK, từ đây phát
sinh ra bào tử. Sợi cơ chất là sợi cắm sâu vào môi trường làm nhiệm vụ hấp
thu chất dinh dưỡng. Sợi cơ chất sinh ra sắc tố thấm vào mơi trường, sắc tố
này thường có màu khác với màu của sợi khí sinh. Đây cũng là một đặc điểm
phân loại quan trọng. Một số XK không có sợi khí sinh mà chỉ có sợi cơ chất,
loại sợi này làm cho bề mặt XK nhẵn và khó tách ra khi cấy truyền. Loại chỉ
có sợi khí sinh thì ngược lại, rất dễ tách tồn bộ khuẩn lạc khỏi mơi trường
(hình 1.1) [3].

Hình 1. 1: Các kiểu hệ sợi của xạ khuẩn
Khuẩn lạc XK thường có cấu tạo 3 lớp: lớp vỏ ngồi có dạng sợi bện
chặt, lớp trong tương đối xốp và lớp giữa có cấu trúc tổ ong. Khuẩn lạc XK
thường rắn chắc, xù xì, có thể có dạng da, dạng phấn, dạng nhung, dạng vơi
phụ thuộc vào kích thước bào tử. Trường hợp khơng có sợi khí sinh khuẩn lạc
có dạng màng dẻo. Kích thước khuẩn lạc thay đổi tùy loài XK và tùy điều
kiện ni cấy. Khuẩn lạc thường có dạng phóng xạ, một số có dạng những
vịng trịn đồng tâm cách nhau một khoảng nhất định. Nguyên nhân của hiện
tượng vòng tròn đồng tâm là do XK sinh ra chất ức chế sinh trưởng, khi sợi
mọc qua vùng này chúng sinh trưởng yếu đi, qua được vùng có chất ức chế
chúng lại sinh trưởng mạnh thành vòng tiếp theo, vòng này lại sinh ra chất ức