GIÁO TRÌNH THỰC tập dược LIỆU 2

Giáo trình Thực tập dược liệu

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
KHOA DƯỢC

GIÁO TRÌNH THỰC TẬP
DƯỢC LIỆU 2
(Dành cho sinh viên dược)

ĐÀ NẴNG
2018

1


Giáo trình Thực tập dược liệu

2


Giáo trình Thực tập dược liệu

NỘI QUY PHỊNG THÍ NGHIỆM
Sự an tồn phịng thí nghiệm là vấn đề được đặt lên hàng đầu. Vì vậy,
tất cả sinh viên thực hành tại phịng thí nghiệm và cán bộ giảng dạy, cán
bộ làm cơng tác nghiên cứu tại phịng thí nghiệm phải thực hiện theo đúng
nội quy sau:
1.Đọc kỹ tài liệu thực tập, nắm vững nguyên tắc, vật liệu, phương pháp
thực hành bài tập trước khi bước vào phịng thí nghiệm và thực hiện đúng
theo nội quy của phịng thí nghiệm trong quá trình thực tập, nghiên cứu.
2.Mặc áo blouse trong suốt thời gian thực tập và nghiên cứu tại phịng

thí nghiệm. Chỉ mang những tài liệu tối thiểu cần thiết cho thực tập vào
chỗ làm, tất cả các vật dụng khác phải để ở vị trí cách ly riêng.
3.Khơng ăn uống, hút thuốc, trang điểm, nghe nhạc, đùa giởn trong
phịng thí nghịêm.
4.Phải vệ sinh thật sạch vị trí thực tập, thiết bị, dụng cụ thí nghiệm
trước và sau khi thực tập, nghiên cứu.
5.Đổ hố chất ra ngồi phải lau sạch ngay, chai hố chất phải có tên
hố chất. Tuyệt đối khơng dùng dụng cụ lấy cùng lúc nhiều loại hoá chất.
6.Cấm tuyệt đối khơng dùng miệng để hút hố chất, khơng dùng mũi
ngửi hố chất. Pha các dung mơi và các chất độc hại trong tủ hút khí độc
có mang khẩu trang và găng tay chống khí độc.
7. Đeo kính bảo hộ khi thực hiện phản ứng, các phản ứng với dung môi
độc hoặc acid đậm đặc phải thực hiện trong tủ hút.
8. Không hút thuốc hoặc dùng lửa trần trong phịng thí nghiệm và
những khu vực lân cận.
9.Tn thủ nghiêm túc các hướng dẫn của cán bộ phụ trách phòng thí
nghiệm trong việc sử dụng hố chất, dụng cụ và thiết bị.... Nếu có trường

3


Giáo trình Thực tập dược liệu

hợp xảy ra tai nạn, sự cố phải báo ngay cho cán bộ phụ trách để có biện
pháp xử lý kịp thời.
VÌ AN TỒN CHO CÁ NHÂN BẠN VÀ MỌI NGƯỜI, HÃY TUÂN
THỦ ĐÚNG QUY ĐỊNH

4

Giáo trình Thực tập dược liệu

KIỂM NGHIỆM DƯỢC LIỆU CHỨA ALKALOID
I. CƠ SỞ LÝ THUYẾT CHUNG
Các alkaloid (alcaloid) là những base hữu cơ thường dễ tan trong các dung
môi hữu cơ (như ether, benzen, cloroform, aceton, methanol, và ethanol).
Đa số các alkaloid base thực tế không tan trong nước.
Một vài alkloid khơng có oxy tồn tại dưới trạng thái lỏng có thể tan ít trong
nước.
Một số alkaloid dạng lỏng có thể bay hơi và lôi cuốn được theo hơi nước.
Một số alkaloid khơng có oxy ở dạng rắn có thể thăng hoa được ở áp suất
thường.
Một số alkaloid có –OH phenol có thể tan một phần trong dung dịch kiềm
mạnh.
Dưới dạng muối, các alkaloid thường tan được trong nước, cồn (ethanol,
methanol) hay hỗn hợp cồn nước; chúng không tan hoặc rất kém tan trong các
dung môi hữu cơ kém phân cực (ether, benzen, cloroform)
II. TÍNH CHẤT CHUNG CỦA ALKALOID
Alkaloid thường là những base yếu, tan trong các dung môi hữu cơ, không tan
trong nước. Khi cho alkaloid tác dụng với acid sẽ thu được alkaloid dạng
muối.
Các muối của alkaloid thường dễ tan trong nước. Các muối này dễ bị các chất
kiềm vơ cơ (NH4OH, NaOH) thậm chí cả cá muối khác (Na2CO3, đôi khi cả
NaHCO3) đẩy ra khỏi muối cho lại alkaloid ban đầu.
Alkaloid phản ứng với các thuốc thử chung (thuốc thử tạo tủa) tạo thành các
muối khó tan (dạng kết tinh hay vơ định hình) được ứng dụng trong định tính
alkaloid.

5

Giáo trình Thực tập dược liệu

Một số alkaloid hay nhóm alkaloid có thể cho màu sắc đặc trưng với một số
thuốc thử được gọi là thuốc thử đặc hiệu của alkaloid (thuốc thử tạo màu) ứng
dụng trong định tính hoặc làm thuốc thử phát hiện trong sắc ký.
III. KIỂM ĐỊNH CÁC ALKALOID
Trong kiểm định các dược liệu chứa alkaloid, ngoài các chỉ tiêu kiểm định
chung cho mọi dược liệu, người ta phải tiến hành định tính và định lượng các
alkaloid trong dược liệu đó.
Có thể định tính alkaloid trực tiếp trong các mô thực vật hay trên dịch chiết
dược liệu. Để định tính alkaloid trong vi phẫu thực vật, người ta quan sát tủa
của alkaloid với thuốc thử Bouchardat dưới kính hiển vi.
Đơi khi có thể định tính trực tiếp alkaloid trên mặt cắt dược liệu bằng
thuốc thử đặc hiệu. Để định tính alkaloid trong dịch chiết dược liệu,
các thuốc thử chung, thuốc thử tạo màu và sắc ký lớp mỏng là những
phương pháp thường dùng.
Có nhiều phương pháp định lượng alkaloid trong dược liệu như
phương pháp cân, phương pháp thể tích, phương pháp quang phổ. Tùy
trường hợp mà lựa chọn phương pháp thích hợp. Cũng có thể kết hợp
các phương pháp phân tách (thường là các phương pháp sắc ký) với
việc định lượng (thường là các phương pháp quang phổ) để định
lượng riêng một hay một vài alkaloid nào đó trong hỗn hợp alkaloid
tồn phần.
Kết quả có thể được biểu thị bằng
- % của alkaloid tồn phần có trong dược liệu (phương pháp cân trực
tiếp).
- % cuả alkaloid toàn phần có trong dược liệu quy theo một alkaloid
chính (phương pháp cân gián tiếp, phương pháp chuẩn độ acid-base,

phương pháp quang phổ).

6


Giáo trình Thực tập dược liệu

- % của một alkaloid nào đó có trong dược liệu (phương pháp kết hợp
sắc ký- quang phổ).
IV. CHIẾT XUẤT CÁC ALKALOID
Trong cây, alkaloid thường tồn tại dưới dạng muối hòa tan với acid
hữu cơ hoặc vô cơ hay dạng kết hợp với tanin. Người ta có thể chiết
alkaloid ra khỏi nguyên liệu thực vật bằng nhiều cách nhưng nhìn
chung có thể quy về 2 cách chính là:
- Chiết alkaloid ra khỏi dược liệu dưới dạng alkaloid base bằng dung
môi hữu cơ.
- Chiết alkaloid ra khỏi dược liệu dưới dạng muối bằng dung môi phân
cực (nước, cồn, hỗn hợp cồn nước đã được acid hóa).
Với một vài alkaloid đặc biệt, người ta có thể chiết xuất bằng cách:
- Phương pháp cất kéo lôi cuốn theo hơi nước (chiết xuất nicotin từ
Thuốc lá).
- Phương pháp thăng hoa (chiết cafein từ Trà).
Dựa vào tính tan khác nhau của dạng base và dạng muối alkaloid
trong các dung môi, người ta có thể loại phần nào các tạp chất ra khỏi
dịch chiết trước khi định tính, định lượng hay phân lập các alkaloid
tinh khiết.
Các quy trình chiết dưới đây thường được sử dụng trong chiết xuất
alkaloid từ nguyên liệu thực vật dùng cho định tính alkaloid.
Ghi chú: thể tích dung môi chiết, thời gian chiết trong các phương pháp trên
có thể thay đổi tùy thuộc vào dược liệu và phương tiện sử dụng.

7


Giáo trình Thực tập dược liệu

1. Chiết bằng dung mơi hữu cơ trong môi trường kiềm (Phương pháp 1)
Bột dược liệu (5g)
- Kiềm hóa bằng NH4OH đậm đặc (vừa đủ ẩm)
- Chiết nóng bằng 20-30ml CHCl3
(đun nóng nhẹ/BM 10 phút, lọc hoặc chiết bằng Sohxlet)

Dịch chiết CHCl3
H2SO4 2% (5ml x 2 lần)

Dịch chiết nước acid
NH4OH đậm đặc → pH 10

Định tính bằng thuốc thử chung
Định tính bằng thuốc thử đặc hiệu

Chiết bằng CHCl3 (10ml x 2-3 lần)

Dịch chiết CHCl3

Định tính bằng phương pháp sắc ký

Bốc hơi tới cắn khô

Cắn alkaloid base

Định tính bằng thuốc thử đặc hiệu

8


Giáo trình Thực tập dược liệu

2. Chiết bằng nước acid (Phương pháp 2)
Bột dược liệu
(5g)
20ml dung dịch H2SO4 2%
Đun BM 15 phút, lọc (2 lần x 20ml)

Dịch chiết nước acid
NH4OH đậm đặc → pH 10
CHCl310ml x 2 lần

Dịch chiết CHCl3

Định tính bằng phương pháp sắc ký
Định tính bằng thuốc thử đặc hiệu

H2SO4 2% (5ml x 2 lần)

Dịch chiết nước acid

Định tính bằng thuốc thử chung
Định tính bằng thuốc thử đặc hiệu

9


Giáo trình Thực tập dược liệu

3. Chiết bằng cồn acid (Phương pháp 3)
Bột dược liệu
(5g)
20-30ml cồn có 5% acid (sulfuric, hydrochlorid,
acetic)
Đun hồi lưu/BM 10 phút, lọc.

Dịch chiết cồn
acid
- Trung hòa đến pH 5-6 (nếu cần)
- Bay hơi cồn trên bếp cách thủy đến cắn
- Hịa tan cắn trong nước nóng (10mlx 2
lần), lọc

Dịch chiết nước
acid

Định tính bằng thuốc thử chung
Định tính bằng thuốc thử đặc
hiệu

NH4OH đậm đặc → pH 10
Chiết bằng CHCl3 (10ml x 2-3
lần)

Dịch chiết
CHCl3

Định tính bằng phương pháp sắc
ký
Định tính bằng thuốc thử đặc hiệu

Chiết với H2SO4 2% (5ml x 2
lần)

Dịch chiết nước
acid

Định tính bằng thuốc thử chung
Định tính bằng thuốc thử đặc
hiệu

10


Giáo trình Thực tập dược liệu

BÀI 1
ĐỊNH TÍNH ALKALOID TRONG DƯỢC LIỆU
BẰNG PHẢN ỨNG HÓA HỌC VÀ SẮC KÝ LỚP MỎNG
Mục tiêu
Sau khi thực hành, sinh viên phải:
- Chiết được alkaloid ra khỏi dược liệu bằng các phương pháp thích
hợp.
- Xác định được alkaloid trong dịch chiết dược liệu bằng các thuốc thử

chung.
- Phát hiện được alkaloid trong dược liệu bằng phương pháp sắc ký
lớp mỏng.
I. CƠ SỞ LÝ THUYẾT
1. Định tính alkaloid bằng thuốc thử chung
Để phát hiện alkaloid trong dược liệu bằng các phản ứng hóa học,
thơng thường người ta chiết alkaloid ra khỏi cơ quan thực vật bằng
phương pháp chiết thích hợp rồi dùng các thuốc thử để phát hiện và
đánh giá sơ bộ sự có mặt của chúng trong dược liệu. Tùy theo phản
ứng mà sử dụng dịch chiết thích hợp. Các phản ứng với thuốc thử
chung thường được thực hiện với muối alkaloid trong môi trường
nước acid.
Các thuốc thử chung cho với các alkaloid một tủa vơ định hình có màu
sắc khơng đặc trưng thay đồi tùy theo thuốc thử. Với một số thuốc
thử, tủa này có thể tan lại tỏng một lượng thuốc thử thừa.
Trong những điều kiện quy định về lượng dược liệu, lượng dung mơi,
cách chiết và thuốc thử sử dụng có thể dựa vào mức độ tạo tủa, lượng

11


Giáo trình Thực tập dược liệu

thuốc thử sử dụng để đánh giá sơ bộ hàm lượng alkaloid trong nguyên
liệu.
Các thuốc thử thường dùng là Bouchardat,Valse-Mayer, Dragendroff,
Bertrand, Hager, và acid tanic.
2. Định tính alkaloid bằng phương pháp sắc ký lớp mỏng (SKLM)
SKLM được sử dụng như một phương pháp phát hiện sự có mặt, đồng
thời đánh giá sơ bộ thành phần alkaloid của dược liệu khi sử dụng các

hệ dung môi thích hợp. Tiến hành sắc ký song song với 1 alkaloid
chuẩn cịn cho phép nhận định sự có mặt của một alkaloid nào đó
trong dược liệu. SKLM cịn hữu dụng trong việc xác định 1 dược liệu
khi sắc ký so sánh với dược liệu chuẩn.
Pha tĩnh: trong định tính alkaloid bằng SKLM thường dùng silicagel G,
F254, GF254. Các pha tĩnh khác như nhôm oxyd, silicagel pha đảo đôi khi
cũng được dùng.
Dung môi khai triển
Dung môi khai triển cho sắc ký alkaloid thường là hỗn hợp của 2 hay 3
dung môi hữu cơ; thường từ phân cực yếu tới phân cực trung bình (như
hexan, benzen, ether ethylic, cloroform, dicloromethan, ethyl acetat). Có
thể sử dụng thêm các dung mơi hữu cơ có tính kiềm (pyridin, dimethyl
formamid, diethylamin, triethylamin) hoặc một lượng nhỏ các kiềm vô cơ
(thường là amoniac đặc) bằng cách pha thẳng vào hệ dung mơi hay bằng
cách để bão hịa khí quyển trong bình sắc ký.
Đơi khi, các dung mơi phân cực mạnh hơn như butanol, ethanol,
methanol, nước, các acid như acid acetic, acid formic cũng được dùng đối
với alkaloid phân cực mạnh.
Mẫu thử

12


Giáo trình Thực tập dược liệu

Mẫu thử thường là alkaloid base hay hỗn hợp alkaloid base tồn phần,
được hịa tan trong các dung mơi ít phân cực và dễ bay hơi như cloroform,
ether…
Các dung dịch alkaloid muối (pha trong EtOH, MeOH) cũng có thể được
sử dụng khi dung mơi khai triển là các hệ dung mơi phân cực mạnh,

thường có thêm acid.
Phát hiện vêt
Để phát hiện vết alkaloid trên bản sắc ký người ta thường phun (hoặc
nhúng) với thuốc thử Dragendroff. Các alkaloid sẽ cho các vết màu đỏ
cam trên nền vàng cam.
Các cách phát hiện thông thường như soi đèn UV (254nm và 365nm) hoặc
hơ trong hơi iod cũng được dùng như là phương pháp bổ sung nhưng
không đặc hiệu.
Ghi nhận kết quả
Ghi nhận số lượng các vết quan sát được trên sắc đồ về màu sắc với các
phương pháp phát hiện, Rf và tỉ lệ tương đối của các vết alkaloid trong
hỗn hợp.
Rf của 1 chất A được định nghĩa là tỷ số giữa đoạn đường di chuyển của
chất A (lA) và đoạn đường di chuyển của dung mơi (lO) tính từ mức xuất
phát của mẫu thử

Trị số Rf ln < 1,00 và ln có đúng hai số lẻ (ví dụ 0,08; 0,72…)
Trong những điều kiện sắc ký nhất định, giá trị R f của 1 chất là một
trong những đặc trưng của chất đó trong hệ dung môi đã sử dụng. Tuy
nhiên, do giá trị Rf phụ thuộc vào khá nhiều yếu tố (bản chất, bề dày

13


Giáo trình Thực tập dược liệu

và độ hoạt hóa của pha tĩnh, pha động, mức độ bão hịa dung mơi, độ
ẩm và nhiệt độ của môi trường…) nên người ta còn sử dụng giá trị R x
ổn định hơn để biểu thị đặc trưng của chất ấy.
Rx của một chất A so với chất quy chiếu X được định nghĩa là tỷ số

giữa đoạn đường di chuyển của hóa chất A (lA) và đoạn đường di
chuyển của chất quy chiếu X (lX) trong cùng 1 điều kiện (cùng 1 bản
sắc ký)

Khác với Rf, trị số RX có thể > 1,00 và cũng chỉ lấy 2 số lẻ.
Chất quy chiếu thường được dùng trong sắc ký alkaloid là quinin, khi
đó Rf của một alkaloid so với quinin được ghi là RQ.
II. THỰC HÀNH
1. Dược liệu
- Bình vơi hay bách bộ
- Lá sen
- Tâm sen
2. Chiết xuất alkaloid
Chiết 3 dược liệu thuộc 3 phương pháp dưới đây để thực hiện phản
ứng định tính bằng các thuốc thử chung
- Bình vơi, bách bộ: chiết alkaloid bằng dung môi hữu cơ (phương
pháp 1). Lấy dịch chiết nước acid để định tính với thuốc thử chung
của alkaloid, dịch CHCl3 dùng để SKLM.
- Lá sen: chiết bằng nước acid (phương pháp 2). Lấy dịch chiết nước
acid lần 2 (sau giai đoạn cloroform) để định tính với thuốc thử chung
của alkaloid, dịch CHCl3 dùng để SKLM.

14


Giáo trình Thực tập dược liệu

- Tâm sen: chiết bằng cồn acid (phương pháp 3). Lấy dịch chiết nước
acid (trong thực tập, lấy dịch chiết nước acid ở giai đoạn đầu tiên) để
định tính với thuốc thử chung của alkaloid, dịch CHCl 3 dùng để

SKLM.
Ghi chú: các phương pháp chiết, lượng dung mơi hóa chất dùng để
làm ẩm, để chiết cho từng dược liệu có thể thay đổi tùy thuộc vào loại
dược liệu và điều kiện thực tế.
3. Định tính alkaloid bằng thuốc thử chung
Lấy 5 ống nghiệm nhỏ, cho vào mỗi ống nghiệm 2ml dịch chiết nước acid.
Cho riêng rẽ vào mỗi ống nghiệm 3 giọt thuốc thử lần lượt là Bouchardat,
Valse-Mayer, Dragendroff, Bertrand và Hager. Lắc đều, quan sát và nhận định
kết quả. Nếu cần có thể cho thêm 1-2 giọt thuốc thử nữa.
Nhận định kết quả
(-)

Dung dịch vẫn trong

(+)

Dung dịch đục mờ nhưng không lắng xuống

(++) Dung dịch đục, có tủa lắng xuống sau vài phút
(+++) Có tủa lắng xuống ngay. Dung dịch đục sau khi thêm giọt thuốc thử
thứ 2
(++++) Có tủa nhiều
4. Định tính alkaloid bằng phương pháp SKLM
Chuẩn bị bản mỏng
Có hai loại: bản mỏng tự tráng và bản mỏng tráng sẵn. Hiện nay, bản mỏng
tráng sẵn được sử dụng phổ biến.
Với bản mỏng tráng sẵn, dùng bàn cắt hoặc kéo cắt thành những miếng có
kích thước thích hợp (2,5 x 10cm), khơng cần sấy hoạt hóa.
Chuẩn bị dung mơi và bình sắc ký

15


Giáo trình Thực tập dược liệu

Bình sắc ký được rửa sạch và sấy nhẹ đến khơ. Lót lịng trong bình bằng giấy
lọc.
Nhỏ lên trên miếng giấy lọc này 3-4 giọt NH4OH đậm đặc rồi lót dung mơi
sắc ký vào bình (lớp dung mơi này cao khoảng 0,5cm).
Đậy nắp kín (nếu cần, có thể thoa 1 ít vaseline trên miệng bình), đặt ở nơi
phẳng, để yên trong ít nhất 30 phút trước khi triển khai.
Các hệ dung môi sử dụng
S1 = benzen : aceton (1:4)
S2 = CHCl3 : MeOH : NH4OH (50:9:1)
Đưa mẫu lên bản mỏng, triển khai và phát hiện
Dùng mao quản chấm lên mỗi bản sắc ký 2 vết, tuần tự từ trái sang phải là 2
dung dịch alkaloid base tồn phần trong cloroform của Bình vơi và Tâm sen.
Các vết chấm này phải nhỏ, gọn (nên chấm thành vạch 1mm x 3mm),
thẳng hàng và cách đều nhau, vết nọ cách vết kia ≥ 0,5cm;cách 2 mép bên
≥ 0,5cm và cách mép dưới khoảng 1,5cm. Tùy theo nồng độ dịch thử mà
chấm với số lần thích hợp, sao cho sau khi triển khai và phun thuốc thử
các vết không q mờ, khó phát hiện và cũng khơng q đậm, làm các vết
to, chồng lấn lên nhau.
Đặt bản mỏng vào bình sắc ký, đậy kín nắp và để n (các vết chấm phải
nằm cao hơn lớp dung môi). Khi dung mơi chạy cịn cách mép trên
khoảng 0,5cm, lấy bản mỏng ra, dùng bút chì đánh dấu mức dung mơi, để
khơ tự nhiên hay sấy nhẹ cho hết dung môi.
Phát hiện các vết trên sắc đồ lần lượt bằng cách:
- Soi dưới đèn UV 254nm và 365nm.
- Phun (hoặc nhúng nhanh) thuốc thử Dragendroff (trong tủ hốt!)

Vẽ sắc ký đồ khi phát hiện bằng UV 245nm và thuốc thử Dragendroff.

16


Giáo trình Thực tập dược liệu

Ghi nhận lại màu sắc của các vết trong UV 365nm và sau khi phun thuốc
thử Dragendroff.
Tính Rf của các vết màu với thuốc thử Dragendroff. Ghi nhận xét.

17


Giáo trình Thực tập dược liệu

BÀI 2
ĐỊNH LƯỢNG ALKALOID
BẰNG PHƯƠNG PHÁP ACID-BASE
Mục tiêu
Sau khi thực hành, sinh viên phải:
- Định lượng được alkaloid toàn phần trong Canh ki na bằng phương pháp
acid base.
- Định lượng được strychnin trong Mã tiền bằng phương pháp acid base.
- Định lượng được alkaloid từ các dược liệu cụ thể bằng phương pháp acid
base theo quy trình đã cho.
I. CƠ SỞ LÝ THUYẾT
Dựa vào tính kềm của alkaloid, có thể xác định hàm lượng alkaloid trong một
dung dịch bằng phương pháp chuẩn độ acid-base. Tùy theo bản chất của
alkaloid và điều kiện tiến hành, có thể áp dụng các phương pháp sau:

- Định lượng gián tiếp (chuẩn độ thừa trừ, chuẩn độ ngược): dùng cho đa số
các alkaloid.
- Định lượng trực tiếp: chỉ áp dụng cho các alkaloid có tính kiềm mạnh.
Trong trường hợp này, hỗn hợp cồn nước thường được dùng làm dung môi.
- Định lượng trong môi trường khan (hay dùng acid acetic băng): thường áp
dụng cho những alkaloid có tính kiềm yếu. Alkaloid thường được chuẩn độ
bằng acid percloric trong môi trường acid acetic băng, với chỉ thị là tím tinh
thể.
Khi định lượng trong môi trường nước, thường chuẩn độ bằng các dung dịch
HCl, H2SO4 và NaOH (nồng độ từ 0,01 - 0,1N). Chỉ thị màu thường dùng là
methyl đỏ (vì hầu hết các muối của alkaloid có pH phân ly ở vùng chuyển
màu của chỉ thị này, pH 4,2-6,3). Methyl da cam (helianthin, pH 3,1-4,4) đôi
khi cũng được dùng.

18


Giáo trình Thực tập dược liệu

Cũng có thể dùng hỗn hợp chỉ thị để dễ quan sát vùng chuyển màu hơn (ví dụ:
dùng methyl đỏ + methylen xanh làm chỉ thị trong định lượng alkaloid của vỏ
Canh ki na).

19


Giáo trình Thực tập dược liệu

II. THỰC HÀNH
1. Dược liệu

- Mã tiền
- Cà độc dược
2. Định lượng strychnin trong hạt Mã tiền
Cân chính xác khoảng 5g bột hạt Mã tiền vào một erlen 250ml. Kiềm
hóa bằng một lượng vừa đủ NH 4OH đậm đặc, đậy kín, để yên 15 phút
rồi thêm 50ml hỗn hợp ether-cloroform (3:1), lắc đều 15 phút và để
yên 1 giờ (thỉnh thoảng lắc đều). Gạn/lọc dịch chiết vào 1 bình lắng
gạn có chứa sẵn 25ml H2SO4 2%. Bã dược liệu được lắc tiếp với ethercloroform (3:1) (3 lần x 20ml) cho đến khi dịch chiết không cịn phản
ứng alkaloid nữa.
Gộp chung dịch chiết acid vào bình lắng gạn, lắc đều và tách lấy lớp
acid. Chiết tiếp phần dung môi bằng H2SO4 5% (10, 10, 10ml…) cho
đến khi dịch chiết khơng cịn phản ứng của alkaloid nữa.
Gộp các dịch chiết acid vào bình lắng gạn, kiềm hóa bằng NH 4OH
đậm đặc đến pH 10. Chiết alkaloid base bằng CHCl 3 (20, 10, 10ml)
cho đến hết alkaloid. Gộp các dịch chiết CHCl 3 vào becher và bay hơi
dung môi trên bếp cách thủy (trong tủ hốt!) cho đến cắn.
Hòa tan cắn bằng hỗn hợp 10ml H 2SO4 5% và 2ml HNO3 50%. Thêm
vào dung dịch này vài tinh thể NaNO 2, để yên khoảng 20 phút trong tủ
hốt rồi chuyển vào bình lắng gạn có chứa sẵn 20ml NaOH 10%. Tráng
becher bằng 5ml nước cất rồi cho chung vào bình lắng gạn.
Lắc đều bình gạn rồi chiết strychnin bằng CHCl 3 (10, 10, 5ml…) cho
đến khi dịch CHCl3 khơng cịn phản ứng alkaloid.
Gộp các dịch CHCl3 vào 1 bình lắng gạn. Rửa lớp CHCl 3 bằng 5ml
NaO 10% rồi bằng nước cất (10ml x 3 lần). Cho dịch CHCl 3 đã rửa

20


Giáo trình Thực tập dược liệu

vào một becher 100ml. làm khan bằng khoảng 1g bột Na 2SO4 khan và
lọc vào erlen 100ml. Rửa lớp Na2SO4 bằng CHCl3 (3ml x 3 lần) và
gộp dịch rửa vào dịch CHCl3 đã lọc.
Bay hơi dung môi cho đến cắn trên bếp cách thủy (trong tủ hốt!)
Hịa tan cắn trong 10ml (chính xác) H2SO4 0,1N và thêm 2 giọt methyl
đỏ. Định lượng H2SO4 thừa bằng dung dịch NaOH 0,1N.
1ml dung dịch H2SO4 0,1N tương đương với 0,0334g strychnin
(C21H22N2O2 = 334).
Hệ số hiệu chỉnh lượng strychnin hao hụt trong phép định lượng này là k =
1,02.
3. Định lượng alkaloid trong bình vơi
Cân chính xác khoảng 5 g bột dược liệu cho vào bình nón 250 ml, làm ẩm vừa
đủ bằng dung dịch NH4OH 10% và chiết hồi lưu bằng 80 ml CHCl 3 trên bếp
cách thủy trong 30 phút. Lọc dịch chiết vào một bình lắng gạn 250 ml có sẵn
20 ml HCl 5%. Chiết tiếp bã dược liệu như trên ( mỗi lần 50 ml CHCl 3, đun
hồi lưu 15 phút) cho tới khi dịch chiết khơng cịn alkaloid nữa. Gộp chung các
dịch chiết với dịch chiết ban đầu.
Chiết alkaloid dạng muối bằng dung dịch HCl 5% (20, 10, 10 ml…) cho tới
khi dịch HCl thu được khơng cịn alkaloid nữa. Gộp chung dịch chiết acid vào
một bình lắng gạn 250 ml, lắc dung dịch với ether dầu hỏa (10 ml x 3 lần),
loại bỏ lớp ether dầu hỏa.
Kiềm hóa dịch HCl bằng NH4OH 10% cho tới pH 11 và chiết alkaloid base
bằng CHCl3 ( 20, 10, 10 ml…) cho tới khi dịch CHCl 3 thu được khơng cịn
phản ứng alkaloid nữa. Gộp chung dung dịch CHCl 3 vào 1 bercher khô và làm
khan bằng Na2SO4.
Gạn dịch CHCl3 khan vào 1 bercher 250 ml. Rửa lớp Na 2SO4 bằng CHCl3 (5
ml x 2 lần) và gộp chung với CHCl 3 ở trên, Bốc hơi dung môi tới cắn trên bếp

21

Giáo trình Thực tập dược liệu

cách thủy ( trong tủ hốt) rồi hịa tan cắn trong 20 ml (pipet chính xác) acid
sulfuric 0,1 N.
Thêm 2 giọt đỏ methyl (CT) và định lượng alkaloid toàn phần trong dung
dịch bằng dung dịch NaOH 0,1 N cho tới khi có màu vàng.
Tiến hành song song với 1 mẫu trắng khơng có cắn alkaloid.
1 ml dung dịch acid sulfuric 0,1 N tương ứng với 0,0712 g alkaloid tồn phần
tính theo 1-tetrahydropalmatin (C21H26NO4 = 356).
Hàm lượng

(%) alkaloid tồn phần trong dược liệu (A) tính theo 1-

tetrahydropalmatin khan được tính theo cơng thức:
A = [( n1- n2) * 0,0712 * 100]/ [a * (1-h)]
Với : n1: số ml NaOH 0,1 N đã dùng cho mẫu trắng
n2: số ml NaOH 0,1 N đã dùng cho mẫu thử
a: khối lượng dược liệu đem định lượng (gam)
h: độ ẩm của mẫu định lượng
BÀI 3
KIỂM NGHIỆM DƯỢC LIỆU CÓ ALKALOID
Mục tiêu
Sau khi thực hành, sinh viên phải:
- Trình bày được các nội dung cần thực hiện để kiểm nghiệm một
dược liệu chứa alkaloid.
- Kiểm nghiệm được các dược liệu : Mã tiền, Canh ki na, Cà độc
dược, Trà, Vàng đắng.
I. CƠ SỞ LÝ THUYẾT
Để kiểm định một dược liệu nói chung và dược liệu chứa alkaloid nói

riêng, người ta thường thực hiện các nội dung sau:

22


Giáo trình Thực tập dược liệu

- Khảo sát các đặc điểm cảm quan (hình dạng, thể chất, màu sắc và
mùi vị).
- Kiểm định về mặt thực vật học và vi học (các đặc điểm giải phẫu,
mô học).
- Kiểm định độ tinh khiết: độ ẩm, độ tro, tạp cơ học, dư lượng thuốc
trừ sâu…
- Kiểm định hóa học: định tính, định lượng các nhóm hoạt chất có
trong dược liệu.
Ngồi ra, có những trường hợp người ta còn đòi hỏi kiểm định về mặt
sinh học (tác dụng sinh lý, xác định sự nhiễm nấm, khuẩn, cơn trùng).
Mỗi loại dược liệu đều có các thành phần cấu tạo (giải phẫu hay hóa
học) đặc trưng. Dựa vào các điểm đặc trưng này, người ta có thể nhận
diện chúng trong mẫu kiểm nghiệm để xác nhận, đánh giá chất lượng
của dược liệu và phát hiện sự giả mạo.
Trong kiểm định dược liệu chứa alkaloid về mặt hóa học, ngồi việc
sử dụng các thuốc thử chung của alkaloid để định tính, trong một số
trường hợp, người ta cịn có thể sử dụng những phản ứng chun biệt
(còn gọi là phản ứng với các thuốc thử đặc hiệu; thường là các phản
ứng màu) để phát hiện sự có mặt của một alkaloid hoặc một nhóm
alkaloid đặc trưng của một dược liệu.
Ví dụ: các phản ứng Thaleoquinin, Erythroquinin… để phát hiện
quinin,

phản

ứng

Vitali-Morin

để

phát

hiện

hyoscyamin,

scopolamin…
Các phản ứng với thuốc thử đặc hiệu, tùy theo phản ứng, có thể thực
hiện trên cắn alkaloid, trong dung môi hữu cơ hay trong dung dịch
nước.

23


Giáo trình Thực tập dược liệu

Nhiều phản ứng cho sản phẩm màu kém bền và chuyển nhanh từ màu
này sang màu khác, vì thể phải quan sát màu ngay khi cho thuốc thử.
II. THỰC HÀNH
1. Dược liệu
- Mã tiền
- Canh ki na

- Cà độc dược
- Trà
- Vàng đắng
2. Kiểm nghiệm hạt Mã tiền
Bộ phận dùng là hạt của cây Mã tiền (Strychnos nux-vomica L., Loganiaceae)
2.1. Bột dược liệu
Bột màu vàng xám nhạt, không mùi, vị rất đắng. Quan sát dưới kính hiển vi
thấy:
- Rất nhiều lơng che chở đơn bào dài, mảnh, rời hay dính thành bó, ngun
hay gãy thành nhiều đoạn có dạng hình que, gốc lơng phình to, có màng dày.
- Đám tế bào vỏ hạt gồm những tế bào nhỏ có màng dày, có ống trao đổi.
- Mảnh nội nhũ là những tế bào lớn, có nhiều cạnh, màng hóa sừng dày trong
suốt, có nhân rõ.
2.2. Định tính bằng các phản ứng đặc hiệu
Chiết xuất: chiết 3g bột dược liệu theo phương pháp 2 đến giai đoạn alkaloid
base trong cloroform. Cho dịch cloroform vào 2 chén sứ, cơ cách thủy tới cắn
khơ.
Định tính strychnin: nhỏ vào chén thứ nhất chừng 1 giọt H2SO4 đậm đặc,
khuấy nhẹn cho tan, thả vào chén một vài hạt tinh thể K 2Cr2O7. Dùng đũa kéo
hạt tinh thể K2Cr2O7 ngang qua dung dịch acid, cà mạnh, sẽ có vệt màu tím rồi
chuyển sang hồng vàng và biến thành nâu đen.

24


Giáo trình Thực tập dược liệu

Định tính brucin: nhỏ một giọt HNO3 đậm đặc vào cắn trên chén 2 sẽ có màu
đỏ cam.
3. Kiểm nghiệm Cà độc dược

Bộ phận dùng là lá hay hạt của cây Cà độc dược (Datura metel L.,
Solanaceae)
3.1. Bột dược liệu (lá Cà độc dược)
Bột màu xanh lục hay lục nâu. Quan sát dưới kính hiển vi thấy:
- Mảnh biểu bì mang lỗ khí
- Lơng che chở đa bào có eo thắt
- Tinh thể calci oxalat hình cầu gai
- Mảnh mơ mềm hình giậu
- Lơng tiết chân đơn bào, đầu đa bào
- Mảnh mạch
3.2. Định tính bằng thuốc thử đặc hiệu
Phản ứng Vitali-Morin
Lấy 5g bột dược liệu, chiết theo phương pháp 1, thu được dịch
alkaloid base trong cloroform (đã qua giai đoạn nước acid). Làm khan
dịch CHCl3 bằng Na2SO4 khan.
Bốc hơi dung dịch cloroform trong một chén sứ cho tới cắn khô.
Thêm vào cắn vài giọt HNO3 đậm đặc rồi đun trên bếp cách thủy đến
cắn khô (làm trong tủ hốt!)
Để nguội, thêm 0,5ml aceton, tráng nhanh cắn trong chén và cho dịch
aceton này vào một ống nghiệm khô (ống 1).
Thêm tiếp vào chén 2ml aceton, dùng đũa thủy tinh khuấy kỹ cho cắn
alkaloid hòa tan vào aceton và chuyển vào một ống nghiệm khô khác
(ống 2).

25