(Luận văn thạc sĩ) Nghiên cứu một số yếu tố ảnh hưởng đến sự phát triển vi củ sâm Ngọc Linh (PanaxVietnamensis Ha et Grushv.) từ nuôi cấy phôi soma

1

MỤC LỤC
Trang
DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU VÀ CHỮ VIẾT TẮT ....................................... 5
DANH MỤC BẢNG ......................................................................................... 6
DANH MỤC HÌNH .......................................................................................... 8
MỞ ĐẦU ........................................................................................................... 9
1.

Tính cấp thiết của đề tài .......................................................................... 9

2.

Mục đích của đề tài ............................................................................... 10

3.

Cơ sở khoa học và tính thực tiễn của đề tài .......................................... 10

4.

3.1

Cơ sở khoa học ................................................................................ 10

3.2

Tính thực tiễn .................................................................................. 10

Đối tƣợng và phạm vi nghiên cứu của đề tài ........................................ 11

4.1

Đối tƣợng nghiên cứu ...................................................................... 11

4.2

Phạm vi nghiên cứu của đề tài......................................................... 11

CHƢƠNG 1. TỔNG QUAN ĐỀ TÀI ............................................................. 12
1.1 SƠ LƢỢC VỀ CHI PANAX ................................................................ 12
1.1.1

Phân bố các loài thuộc chi Panax ................................................. 12

1.1.2

Phân loại ....................................................................................... 13

1.1.3

Đặc điểm thực vật ........................................................................ 16

1.1.4

Thành phần hóa học ..................................................................... 16

1.1.5

Tác dụng ....................................................................................... 17

1.1.6

Các dạng chế biến từ sâm............................................................. 18

1.2 TỔNG QUAN VỀ SÂM NGỌC LINH ................................................ 20
1.2.1

Phân loại khoa học ....................................................................... 20

1.2.2

Đặc điểm hình thái ....................................................................... 20


2

1.2.3

Đặc điểm sinh trƣởng và phát triển của sâm Ngọc Linh ............. 21

1.2.4

Đặc điểm phân bố......................................................................... 22

1.2.5

Đặc tính dƣợc liệu ........................................................................ 22

1.2.6

Công dụng .................................................................................... 23

1.2.7

Giá trị kinh tế................................................................................ 24

1.2.8

Một số nghiên cứu về sâm Ngọc Linh trong và ngoài nƣớc ........ 24

1.2.9

Các yếu tố ảnh hƣởng đến q trình ni cấy .............................. 27

1.2.10 Điều kiện nuôi cấy........................................................................ 31
1.2.11 Các yếu tố khác ảnh hƣởng đến nuôi cấy in vitro ........................ 33
CHƢƠNG 2. VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU .................. 38
2.1 THỜI GIAN VÀ ĐỊA ĐIỂM NGHIÊN CỨU...................................... 38
2.1.1

Thời gian ...................................................................................... 38

2.1.2

Địa điểm ....................................................................................... 38

2.2 VẬT LIỆU NGHIÊN CỨU .................................................................. 38
2.2.1

Vật liệu nghiên cứu ...................................................................... 38

2.2.2

Điều kiện nuôi cấy........................................................................ 38

2.2.3

Dụng cụ và thiết bị ....................................................................... 39

2.2.4

Mơi trƣờng và hóa chất ................................................................ 39

2.3 NỘI DUNG NGHIÊN CỨU ................................................................. 39
2.3.1 Nội dung 1: Nghiên cứu ảnh hƣởng của hóa chất ni cấy trong
giai đoạn hình thành vi củ sâm Ngọc Linh từ nuôi cấy phôi soma .......... 39
2.3.2 Nội dung 2: Nghiên cứu ảnh hƣởng của điều kiện nuôi cấy trong
giai đoạn hình thành vi củ sâm Ngọc Linh từ ni cấy phơi soma .......... 39
2.4 PHƢƠNG PHÁP BỐ TRÍ THÍ NGHIỆM............................................ 40
2.4.1 Nội dung 1: Nghiên cứu ảnh hƣởng của hóa chất ni cấy trong
giai đoạn hình thành vi củ sâm Ngọc Linh từ nuôi cấy phôi soma .......... 40


3

2.4.2 Nội dung 2: Nghiên cứu ảnh hƣởng của điều kiện ni cấy trong
giai đoạn hình thành vi củ sâm Ngọc Linh từ nuôi cấy phôi soma .......... 43
2.5 PHƢƠNG PHÁP LẤY SỐ LIỆU ......................................................... 47
2.6 PHÂN TÍCH VÀ XỬ LÝ SỐ LIỆU ..................................................... 47
CHƢƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN .................................................. 48

3.1 NỘI DUNG 1: NGHIÊN CỨU ẢNH HƢỞNG CỦA HĨA CHẤT
NI CẤY TRONG GIAI ĐOẠN HÌNH THÀNH VI CỦ SÂM NGỌC
LINH TỪ NUÔI CẤY PHÔI SOMA .......................................................... 48
3.1.1 Thí nghiệm 1: Khảo sát ảnh hƣởng của Myo-inositol lên khả năng
hình thành vi củ sâm Ngọc Linh ............................................................... 48
3.1.2 Thí nghiệm 2: Khảo sát ảnh hƣởng của adenine sulphate lên khả
năng hình thành vi củ sâm Ngọc Linh ...................................................... 51
3.1.3 Thí nghiệm 3: Khảo sát ảnh hƣởng của L-tyrosine lên khả năng
hình thành vi củ sâm Ngọc Linh ............................................................... 54
3.1.4 Thí nghiệm 4: Khảo sát ảnh hƣởng của casein hydrolysate lên khả
năng hình thành vi củ sâm Ngọc Linh ...................................................... 57
3.1.5 Thí nghiệm 5: Khảo sát ảnh hƣởng của peptone lên khả năng hình
thành vi củ sâm Ngọc Linh ....................................................................... 61
3.1.6 Thí nghiệm 6: Khảo sát ảnh hƣởng của cao nấm men lên khả năng
hình thành vi củ sâm Ngọc Linh ............................................................... 64
3.2 NỘI DUNG 2: NGHIÊN CỨU ẢNH HƢỞNG CỦA ĐIỀU KIỆN
NI CẤY TRONG GIAI ĐOẠN HÌNH THÀNH VI CỦ SÂM NGỌC
LINH TỪ NUÔI CẤY PHÔI SOMA .......................................................... 66
3.2.1 Thí nghiệm 7: Khảo sát ảnh hƣởng của điều kiện chiếu sáng lên
khả năng hình thành vi củ sâm Ngọc Linh ............................................... 66
3.2.2 Thí nghiệm 8: Khảo sát ảnh hƣởng của điều kiện thống khí lên
khả năng hình thành vi củ sâm Ngọc Linh ............................................... 69


4

3.2.3 Thí nghiệm 9: Khảo sát ảnh hƣởng của điều kiện nhiệt độ lên khả
năng hình thành vi củ sâm Ngọc Linh ...................................................... 72
3.2.4

Bài toán tối ƣu .............................................................................. 75

CHƢƠNG 4. KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ .................................................. 77
4.1 KẾT LUẬN ........................................................................................... 77
4.2 KIẾN NGHỊ .......................................................................................... 77
TÀI LIỆU THAM KHẢO ............................................................................... 79


5

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU VÀ CHỮ VIẾT TẮT
BA

6-benzyladenine

CĐHSTTV

Chất điều hòa sinh trƣởng thực vật

GA3

Acid gibberellic

G-Rb1

Ginsenoside-Rb1

G-Rg1

Ginsenoside-Rg1

G-Rg2

Ginsenoside-Rg2

G-Rd

Ginsenoside-Rd

HPLC

High performance liquid chromatography

IBA

Indole- 3-butyric

LED

Light-Emmitting Diode

MS

Môi trƣờng Murashige và Skoog

NAA

α-Naphtaleneacetic acid

OA

Olean

OCT

Ocotillol saponin

PPD

Protopanaxadiol

PPT

Protopanaxatriol

SH

Môi trƣờng Schenk và Hildebrandt

YE

Yeast extract


6

DANH MỤC BẢNG
Bảng 1.1: Các loài thuộc chi Panax trên thế giới [2] ...................................... 12
Bảng 1.2: Bảng hệ thống phân loại các loài thuộc chi Panax ở Châu Á và thế
giới [2] ............................................................................................................. 14

Bảng 1.3: Một số vi lƣợng thông dụng ........................................................... 30
Bảng 1.4: Các vitamin thƣờng dùng trong nuôi cấy mô tế bào thực vật ........ 31
Bảng 2.1: Các mức và khoảng biến thiên của thí nghiệm .............................. 45
Bảng 2.2: Bảng bố trí ma trận các nghệm thức thực nghiệm ......................... 46
Bảng 3.1: Ảnh hƣởng của myo-inositol lên sự hình thành vi củ từ mẫu phơi
soma sâm Ngọc Linh ....................................................................................... 48
Bảng 3.2: Ảnh hƣởng của adenine sulphate lên sự hình thành vi củ từ mẫu
phơi soma sâm Ngọc Linh............................................................................... 52
Bảng 3.3: Ảnh hƣởng của L-tyrosine lên sự hình thành vi củ từ mẫu phôi
soma sâm Ngọc Linh ....................................................................................... 55
Bảng 3.4 : Ảnh hƣởng của casein hydrolysate lên sự hình thành vi củ từ mẫu
phôi soma sâm Ngọc Linh............................................................................... 58
Bảng 3.5: Ảnh hƣởng của peptone lên sự hình thành vi củ từ mẫu phôi soma
sâm Ngọc Linh ................................................................................................ 61
Bảng 3.6: Ảnh hƣởng của cao nấm men lên sự hình thành vi củ từ mẫu phôi
soma sâm Ngọc Linh ....................................................................................... 64
Bảng 3.7: Ảnh hƣởng của điều kiện chiếu sáng lên sự hình thành vi củ từ mẫu
phơi soma sâm Ngọc Linh............................................................................... 67
Bảng 3.8: Ảnh hƣởng của điều kiện thống khí lên sự hình thành vi củ từ mẫu
phơi soma sâm Ngọc Linh............................................................................... 69
Bảng 3.9: Ảnh hƣởng của điều kiện nhiệt độ lên sự hình thành vi củ từ mẫu
phơi soma sâm Ngọc Linh............................................................................... 72
Bảng 3.10: Bố trí ma trận các thí nghiệm thực nghiệm .................................. 75


7

Bảng 3.11: Bảng mức độ ảnh hƣởng của điều kiện ni cấy lên sự hình thành
vi củ sâm Ngọc Linh ....................................................................................... 76

8

DANH MỤC HÌNH
Hình 1.1: Hồng sâm (trái) và Hắc sâm (phải) [5]. .......................................... 18
Hình 1.2: Các sản phẩm phong phú từ sâm trên thị trƣờng [5]. ..................... 19
Hình 1.3: Sâm Ngọc Linh [9].......................................................................... 20
Hình 2.1: Phơi soma sâm Ngọc Linh nuối cấy in vitro................................... 38
Hình 3.1: Ảnh hƣởng của myo-inositol lên sự hình thành vi củ sâm Ngọc Linh
......................................................................................................................... 49
Hình 3.2: Ảnh hƣởng của adenine sulphate lên sự hình thành vi củ sâm Ngọc
Linh ................................................................................................................. 53
Hình 3.3: Ảnh hƣởng của L-tyrosine lên sự hình thành vi củ sâm Ngọc Linh
......................................................................................................................... 56
Hình 3.4: Ảnh hƣởng của casein hydrolysate lên sự hình thành vi củ sâm
Ngọc Linh ........................................................................................................ 59
Hình 3.5: Ảnh hƣởng của peptone lên sự hình thành vi củ sâm Ngọc Linh ... 62
Hình 3.6: Ảnh hƣởng của cao nấm men lên sự hình thành vi củ sâm Ngọc
Linh ................................................................................................................. 65
Hình 3.7: Ảnh hƣởng của ánh sáng lên sự hình thành vi củ sâm Ngọc Linh . 67
Hình 3.8: Ảnh hƣởng của điều kiện thống khí lên sự hình thành vi củ sâm
Ngọc Linh ........................................................................................................ 70
Hình 3.9: Ảnh hƣởng của nhiệt độ lên sự hình thành vi củ sâm Ngọc Linh .. 73


9

MỞ ĐẦU
1. Tính cấp thiết của đề tài
Sâm Ngọc Linh có tên khoa học là Panax vietnamensis Ha et Grushv.,

thuộc họ Nhân sâm (Araliaceae). Từ sâm Ngọc Linh đã chiết đƣợc 50 hợp
chất, xác định cấu trúc hóa học cho thấy 26 hợp chất có cấu trúc đã biết
(thƣờng thấy ở sâm Triều Tiên, sâm Mỹ, sâm Nhật) và 24 saponin
dammarane có cấu trúc mới khơng bắt gặp ở các lồi sâm khác trên thế giới
[1].
Với mục đích bảo tồn và phát triển nguồn gen quý hiếm của quốc gia
đồng thời phát triển những vùng trồng để cung cấp nguyên liệu cho ngành
dƣợc, từ lâu công tác tạo nguồn giống sâm Ngọc Linh đã đƣợc đề cập đến với
hai hình thức chủ yếu là nhân giống từ hạt và tạo giống từ đầu mầm (thân rễ
ngầm) nhƣng kết quả đạt đƣợc còn hạn chế do số lƣợng hạt giống chất lƣợng
càng ngày càng hiếm do khai thác quá mức các cây sâm có thể cho hạt, cơng
nghệ vi nhân giống vẫn chƣa đáp ứng đƣợc chất lƣợng cây giống trong canh
tác ngoài đồng ruộng (tỷ lệ cây giống chết và cây chậm phát triển, khơng tạo
củ hồn chỉnh khi trồng ngồi đồng ruộng). Do đó, cần phải cải tiến các công
nghệ vi nhân giống cây sâm Ngọc Linh là yêu cầu cấp thiết cần giải quyết.
Việc ứng dụng phƣơng pháp phát sinh phôi soma ở cây sâm Ngọc Linh hứa
hẹn sẽ mang lại nhiều ƣu điểm vì có thể tạo ra một số lƣợng lớn cây con có
chất lƣợng tốt trong một thời gian ngắn, tỷ lệ sống sót của cây con ngoài vƣờn
ƣơm cao do cây con phát triển từ phơi vơ tính theo con đƣờng tƣơng tự nhƣ
phơi hữu tính. Tuy nhiên các kết quả nghiên cứu gần đây về phát sinh phôi
soma ở sâm Ngọc Linh vẫn cịn nhiều hạn chế ở hiệu quả hình thành các vi củ
(micro - rhizome) từ phôi, đây là giai đoạn quan trọng để tăng tỷ lệ hình thành
cây giống hồn chỉnh trên một đơn vị nuôi cấy.
Các kết quả nghiên cứu về quá trình sinh lý trong giai đoạn hình thành
và giai đoạn phát triển vi củ (micro - rhizome) sâm Ngọc Linh từ ni cấy
phơi soma cũng có thể ứng dụng trong sản xuất sinh khối sâm trong điều kiện
Plant factory (canh tác trong nhà).


10

Với những cơ sở và lý do trên, đề tài: “Nghiên cứu một số yếu tố ảnh
hƣởng đến sự phát triển vi củ sâm Ngọc Linh (Panax vietnamensis Ha et
Grushv.) từ nuôi cấy phôi soma” cần đƣợc tiến hành nghiên cứu.
2. Mục đích của đề tài
Nghiên cứu tìm ra loại và nồng độ chất hữu cơ cũng nhƣ điều kiện ni
cấy in vitro thích hợp cho giai đoạn hình thành vi củ sâm Ngọc Linh từ nuôi
cấy phôi soma.
3. Cơ sở khoa học và tính thực tiễn của đề tài
3.1 Cơ sở khoa học
Sâm Ngọc Linh là một trong những lồi sâm có hàm lƣợng saponin
khung dammaran cao nhất (khồng 12 - 15%) và lƣợng saponin nhiều nhất so
vói các loài khác cùa chi Panax trên thế giới [2]. Với những đặc điểm đó, sâm
Ngọc Linh khơng chỉ là lồi sâm q mà cịn có rất nhiều nghiên cứu về nhân
giống và công dụng của sâm Ngọc Linh ở Việt Nam và trên thế giới.
Theo nghiên cứu dƣợc lý lâm sàng của sâm Ngọc Linh cho kết quả tốt:
bệnh nhân ăn ngon, ngủ ngon, cải thiện thị lực, hoạt động trí tuệ, thể lực và
sức đề kháng, cải thiện các trƣờng hợp suy nhƣợc thần kinh, nâng cao huyết
áp ở ngƣời bị huyết áp thấp. Hiện nay, với nhu cầu gia tăng từ ngành dƣợc
phẩm thảo dƣợc sâm Ngọc Linh đang đƣợc khai thác quá mức nên lâm vào
tình trạng bị đe dọa tuyệt chủng cao.
Nhân giống sâm Ngọc Linh hiện cịn gặp nhiều khó khăn. Nhân giống
hữu tính theo cách thơng thƣờng (gieo hạt) thì khơng cho kết quả cao vì hạt
khi gieo nằm trong đất sau một thời gian dài mới nảy mầm, vì vậy hạt thƣờng
bị các lồi động vật, cơn trùng gặm nhấm ăn…, ngồi ra tỷ lệ nảy mầm từ hạt
rất thấp (chỉ đạt khoảng 30 - 40%) [3]. Do đó việc ni cấy tạo cây con in
vitro góp phần tăng sức sống của cây, nâng cao tỷ lệ sống sót của cây khi đƣa
ra vƣờn ƣơm là một trong những bƣớc đi mới, góp phần bảo tồn và phát triển
loài dƣợc liệu quý này.
3.2 Tính thực tiễn

Xác định đƣợc loại và nồng độ chất hữu cơ cũng nhƣ điều kiện nuôi


11

cấy in vitro thích hợp cho giai đoạn hình thành vi củ sâm Ngọc Linh từ nuôi
cấy phôi soma là một trong những nhu cầu quan trọng nhằm cung cấp nguồn
giống cho việc trồng và phát triển loài sâm này ở quy mơ lớn, góp phần lƣu
giữ nguồn gen q, thay thế nguồn giống tự nhiên đang dần bị cạn kiệt do
khai thác quá mức.
4. Đối tƣợng và phạm vi nghiên cứu của đề tài
4.1 Đối tƣợng nghiên cứu
Đối tƣợng đƣợc thực hiện trong nghiên cứu này là phôi soma sâm Ngọc
Linh nuối cấy in vitro trong môi trƣờng SH (Schenk and Hildebrandt, 1972)
tại Phịng Cơng nghệ Tế bào Thực vật, Viện Sinh học Nhiệt đới Tp.HCM.
4.2 Phạm vi nghiên cứu của đề tài
Đề tài áp dụng phƣơng pháp nuôi cấy mô trên phôi soma Sâm Ngọc
Linh trong các loại và nồng độ chất hữu cơ cũng nhƣ điều kiện ni cấy in
vitro khác nhau trong q trình phát sinh hình thái.


12

CHƢƠNG 1. TỔNG QUAN ĐỀ TÀI
1.1

SƠ LƢỢC VỀ CHI PANAX

1.1.1 Phân bố các loài thuộc chi Panax
Chi nhân sâm (danh pháp khoa học: Panax) là một chi chứa khoảng 14

loài cây có củ phát triển rất chậm thuộc họ nhân sâm (Bảng 1.1).
Bảng 1.1: Các loài thuộc chi Panax trên thế giới [2]
Tên thông thƣờng

Nguồn gốc

Sâm Hàn Quốc

Hàn Quốc

Sâm Bắc Mỹ

Bắc Mỹ

Panax trifolius L.

Sâm lùn

Bắc Mỹ

Panax notoginseng
F.H.Chen ex C.Y.Wu
et K.M. Feng

Tam thất

Trung Quốc

Panax pseudo-ginseng
Wall. Subsp. Pseudogingseng Hara

Giả nhân sâm

Nhật Bản

Panax japonicas
C.A.Meyer

Nhân sâm Nhật bản

Nhật Bản

Panax japonicas
C.A.Meyer. var.
Angustifolius (Burk.)
Chen et Chu

Nhân sâm Nhật bản

Trung Quốc

Tên khoa học
Panax ginseng
C.A.Meyer
Panax quinquefolius
L.