Nghiên cứu khả năng kháng khuẩn sâu răng của một số loài thực vật

Nghiên cứu khả năng kháng khuẩn sâu răng của
một số loài thực vật

Nguyễn Thị Thúy Anh
Trường Đại học Khoa học Tự nhiên; Khoa Sinh học
Chuyên ngành: Sinh học thực nghiệm; Mã số: 60 42 30
Người hướng dẫn: TS. Nguyễn Quang Huy
Năm báo vệ: 2011

Abstract. Tổng quan về Bệnh sâu răng và cơ chế gây bệnh sâu răng; Vi khuẩn
Streptococcus mutans và khả năng gây bệnh sâu răng; Các biện pháp phòng ngừa sâu
răng; Hợp chất thứ cấp trong thực vật. Trình bày nguyên liệu và phương pháp nghiên
cứu: Nuôi cấy vi khuẩn và chuẩn bị mẫu tế bào; Chiết rút các hợp chất tự nhiên trong
dịch chiết thực vật; Nghiên cứu định tính các thành phần một số hợp chất tự nhiên có
trong dịch chiết thực vật; Phân tách các thành phần các chất trong dịch chiết thực vật;
Xác định tính kháng khuẩn sâu răng bằng phương pháp đục lỗ; Xác định mức độ sinh axit
của vi khuẩn bằng thí nghiệm giảm pH; Xác định mức độ sống sót của vi khuẩn… Đưa ra
kết quả nghiên cứu: Nghiên cứu sàng lọc một số cây thuốc có khả năng kháng khuẩn sâu
răng; Phân tích một số hợp chất thực vật thứ cấp có hoạt tính kháng khuẩn từ cây Lấu Ba
Vì và cây xoài
Keywords. Khả năng kháng khuẩn; Sâu răng; Thực vật; Vi khuẩn; Dịch chiết thực vật

Content

Mở đầu
Sâu răng là bệnh rất phổ biến trên thế giới, ở mọi lứa tuổi, mọi tầng lớp xã hội. Bệnh
sâu răng có tỷ lệ mắc cao trong cộng đồng, việc điều trị sâu răng tốn kém cho cá nhân và
xã hội cả về kinh phí cũng như thời gian. Bệnh sâu răng được Tổ chức Y tế thế giới
(WHO) và nhiều quốc gia trên thế giới đặc biệt quan tâm.
Bệnh sâu răng từng được xem là một trong ba mối nguy hại cho sức khỏe con
người sau bệnh tim mạch và ung thư, chính vì thế cho đến nay, bệnh sâu săng vẫn là nỗi

lo mà bất cứ ai cũng không thể xem thường. Theo số liệu điều tra của Viện Răng Hàm
Mặt Trung Ương năm 2003, khoảng 90% dân số Việt Nam mắc các bệnh về răng, miệng,
trong đó phổ biến nhất là sâu răng và viêm quanh răng. Nguyên nhân chính gây bệnh sâu
răng là do các vi khuẩn, đặc biệt là vi khuẩn nhóm Streptococci có mặt trong mảng bám
răng sinh axit gây ăn mòn men răng.
Cách tốt nhất để phòng chống bệnh sâu răng là vệ sinh răng miệng thường xuyên
và đúng cách cùng với hạn chế các đồ ăn có nhiều đường. Các sản phẩm bảo vệ răng
miệng sử dụng thường được bổ sung các chất kháng khuẩn như fluor, axit yếu, peroxit
hydro, muối kim loại. Tuy nhiên, việc sử dụng lâu dài các chất kháng khuẩn như fluor,
axit yếu… đều mang lại những hậu quả không mong muốn. Hiện nay, việc tìm kiếm các
hợp chất mới có tác dụng bảo vệ răng, đặc biệt là những hợp chất từ thiên nhiên đang thu
hút được sự quan tâm của cả các nhà khoa học và các doanh nghiệp.
Việt Nam là một nước nhiệt đới gió mùa, có hệ thực vật phong phú và đa dạng,
trong đó có nhiều loài có chứa các hợp chất có hoạt tính cao, đã được sử dụng trong việc
chữa bệnh. Ở Việt Nam, việc tìm kiếm các hợp chất từ thiên nhiên đã được chú ý, tuy
nhiên chưa mang lại hiệu quả như mong đợi, nhiều nghiên cứu được ứng dụng thực tiễn
còn hạn chế. Vì vậy, để đáp ứng nhu cầu nâng cao hiệu quả phòng chống các bệnh về
răng, đặc biệt là sâu răng, chúng tôi đã tiến hành nghiên cứu đề tài: “Nghiên cứu khả
năng kháng khuẩn sâu răng của một số loài thực vật”.
Với đối tượng nghiên cứu là vi khuẩn sâu răng S. mutans, ở Việt Nam cũng có một
số công trình nghiên cứu về cây Sao Đen, Sắn thuyền, Kim ngân, Sài đất [9, 10]. Để bổ
sung nguồn dữ liệu khoa học về cây thuốc Việt Nam, chúng tôi lựa chọn một số cây
thuốc khác có tính kháng khuẩn trên cơ sở tài liệu Những cây thuốc và vị thuốc Việt Nam
của Đỗ Tất Lợi [11]. Đồng thời, lựa chọn thêm một số cây thuốc chưa được nghiên cứu
nhưng thường được sử dụng trong các bài thuốc dân gian để chữa bệnh sâu răng. Các cây
thuốc trong đề tài này gồm có: Duối (Streblus asper); Húng quế (Ocimum basilicum L.);
Lấu Ba Vì (Psychotria baviensis); Lược vàng (Callisi fragrans L.); Xoan (Melia
azedarach L.); Xoài (Mangifera indica L.).

2. Nguyên liệu và phương pháp

2.1. Nguyên liệu
2.1.1. Chủng vi sinh vật
Chủng vi khuẩn Streptococcus mutans GS5, là quà tặng của giáo sư Robert
Marquis, Đại học Rochester, Mỹ.
Chủng vi khuẩn Streptococcus mutans 74, phân lập từ các mẫu bệnh phẩm người
Việt Nam lấy tại Khoa Răng Hàm Mặt, Bệnh viện Bạch Mai, Hà Nội. Chủng S. mutans
74 hiện đang được giữ và bảo quản tại phòng thí nghiệm Enzym học và Phân tích hoạt
tính Sinh học, Phòng thí nghiệm Trọng điểm Công nghệ Enzym và Protein.
2.1.2. Mẫu thực vật trong nghiên cứu
Các mẫu thực vật Cau, Ruối, Xoan, Xoài được thu thập từ tỉnh Hải Phòng.
Mẫu Lược vàng, Húng quế được thu thập ở tỉnh Hưng Yên.
Mẫu Chè, Ngũ sắc, Lấu Ba Vì được thu thập ở Chương Mỹ, Hà Nội.
Các mẫu thực vật được xác định tên bởi TS. Nguyễn Trung Thành, Trường Đại
học Khoa học Tự nhiên, ĐH Quốc gia Hà Nội.
Nguyên liệu thực vật sau khi thu thập về, được rửa sạch, sấy khô, sau đó được
nghiền thành bột mịn và ngâm chiết trong các dung môi nghiên cứu với tỷ lệ 1g nguyên
liệu: 10 thể tích dung môi.
2.2. Phương pháp nghiên cứu
2.2.1. Nuôi cấy vi khuẩn và chuẩn bị mẫu tế bào
Các mẫu vi khuẩn được nuôi cấy trên môi thạch tryptic soy agar (TSA) và cấy
chuyển 2 tuần một lần, giữ ở 4
o
C.
Vi khuẩn được nuôi cấy lắc ở 37
o
C trong môi trường TY (tryptone 3%, cao nấm
men 0,5%) có bổ sung glucose 1%; thời gian nuôi cấy từ 12-14 giờ. Tế bào vi khuẩn
được thu lại bằng ly tâm, sau đó hòa tan lại trong muối khoáng (KCl 50mM, MgCl
2

1mM).
Mẫu vi khuẩn được lưu giữ lâu dài ở -80
o
C trong glycerol 50%.
2.2.2. Chiết rút các hợp chất tự nhiên trong dịch chiết thực vật
Các mẫu được chuẩn bị theo phương pháp chiết ngâm. Các mẫu thực vật được rửa
sạch sấy khô, nghiền nhỏ, sau đó chiết trong nước hay dung môi ethanol 96
o
theo tỷ lệ
1:10 (1g nguyên liệu: 10ml dung môi). Sau khi chiết xong được ly tâm bỏ cặn.
2.2.3. Phân tách các thành phần các chất trong dịch chiết thực vật
Phương pháp sắc kí bản mỏng được sử dụng để phân tách các thành phần trong
dịch chiết. Sắc ký lớp mỏng (TLC) được thực hiện trên bản mỏng tráng sẵn DC-Alufolien
60 F
254
(Merck). Dịch chiết thực vật được tiến hành chạy sắc ký bản mỏng 1 chiều
(7x13cm) với hệ dung môi TEAF (Toluen: ethylacetat: axeton: axit formic 5:3:1:1), phát
hiện sắc ký đồ trong điều kiện ánh sáng thường khi không phun thuốc thử và có phun
thuốc thử đặc trưng là dung dịch H
2
SO
4
10% được phun đều lên bản mỏng, sấy khô rồi
hơ nóng trên bề mặt bếp điện từ từ đến khi hiện màu. Từ màu sắc của sắc ký đồ cho phép
xác định sự có mặt của các chất trong dịch chiết.
2.2.4. Xác định tính kháng khuẩn sâu răng bằng phương pháp đục lỗ
Dịch chiết, sau khi được phân tách bằng sắc kí sẽ được thu lại một số băng vạch,
hòa tan trong methanol, ly tâm thu dịch trong, loại bỏ cặn. Vi khuẩn S.mutans được cấy
trải trên môi trường thạch TSA. Sau đó, các đĩa thạch được đục lỗ, mỗi lỗ bổ sung vào
0,25ml dịch chiết. Nuôi vi khuẩn trong tủ ấm 37

o
C qua đêm. Quan sát vòng kháng khuẩn.
2.2.5. Xác định mức độ sinh axit của vi khuẩn bằng thí nghiệm giảm pH
Tế bào vi khuẩn sau khi nuôi cấy được hòa lại trong dung dịch muối khoáng 1x
sao cho mật độ cuối cùng tương đương A
700
= 10. pH của huyền dịch tế bào được chỉnh
đến 7,2 bằng NaOH 0,1N. Glucose được bổ sung sao cho nồng độ cuối cùng là 1%, đảm
bảo môi trường dư thừa cơ chất cho quá trình đường phân. Sự giảm pH của môi trường
được theo dõi bằng máy pH meter tại những thời điểm nhất định. Độ giảm pH của môi
trường phản ánh khả năng sinh axit của tế bào.
2.2.6. Xác định mức độ sống sót của vi khuẩn
Xác định mức độ sống sót của tế bào vi khuẩn được tiến hành theo phương pháp
của Phan và cộng sự [15]. Tế bào vi khuẩn được rửa và hòa tan trong dung dịch peptone
1% sao cho mật độ tế bào cuối cùng tương đương A
700
= 1 (khoảng 10
9
tế bào/ml). Các
chất được bổ sung để đạt nồng độ cuối cùng mong muốn. Hút 100

l dịch tế bào ra pha
loãng trong peptone 1% theo các nồng độ nhỏ dần 10 lần và được cấy trải trên đĩa thạch
TSA. Các đĩa thạch được cất ở 37
o
C cho đến khi các khuẩn lạc hình thành rõ rệt và có thể
đếm bằng mắt thường.
Tác dụng gây chết của dịch chiết được đánh giá bằng giá trị D, là thời gian cần
thiết để 50% quần thể vi khuẩn bị giết chết. Tác dụng này được đánh giá bằng giá trị
LogN/N

0
với N
0
là số vi khuẩn ban đầu, N là số vi khuẩn tại thời điểm nghiên cứu. Giá trị
D tương ứng với LogN/N
0
= -1/2.
2.2.7. Phương pháp xác định ảnh hưởng của dịch chiết lên khả năng hình thành
biofilm của vi khuẩn
Nguyên tắc: trong điều kiện dinh dưỡng thích hợp và môi trường nuôi cấy tĩnh trên một
bề mặt giá thể các chủng vi sinh vật hình thành biofilm trên bề mặt giá thể. Phát hiện,
quan sát biofilm bằng cách nhuộm với tím kết tinh – là chất có khả năng bắt màu với tế
bào vi khuẩn.
Tiến hành thí nghiệm theo phương pháp của O’Toole và cộng sự [50].
Các chủng vi khuẩn được lắc kích hoạt trong bình tam giác chứa môi trường TYG
trong 24 giờ ở 37
o
C sao cho mật độ tế bào đo ở bước sóng 620nm ở vào khoảng 0,2- 0,3.
Hút 100µl dịch nuôi cấy vi khuẩn bổ sung vào 700µl TYG lỏng trong các ống effendorf
đã khử trùng và ủ trong điều kiện tĩnh ở 37
o
C trong 24 giờ.
Ống đối chứng được bổ sung thêm H
2
O cùng lúc với dịch nuôi cấy vi khuẩn.
Đối với các ống effendorf nghiên cứu tác dụng của dịch chiết thì dịch chiết được
bổ sung cùng lúc với dịch nuôi cấy vi khuẩn.
Sau 48 giờ các màng nổi và dịch nuôi cấy được loại bỏ cẩn thận ra khỏi các ống
effendorf. Quan sát khả năng hình thành biofilm: Mỗi ống effendorf được rửa sạch 2 lần
bằng nước cất khử trùng. Bổ sung vào mỗi ống effendorf 1ml dung dịch tím tinh thể 1%

và giữ trong 20 phút ở nhiệt độ phòng. Loại bỏ dung dịch nhuộm và quan sát sự bắt màu
của các tế bào bám trên trên thành ống với tím kết tinh.
Định lượng mức độ tạo biofilm: Sau khi rửa sạch 2 lần bằng nước cất khử trùng
các tinh thể tím bám trên thành effendorf được hòa tan trong 1ml etanol 70
o
. Mật độ tế
bào trong biofilm được xác định bằng cách đo độ hấp thụ ở bước sóng 570nm.
2.2.8. Phương pháp xác định hoạt độ một số enzym quan trọng của vi khuẩn gây
bệnh sâu răng
2.2.8.1. Chuẩn bị tế bào thấm
Tế bào được nuôi qua đêm được rửa 1 lần bằng dung dịch muối khoáng 1x (50mM
KCl, 1mM MgCl
2
) và được hòa lại trong đệm Tris– HCl 50mM, pH 7,5 có bổ sung 1mM
MgCl
2
, 50mM KCl sao cho mật độ tế bào tương đương OD
700
= 14. Dung dịch tế bào này
được chia đều vào các ống falcon (5ml/ống), bổ sung thêm 10% toluen, trộn mạnh bằng
máy Vortex. Sau đó, hỗn hợp được ủ ở 37
o
C bằng bể ổn nhiệt trong 5 phút rồi chuyển
sang làm đông đá bằng nitơ lỏng trong 1 phút. Lặp lại pha làm ấm và đông đá tế bào 2
lần. Cuối cùng, dung dịch tế bào được ủ ở 37
o
C cho tới khi tan đá hoàn toàn. Loại bỏ
toluen dư bằng ly tâm và rửa lại 2 lần với dung dịch muối khoáng 1x. Hòa kết tủa tế bào
trở lại trong đệm Tris– HCl pH 7,5 với thể tích bằng 1/10 thể tích ban đầu.
Việc xử lý tế bào với toluen kết hợp với việc chuyển tế bào qua các pha ấm và pha

đông đá có tác dụng làm tổn thương cục bộ màng tế bào, làm cho tế bào có thể thấm được
các chất có khối lượng phân tử lớn hơn nhưng không làm tổn thương các enzym trên
màng. Vì vậy, dịch tế bào được chuẩn bị theo phương pháp này gọi là dịch tế bào thấm,
được sử dụng trong các thiết bị thí nghiệm với enzym.
2.2.9. Phương pháp xác định phổ hồng ngoại của hợp chất
Các dịch chiết nghiên cứu được phân tách bằng sắc ký bản mỏng để phân tách
thành các phân đoạn khác nhau. Sau đó những phân đoạn nào có hoạt tính mạnh nhất
được xác định phổ hấp thụ hồng ngoại.
Sử dụng máy quang phổ hồng ngoại, máy làm việc ở miền bức xạ hồng ngoại, vê
nguyên lý cũng giống như máy quang phổ hấp thụ khác.
Phân đoạn dịch chiết sau khi chạy sắc ký bản mỏng, được cạo, hòa tan trở lại trong
methanol. Ly tâm 2 lần thu dịch trong, thấm đều phân đoạn dịch chiết lên chất nền KBr
rồi đưa vào máy xác định phổ hấp thụ. Phổ hồng ngoại được đo trên máy quang phổ hồng
ngoại FTIR, khoa Công nghệ Hóa học và Môi trường, Đại học Sư Phạm Kỹ thuật Hưng
Yên.
3. Kết quả và thảo luận
3.1. Nghiên cứu sàng lọc một số cây thuốc có khả năng kháng khuẩn sâu răng
3.1.1. Khả năng ức chế sự sinh axit từ dịch chiết một số cây thuốc
Bảng 1. So sánh tác dụng của dịch chiết thực vật chiết trong H
2
O hoặc ethanol lên
sự sinh axit của vi khuẩn S. mutans 74 với nồng độ 10% (v/v)


STT

Tên dịch chiết
Giá trị pH cuối cùng
Chiết bằng ethanol
Chiết bằng nước

1
LVL
5,51
4,80
2
HUN
5,42
4,98
3
LAU
6,12
4,45
4
DUL
5,06
4,87
5
LVT
4,94
4,88
6
XOA
5,08
5,19
7
Lx
5,87
4,45
8
Tx

5,78
5,17

Kết quả bảng 1 cho thấy dịch chiết trong các cây thuốc trong ethanol có tác dụng
ức chế sự sinh axit của vi khuẩn mạnh hơn so với mẫu cùng loại được chiết trong nước.
Điều này chứng tỏ hoạt chất chính gây ức chế sự sinh axit của vi khuẩn S. mutans 74 hòa
tan tốt trong ethanol, mặt khác dịch chiết ethanol cũng thuận lợi hơn cho việc tách chiết
[10]. Do vậy, chúng tôi lựa chọn ethanol cho các thí nghiệm tiếp theo.
Kết quả nghiên cứu về ảnh hưởng của các dịch chiết cây thuốc lên sự sinh axit
của vi khuẩn S. mutans 74 được trình bày trong hình 4.

Hình 4. Ảnh hưởng dịch chiết thực vật lên sự sinh axit của vi khuẩn S.mutans 74
Trong môi trường không bổ sung dịch chiết các cây thuốc, pH của huyền dịch tế
bào giảm nhanh (mẫu đối chứng trong ethanol và trong nước), trong khi ở các mẫu có bổ
sung dịch chiết vào huyền dịch tế bào làm cho sản xuất axit của vi khuẩn S. mutans 74 đã
bị ức chế thể hiện qua sự giảm pH chậm lại. Sau 90 phút thí nghiệm, kết quả cho thấy ở
mẫu đối chứng (ĐC), pH cuối cùng đều nằm trong khoảng 4,0 - 4,6 và ít có sự khác biệt
giữa mẫu đối chứng nước hay ethanol. Trong khi ở các mẫu có bổ sung dịch chiết thực
vật thì pH cuối cùng cao hơn, với giá trị tương ứng là từ 4,9 đến 6,2.
Trong các mẫu dịch chiết thực vật được làm thí nghiệm, dịch chiết cây Lấu Ba Vì
(LAU) và cây Xoài (Tx, Lx) thể hiện khả năng ức chế sự sinh axit tốt nhất. Giá trị pH
giảm của hai mẫu này cho thấy dịch chiết từ xoài và Lấu Ba Vì đã làm chậm tốc độ giảm
pH của môi trường, giá trị pH cuối cùng sau 90 phút thí nghiệm là đối với dịch chiết thân
xoài là 5,78, dịch chiết lá xoài là 5,87 và đối với dịch chiết lá cây Lấu Ba Vì là 6,12. Vì
vậy, chúng tôi lựa chọn dịch chiết lá xoài, thân xoài và dịch chiết cây Lấu Ba Vì để tiếp
tục nghiên cứu.
3.1.2. Khả năng diệt S. mutans bởi dịch chiết một số thực vật
3.1.2.1. Khả năng giết vi khuẩn Streptococcus mutans ở pH 4,0
Thí nghiệm được tiến hành ở pH 4,0, giá trị pH bắt đầu gây mòn men răng. Đây là
môi trường mà vi khuẩn S. mutans có khả năng sinh trưởng tốt, trong khi các chủng vi

khuẩn khác kém phát triển [23].


Hình 6. Khả năng giết vi khuẩn S.mutans của các dịch chiết tại pH 4,0
Kết quả ở hình 6 cho thấy, với nồng độ 15%, thời gian 90% quần thể tế bào vi
khuẩn bị giết chết tương ứng với giá trị logN/No= -1 lần lượt là hơn 13 phút đối với dịch
chiết thân xoài và với dịch chiết lá xoài là 19 phút. Đối với dịch chiết từ lá cây Lấu Ba Vì
(LAU), 50% quần thể tế bào bị giết sau khoảng 20 phút xử lý. So sánh với các kết quả
nghiên cứu này với một số nghiên cứu đã công bố về dịch chiết một số nguồn thực vật
khác như từ vỏ quả măng cụt [18], vỏ sao đen và lá sắn thuyền [7, 17] cho thấy hoạt tính
kháng khuẩn của dịch chiết thân xoài và lá xoài là cao hơn.
3.1.2.2. Khả năng giết vi khuẩn Streptococcus mutans ở pH 7,0
Giá trị pH 7,0 là giá trị pH trung tính trong khoang miệng và được chúng tôi tiến
hành thử nghiệm với các dịch chiết. Kết quả cho thấy ở pH 7,0, các dịch chiết cũng có tác
dụng diệt vi khuẩn S. mutans. Tuy nhiên, so với khả năng diệt khuẩn ở pH 4,0 thì khả
năng giết vi khuẩn ở pH 7,0 thấp hơn với cùng một nồng độ dịch chiết. Thời gian để diệt
50% số lượng tế bào trong quần thể vi khuẩn S. mutans 74 đối với dịch chiết từ lá cây
Lấu Ba Vì từ 23 đến 25 phút. Còn với dịch chiết thân xoài, lá xoài lần lượt là 23 phút và
25 phút thì 90% số lượng tế bào trong quần thể bị tiêu diệt (Hình 7).
So sánh với các kết quả nghiên cứu trước đây của Nguyễn Quang Huy và cộng sự
[10, 11] cho thấy dịch chiết ethanol từ lá xoài, thân xoài và lá cây Lấu Ba Vì đều có khả
năng giết S. mutans 74 thấp hơn so với dịch chiết từ cây Sao đen hay sắn thuyền. Tuy
nhiên, đây là kết quả nghiên cứu trên đối tượng là vi khuẩn S. mutans 74, chủng vi khuẩn
được phân lập từ người Việt Nam.

Hình 7. Khả năng giết vi khuẩn S. mutans 74 của các dịch chiết tại pH 7,0
3.1.3. Khả năng kết hợp dịch chiết với một số chất bảo vệ răng miệng thông qua khả
năng ức chế sự sinh axit
3.1.3.1. Kết hợp với NaF
Dịch chiết được sử dụng ở nồng độ có tác dụng mạnh nhất là 15% (v/v) phối hợp

với NaF nồng độ cuối cùng 0,25mM (Theo nghiên cứu trước đây của Phan và cộng sự)
[15]. Nồng độ này thấp hơn nhiều lần so với nồng độ fluor được sử dụng trong các sản
phẩm bảo vệ răng miệng thông thường. Khả năng kết hợp giữa dịch chiết với NaF lên vi
khuẩn S. mutans phân lập từ người Việt Nam được đánh giá qua khả năng ức chế sinh
sinh axit của chủng vi khuẩn.



Hình 8. Tác dụng của dịch lá xoài, thân xoài và Lấu Ba Vì phối hợp với NaF lên sự
sinh axit của vi khuẩn S. mutans 74
Sau 90 phút thí nghiệm được trình bày ở hình 8, pH ở mẫu đối chứng giảm xuống
còn 4,08. NaF ở nồng độ 0,25mM có tác dụng ức chế sự sinh axit của chủng vi khuẩn
nghiên cứu nhưng ở mức độ thấp, đạt 5,05. Trong khi đó, khi phối hợp dịch chiết cây
xoài với NaF, hiệu quả ức chế quá trình sinh axit của vi khuẩn cao hơn khi sử dụng dịch
chiết ở dạng riêng lẻ, giá trị pH ở hai mẫu nghiên cứu (thân và lá xoài kết hợp với NaF)
đều đạt trên 7, với cây Lấu Ba Vì đạt 6,75. Điều này chứng tỏ tác dụng của NaF và dịch
chiết có tác dụng cộng gộp, làm tăng khả năng ức chế sự sinh axit của chủng vi khuẩn S.
mutans.
3.1.3.2. Kết hợp với H
2
O
2
Trong nhiều nghiên cứu trước đây cho thấy H
2
O
2
có tác dụng mạnh lên nhiều quá
trình sinh lý của vi khuẩn sâu răng, mặt khác H
2
O

2
cũng được sử dụng trong các sản
phẩm nước súc miệng, do vậy chúng tôi tiến hành thử nghiệm hoạt tính của các dịch chiết
cây thuốc kết hợp với H
2
O
2
với nồng độ cuối cùng trong dịch nuôi cấy là 0,3mM. Kết
quả được thể hiện trong hình 9.


Hình 9. Tác dụng của dịch chiết cây xoài và Lấu Ba Vì phối hợp với H
2
O
2
lên sự
sinh axit của vi khuẩn S. mutans 74
Kết quả trình bày ở hình 9 cho thấy sau 90 phút đối với mẫu đối chứng H
2
O có pH
là 4,09, mẫu bổ sung H
2
O
2
có pH cuối cùng là 4,37. Các mẫu có bổ sung dịch lá xoài,
thân xoài và Lấu Ba Vì với H
2
O
2
thì giá trị pH cuối cùng của các mẫu thí nghiệm lần lượt

là 6,28; 6,49; và 6,58. Như vậy, các mẫu có bổ sung dịch chiết cây xoài và Lấu Ba Vì với
H
2
O
2
thì hiệu quả ức chế quá trình sinh axit của tế bào cao hơn so với mẫu chỉ có dịch
chiết riêng lẻ.
3.1.4. Khả năng ức chế sự hình thành biofilm từ các dịch chiết
Tiến hành nhuộm màng biofilm bằng dung dịch tím kết tinh, có thể dễ dàng quan
sát được khả năng hình thành biofilm của chủng vi khuẩn khi không có tác dụng của dịch
nghiên cứu so với mẫu thí nghiệm có bổ sung dịch chiết thân và lá xoài. Các tế bào trên
biofilm sẽ bắt màu tím với thuốc nhuộm, sự bắt màu càng đậm chứng tỏ mật độ tế bào ở
biofilm càng nhiều.

(a) (b)
Hình 10. Sự hình thành biofilm của chủng S.mutans 74
(a) Sự ức chế hình thành biofilm của dịch chiết cây xoài
1. Đối chứng môi trường; 2. Dịch nuôi cấy vi khuẩn; 3. Dịch nuôi cấy vi khuẩn có bổ
sung dịch chiết thân xoài; 4. Dịch nuôi cấy vi khuẩn có bổ sung dịch chiết lá xoài
(b) Sự ức chế hình thành biofilm của dịch chiết cây Lấu Ba Vì
1. Đối chứng môi trường; 2. Dịch nuôi cấy vi khuẩn; 3. Dịch nuôi cấy vi khuẩn có bổ sung
dịch chiết Lấu Ba Vì
1
2
3

Hình 11. Sự hình thành biofilm cuả chủng S. mutans GS-5
(a) Sự ức chế hình thành biofilm của dịch chiết cây xoài
1.Đối chứng môi trường; 2. Dịch nuôi cấy vi khuẩn; 3. Dịch nuôi cấy vi khuẩn có bổ
sung dịch chiết thân xoài; 4. Dịch nuôi cấy vi khuẩn có bổ sung dịch chiết lá xoài

(b) Sự ức chế hình thành biofilm của dịch chiết cây Lấu Ba Vì
1. Đối chứng môi trường; 2. Dịch nuôi cấy vi khuẩn; 3. Dịch nuôi cấy vi khuẩn có bổ sung
dịch chiết Lấu Ba Vì

Quan sát kết quả nhuộm biofilm trên hình 10 và hình 11, bước đầu chúng ta có thể
rút ra nhận xét rằng dịch chiết thân xoài, lá xoài và Lấu Ba Vì đã có tác dụng làm giảm
khả năng hình thành biofilm của hai chủng vi khuẩn nghiên cứu thể hiện ở việc ống
effendorf có bổ sung dịch chiết có sự bắt màu với thuốc nhuộm ít hơn so với ống đối
chứng chỉ bổ sung dịch nuôi cấy tế bào vi khuẩn. Tuy nhiên, đây mới chỉ là các kết quả
nghiên cứu bước đầu về khả năng tạo thành và ức chế sự tạo thành biofilm của các chủng
vi khuẩn gây sâu răng trên giá thể là ống nhựa (ống effendorf).
Để định lượng được mật độ tế bào trong biofilm hình thành, chúng tôi tiến hành đo
độ hấp thụ của chúng ở bước sóng 570nm. Giá trị OD
570
phản ánh mật độ tế bào tồn tại
trong biofilm, thông qua giá trị này chúng ta có thể đánh giá được khả năng hình thành
biofilm của các chủng vi khuẩn cũng như việc ức chế sự hình thành biofilm từ các dịch
chiết nghiên cứu.

1
2
3

(a) (b)
Hình 12. Khả năng ức chế sự hình thành biofilm của chủng S. mutans 74 của
dịch chiết thân và lá xoài (a) và Lấu Ba Vì (b)
Kết quả trên cho chúng ta thấy dịch chiết của các mẫu nghiên cứu đã có tác dụng
ức chế sự hình thành biofilm đối với chủng S. mutans 74 thể hiện ở giá trị OD
570
giảm so

với giá trị OD
570
đối chứng (hình 12).
Đối với chủng S. mutans GS-5, kết quả cho thấy sự hình thành biofilm có phần
yếu hơn so với chủng S. mutans 74. Tuy nhiên, đối với các mẫu có bổ sung dịch chiết vẫn
cho thấy có sự ức chế hình thành biofilm (hình 13).

(a) (b)
Hình 13. Khả năng ức chế sự hình thành biofilm của chủng S. mutans GS-5 của
dịch chiết thân và lá xoài (a) và Lấu Ba Vì (b).
3.1.5. Phân tách các hợp chất bằng sắc ký lớp mỏng
Bước tiếp theo, chúng tôi phân tách các hợp chất bằng phương pháp sắc kí lớp
mỏng. Theo kết quả nghiên cứu của Nguyễn Quang Huy và cộng sự [10] cho thấy hệ
dung môi TEAF với tỷ lệ 5:3:1:1 cho khả năng tách chiết các hợp chất thứ cấp trong dịch
chiết thực vật là tốt. Vì vậy, chúng tôi lựa chọn hệ dung môi TEAF với tỷ lệ 5:3:1:1 cho
thí nghiệm sắc kí bản mỏng với các dịch chiết.
Từ dịch chiết bằng ethanol qua sắc ký bản mỏng với hệ dung môi TEAF (5:3:1:1) chúng
tôi nhận thấy lá xoài có 7 phân đoạn (hình 14c), nhiều phân đoạn hơn dịch chiết thân xoài
4 phân đoạn (hình 14b). Trong các băng vạch xuất hiện trong dịch chiết lá và thân xoài
băng có hệ số R
f
= 0,57 thấy xuất hiện ở cả lá và thân xoài, ký hiệu là M5.

(a) (b) (c)
Hình 14. Ảnh sắc ký bản mỏng từ dịch chiết Lấu Ba Vì (a), thân xoài (b), lá xoài (c).
Từ các phân đoạn sắc ký bản mỏng thu được, chúng tôi tiến hành đánh giá kiểm
tra hoạt tính ức chế sự phát triển của các chủng Streptococci từ các phân đoạn tách từ bản
sắc ký (hình 14). Các phân đoạn tách từ bản sắc ký lá, vỏ xoài và Lấu Ba Vì đều có tác
dụng ức chế sự phát triển của các chủng Streptococci ở các mức độ khác nhau. Trong đó
thấy phân đoạn M5 (có hệ số R

f
= 0,57) có hoạt tính mạnh nhất ức chế sự phát triển của
cả chủng vi khuẩn S. mutans GS-5, cũng như chủng S. mutans 74 phân lập từ người Việt
Nam (hình 15). Tuy nhiên, vì lượng tách chiết chưa nhiều nên việc đánh giá mới là bước
đầu, cần có các thí nghiệm để thu hồi được lượng mẫu từ các phân đoạn lớn hơn.

(a) (b)
Hình 15. Khả năng ức chế sự phát triển của
S. mutans
GS-5 (a),
S. mutans
74
(b) cuả dịch chiết lá xoài


(a) (b)
Hình 16. Khả năng ức chế sự phát triển của
S. mutans
GS-5 (a),
S. mutans
74 (b) cuả
dịch chiết Lấu Ba Vì
Kết quả trên cũng cho thấy dịch chiết từ lá cây Lấu Ba Vì có 2 phân đoạn có hoạt
tính kháng khuẩn mạnh nhất đối với chủng S. mutans từ người Việt Nam đó là phân đoạn
2 và 5 tương ứng với R
f
là 0,78 và 0,98; Các phân đoạn này cũng có tác dụng đối với
chủng chuẩn S. mutans GS5.
Kết quả này sẽ là cơ sở để tiến hành xác định các hợp chất có tác dụng diệt vi
khuẩn sâu răng S. mutans trong dịch chiết từ lá cây Lấu Ba Vì và cây xoài cho các nghiên

cứu tiếp theo.

3.1.6. Nghiên cứu tác dụng của một số phân đoạn dịch chiết lên một số enzym của S.
mutans
Các phân đoạn thu được từ sắc lý lớp mỏng có hoạt tính kháng khuẩn mạnh nhất
được sử dụng cho nghiên cứu sự ảnh hưởng lên các enzym của vi khuẩn S. mutans. Với
dịch chiết cây Lấu Ba Vì, phân đoạn có hoạt tính mạnh nhất là phân đoạn có Rf= 0,98,
dịch chiết lá xoài và thân xoài đều có phân đoạn có Rf= 0,57 có hoạt tính mạnh nhất.
3.1.6.1. Ảnh hưởng lên enzym ATPase
ATPase là enzym trên màng tế bào, có vai trò quan trọng trong quá trình vận
chuyển proton qua màng, do đó đây là enzym có vai trò quyết định khả năng chịu axit
của vi khuẩn sâu răng.
Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của phân đoạn M5 có tác dụng ức chế hoạt tính của
enzym ATPase. Ngay tại nồng độ thấp là 2,5%, khoảng gần 50% hoạt tính enzym đã bị
ức chế đối với chủng S. mutans 74. Tác dụng ức chế enzym ATPase của phân đoạn này
giải thích được một phần tác dụng diệt vi khuẩn S.mutans tại giá trị pH axit của dịch
chiết thân và lá xoài.

(a) (b)
Hình 17. Ảnh hưởng phân đoạn 5 dịch chiết lá xoài (a), phân đoạn 5 dịch
chiết Lấu Ba Vì (b) lên hoạt độ ATPase của S. mutans 74
3.1.6.2. Ảnh hưởng lên enzym NADH oxidase
NADH oxidase chịu trách nhiệm chính cho quá trình hô hấp của vi khuẩn gây sâu
răng. Kết quả thu được về sự ức chế enzyme dưới hình 18.

(a) (b)
Hình 18. Ảnh hưởng phân đoạn 5 dịch chiết lá xoài (a), phân đoạn 5 dịch
chiết Lấu Ba Vì (b) lên hoạt độ NADH oxidase của S. mutans 74
So sánh về khả năng ức chế enzyme NADH oxidase, dịch chiết cây xoài ở nồng độ
2% đã ức chế 50% hoạt độ enzyme, dịch chiết lấu Ba Vì nồng độ 1% ức chế hơn 50%

hoạt độ enzym, theo kết quả nghiên cứu của Nguyễn Quang Huy dịch chiết lá sắn thuyền
và sao đen ở nồng độ 3% ức chế được 50% hoạt độ enzyme này. Như vậy khả năng ức
chế enzyme NADH oxidase của hai dịch chiết nghiên cứu cao hơn kết quả nghiên cứu
trước đây.
Điều này bước đầu giải thích tại sao quá trình sinh axit của tế bào vi khuẩn S.
mutans bị ức chế bởi dịch chiết thân và lá xoài, và dịch chiết cây Lấu Ba Vì.
3.1.6.2. Ảnh hưởng lên enzym phosphoryl hóa đường (PTS)
Hệ thống enzym PTS đóng vai trò chủ yếu trong việc phosphoryl hóa đường từ bên
ngoài vào tế bào chất. Kết quả kiểm tra ảnh hưởng của phân đoạn số 5 dịch chiết lá xoài
và Lấu Ba Vì lên hoạt tính của enzym PTS. Kết quả trên hình 19 cho thấy hợp chất này
với nồng độ dịch chiết lá xoài là 1%, dịch chiết Lấu Ba Vì là 2% đã ức chế 50% hoạt độ
enzyme vận chuyển đường.

(a) (b)
Hình 19. Ảnh hưởng phân đoạn 5 dịch chiết lá xoài (a), phân đoạn 5 dịch chiết
Lấu Ba Vì (b) lên hoạt độ enzym PTS của S. mutans 74
3.1.7. Phổ hấp thụ hồng ngoại của một số phân đoạn dịch chiết
Để bước đầu tìm hiểu về cấu trúc của những phân đoạn có hoạt tính kháng khuẩn sâu
răng Streptococcus mutans mạnh từ dịch chiết của Lấu Ba Vì và thân, lá xoài, chúng tôi
đã đánh giá qua khả năng hấp thụ bước sóng hồng ngoại.

Hình 20. Phổ hấp thụ hồng ngoại của phân đoạn 5 dịch chiết lá xoài
Nhìn trên kết quả hình 20 ta thấy xuất hiện một số đỉnh hấp thụ hồng ngoại của
phân đoạn 5 dịch chiết lá xoài. Đỉnh hấp thụ bước sóng ở mức độ vừa phải trong khoảng
3200- 3700 cm
-1
là vùng hấp thụ của liên kết –OH. Ngoài ra còn xuất hiện đỉnh hấp thụ
mạnh bước sóng trong khoảng 1000- 1500 cm
-1
, hấp thụ thấp bước sóng trong khoảng

600 – 1000 cm
-1
là vùng hấp thụ của liên kết C=C mạch vòng. Từ những kết quả này có
thể thấy rằng dịch chiết phân đoạn 5 có thể là hợp chất mangiferin, là một loại
polyphenol.

Cấu trúc Mangiferin [66]
Mangiferin [66] được sử dụng trong y học ở nhiều nước trên thế giới như chống
oxy hóa, kháng viêm, kháng virus, tăng cưỡng miễn dịch. Thân xoài chứa mangiferin tới
3%, lá xoài chứa khoảng 1,6% mangiferin. Chất này trong lá xoài là chất chống viêm, nó
còn có tác dụng diệt vi khuẩn gram dương rất mạnh, bảo vệ răng miêng, chống bựa răng
và các mảng phủ quanh chân răng. Mangiferin dễ tan trong nước nóng, để chiết xuất có
thể dùng các dung môi như metylic, etylic, axeton, chloroform, n-butanol [14].

Hình 21. Phổ hấp thụ hồng ngoại của phân đoạn 5 dịch chiết Lấu Ba Vì
Kết quả trên hình 21 cho thấy, phổ hấp thụ của phân đoạn dịch chiết Lấu Ba Vì xuất
hiện nhiều đỉnh hấp thụ, chứng tỏ phân tách các phân đoạn chưa sạch, trong phân đoạn 5
còn lẫn một số phân đoạn khác. Tuy nhiên, trong số các đỉnh hấp thụ, có đỉnh hấp thụ
trong khoảng 3200-3600, vùng chứa liên kết – OH, ta cũng có thể kết luận bước đầu phân
đoạn 5 chứa hợp chất polyphenol, để khẳng định cần phải có thêm các kết quả nghiên cứu
sâu hơn.



References :
Tài liệu tiếng Việt
1. Đỗ Huy Bích, (2004). Cây thuốc và động vật làm thuốc ở Việt Nam (2 tập),
NXB Khoa học và Kỹ thuật Hà Nội.
2. Lê Tự Hải, Phạm Thị Thùy Trang, Dương Ngọc Cầm, Trần Văn Thắm, (2010).
“Nghiên cứu tách chiết, xác định thành phần hóa học của hợp chất tanin từ lá

chè xanh và khảo sát tính ức chế ăn mòn kim loại của nó”.
3. Trịnh Đình Hải (2004), “Giáo trình dự phòng sâu răng”, Nhà xuất bản Y học.
4. Trịnh Đình Hải, (2005). “Sâu răng ở người trưởng thành”. Tạp chí Y học Việt
Nam số 1/2005: 7-11.
5. Nguyễn Dương Hồng (1997), “Sâu răng-Răng Hàm Mặt”, Tập 1 Nxb Y học,
pp. 102-199.
6. Lê Thị Thu Hiền, (2010). “Khảo sát tính kháng sinh của chất chiết hành, tỏi,
hẹ, lá móng tay trên vi khuẩn E. coli”, LV-NLN-NN02, Đại học Nông lâm Tp.
Hồ Chí Minh.
7. Nguyễn Như Hiền, Chu Văn Mẫn, (2004), Cơ sở sinh học người, NXB Đại học
Quốc gia Hà Nội.
8. Nguyễn Quang Huy (2008), “Nghiên cứu tác dụng của một số hợp chất thực
vật thứ sinh lên vi khuẩn gây sâu răng”, Luận án tiến sĩ khoa học, pp. 51-52.
9. Nguyễn Quang Huy, Phạm Thanh Nga, Phan Tuấn Nghĩa (2005), “Tìm hiểu
tác dụng chống sâu răng của dịch chiết vỏ cây Sao Đen (Hopea odorata
Roxb)”, Tạp chí Dược học, 45 (350), pp. 13-19.
10. Nguyễn Quang Huy, Ngô Văn Quang, Phạm Văn Kiệm, Phan Tuấn Nghĩa
(2007), “Axít asiatic phân lập từ cây sắn thuyền Syzygium resinosum Gagnep
và tác dụng của nó lên vi khuẩn Streptococcus mutans”, Tạp chí Dược học 47,
pp. 19-22.
11. Đỗ Tất Lợi (1986), “Những cây thuốc và vị thuốc Việt Nam”, Nxb Khoa học
kĩ thuật, Hà Nội.
12. Nguyễn Hoàng Lộc, “Sản xuất các hợp chất thứ cấp từ nuôi cấy tế bào thực
vật”, Viện Tài nguyên Môi trường và Công nghệ Sinh học, Đại Học Huế.
13. Hà Thị Bích Ngọc, Trần Thị Huyền Nga, Nguyễn Văn Mùi, (2007), “Điều tra
hợp chất carotenoit trong một số thực vật của Việt Nam”. Tạp chí Khoa học
ĐHQGHN, Khoa học Tự nhiên và Công nghệ 23: 130-134.
14. Đoàn Suy Nghĩ, Nguyễn Thị Thu Thủy, (2009). “Nghiên cứu một số chỉ số
sinh hóa và khả năng kháng khuẩn của nấm Hoàng chi Ganoderma colossum”.
Tạp chí Khoa học, Đại học Huế, số 55: 25 – 32.

15. Phan Tuấn Nghĩa, Nguyễn Thị Mai Phương, Robert E. Marquis, (2003), “Cơ
chế tác dụng của peroxithydro lên vi khuẩn gây bệnh sâu răng Streptococcus
mutans”, Tạp chí Sinh học, 25(2A): 104-110.
16. Nguyễn Thị Mai Phương, Bùi Tuyết Ánh (2007), “Điều tra tác dụng kháng vi
khuẩn sâu răng Streptococcus mutans của một số thực vật Việt Nam”, Tạp chí
Dược liệu 12, pp. 19-23.
17. Nguyễn Thị Mai Phương, Nguyễn Thị Ngọc Dao, Phan Tuấn Nghĩa, Đặng
Minh Phương (2003), “Tác dụng của polyphenol của dịch chiết vỏ măng cụt
(Garcinia mangostana L.) lên vi khuẩn gây sâu răng Streptococcus mutans”,
Những vấn đề cơ bản trong khoa học sự sống, pp. 983-986.
18. Nguyễn Thị Mai Phương, Vũ Thị Minh Đức, Nguyễn Thị Ngọc Dao, (2003),
“Tìm hiểu thành phần mảng bám răng của người Việt Nam”, Tap chí Y học
Việt Nam, 8, trang 11-17.
19. “Sinh lý học của răng ”, Nhà xuất bản Trường đại học y Hà Nội, pp. 1-13.
20. Trần Thị Thanh (2006), “Nghiên cứu sự đáp ứng stress ở Streptococcus
mutans”, Luận văn thạc sĩ Sinh học, pp. 6-14.
21. Trần Thu Thủy (2005), “Sâu răng-bệnh do màng sinh học”, Tài liệu dịch, cập
nhật nha khoa. , Nhà xuất bản Y học thành phố Hồ Chí Minh, pp. 22-26.
22. Trần Văn Trường, Trịnh Đình Hải, Spencer, J. A., Thomson R. K. (2002).
“Điều tra sức khỏe răng miệng toàn quốc ở Việt Nam 1999-2000”. Tạp chí Y
học Việt Nam. 240: 24-28.

Tài liệu Tiếng Anh
23. Aeba T., Fejerskkov Q., (2002), “Dental fluorosis: chemistry and biology”,
Crit. Rev. Oral. Biol. Med., 13(2), pp.155-170.
24. Beegum, S.J.G.R.J. (2007), “In vitro susceptibility of viridans streptococci to
leaf extracts of Mangifera Indica”, Indian J. Microbiol, 47, pp. 160-163.
25. Belli, W. A., and Marquis, R. E. (1991), “Adaptation of Streptococcus mutans
and Enterococcus hirae to acid stress in continuous culture”, Appl. Environ.
Microbiol. 57: 785-791.

26. Belli W.A., Buckley D.H., Marquis R.E., (1995), “Week acid effects and
fluorid inhibition of glycolysis by Streptococcus mutans GS-5”, Can. J.
Microbiol., 41, pp.785-791.
27. Bender, G.R., Marquis, R. E. (1987), “Membrane ATPase and acid tolerance
of Actinomyces viscosus and Lactobacillus casei”, Appl. Environ. Microbiol.,
53, pp. 2124-2128.
28. Bender, G.R., Sutton, S. V. W., Marquis, R. E. (1986), “Acid tolerance, proton
permeabilities, and membrane ATPase of oral streptococci”, Infect. Immun.,
53, pp. 331-338.
29. Berow, L., Sage, H., Fridovich, I. (1997), “The copper and zinc-containing
superoxise dismutases from E. coli: molecullar and weight stability”, Arch.
Biochem. Biophys. 340: 305-310.
30. Bowen W. H., (1972), “Dental caries”, Archives of Disease in Childhood, 47,
849.
31. Burne, R. A. (1998), “Oral streptococci-products of their environment”, J.