(Luận án tiến sĩ) Nghiên cứu khả năng phân hủy hydrocarbon dầu mỏ của một số chủng vi khuẩn tía quang hợp tạo màng sinh học phân lập tại Việt Nam

i

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC
VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM

HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ
-----------------------------

NGUYỄN THỊ MINH NGUYỆT

NGHIÊN CỨU KHẢ NĂNG PHÂN HỦY HYDROCARBON
DẦU MỎ CỦA MỘT SỐ CHỦNG VI KHUẨN TÍA QUANG HỢP TẠO
MÀNG SINH HỌC PHÂN LẬP TẠI VIỆT NAM

LUẬN ÁN TIẾN SĨ SINH HỌC

HÀ NỘI – 2022


ii

VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM
HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ
……..….***…………

NGUYỄN THỊ MINH NGUYỆT

NGHIÊN CỨU KHẢ NĂNG PHÂN HỦY HYDROCARBON
DẦU MỎ CỦA MỘT SỐ CHỦNG VI KHUẨN TÍA QUANG HỢP TẠO

MÀNG SINH HỌC PHÂN LẬP TẠI VIỆT NAM

LUẬN ÁN TIẾN SĨ SINH HỌC
Chuyên ngành: Vi sinh vật học
Mã số: 9 42 01 07

Người hướng dẫn khoa học:
1. TS. Lê Thị Nhi Công
2. PGS.TS. Đồng Văn Quyền

Hà Nội – 2022


iii

LỜI CẢM ƠN
Để hoàn thành luận án này, trước tiên tôi xin gửi lời cảm ơn sâu sắc tới TS.
Lê Thị Nhi Cơng - Trưởng phịng Cơng nghệ sinh học mơi trường và PGS.TS.
Đồng Văn Quyền, Phó Viện trưởng Viện Công nghệ sinh học, Viện Hàn lâm Khoa
học và Công nghệ Việt Nam đã trực tiếp hướng dẫn, truyền đạt những kiến thức và
những kinh nghiệm qúy báu trong suốt q trình học tập và thực hiện đề tài nghiên
cứu.
Tơi xin chân thành cảm ơn TS. Đỗ Thị Liên và tồn thể các anh, chị cán bộ
nhân viên phịng CNSH môi trường Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt
Nam đã tận tình hướng dẫn, giúp đỡ, chỉ bảo và đóng góp những lời khun bổ ích
trong suốt q trình học tập nghiên cứu để tơi có thể hồn thành luận án.
Tơi xin bày tỏ lịng cảm ơn chân thành đến Ban lãnh đạo Viện Công nghệ
sinh học, Ban lãnh đạo Học viện Khoa học và Công nghệ đã tạo mọi điều kiện cho
tôi được học tập và nghiên cứu trong suốt những năm qua.
Bên cạnh đó, tơi cũng xin chân thành cảm ơn chuyên viên Bùi Thị Hải Hà

phụ trách đào tạo của Viện Công nghệ sinh học và chuyên viên Nguyễn Thị Minh
Tâm phòng Đào tạo, Học viện Khoa học và Công nghệ đã giúp đỡ tôi hồn thành
những thủ tục cần thiết trong suốt q trình nghiên cứu sinh và bảo vệ luận án.
Tôi xin gửi lời cảm ơn đến Quỹ Nghiên cứu cơ bản cấp Nhà nước (Nafosted)
đã cấp kinh phí cho nhóm nghiên cứu.
Trong thời gian qua, tôi đã nhận được sự hỗ trợ nhiệt tình và tạo mọi điều
kiện thuận lợi từ trường ĐH Sư phạm Hà Nội 2 nơi tôi đang công tác, cùng với sự
giúp đỡ nhiệt tình cũng như những đóng góp quý báu của các bạn bè đồng nghiệp.
Nhân dịp này tôi xin chân thành cảm ơn sự giúp đỡ q báu đó.
Cuối cùng, tơi xin gửi lời cảm ơn sâu sắc đến những người thân trong gia
đình, những người bạn thân thiết đã luôn bên cạnh động viên và khích lệ tơi trong
suốt q trình học tập và nghiên cứu.
Một lần nữa tôi xin chân thành cảm ơn!
Tác giả luận án

Nguyễn Thị Minh Nguyệt


iv

LỜI CAM ĐOAN
Tơi xin cam đoan:
Đây là cơng trình nghiên cứu của tôi và một số kết quả cùng cộng tác với các
cộng sự khác;
Các số liệu và kết quả trình bày trong luận án là trung thực, một phần đã
được cơng bố trên các tạp chí khoa học chun ngành với sự đồng ý và cho phép
của các đồng tác giả;
Phần cịn lại chưa được ai cơng bố trong bất kỳ cơng trình nào khác.
Tơi xin cam đoan mọi sự giúp đỡ đã được cảm ơn, các tài liệu trích dẫn đã
được chỉ rõ nguồn gốc.

Hà Nội, ngày

tháng

năm 2022

Tác giả luận án

Nguyễn Thị Minh Nguyệt


v

MỤC LỤC
MỞ ĐẦU

1

CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU

3

Một số đặc điểm sinh học cơ bản của vi khuẩn tía quang hợp .

3

1.1.1. Giới thiệu chung về vi khuẩn tía quang hợp ...................................

3

1.2.2. Sinh thái học của vi khuẩn tía quang hợp .......................................

3

1.2.3. Đa dạng vi khuẩn tía quang hợp .....................................................

4

1.2.4. Đặc điểm của bộ máy quang hợp ....................................................

9

1.2.5. Dinh dưỡng carbon..........................................................................

12

1.1.

1.2.

Ứng dụng của vi khuẩn tía quang hợp để phân hủy
hydrocarbon dầu mỏ .....................................................................

13

1.2.1. Tính độc của hydrocarbon dầu mỏ ..................................................

13

1.2.2. Các phương pháp xử lý ô nhiễm dầu mỏ .........................................

18

1.2.3. Ứng dụng của vi khuẩn tía quang hợp để phân hủy hydrocarbon
dầu mỏ .............................................................................................
1.3.

22

Vi sinh vật có khả năng phân hủy hydrocarbon dầu mỏ và tạo
màng sinh học.................................................................................

24

CHƯƠNG 2. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU .........

30

2.1.

Vật liệu nghiên cứu ........................................................................

30

2.1.1. Ngun liệu ......................................................................................

30

2.1.2. Hóa chất, mơi trường ni cấy ........................................................

31

2.1.3. Các thiết bị máy móc .......................................................................

32

Phương pháp nghiên cứu ..............................................................

33

2.2.1. Các phương pháp phân tích vi sinh vật ...........................................

34

2.2.2. Các phương pháp sinh học phân tử.................................................

42

2.2.3. Nhóm phương pháp phân tích hóa học ...........................................

43

2.2.4. Xử lý thống kê ..................................................................................

43

CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ...........................................

44

2.2.


vi

3.1.

Kết quả phân lập và tuyển chọn các chủng VKTQH khả năng
tạo màng sinh học và phân hủy hydrocarbon dầu mỏ ...............

44

3.1.1. Kết quả phân lập các chủng VKTQH từ các mẫu nước và bùn ô
nhiễm dầu ........................................................................................

44

3.1.2. Tuyển chọn các chủng VKTQH khả năng tạo màng sinh học và
phân hủy hydrocarbon dầu mỏ ........................................................
3.2.

48

Các đặc điểm sinh học và định danh ba chủng DQ41, DD4 và
FO2 ..................................................................................................

56

3.2.1.

Các đặc điểm hình thái ...................................................................

56

3.2.2.

Trình tự 16S rRNA và định danh ba chủng DQ41, DD4 và FO2 ..

58

3.2.3. Các đặc điểm sinh học .....................................................................

59

3.3.

Ảnh hưởng của một số điều kiện môi trường đến sự hình
thành màng sinh học của 3 chủng VKTQH ................................

63

3.3.1. Ảnh hưởng của nhiệt độ...................................................................

63

3.3.2. Ảnh hưởng của pH ...........................................................................

64

3.3.3. Ảnh hưởng của nồng độ muối (NaCl) .............................................

65

3.4.

Hiệu suất phân hủy một số hydrocarbon dầu mỏ của màng
sinh học từ 3 chủng VKTQH ........................................................

66

3.4.1. Hiệu suất phân hủy một số hydrocarbon thơm bởi màng sinh học
đơn chủng không gắn giá thể của các chủng VKTQH được lựa
chọn .................................................................................................

66

3.4.2. Phân hủy hydrocarbon dầu mỏ bởi màng sinh học từ các VKTQH
lựa chọn ...........................................................................................

69

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ .................................................................... 97
DANH MỤC CÁC CÔNG TRÌNH ĐÃ CÔNG BỐ CÓ LIÊN QUAN
ĐẾN LUẬN ÁN ........................................................................................... 98
TÀI LIỆU THAM KHẢO .......................................................................... 99


vii

DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT

Chữ viết tắt
Tiếng Anh
BA
Benzoic acid
Bchl
Bacteriochlorophyl
BLAST
Basic local alignment search
tool
BOD
Biochemical oxygen demand
BTNMT
CB
Cinder bead
CF
Coconut fiber
CFU
Colony Forming Unit
COD
Chemical oxygen demand
DAD
Diode array detector
DNA
Deoxyribonucleic acid
DSMZ
Deutch
samplung
microorganism zentrum
GCMS
Gas chromatography – Mass

spectrometry
HPLC
High performance – Liquid
chromatography
MSH
OD
Optical density
PAH
Polycyclic
aromatic
hydrocarbon
PCR
Polymerase chain reaction
PUF
Polyurethare foam
QCVN
rARN
Ribosomal ribonucleic acid
RNA
Ribonucleic acid
TCVN
VK
VKTQH
PNSB
Purple
non-sulfur
photosynthetic bacteria
PSB
Purple sulfur photosynthetic
bacteria

VSV

Tiếng Việt
Axit benzoic
Cơng cụ tìm kiếm các trình tự
tương đồng
Nhu cầu oxy sinh hóa
Bộ tài ngun mơi trường
Sỏi nhẹ
Xơ dừa
Đơn vị hình thành khuẩn lạc
Nhu cầu oxy hố học
Detectơ dãy diode
Axit đeoxyribônuclêic
Trung tâm lưu trữ giống vi sinh
vật – Đức
Sắc kí khối phổ
Sắc kí lỏng cao áp
Màng sinh học
Mật độ quang
Hydrocacbon thơm đa vòng
Chuỗi phản ứng trùng hợp
Mút xốp
Quy chuẩn Việt Nam
Axit ribônuclêic ribôxôm
Axit ribônuclêic
Tiêu chuẩn Việt Nam
Vi khuẩn
Vi khuẩn tía quang hợp
Vi khuẩn tía quang hợp khơng lưu

huỳnh
Vi khuẩn tía quang hợp lưu huỳnh
Vi sinh vật


viii

DANH MỤC BẢNG

Bảng 1.1.

Các chi vi khuẩn tía quang hợp ..................................................

6

Bảng 1.2.

Những ảnh hưởng đến sức khỏe con người và động vật ............

17

Bảng 1.3.

Các chi vi khuẩn có khả năng phân huỷ hiếu khí hydrocarbon 24
thơm ............................................................................................

Bảng 1.4.

Các chi vi khuẩn có khả năng phân huỷ hiếu khí hydrocarbon 24
no ................................................................................................

Bảng 1.5.

Các nhóm vi khuẩn có khả năng phân huỷ kỵ khí hydrocarbon

25

Bảng 2.1.

Các loại giá thể ...........................................................................

31

Bảng 3.1.

Kết quả phân lập các chủng VKTQH từ mẫu các mẫu nước và
bùn ô nhiễm dầu ..........................................................................

Bảng 3.2.

Khả năng sinh trưởng và phát triển của các chủng VKTQH đã
phân lập được (theo ∆OD800) ......................................................

Bảng 3.3.

67

Sự phân hủy thành phần (%) của 20 (g) dầu thô sau 14 ngày
nuôi cấy .......................................................................................

Bảng 3.7.

62

Khả năng phân hủy một số hydrocarbon thơm của màng sinh
học do 3 chủng VKTQH tạo thành sau 14 ngày nuôi cấy. .........

Bảng 3.6.

56

So sánh mức độ sử dụng một số nguồn C của ba chủng DQ41,
DD4 và FO2 với đại diện của loài Rhodopseudomonas .............

Bảng 3.5.

48

Khả năng sinh trưởng và phát triển trên các nguồn cơ chất của
VKTQH ......................................................................................

Bảng 3.4.

45

90

Sự phân hủy hydrocacbon no (%) của dầu thô sau 14 ngày
nuôi cấy bởi MSH đơn chủng và đa chủng VKTQH không giá
thể................................................................................................

93


ix

DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ
Hình 1.1.

Hình ảnh chụp dưới kính hiển vi huỳnh quang của VKTQH ... 5

Hình 1.2.

Sơ đồ vị trí các thành phần của bộ máy quang hợp sơ cấp ở
VKTQH .................................................................................... 10

Hình 1.3.

Quang hợp ở vi khuẩn tía khơng lưu huỳnh ............................. 11

Hình 2.1.

Hình ảnh các loại giá thể .......................................................... 31

Hình 2.2.

Sơ đồ các bước thí nghiệm thực hiện trong luận án ................. 33

Hình 2.3.

Sơ đồ xử lý sơ bộ các loại giá thể ............................................. 39

Hình 2.4.

Chi tiết mơ hình xử lý hydrocarbon dầu mỏ ............................. 40

Hình 2.5.

Các giai đoạn trong mơ hình xử lý hydrocarbon dầu mỏ ......... 41

Hình 3.1.

Mẫu bùn ơ nhiễm dầu trước và sau làm giàu ............................... 44

Hình 3.2.

Một số khuẩn lạc VKTQH được phân lập từ mẫu làm giàu ..... 45

Hình 3.3.

Khả năng tạo MSH dựa trên khả năng bắt giữ tím tinh thể của
MSH do các chủng VKTQH tạo thành ..................................... 50

Hình 3.4.

Khả năng tạo màng sinh học của các chủng VKTQH phân
hủy hydrocarbon dầu mỏ và Acinetobacter calcoaceticus P23

Hình 3.5.

50

Khả năng sinh trưởng của 10 chủng VKTQH sau 7 ngày nuôi
cấy ở các nồng độ dầu diesel khác nhau ................................... 51

Hình 3.6.

Dịch ni cấy của 10 chủng VKTQH ở 10% dầu diesel sau 7
ngày ni cấy ............................................................................ 51

Hình 3.7.

Khả năng sinh trưởng của 10 chủng VKTQH ở các nồng độ
toluene khác nhau sau 7 ngày nuôi cấy .................................... 52

Hình 3.8.

Dịch ni cấy của 10 chủng VKTQH ở 250 ppm toluene sau
7 ngày ni cấy ......................................................................... 52

Hình 3.9.

Khả năng sinh trưởng của 10 chủng VKTQH sau 7 ngày nuôi
cấy ở các nồng độ phenol khác nhau ........................................ 53

Hình 3.10. Dịch nuôi cấy của 10 chủng VKTQH ở 150 ppm phenol sau 7
ngày ........................................................................................... 53
Hình 3.11. Khả năng sinh trưởng của 10 chủng VKTQH ở các nồng độ
naphthalene khác nhau sau 7 ngày ni cấy ............................. 54
Hình 3.12. Dịch ni cấy của 10 chủng VKTQH ở nồng độ 200 ppm

x

naphthalene sau 7 ngày ni cấy .............................................. 54
Hình 3.13. Khả năng sinh trưởng của các chủng VKTQH ở các nồng độ
pyrene khác nhau sau 7 ngày ni cấy ..................................... 55
Hình 3.14. Dịch nuôi cấy của 10 chủng VKTQH ở nồng độ 200 ppm
pyrene sau 7 ngày ni cấy ....................................................... 55
Hình 3.15. Hình dạng khuẩn lạc và hình dạng tế bào dưới kính hiển vi
điện tử của chủng DD4, DQ41, FO2 ........................................ 57
Hình 3.16. Cây phát sinh chủng loại của 3 chủng DD4, DQ41, FO2 ........ 58
Hình 3.17. Phổ hấp phụ dịch huyền phù tế bào của 3 chủng DD4 (A),
DQ41 (B), FO2 (C) ................................................................... 60
Hình 3.18. Khả năng tạo sắc tố quang hợp của VKTQH ở hai điều kiện
(A) kỵ khí, sáng và (B) hiếu khí, tối. ........................................ 61
Hình 3.19. Ảnh hưởng của nhiệt độ đến khả năng hình thành màng sinh
học của các chủng VKTQH ..................................................... 64
Hình 3.20. Ảnh hưởng của pH tới khả năng hình thành màng sinh học
của các chủng VKTQH ............................................................ 64
Hình 3.21. Ảnh hưởng của nồng độ NaCl tới khả năng hình thành màng
sinh học của các chủng VKTQH .............................................. 66
Hình 3.22. Thí nghiệm đánh giá sự đối kháng lẫn nhau của các chủng
VKTQH lựa chọn...................................................................... 70
Hình 3.23. Mật độ tế bào của chủng DD4, DQ41 và FO2 trong màng
sinh học VKTQH sau 9 ngày ni cấy ..................................... 71
Hình 3.24. Hình ảnh hiển vi điện tử quét (SEM) của các giá thể trước và
sau khi VKTQH bám dính ........................................................ 72
Hình 3.25. Thời gian phân hủy dầu diesel và mật độ tế bào của chủng
VKTQH trong màng sinh học đơn hoặc đa chủng khơng giá

thể.............................................................................................. 74
Hình 3.26. Khả năng phân hủy dầu diesel và mật độ tế bào của chủng
VKTQH DD4, DQ41 và FO2 trong MSH đa chủng trên giá
thể.............................................................................................. 75
Hình 3.27. Hiệu suất phân hủy thành phần n-alkane (từ C8 đến C16) có
trong dầu diesel bởi màng sinh học đa chủng VKTQH trên


xi

các giá thể khác nhau ................................................................ 76
Hình 3.28. Hiệu suất phân hủy PAH bởi các loại màng sinh học khác
nhau ........................................................................................... 81
Hình 3.29. Sắc ký đồ phân tích thành phần dầu thơ cịn lại sau 14 ngày
trong thí nghiệm phân huỷ dầu bằng MSH đơn chủng
VKTQH .................................................................................... 86
Hình 3.30. Sắc ký đồ phân tích thành phần dầu thơ cịn lại sau 14 ngày
trong thí nghiệm phân huỷ dầu bằng MSH đa chủng VKTQH
khơng gắn trên giá thể............................................................... 87
Hình 3.31. Sắc ký đồ phân tích thành phần dầu thơ cịn lại sau 14 ngày
trong thí nghiệm phân huỷ dầu bằng MSH đa chủng VKTQH
trên giá thể (sỏi nhẹ, xơ dừa, mút xốp) ..................................... 88
Hình 3.32. Sắc ký đồ phân tích thành phần dầu thơ cịn lại sau 14 ngày
trong thí nghiệm khả năng hấp phụ dầu thô của giá thể (sỏi
nhẹ, xơ dừa, mút xốp) ............................................................... 89
Hình 3.33. Hiệu suất phân huỷ hydrocarbon no (%) của dầu thô sau 14
ngày nuôi cấy bởi màng sinh học đơn chủng và đa chủng
VKTQH khơng giá thể.............................................................. 91
Hình 3.34. Hiệu suất phân huỷ hydrocarbon no (%) của dầu thô sau 14
ngày nuôi cấy bởi màng sinh học đa chủng VKTQH trên giá

thể.............................................................................................. 92


1

MỞ ĐẦU
Dầu mỏ đã được sử dụng từ thời cổ đại và ngày càng trở nên quan trọng
trong xã hội, đặc biệt là kinh tế, chính trị và cơng nghệ. Bên cạnh những lợi ích
kinh tế, dầu mỏ và các sản phẩm của dầu cũng là một trong những nguồn ô
nhiễm môi trường nghiêm trọng, được thải ra từ quá trình khai thác, sử dụng và
chế biến dầu. Dầu mỏ có chứa nhiều hợp chất độc hại khó phân hủy trong tự
nhiên, gây độc và có thể gây những hệ lụy nghiêm trọng cho môi trường sinh
thái. Đặc biệt, các hợp chất thơm như: benzene, toluene, naphthalene, pyrene,
phenol... có độ hòa tan trong nước khá cao, độc hại đối với nhiều lồi sinh vật.
Xử lý ơ nhiễm dầu mỏ có thể được tiến hành theo phương pháp cơ học
(vật lý), hóa học và sinh học. Trong đó, các phương pháp vật lý và hóa học
thường được sử dụng để xử lý ô nhiễm hydrocarbon dầu mỏ ở nồng độ cao, có
chi phí lớn. Biện pháp sinh học sử dụng các vi sinh vật (VSV) phân hủy
hydrocarbon dầu mỏ là biện pháp hiệu quả trong xử lý ô nhiễm hydrocarbon
dầu mỏ ở nồng độ thấp, nằm ngoài khả năng của xử lý cơ học/hố học. Ứng
dụng VSV có khả năng phân hủy hydrocarbon dầu mỏ đồng thời tạo màng sinh
học sẽ tăng hiệu quả xử lý sinh học.
Vi khuẩn tía quang hợp (VKTQH) là các vi khuẩn quang hợp kỵ khí,
được cơng bố là có khả năng trao đổi chất linh hoạt, sử dụng nhiều loại cơ chất,
trong đó có hydrocarbon. Một số VKTQH có khả năng tạo màng sinh học có
thể đóng vai trị quan trọng trong việc phân hủy và chuyển hóa các hợp chất
hydrocarbon trong dầu mỏ. VKTQH phân bố rộng rãi trong tự nhiên, do vậy có
tiềm năng ứng dụng cao trong xử lý ô nhiễm hydrocarbon dầu mỏ tại chỗ (in
situ) và bên ngoài (ex situ).
Luận án “Nghiên cứu khả năng phân hủy hydrocarbon dầu mỏ của

một số chủng vi khuẩn tía quang hợp tạo màng sinh học phân lập tại Việt
Nam” được thực hiện với mục tiêu và nội dung nghiên cứu như sau:
Mục tiêu nghiên cứu của luận án
- Tuyển chọn được một số chủng VKTQH từ các vùng biển ô nhiễm dầu
ở Việt Nam, vừa có khả năng tạo tạo màng sinh học vừa có khả năng phân hủy
hydrocarbon dầu mỏ hiệu suất cao.