Tài liệu TIỂU LUẬN:CHẨN ĐOÁN VIRUS CÚM GIA CẦM BẰNG KỸ THUẬT NUÔI CẤY PHÔI TRỨNG ppt

Chẩn đoán virus cúm gia cầm bằng kỹ thuật nuôi cấy phôi trứng
- 1 -
BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH
BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC









Seminar
: Chẩn đoán bệnh

CHẨN ĐOÁN VIRUS CÚM GIA CẦM BẰNG KỸ
THUẬT NUÔI CẤY PHÔI TRỨNG.







Giảng viên hướng dẫn: Sinh viên thực hiện:
PGS.TS. Nguyễn Ngọc Hải Hồ Bảo Quốc
06126117
DH06SH

Thành phố Hồ Chí Minh
Tháng 1

Chẩn đoán virus cúm gia cầm bằng kỹ thuật nuôi cấy phôi trứng
- 2 -

A. Đặt vấn đề
Virus cúm và đại dịch cúm gia cầm gây thiệt hại rất lớn về kinh tế của mọi quốc gia
trên thế giới và chúng là một thách thức lớn cho ngành y tế trong những năm qua. Việt
Nam là một trong những quốc gia chịu ảnh hưởng nhiều nhất của đại dịch này. Mặc
dù chúng ta đã có nhiều biện pháp và nỗ lực trong việc phòng chống nhưng vẫn chưa
mang lại hi
ệu quả như mong muốn. Trong công tác phòng chống việc chẩn đoán để
xác định chính xác virus gây bệnh là một khâu hết sức quan trọng. Một trong những
kỹ thuật chẩn đoán virus cúm gia cầm có độ chính xác cao đó là kỷ thuật nuôi cấy
phôi trứng.

Chẩn đoán virus cúm gia cầm bằng kỹ thuật nuôi cấy phôi trứng
- 3 -
B. Tổng quan
I. Thông tin chung về cúm gia cầm
1. Cúm gia cầm là gì ?
Cúm gia cầm, còn được gọi là cúm gà, là
bệnh truyền nhiễm trên động vật, chủ yếu là
loài chim, đôi khi cũng thấy trên lợn do vi-
rút cúm gia cầm týp A gây ra. Chủng vi-rút
cúm này có độc tính cao, đôi khi vượt qua
hàng rào bảo vệ lây nhiễm cho con người.
Dựa trên kháng nguyên, người ta chia cúm
gia cầm thành 16 phân nhóm H
(Haemagglutinin: H1-H16) và 9 phân nhóm N (Neuraminidase: N1-N9), trong đó
phân nhóm H5 và H7 có độc tính cao. Hiện nay chỉ có 2 vi-rút H
1
N
1
và H

3
N
2
đang lưu
hành và gây bệnh ở người.
Chẩn đoán virus cúm gia cầm bằng kỹ thuật nuôi cấy phôi trứng
- 4 -

Vi-rút cúm gây dịch cúm gia cầm hiện nay là H5N1 và được chia làm 2 nhóm:
- Vi-rút cúm gia cầm có độc tính thấp (Low pathogenic avian virus: LPAV): thường
lưu hành trong loài chim hoang dã, không gây bệnh hay gây bệnh nhẹ: xù lông, giảm
sản lượng trứng và thường không được phát hiện.
- Vi-rút cúm gia cầm có độc tính cao (Highly pathogenic avian virus: HPAV): rất
nguy hiểm. Chúng lan truyền rất nhanh trong đàn gia cầm, gây bệnh nặng ảnh hưởng
đến nhiều cơ quan và cuối cùng gây tử vong gần 100% trong vòng 48 giờ kể từ khi
nhiễm bệnh.
Bệnh lý
LPAI ( low pathogenic avian influenza virus )
Những thương t
ổn thay đổi với giống, loài virus và tuổi của kí chủ. Thông thường,
chỉ những gà tây và những con gà biểu lộ một vài sự thay đổi đặc biệt lớn và cực kỳ
nhỏ với những giống đã thích nghi với ký chủ ( Capua và Mutinelli 2001). Trong gà
tây, bệnh viêm xoang, viêm khí quản và airsacculitis đã được phát hiện, mặc dầu sự
tiêm nhiễm vi khuẩn sơ cấp có thể góp phần không có hại gì.Tuỵ của gà tây đã được
mô tả. v
ới những con gà bình thường, sự bọc nhẹ của đường hô hấp thì thường được
thấy. Thêm vào, những tổn thương tập trung trên những cơ quan sinh sản của những
con gà đẻ trứng ( buồng trứng, vòi trứng, viêm màng noãn hoàn.)
HPAI (hightly pathogenic avian influentza viruses )
Những thay đổi lớn về bệnh lý và mô bệnh học của HPAI bộc lộ sự phụ thuộc

giống nhau để ghi vào danh sách cho sự hiện diện của triệu chứng lâm sàn. Bố
n loại
thay đổi của tác nhân gây bệnh đã được thăm dò nguyên lí cơ bản ( Perkins and
Swayne 2003):
(i) Có lẽ (chết trong khoảng thời gian 24- 36 hours tiêm nhiễm, phần lơn trông
thấy trong loài galliforme) và dạng cấp tính của bệnh biểu lộ những thay đổi bệnh
tích không đặc thù: một sự hydropericardium rời rạc, sung huyết nhẹ trong ruột và
Chẩn đoán virus cúm gia cầm bằng kỹ thuật nuôi cấy phôi trứng
- 5 -
thỉnh thoảng có những đóm xuất huyết trên màng treo và màng ngoài của màng ói
được mô tả không nhất quán ( Mutinelly 2003a, Jones and Swayne 2004). Những
con gà đã bị tác động bởi dòng H
5
N
1
châu Á đôi lúc biểu hiện xuất huyết từng
mảng và tổng lượng chất nhầy đáng kể trong khí quản ( Elbers 2004). Tiết dịch rỉ
huyết thanh trong các khoang cơ thể và phù nề ở phổi có thể được trông thấy
không có hại gì. Những đóm chảy máu trong màng nhầy của dạ dày tuyến, nó
thường được mô tả trong phần chính của sách trong phần trước, chỉ có sự khác biệt
được gặp trong gia cầm đã nhi
ễm với dòng H
5
N
1
châu Á (Elbers 2004). Những tổn
thương mô học khác nhau gắn với kháng nguyên của virus có thể được phát hiện ở
các mô khác nhau ( Mo 1997). Virus được trông thấy đầu tiên trong màng trong
của những tế bào. Vào một giai đoạn sau đó những tế bào bị nhiễm virus được phát
hiện trong cơ tim, tuyến thượng thận và tuỵ tạng. Những tế bàp thần kinh cũng như

tế bào thần kinh đệm của bộ não cũng bị nhiễm.Về bệ
nh lý, một tiến trình tương tự
virus màng trong khác có thể được thừa nhận nơi màng trong và sự hoạt hoá của
bạch cầu chỉ dẫn đến một hệ thống và sự phân bào rời rạc phóng thích khả năng dễ
mắc bệnh đến tim phổi hoặc nhiều cơ quan hoạt động kém (Feldmann 2000, Klenk
2005).
(ii) Ở động vật hữu nhũ chúng thể hiện một sự tấn công kéo dài của nhữ
ng triệu
chứng bệnh và một tiến trình kéo dài của bệnh, triệu chứng thần kinh và mô học,
những tổn thương bộ não gây mưng mủ trội hơn hẳn sự hình dung (Perkins and
Swayne 2002a, Kwon 2005). Tuy nhiên, virus cũng có thể được phân lập từ những
cơ quan khác. Quá trình được mô tả trong ngỗng, vịt, đà diểu và những loài khác
tiêm thí nghiệm với dòng HPAI H
5
N
1
châu Á. Trong những chim cho trứng, chứng
viêm của buồng trứng, vòi trứng, và sau đó nang bị vỡ, cái gọi là viêm phúc mạc
lòng đỏ trứng, có thể được trông thấy.
Chẩn đoán virus cúm gia cầm bằng kỹ thuật nuôi cấy phôi trứng
- 6 -
(iii) Ở vịt, mồng biển, chim sẻ, chỉ sự tái bản của virus được tìm thấy. Những
loài chim này đã thể hiện viêm phổi nhẹ, viêm khí quản và thỉnh thoảng tế bào
bạch cầu và viêm mô cơ tim ( Perkins and Swayne 2002a, 2003).
(iv) Trong những thí nghiệm được mô tả bởi Perkins và Swayne (2003), chim
bồ câu và chim sáo biển chứng tỏ khả năng kháng lại sự tiêm nhiễm của virus
H
5
N
1

. Tuy nhiên, Werner và cộng sự ( công bố) đã có khả năng gây ra bệnh thần
kinh, sự thừa hưởng đến viêm não không làm mưng mủ (KlopBesch 2006), trong
5/16 chim bồ câu dùng một chủng H
5
N
1
HPAI phân lập cách đay không lâu.

2. Vi-rút cúm khuyếch tán và lây truyền như thế nào?
Loài thủy cầm là nguồn của tất cả các loại vi-rút cúm trong tự nhiên qua hàng thế kỷ,
kể cả týp H5 và H7 nhưng thường có độc tính thấp. Tuy nhiên chính các chủng độc
tính thấp H5 và H7 này khi truyền cho gia cầm, chúng biến đổi, đột biến gen để trở
thành chủng độc tính cao gây nên dịch.
Trong thời gian gần đây, người ta ghi nhận một số loài chim di trú có khả năng
khuyếch tán vi-rút H5N1
độc tính cao này.
3. Hiện nay dịch cúm gia cầm xảy ra như thế nào?
- Dịch cúm gia cầm bắt đầu xảy ra
vào giữa năm 2003 tại Đông Nam Á,
là dịch cúm gia cầm lớn nhất và
nghiêm trọng nhất trong lịch sử loài
người, làm chết hàng loạt các loài
chim. Tác nhân gây bệnh là vi-rút
H5N1 tồn tại dai dẳng, đã giết chết
hay khiến con người tiêu hủy ước tính
khoản 150 triệu con chim và gia cầm.
Chẩn đoán virus cúm gia cầm bằng kỹ thuật nuôi cấy phôi trứng
- 7 -
Hiện nay vi-rút này được xem là tác nhân gây dịch tại Indonesia, Việt Nam, một số
tỉnh Cambodia, Trung Quốc, Thái Lan và Cộng Hoà Nhân Dân Lào. Ngoài ra từ giữa

tháng 12/2003 – đầu tháng 2/2004, cúm gia cầm do H5N1 được báo cáo ở 8 quốc gia
Châu Á: Hàn Quốc, Việt Nam, Nhật Bản, Thái Lan, Cambodia, Cộng Hoà Nhân Dân
Lào, Indonesia và Trung Quốc. Hầu hết các quốc gia này chưa bao giờ từng xảy ra
dịch cúm gia cầm trong lịch sử của họ.
- Đầu tháng 8/2004: cúm gia cầm do H5N1 lần đầu tiên bùng nổ tại Malaysia, kế đến
là Nga vào cuối tháng 7/2005, một s
ố tỉnh Cộng Hoà Kazakhtan và Mông Cổ vào đầu
8/2005. Vào đầu 9/2005 cúm cũng ghi nhận tại Thổ Nhĩ Kỳ và Romania. Hiện nay
Nhật Bản, Hàn Quốc và Malaysia được đưa ra khỏi danh sách các quốc gia bị dịch.
- Tính đến 24/08/2006 có 59 quốc gia có gia cầm bị nhiễm vi-rút cúm H5N1.
4. Cúm gia cầm ảnh hưởng đến sức khoẻ con người
như thế nào?
(a) Sự lan rộng và tồn tại lâu dài của dịch cúm gia cầm gây ra 2 mối nguy cơ lớn
đối
với sức khoẻ con người:
Chẩn đoán virus cúm gia cầm bằng kỹ thuật nuôi cấy phôi trứng
- 8 -
- Nguy cơ lây nhiễm trực tiếp vi-rút cúm từ gia cầm bị bệnh, gây bệnh rất nặng, trong
đó chủng vi-rút H5N1 gây bệnh nghiêm trọng và có tỉ lệ tử vong cao (>50%), chủ yếu
là bệnh viêm phổi và suy đa cơ quan.
Đa số xảy ra trên những bệnh nhân trước khi mắc bệnh thì hoàn toàn khoẻ mạnh.
- Quan trọng hơn, nguy cơ vi-rút bị đột biến, biến đổi gen nên dễ lây truyền từ gia cầm
sang người, rồi từ
người sang người. Sự biến đổi này là khởi phát đại dịch.
(b) Các trường hợp cúm gia cầm H5N1 xảy ra trên con người:
- 1997: có 18 trường hợp đầu tiên xảy ra ở Hong Kong, gây tử vong 6 trường hợp
(chiếm tỉ lệ 33,33%).
- 2003: có 2 trường hợp xảy ra ở Hong Kong trong 1 gia đình có tiền sử đi du lịch
Trung Quốc gần đây, gây tử vong 1 trường hợp (chiếm tỉ lệ 50 %).
- 2004: tại Thái-lan có 17 ca và tử vong 12 (chiếm tỉ lệ 70,59%), Vi

ệt Nam có 29 ca
và tử vong 20 (chiếm tỉ lệ 68,97 %).
- 2005: có 5 quốc gia có bệnh nhân nhiễm, tổng cộng 95 ca và tử vong 41 (chiếm tỉ lệ
43,16 %)
- Tính đến 23/08/2006: các trường hợp nhiễm vi-rút cúm H5N1 được xác định bằng
xét nghiệm được báo cáo tại 9 quốc gia với 96 ca bị nhiễm và tử vong 64 (chiếm tỉ lệ
66,67 %) trong đó không có Việt Nam.
Tóm lại, dịch cúm A (H5N1) ở người đã ghi nhận tại 10 quốc gia trên thế giới, với
232 trường hợ
p mắc bệnh và có tổng cộng 134 trường hợp tử vong (chiếm 57,9%).
- Riêng tại Việt Nam, từ ngày 14/11/2005 đến nay gần 9 tháng không ghi nhận trường
hợp mắc mới cúm A (H5N1) ở người. Tính từ trường hợp mắc cúm A(H5N1) đầu tiên
tại Việt Nam (26/12/2003) đến nay đã ghi nhận 93 trường hợp mắc tại 32 tỉnh/thành
phố, trong đó có 42 trường hợp tử vong. (xem chi tiết số liệu bảng 1)
(c) Con người bị nhiễm vi-rút cúm H5N1 trong trườ
ng hợp nào?
- Tiếp xúc trực tiếp với gia cầm bị bệnh, tiếp xúc với bề mặt hay vật dụng bị nhiễm
phân của gia cầm bị bệnh.
Chẩn đoán virus cúm gia cầm bằng kỹ thuật nuôi cấy phôi trứng
- 9 -
- Hầu hết các trường hợp xảy ra ở nông thôn, ngoại ô hay nơi có nuôi gia cầm.
- Phân và chất tiết của chim nhiễm bệnh thảy ra môi trường chứa nhiểu vi-rút cúm gây
bệnh xuống môi trường rất lớn.
- Nghiêm trọng hơn cả là người nuôi gia cầm trong vùng dịch tễ thấy gia cầm có triệu
chứng nhiễm bệnh là làm thịt, chế biến rồi dùng hay bán ra thị trường.
Nguồn tiếp xúc có nguy cơ cao là khi con người giết gia cầ
m, nhổ lông và chế biến
trước khi đem nấu chín.
5. Triệu chứng của bệnh cúm gia cầm ở người là gì?
Dựa trên các yếu tố và triệu chứng sau:

(a) Yếu tố dịch tễ:
- Tiếp xúc với gia cầm bị bệnh trong vòng 2 tuần trước đó (nuôi, buôn bán, vận
chuyển, giết mổ, ăn thịt gia cầm bị bệnh, ăn tiết canh v.v ), hoặc sống ở vùng có dịch
cúm gia cầm.
- Tiếp xúc gần với người bệnh đã xác định cúm, hoặc người bệnh tử vong vì viêm
phổi chưa rõ nguyên nhân.
(b) Lâm sàng:
Bệnh diễn biến cấp tính và có thể có các biểu hiện sau đây:
- Có dấu hiệu nhiễm khuẩn: sốt trên 38
o
C, có thể rét run
- Các triệu chứng về hô hấp:
o Ho, thường ho khan, đau ngực, ít gặp triệu chứng viêm long đường hô hấp trên.
o Khó thở, thở nhanh, tím tái,
o Ran nổ, ran ẩm khi nghe phổi
o Có thể dẫn đến suy hô hấp cấp tiến triển (ARDS).
- Triệu chứng tuần hoàn: nhịp tim nhanh, đôi khi có sốc.
- Các triệu chứng khác: đau đầu, đau cơ, tiêu chảy, rối loạn ý thức
- Suy đa tạng.

Chẩn đoán virus cúm gia cầm bằng kỹ thuật nuôi cấy phôi trứng
- 10 -
(c) Cận lâm sàng:
- X quang phổi: Tổn thương thâm nhiễm lan toả một bên hoặc hai bên, tiến triển
nhanh
- Xét nghiệm máu:
o Công thức máu: số lượng bạch cầu: bình thường hoặc giảm.
o Khí máu: giảm oxy máu khi bệnh tiến triển nặng
+ PaO
2

giảm (< 85 mmHg), có thể giảm nhanh (dưới 60 mmHg). Tỷ lệ PaO
2
/FiO
2
dưới 300 khi có tổn thương phổi cấp (ALI), dưới 200 khi có suy hô hấp cấp tiến triển
(ARDS).
- Chẩn đoán vi sinh vật:
o Làm RT-PCR để xác định vi rút cúm A/H5
o Phân lập vi khuẩn theo thường quy
II. Chẩn đoán bệnh trong phòng thí nghiệm
1. Sự thu thập mẫu xét nghiệm
Những mẫu xét nghiệm nên dược thu thập từ một vài xác xúc vật chết còn tươi và từ
những chim bị bệnh của một ßock. Theo lý tưởng, sự lấy mẫu
đầy đủ được nhìn lại
bằng phương pháp thống kê và sự chẩn đoán được làm trên một đế ßock. Khi thu thập
mẫu nghi nhiễm HPAI, tiêu chuẩn an toàn phải được khảo sát để tránh sự phơi bày
của những người sưu tập mẫu đến khả năng của HPAIV (Bridges 2002), Nguyên tắc
chỉ đạo được đề nghị bỡi CDC (CDC 2005).
Khi xét nghiệm virus, những bông thấm thu được từ lỗ huyệt và vùng hầ
u thông
thường cho phép một phòng thí nghiệm điều tra đầy đủ và hoàn chỉnh. Vật liệu thu
thập trên những mẫu bông nên được trộn vào trong 2-3ml mẫu đại diện của một môi
trường vận chuyển đẳng trương vô trùng bao gồm kháng sinh bổ sung và một protein
nguồn (e.g. 0,5%[ w/v] albumin huyết thanh bò, 10% huyết thanh bò hoặc một dung
dịch pha lấy ở giữa não).
Chẩn đoán virus cúm gia cầm bằng kỹ thuật nuôi cấy phôi trứng
- 11 -
Khi mổ xẻ để phân tích, mang ra ngoài dưới những điều kiện an toàn và tránh phát
tán mầm bệnh (xem trọng), những mẫu bệnh phẩm của não, khí quản/phổi, lách và cái
gì đó chứa trong ruột không được bảo quản được thu thập cho việc phân lập virus.

Mục đích của huyết thanh học, những mẫu máu tự nhiên được lấy. Một số mẫu đã
thu thập nên phát hiện bằng một khoảng thời gian tin c
ậy 95% cho một giới hạn với
một sự phổ biến 30% .



2. Sự vận chuyển mẫu xét nghiệm
Những mẫu bông thấm, mô và máu nên được
giữ lạnh khi vận chuyển nhưng không cho phép
đông đá. Nếu những trở ngại gặp phải trên
đường vận chuyển làm thời gian kéo dài hơn
48h, những mẫu xét nghiệm nên được đóng
băng và vận chuyển trên cacbondioxit đậm đặc.
Trong tất cả các trường hợp, những điều chỉnh
an toàn khi vậ
n chuyển (e.g. IATA rules) nên
được khảo sát kỹ để tránh phát tán mẫu bệnh và
sự phơi nhiễm của con người trong suốt quá
trình vận chuyển. Nó là thích hợp cao để tiếp xúc phòng thí nghiệm được bổ nhiệm
Chẩn đoán virus cúm gia cầm bằng kỹ thuật nuôi cấy phôi trứng
- 12 -
cho việc chẩn đoán trước khi gửi những mẫu phân tích đến và, lý tưởng, troen tru
trước khi thu thập chúng.

3. Phát hiện trực tiếp sự tiêm nhiễm của AIV
Cơ bản, đó là hai (parallel) con đường của những phương pháp chẩn đoán chúng
được thử để phân lập và kiểu phụ của virus bằng những phương pháp cơ bản ( xem sổ
tay OIE 2005 ) và phát hiện phân tử và đặc trưng của bộ gen virus.
Thông thường, AI virus đượ

c phân lập bỡi sự tiêm miễn dịch của những miến gạt
ướt hoặc những mô đồng chất của trứng gà có phôi từ 9- 11 ngày tuổi, thường bằng
màng đệm túi niệu ( Woolcock 2001 ). Phụ thuộc dạng tác nhân, những phôi có thể
hoặc không thể chết với 5 ngày khảo sát , và thừơng đó là những thương tổn đặc thù
để được trông thấy trong phôi này hoặc màng túi niệu ( Mutinelli 2003b). Những quả
trứng được tiêm chủng vớ
i HPAIV bao gồm vật liệu thường chết trong vòng 48 giờ.
Sự xuất hiện của một tác nhân ngưng kết có thể được phát hiện trong tấm gạt của túi
niệu. Sự ngưng kết (HA) là một kỹ thuật vô tình yêu cầu ít nhất 10
6.0
mảnh nhỏ trong
mỗi ml. Nếu chỉ tập trung một lượng thấp virus được hiện diện trong chất để tiêm
chủng, tuỳ vào hai sự đi qua được đẩy mạnh trong những trứng được thụ tinh có thể
cần thiết cho một vài giống LPAIV, trong kiểu để sản xuất đủ virus để phát hiện bằng
HA. Trong trường hợp của HPAIV , một sự đi qua thứ hai sử dụng chất
để tiêm chủng
pha loãng có thể thuận lợi cho sự sản xuất tối ưu của sự ngưng kết.
Sự phân lập ngưng kết được mô tả kháng nguyên bằng thử nghiệm ức chế ngưng
kết (HI) sử dụng (mono-) kháng kháng huyết thanh loại phụ 16 H và cho việc kiểm
soát, kháng lại những những type khác nhau của virus trên gia cầm, những type này
cũng thể hiện hoạt động nhưng kết. Loài phụ NA có th
ể được được xác định sau đó
bởi thử nghiệm ức chế neuraminidase, mặc khác yêu cầu laọi phụ huyết thanh dặc biệt
( Aymard 2003 ). Trong trường hợp phân lập những dòng H
5
hoặc H
7
được chạm trán,
bảng liệt kê tác nhân trong động mạch gây bệnh (IVPI) cần thiết cho việc xác định để
Chẩn đoán virus cúm gia cầm bằng kỹ thuật nuôi cấy phôi trứng

- 13 -
phân biệt giữa kiểu LP và HP (Allan 1977 ). Đó được hoàn thành bởi sự tiêm chủng iv
của 10 con gà được 6 tuần tuổi với virus phân lập trong trứng phát triển ( 0,1 ml của 1
trong 10dung dịch pha loãng của dịch túi niệu bao gồm một độ chuẩn lớn hơn 1 trong
16). Những con gà được khảo sát trên một thời kỳ mười ngày có triệu chứng bệnh.
Những kết quả được nhập và bên trong một bảng biểu thị một virus HPAI khi tỷ l
ệ lớn
hơn 1.2 vẫn được sử dụng. Như một sự lựa chọn, một HPAI phân lập được thử sức
khi tối thiểu 7 ngoài 10 ( 75% ) gà được tiêm chủng chết với giai đoạn khảo sát.
Những thủ tục cơ bản được mô tả có thể đưa đến một sự chẩn đoán HPAI trong
khoảng thời gian 5 ngày nhưng có thể đòi hỏi nhiều hơn hai tuầ
n để loại trừ sự có mặt
của AIV. Trong tình huống thêm vào, những công cụ chẩn đoán chất lượng cao ( SPF
eggs, H- and N-subtype specific antisera) và kỹ năng của mỗi người là điều kiện quyết
định trước hết. Ngày nay, không một sự ứng dụng nuôi cấy tế bào nào cho việc phân
lập AIV, sự phân lập AIV có thể đạt được sự nhạy cảm của những trứng mái có phôi (
Seo 2001).
ii) Một sự tiếp cậ
n nhanh chóng, đặc biệt khi loại trừ sự tiêm nhiễm được đòi hỏi, tận
dụng kỷ thuật sinh học phân tử, nó nên theo một kiểu phân tầng: sự hiện diện của
RNA đặc biệt của virus cúm được phát hiện thông qua kỹ thuật RT-PCR kỹ thuật này
nhằm vào những đoạn của gen M, hầu hết những vùng genome bảo tồn cao của những
virus cúm ( Fouchier 2000, Spackman 2002), hoặc những gen mã hoá capsid (Dykaer
2004). Khi một kết quả
dương tính đạt được, RT-PCRs sẽ khuếch đại những đoạn của
gen ngưng kết của loài phụ H
5
và H
7
được chạy để phát hiện sự có mặt của AIVs có

thể khai báo ( Dybkear 2004, Spackman 2002). Khi sự đáp lại dương tính, một chẩn
đoán phân tử của loại tác nhân gây bệnh (LP chống lại HP) có thể thực hiện được sau
khi giải trình tự một đoạn của gen HA trải dài vùng phân tách bỡi enzyme proteoza
nội thích ứng. Hiện tại phân lập với những amino acid phức tạp có tính bazơ được
phân loại như HPAI. PCRs và những kỷ thu
ật DNA khác đang được thiết kế cho việc
phát hiện dòng H
5
N
1
châu Á (Collins 2002, Payoungporn 2004, Ng 2005). Loài phụ
Chẩn đoán virus cúm gia cầm bằng kỹ thuật nuôi cấy phôi trứng
- 14 -
Non-H
5
/ H
7
có thể được nhận diện bởi một RT-PCR hợp với tiêu chuẩn và phân tích
trình tự sau đó của đơn vị dưới HA-2 (Phípp 2004).Đó là những primer cho mỗi loài
phụ NA. Một đặc trưng đầy đủ có thể đạt được trong vòng 3 ngày, đặc biệt khi kỷ
thuật real time PCR được sử dụng (Perdue 2003, Lee and Suarez 2004). Tuy nhiên
những chip DNA được phát triển chúng có thể xúc tiến việc sắp xếp có hiệu quả hơn
các loại virus AI (Li 2001, Kessler 2005). Một s
ự chẩn đoán loại trừ thì có khả năng
thực hiện trong khoảng một ngày làm việc một mình.
Những bất lợi của những phương pháp chẩn đoán phân tử là giá thành để trả cho
việc mua những thiết bị và những thứ có thể dùng, nhưng nếu có sẵn, một vài mẫu có
thể được phân tích với ít người trong thời gian ngắn hơn cực kì so với phân lập virus
trong trứng. Tuy nhiên, không nên giữ bí m
ật rằng mỗi phản ứng PCR hoặc lai phân

tử, ngược với phân lập virus trong những quả trứng, chứa chấp một bản chất không rõ
ràng liên quan đến sự hiện diện của những thay đổi đặc biệt trong việc phân lập tại
những vị trí liên kết của những primer và/hoặc những probe chúng có thể đưa đến thử
nghiệm âm tính giả.
Do đó, một sự kết hợp c
ủa sinh học phân tử ( e.g. kết quả sàng lọc) và những
phương pháp phân loại (e.g. đặc trưng không thay đổi của phân lập và xác nhận của
phương pháp chẩn đoán của một bảng phụ lục) có thể giúp để đối trọng sự bất lợi của
hai nguyên lý.
Những phương pháp thử nghiệm nhanh được thiết kế cho việc phát hiện kháng
nguyên của virus trong những vết mô trong phương pháp xét nghiệm kính phết và
cryostat section khi sử
dụng miễn dịch phát huỳnh quang hoặc thử nghiệm miễn dịch
liên kết enzyme bắt giữ kháng nguyên (ELISA) và những hệ thống que đo mực nước
dòng chảy phần bên ở trong chất lưu trong miếng gạt. Cho đến bây giờ, những kỷ
thuật có độ nhạy thấp hơn kỷ thuật phân lập virus hoặc PCR,và do đó có thể gặp khó
khăn để chấp nhận cho một phương pháp chẩn
đoán hợp lý, đặc biệt của một bảng
danh mục ( Davision 1998, Selleck 2003, Cattoli 2004). Ứng dụng của những phương
Chẩn đoán virus cúm gia cầm bằng kỹ thuật nuôi cấy phôi trứng
- 15 -
pháp xét nghiệm nhốt trên mắt phẳng trong lĩnh vực thú y thì vẫn còn trong giai đoạn
phôi thai và cần được đẩy mạnh việc phát triển.
4. Phân lập và nhận dạng virus
4.1. Phân lập virus băng tiêm miễn dịch trong những quả trứng gà có phôi
4.1.1. Quá trình vật liệu cho chẩn đoán virus
4.1.1.1. Miếng gạt lấy mẫu ở lỗ huyệt
30 miếng gạt lấy mẫu ở lỗ huyệt sẽ được chia ra như một m
ẫu được phân phối
trong buffer chứa những kháng thể 30 ml ( isotonic PBS, pH 7,2, penicilin 2000

IU/ml, streptomycin 2 mg/ml và fungizone 0,025mg/ml). Lấy miếng gạt ra ngoài
trước khi tim chủng. Sau đó, mẫu đối chứng dương tính trong nhóm đầu tiên tiêm
chủng 200 µl avian influenza virus HA 10
7,5
. Nhóm thứ hai tiêm chủng 200 µl PBS 1x
cho đối chứng âm. Nhóm cuối cùng tiêm chủng 200 µl thể vẩn bước đầu của nồng độ
virus. Thể vẩn từ 3 nhóm được ly tâm 3000 vòng trong 30 phút trong máy ly tâm lạnh
(4
o
C) để lắng những mảnh mô và tất cả vi khuẩn, chất lỏng sạch trong được thu thập,
sau đó chất lỏng được lọc bằng màng lọc (0,45µm). Khi nhóm đối chứng dương và âm
mỗi thứ lấy 3ml vật liệu tiêm chủng cho vào ống siêu li tâm, và nhóm cuối cùng cho
thể vẩn bước đầu của nồng độ virus chia vào 10 phần giống hệt nhau.
Cho dung dịch pha loãng tiếp nhau (10
-1
, 10
-2
, 10
-3
, 10
-4
, 10
-5
, 10
-6
, 10
-7
, 10
-8
, 10

-9
) thủ
tục giống như nói đén ở trên được sử dụng.
4.1.1.2. Mẫu mô (cơ quan phổi)
20 mẫu phổi thu thập từ từ 10 con gà được chia ra như một mẫu cho sự phân lập
virus. Nghiền mẫu mô trong một cái cối và chày tiệt trùng với thuỷ tinh tán vụn từ một
pipette tiệt trùng, tạo ra một thể vẩn 10% với môi trường vận chuyển được phân phối
trong buffer bao gồm kháng thể 30 ml (PBS đẳng tr
ương, pH 7,2, penicilin 2000
IU/ml, streptomycin 2mg/ml và fungizone 0,025mg/ml), sau đó chuyển mẫu đồng
nhất với môi trường vận chuyển vào bên trong ống li tâm. Khi đối chứng dương trong
nhóm đầu tiêm chủng 200µl vius cúm gia cầm HA
7,5
. Nhóm thứ hai tiêm chủng 200 µl
Chẩn đoán virus cúm gia cầm bằng kỹ thuật nuôi cấy phôi trứng
- 16 -
PBS 1x cho mẫu đối chứng âm. Nhóm cuối cùng tiêm chủng 200 µl thể vẩn bước đầu
của nồng độ virus. Thể vẩn từ 3 nhóm được li tâm 3000 vòng 30 phút trong máy li
tâm lạnh (4
o
C) để lắng những mảnh mô và hầu hết vi khuẩn, dịch lỏng sạch bên trên
được thu thập, sau đó dịch lỏng được lọc bằng màng lọc (0,45µm),. Sau đó nhóm đối
chứng lấy 3ml vật liệu tiêm chủng vào trong ống siêu li tâm, nhóm thứ hai là đối
chứng âm lấy 3ml vật liệu tiêm chủng vào trong ống siêu li tâm, và nhóm cuối cùng
cho thể vẩn bước đầu của nồng độ virus chia vào 10 bản sao giống hệt nhau.
Cho dung dịch pha loãng cận nhau (10
-1
, 10
-2
, 10

-3
, 10
-4
, 10
-5
, 10
-6
, 10
-7
, 10
-8
, 10
-9
)
tiến trình giống như đề cập ở trên được sử dụng.
4.1.1.3. Vật liệu
• Những quả trứng gà đặc biệt sạch với mầm bệnh (SPF), 9-11 ngày tuổi
• Vật soi trứng
• Ethanol 70%
• Kim nhọn
• 22 Máy đo
• Ống tiêm 1ml, 1/
1
/
2

• Cái thoi dùng để tạo lỗ thủng trên quả trứng
• Keo hồ hoặc men trám
• Chất để tiêm chủng
• Khay để trứng

4.1.2. Thủ tục
1. Soi trứng
1. Khảo sát những quả trứng với một biện pháp soi trứng và đặt đầu cùng của
quả trứng quay lên vào bên trong những cái khay trứng.
2. Loại bỏ những trứng không được thụ tinh, có những vết nứt, phát triể
n
không đày đủ, hoặc xuất hiện lỗ thủng.
Chẩn đoán virus cúm gia cầm bằng kỹ thuật nuôi cấy phôi trứng
- 17 -
2. Sự tiêm chủng cho những quả trứng.
1. Đặt những quả trứng với đầu cùng của nó quay lên vào bên trong những cái
khay trứng và đánh dấu mỗi quả trứng với một con số nhận dạng đặc biệc ( 3
quả trứng cho một mẫu bệnh phẩm).
2. Lau sạch mặt trên của những quả trứng bằng ethanol 70% và thọc một lỗ nhỏ
vào bên trong vỏ xuyên qua túi khí. Ba quả trứng cho mỗ
i mẫu bệnh phẩm
thường được tiêm chủng trong túi niệu.
3. Hút 200µl mẫu đã được xử lý vào bên trong một ống tiêm vaccine với một
22 gauge, kiêm tiêm 1/
1
/
2
inch. Lồng kiêm vào bên trong cái lỗ đã được tạo của
quả trứng. dừng một máy đâm ngắn , tiêm chủng 200µl mẫu xử lý chúng được
chuẩn bị từ miếng gạt lỗ huyệt và phổi trong mỗi dung dịch pha loãng cho sự
tập trung virus bên trong khoang huyệt, 10 mẫu cho mỗi nồng độ pha loãng. Rút
kim ra. Tim chủng hai quả trứng khác với cách giống nhau với ống tiêm giống
nhau, kim giống nhau cho toàn bộ 3 trứng đã tiêm chủng mỗi mẫ
u xét nghiệm.
Vứt bỏ ống tiêm vào bên trong một vật chứa an toàn riêng biệt. Bịt kín những

cái lỗ thủng trong những quả trứng bằng một giọt keo dáng. Ấp những quả
trứng ở nhiệt độ 38-39
o
C và độ ẩm 60%- 70% thời gian 5 ngày.



Chẩn đoán virus cúm gia cầm bằng kỹ thuật nuôi cấy phôi trứng
- 18 -
3. khảo sát những quả trứng đã được tiêm chủng
Trứng được tiêm chủng được soi đến 5 ngày. Ghi nhận những quả trứng bị chết
và ghi chép thời gian làm cho phôi chết. Những quả trứng chết trong ngày đầu
tiên được quan tâm như không đặc biệt và không cần để ý đến. Vứt bỏ những
phôi này. Những quả trứng chết trong những ngày sau đó thí có khả năng thừa
hưởng virus cúm gia cầm.( hình 2)

HPAI chết trong 1-2 ngày
LPAI chết sau 2-4 ngày
Thuận lợi:

- Nguyên tắc vàng: Phương pháp được
tiến cử bởi WHO, OIE
- Chính xác : Độ chính xác cao nhất
- Hữu ích : cho phép những nghiên cứu tiếp sau.
Bất lợi :
- Tốn thời gian : thường mất hơn 1 ngày
- Sự an toàn phòng thí nghiệm : BLS-3
- Chất lượng cao hơn của mẫu
- Những tác nhân khác nên được loại trừ
- Sự nhiễm chéo

4. Sự thu hoạch của nhữ
ng quả trứng gà được tiêm chủng
Những quả trứng được giữ lạnh ở 4
o
C qua đêm hoặc khoảng 4 giờ trước khi thu
hoạch. Dáng nhãn một ống plastic (15ml) cho mỗi quả trứng tương ứng với con
số ghi cho mẫu bệnh phẩm. Lau sạch chóp của mỗi quả trứng bằng ethanol
70%. Với kiềm vô trùng, làm vỡ lớp vỏ bên trên túi khí và đẩy màng túi niệu về
một bên bằng kiềm. Sau đó sử dụng một ống tiêm và kim, chọc thủng túi ói và
Chẩn đoán virus cúm gia cầm bằng kỹ thuật nuôi cấy phôi trứng
- 19 -
rút kim ra khi một số lượng lớn
dịch trong túi ói có thể chấp
nhận được. Đặt kết quả trong
một ống tách rời, kết hợp dịch
túi niệu từ 3 quả trứng được
tiêm chủng mỗi mẫu xét
nghiệm . Ly tâm dịch thu hoạch
và thực hiện một xét nghiệm
hemagglutination và ủ ở 4
o
C/30 phút.
5. Xét nghiệm hemagglutination
Vật liệu
Sử dụng 96 đĩa vi chuẩn độ tốt với kiểu đáy chữ V
Multichannel micropipette 5-50 µl.,single micropipette 1-200 µl
Đồng hồ bấm giờ
Muối phosphate buffer (PBS) pH 7,2
1% tế bào máu đỏ của gà

Mẫu đối chứng dương và huyết thanh virus bệnh Newcastle.
Phương pháp
Dùng khay dùng một lần đáy chữ V. Phân phối 50µl dịch túi niệu từ mỗi mẫu
cho vào trong một đĩa vi chuẩn độ tố
t. Dùng một tip riêng biệt cho mỗi mẫu. Kể
cả chứng âm và chứng dương kiểm soát những mẫu dịch túi niệu trên một trong
những cái đĩa. Phân phối 50µl PBS vào trong mỗi đĩa. Thêm 25 µl 1% red
blood cell vào mỗi đĩa. Mở nhẹ những tấm của đĩa để trộn. Đặt một vỏ bọc lên
trên đĩa. Để cho đĩa đứng 45 phút tại phòng nhiệt. khảo sát và ghi chép kết quả.
6. Đọc kết quả
a)
Giải thích kết quả
HI âm tính: Một cái nút nhọn của những tế bào máu màu đỏ tại đáy của V-
Chẩn đoán virus cúm gia cầm bằng kỹ thuật nuôi cấy phôi trứng
- 20 -
botton well.
HI dương tính: một hình ảnh mờ mờ của những tế bào máu đỏ, không nút hoặc
một nút rất nhỏ của những tế bào máu đỏ tại đáy của V-botton well.
Đó sẽ thể hiện sự kháng ngưng kết hồng cầu và chứa đựng một đơn vị kháng
ngưng kết hồng cầu.
Nếu virus gây bệnh Newcastle (NDV) thì xét nghiệm ngưng kết hồng cầu là âm
tính. Sau đó, chứng thự
c bằng kiểu phụ với xét nghiệm nhanh trực tiếp bởi việc
sử dụng vet smart
®
test.
b) Xét nghiệm nhanh bằng sử dụng vet smart
®
test
Bộ kit xét nghiệm vet smart

®
test quảng cáo trên thị trường. Rockeby Avian
Influenza Virus Antigen đã được sử dụng
Bộ kít là một sự phát hiện kháng nguyên của Avian Influenza (Test Type A)
cho việc chẩn đoán, Rockeby biomed. Singapore.Pte.Ltd ).
Phương pháp xét này được thiết kế để đo lường chất lượng của kháng nguyên.
200 µl mẫu được lấy từ mỗi ống nghi ngờ kết quả avian influenza từ xét nghiệm
kháng ngưng kết hồng cầu và góp phần như một mẫu. Lấy một phần chia c
ủa
mẫu (dịch túi niệu) từ ống vi ly tâm với mẫu gạt thu thập. chèn miếng gạt vào
trong ống mẫu xét nghiệm chứa đựng dung dịch xét nghiệm pha loãng. Trộn
miếng gạt cho đến khi mẫu được tan rã vào bên trong dung dich xét nghiệm pha
loãng. Để mặt ống xét nghiệm cho đến khi những mẩu rộng được đọng xuống
đáy của ống. Thoát thiết bị chẩn đoán từ túi nền, và đặt nó lên trên một bề
mặt
nhẵn khô. Dùng ống nhỏ giọt dùng một lần đã cung cấp, giữ nổi trên bề mặt từ
mẫu phân tách trong ống. Thêm 8 giọt vào bên trong lỗ thủng của mẫu bằng
ống nhỏ giọt dùng 1 lần.
(Hình 3). Giải thích kết quả sau 10 phút.
Sự giải thích kết quả;
C : band đối chứng được tìm thấy chỉ band này nó là kết quả âm tính
Chẩn đoán virus cúm gia cầm bằng kỹ thuật nuôi cấy phôi trứng
- 21 -
T : Nhóm xét nghiệm được xét nghiệm mẫu
Kết quả âm tính từ xét nghiệm tìm thấy ở band C
Kết quả dương tính từ xét nghiệm tìm thấy ở cả band C và T
Xét nghiệm nhanh trực tiếp bỡi sử dụng vet smart
®
test bước trước để phát hiện
kháng nguyên trong thể vẩn của nghiên cứa thí nghiệm trong mỗi dịch pha

loãng của nồng độ virus. Kết quả dương tính trong xét nghiệm nhanh dùng để
có khả năng thể hiện ghi nhận kết quả. ( Cho việc phân lập virus và phát hiện
virus bằng việc sử dụng những quả trứng gà có phôi)













Chẩn đoán virus cúm gia cầm bằng kỹ thuật nuôi cấy phôi trứng
- 22 -
C. Kết luận
- Chẩn đoán virus cúm gia cầm bằng kỷ thuật nuôi cấy phôi trứng cho kết quả chính
xác nhất
- Phương pháp chẩn đoán bằng kỷ thuật nuôi cấy phôi trứng tốn nhiều thời gian.
- Trong phương pháp chẩn đoán bằng kỷ thuật nuôi cấy phôi trứng việc đảm bảo
những quả trứng sạch là rất quan trọng.
- Để khắc phục những nhược đ
iểm của phương pháp chẩn đoán bằng kỹ thuật nuôi
cấy phôi trứng cần kết hợp với các phương pháp khác như : sinh học phân tử, huyết
thanh học,…

D. Tài liệu tham khảo:
• www.influenzaReport.com

• www.adb.org/Documents/Events/2007/HPAI-control-technology-
CAREC/Detection-Avian-influe
• www.vphcap.org

• www.who.int

Chẩn đoán virus cúm gia cầm bằng kỹ thuật nuôi cấy phôi trứng
- 23 -

ài liệu tham khảo
A. Đặt vấn đề 2
B. Tổng quan 2
I. Thông tin chung về cúm gia cầm 3
1.Cúm gia cầm là gì? 3
2. Vi-rút cúm khuyếch tán và lây truyền như thế nào? 7
3. Hiện nay dịch cúm gia cầm xảy ra như thế nào? 7
4. Cúm gia cầm ảnh hưởng đến sức khoẻ con người 8
(a) Sự lan rộng và tồn tại lâu dài của dịch cúm gia cầm gây ra 2 mối nguy cơ lớn đối với sức khoẻ
con người 8
(b) Các trường hợp cúm gia cầm H5N1 xảy ra trên con người 9
(c) Con người bị nhiễm vi-rút cúm H5N1 trong trường hợp nào 9
5. Triệu chứng của bệnh cúm gia cầm ở người là gì? 10
(a) Yếu tố dịch tễ 10
(b) Lâm sàng 10
(c) Cận lâm sàng 11
II. Chẩn đoán bệnh trong phòng thí nghiệm 11
1. Sự thu thập mẫu xét nghiệm 11
2. Sự vận chuyển mẫu xét nghiệm 12
3. Phát hiện trực tiếp sự tiêm nhiễm của AIV 13
4. Phân lập và nhận dạng virus 16
4.1. Phân lập virus băng tiêm miễn dịch trong nhữ
ng quả trứng gà có phôi 16
4.1.1. Quá trình vật liệu cho chẩn đoán virus 16
4.1.1.1. Miếng gạt lấy mẫu ở lỗ huyệt 16

4.1.1.2. Mẫu mô (cơ quan phổi) 16
4.1.1.3. Vật liệu 17
4.1.2. Thủ tục 17
1. Soi trứng 17
2. Sự tiêm chủng cho những quả trứng 18
3. khảo sát những quả trứng đã được tiêm chủng 19
4. Sự thu hoạch của những quả trứng gà được tiêm chủng 19
5. Xét nghiệm hemagglutination 20
Chẩn đoán virus cúm gia cầm bằng kỹ thuật nuôi cấy phôi trứng
- 24 -
6. Đọc kết quả 20
a) Giải thích kết quả 20
b) Xét nghiệm nhanh bằng sử dụng vet smart
®
test 21
C. Kết luận 23
D. Tài liệu tham khảo 23