(LUẬN văn THẠC sĩ) đánh giá một số đặc tính sinh học của chủng virus cường độc dịch tả vịt VG 04 sau bảo quản

HỌC VIỆN NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM

VŨ THỊ NGỌC

ĐÁNH GIÁ MỘT SỐ ĐẶC TÍNH SINH HỌC
CỦA CHỦNG VIRUS CƯỜNG ĐỘC DỊCH TẢ VỊT
VG – 04 SAU BẢO QUẢN

Chuyên ngành:

Thú Y

Mã số:

60 64 01 01

Người hướng dẫn khoa học:

PGS.TS. Nguyễn Bá Hiên

NHÀ XUẤT BẢN ĐẠI HỌC NÔNG NGHIỆP - 2016

download by :


LỜI CAM ĐOAN
Tơi xin cam đoan đây là cơng trình nghiên cứu của riêng tôi, các kết quả nghiên
cứu được trình bày trong luận văn là trung thực, khách quan và chưa từng dùng để bảo
vệ lấy bất kỳ học vị nào.
Tôi xin cam đoan rằng mọi sự giúp đỡ cho việc thực hiện luận văn đã được cám
ơn, các thơng tin trích dẫn trong luận văn này đều được chỉ rõ nguồn gốc.

Hà Nội, ngày… tháng 12 năm 2016
Tác giả luận văn

Vũ Thị Ngọc

i

download by :


LỜI CẢM ƠN
Trong suốt thời gian học tập, nghiên cứu và hồn thành luận văn, tơi đã nhận được
sự hướng dẫn, chỉ bảo tận tình của các thầy cơ giáo, sự giúp đỡ, động viên của bạn bè,
đồng nghiệp và gia đình.
Nhân dịp hồn thành luận văn, cho phép tơi được bày tỏ lịng kính trọng và biết
ơn sâu sắc đến PGS. TS. Nguyễn Bá Hiên đã tận tình hướng dẫn, dành nhiều công sức,
thời gian và tạo điều kiện cho tơi trong suốt q trình học tập và thực hiện đề tài.
Tơi xin bày tỏ lịng biết ơn chân thành tới Ban Giám đốc, Ban Quản lý đào tạo, Bộ
môn Vi sinh vật – Truyền nhiễm, Khoa Thú y - Học viện Nơng nghiệp Việt Nam đã tận
tình giúp đỡ tơi trong q trình học tập, thực hiện đề tài và hoàn thành luận văn.
Xin chân thành cảm ơn gia đình, người thân, bạn bè, đồng nghiệp đã tạo mọi
điều kiện thuận lợi và giúp đỡ tôi về mọi mặt, động viên khuyến khích tơi hồn thành
luận văn./.
Hà Nội, ngày ... tháng 12 năm 2016.
Tác giả luận văn

Vũ Thị Ngọc

ii

download by :


MỤC LỤC
Lời cam đoan ................................................................................................................ i
Lời cảm ơn ................................................................................................................ ii
Mục lục

............................................................................................................... iii

Danh mục chữ viết tắt.................................................................................................. vi
Danh mục bảng .......................................................................................................... vii
Danh mục hình .......................................................................................................... viii
Danh mục hình .......................................................................................................... viii
Trích yếu luận văn ....................................................................................................... ix
Thesis abstract ............................................................................................................. xi
Phần 1. Mở đầu ...........................................................................................................1
1.1. Tính cấp thiết của đề tài ..........................................................................................1
1.2. Mục tiêu nghiên cứu ...............................................................................................2
Phần 2. Tổng quan tài liệu ..........................................................................................3
2.1. Giới thiệu về bệnh dịch tả vịt và virus gây bệnh dịch tả vịt ...........................................3
2.1.1. Lịch sử và phân bố bệnh ......................................................................................3
2.1.2. Truyền nhiễm học ................................................................................................5
2.1.3. Triệu chứng và bệnh tích .....................................................................................6
2.1.4. Biện pháp can thiệp và phòng bệnh dịch tả vịt .....................................................7
2.1.5. Chẩn đốn............................................................................................................8
2.2. Tình hình nghiên cứu về bệnh dịch tả vịt .............................................................14
2.2.1. Tình hình nghiên cứu về bệnh dịch tả vịt tại Việt Nam .......................................14
2.2.2. Những nghiên cứu về bệnh dịch tả vịt ở nước ngoài ...........................................16
2.3. Virus gây bệnh dịch tả vịt ....................................................................................18

2.3.1. Hình thái và kích thước ......................................................................................18
2.3.2. Cấu trúc .............................................................................................................18
2.3.3. Sức đề kháng .....................................................................................................20
2.3.4. Độc lực ..............................................................................................................20
2.3.5. Đặc tính ni cấy ...............................................................................................21
2.4. Miễn dịch chống virus dịch tả vịt ..........................................................................22
2.4.1. Đáp ứng miễn dịch không đặc hiệu ....................................................................22
iii

download by :


2.4.2. Đáp ứng miễn dịch đặc hiệu...............................................................................23
2.4.3. Độ dài miễn dịch...............................................................................................24
Phần 3. Vật liệu, nội dung và phương pháp nghiên cứu ..........................................27
3.1. Địa điểm và thời gian nghiên cứu ........................................................................27
3.2. Đối tượng và vật liệu nghiên cứu ..........................................................................27
3.3. Nội dung nghiên cứu ............................................................................................27
3.3.1. Kiểm tra một số đặc tính sinh học của chủng virus cường độc dịch tả vịt VG - 04
được lưu giữ ở dạng nước trứng và bệnh phẩm ở -860C sau 10 năm ....................27
3.3.2. Nghiên cứu một số đặc tính sinh học phân tử của chủng virus cường độc
dịch tả vịt VG – 04 ........................................................................................28
3.4. Phương pháp nghiên cứu ......................................................................................28
3.4.1. Phương pháp xác định khả năng thích ứng và ổn định của chủng virus...............28
3.4.2. Phương pháp xác định chỉ số ELD50 (liều gây chết 50% phôi) của chủng
virus cường độc dịch tả vịt VG - 04...............................................................29
3.4.3. Phương pháp xác định chỉ số EID50 (liều gây nhiễm 50% phôi) của chủng
virus cường độc dịch tả vịt VG - 04...............................................................29
3.4.4. Phương pháp xác định chỉ số LD50 (liều gây chết 50% động vật thí nghiệm)
trên vịt của chủng VG - 04 ............................................................................30

3.4.5. Nghiên cứu biến đổi bệnh lý trên vịt do chủng virus cường độc dịch tả ..............31
3.4.6. Phương pháp tách chiết DNA tổng số của virus .................................................34
3.4.7. Phản ứng PCR để khuếch đại đoạn gene US7 ....................................................34
3.4.8. Giải trình tự gene và xây dựng cây phả hệ..........................................................35
3.4.9. Phương pháp xử lý số liệu..................................................................................35
Phần 4. Kết quả và thảo luận ....................................................................................36
4.1. Kết quả kiễm tra một số đặc tính sinh học của chủng virus cường độc dịch tả vịt VG –
04 sau bảo quản ..............................................................................................36
4.1.1. Kết quả kiểm tra khả năng thích ứng và ổn định của chủng virus dịch tả vịt
cường độc VG-04 trên phôi vịt ......................................................................36
4.1.2. Kết quả đánh giá chỉ số ELD50 của chủng virus cường độc dịch tả vịt VG –
04 sau bảo quản ............................................................................................41
4.1.3. Kết quả đánh giá chỉ số EID50 của chủng virus cường độc dịch tả vịt VG –
04 sau bảo quản ............................................................................................46

iv

download by :


4.1.4. Kết quả đánh giá chỉ số LD50 của chủng virus cường độc dịch tả vịt VG – 04
sau bảo quản .................................................................................................49
4.1.5. Kết quả nghiên cứu biến đổi bệnh lý trên vịt do virus cường độc dịch tả vịt
chủng VG – 04 gây ra ...................................................................................53
4.2. Kết quả nghiên cứu một số đặc điểm sinh học phân tử của chủng virus cường
độc dịch tả vịt VG-04 ....................................................................................56
4.2.1. Kết quả khuếch đại trình tự đoạn gene US7 .......................................................56
4.2.2. Kết quả phân tích trình tự gene US7 ..................................................................57
4.2.3. Kết quả phân tích cây phả hệ (phylogenetic tree) dựa trên trình tự vùng .............60
Phần 5. Kết luận và đề nghị ......................................................................................61

5.1. Kết luận ................................................................................................................61
5.2. Đề nghị .................................................................................................................61
Tài liệu tham khảo .......................................................................................................63

v

download by :


DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT
bp

: Base pair

CPE

: Cytopathogenic effect

Cs

: cộng sự

DEF

: Duck Embryo Fibroblast

DEV

: Duck enteritis virus

DNA

: Deoxy ribonucleic acid

EID50

: 50 percent Embryo Infectious Dose

ELD50

: 50 percent Embryo Lethal Dose

FAO

: Food and Agriculture Organization

Kb

: Kilo base

LD50

: 50 percent Lethal Dose

MEM

: Minimum essential medium

NI

: Neutralization Index

OIE

: World Organisation for Animal Health

P

: page

PBS

: Phosphate Buffered Saline

PCR

: Polymerase chain reaction

RT-PCR

: Reverse Transcription – Polymerase chain reaction

SN

: Serum Neutralization

Tr

: trang

US

: Unique Short

VN

: Virus Neutralization

VSV-TN

: Vi sinh vật - Truyền nhiễm

vi

download by :


DANH MỤC BẢNG
Bảng 3.1.

Trình tự các cặp mồi được sử dụng trong nghiên cứu .............................35

Bảng 4.1.

Kết quả cấy truyền chủng virus dịch tả vịt cường độc VG – 04 trên
phôi vịt ...................................................................................................38

Bảng 4.2.

Kết qua kiểm tra bệnh tích đại thể trên phôi vịt sau khi gây nhiễm ..........39

Bảng 4.3.

Kết qua kiểm tra bệnh tích đại thể trên phơi vịt sau khi gây nhiễm
virus cường ............................................................................................40

Bảng 4.4.

Kết quả xác định chỉ số ELD50 của chủng virus cường độc dịch tả vịt......42

Bảng 4.5.

Kết quả xác định chỉ số ELD50 của chủng virus cường độc dịch tả vịt
VG - 04 sau bảo quản ở dạng nước trứng ................................................43

Bảng 4.6. Chỉ số ELD50 của chủng virus cường độc dịch tả vịt VG – 04 trước và
sau khi bảo quản .....................................................................................45
Bảng 4.7.

Kết quả xác định chỉ số EID50 của chủng virus cường độc dịch tả vịt
VG - 04 sau bảo quản ở dạng bệnh phẩm ................................................47

Bảng 4.8.

Kết quả xác định chỉ số EID50 của chủng virus cường độc dịch tả vịt
VG – 04 sau bảo quản ở dạng nước trứng ...............................................48

Bảng 4.9.

Chỉ số EID50 của chủng virus cường độc dịch tả vịt VG – 04 trước và

sau khi bảo quản .....................................................................................49

Bảng 4.10. Kết quả xác định chỉ số LD50 của chủng virus cường độc dịch tả vịt
VG – 04 sau bảo quản ở dạng bệnh phẩm ...............................................51
Bảng 4.11. Kết quả xác định chỉ số LD50 của chủng virus cường độc dịch tả vịt
VG - 04 sau bảo quản ở dạng nước trứng ................................................52
Bảng 4.12. Chỉ số LD50 của chủng virus cường độc dịch tả vịt VG – 04 trước và
sau khi bảo quản .....................................................................................53
Bảng 4.13. Mức độ tương đồng về trình tự nucleotide vùng gene US7 giữa chủng
virus dịch tả vịt cường độc VG- 04 trong nghiên cứu này với các
chủng virus dịch tả vịt tham chiếu khác trên thế giới ...............................58

vii

download by :


DANH MỤC HÌNH
Hình 2.1.

Các giai đoạn của phản ứng PCR.............................................................13

Hình 2.2.

Hệ gen của virus dich tả vịt .....................................................................19

Hình 4.1.

Phơi vịt bị nhiễm virus dịch tả vịt (bên trái) xuất huyết da .......................41

Hình 4.2.

Vịt ủ rũ, bỏ ăn, khó thở, liệt chân ............................................................54

Hình 4.3.

Vịt sưng mặt, chảy nước mắt, nước mũi ..................................................54

Hình 4.4.

Phân lỗng, màu trắng xanh ....................................................................54

Hình 4.5.

Xuất huyết thực quản, khí quản ...............................................................54

Hình 4.6.

Gan xuất huyết và hoại tử ........................................................................55

Hình 4.7.

Ruột xuất huyết hình vịng nhẫn ..............................................................55

Hình 4.8.

Dạ dày cơ và dạ dày tuyến xuất huyết......................................................55

Hình 4.9.

Gan thối hóa mỡ (HE40X) .....................................................................56

Hình 4.10.

Sung huyết biểu mơ khí quản và bong tróc (HE40X) ...............................56

Hình 4.11.

Tế bào biểu mơ khí quản bong tróc (HE10X) ..........................................56

Hình 4.12.

Xuất huyết ở hạ niêm mạc khí quản (HE40X) .........................................56

Hình 4.13.

Kết quả kiểm tra sản phảm PCR trên gel Agarose....................................57

Hình 4.14.

So sánh trình tự vùng gene US7 giữa chủng virus cường độc dịch tả
vịt VG - 04 trong nghiên cứu này với các chủng virus dịch tả vịt
tham chiếu khác trên thế giới ..................................................................59

Hình 4.15.

Mối quan hệ di truyền giữa chủng virus dịch tả vịt cường độc VG-04
trong nghiên cứu này với các chủng virus dịch tả vịt tham chiếu khác
trên thế giới dựa trên trình tự gene US7. .................................................60

viii

download by :


TRÍCH YẾU LUẬN VĂN
Tên tác giả: Vũ Thị Ngọc
Tên Luận văn: “Đánh giá một số đặc tính sinh học của chủng virus cường độc
dịch tả vịt VG – 04 sau bảo quản”.
Ngành: Thú Y

Mã số: 60 64 01 01

Tên cơ sở đào tạo: Học viện Nơng nghiệp Việt Nam
Mục đích nghiên cứu
Nghiên cứu này nhằm đánh giá được một số đặc tính sinh học và sinh học phân
tử của chủng virus dịch tả vịt cường độc VG – 04 sau thời gian bảo quản ở các dạng
lưu trữ khác nhau.
Phương pháp nghiên cứu
Trong nghiên cứu này chủng virus cường độc dịch tả vịt VG-04 đã được khảo
sát về một số đặc tính sinh học và sinh học phân tử.
Khả năng thích ứng và ổn định khi truyền đời qua phơi vịt của chủng virus cường
độc VG - 04 được đánh giá bằng phương pháp tiêm truyền trên trứng vịt có phôi 13
ngày tuổi. Các chỉ số như liều virus gây chết 50% phôi trứng (ELD50), liều virus gây
nhiễm 50% phôi trứng (EID50) và liều gây chết 50% động vật thí nghiệm (LD50) được
xác định theo phương pháp của Reed và Muench (1938).
DNA tổng số của virus được tách chiết rồi bổ sung trực tiếp vào ống phản ứng
PCR sử dụng kit AccuPower PCR PreMix (BIONEER). Kit này chứa DNA taqpolymerase và các thành phần cần thiết cho quá trình khuếch đại DNA. Sản phẩm PCR
sẽ được kiểm tra trên gel agarose và được gửi sang công ty Macrogen của Hàn Quốc để
giải trình tự gene.

Trình tự gene US7 sau khi được giải trình tự sẽ được phân tích bằng phần mềm
BioEdit và DNAstar và tiến hành so sánh với các trình tự gene tham chiếu khác được
cơng bố trên ngân hàng GenBank. Cây phả hệ (phylogentic tree) được xây dựng bằng
phần mềm MEGA6 sử dụng thuật toán Maximum Likelyhood.
Kết quả chính và kết luận
Kết quả nghiên cứu cho thấy chủng virus VG-04 có khả năng nhân lên và gây chết
phơi vịt, các chỉ số ELD50 và EID50 virus sau bảo quản ở -860C đối với cả 2 dạng bảo
quản (bệnh phẩm và nước trứng tươi) trên phôi vịt tương ứng là 105,29/0,2 ml; 107,56 /0,2
ml và 105,27/0,2 ml và 107,46/0,2ml. Kết quả gây nhiễm virus trên vịt cho thấy chủng

ix

download by :


virus dịch tả vịt cường độc VG-04 có khả năng nhân lên và gây chết vịt thí nghiệm với
các triệu chứng và bệnh tích đặc trưng. Chỉ số LD50 trên vịt của chủng virus VG-04
(bệnh phẩm và nước trứng tươi) là 109,13/0,5 ml và109,23/0,5 ml .
Kết quả phân tích về trình tự nucleotide của đoạn gene US7 cho thấy chủng virus
VG-04 có mức độ tương đồng 100% khi so sánh với chủng virus vacxin nhược độc dịch
tả vịt DP-EG-2000. Khi so sánh với các chủng virus dịch tả vịt tham chiếu khác trên thế
giới, tỷ lệ tương đồng về nucleotide giao động từ 96,5 – 99,6%.
Như vậy, sau bảo quản 10 năm ở -860C trong bệnh phẩm và ở dạng nước trứng
tươi, chủng virus VG-04 vẫn ổn định về đặc tính sinh học, có thể tuyển chọn làm chủng
cường độc chuẩn phục vụ cơng tác nghiên cứu về bệnh.
Từ khóa: Dịch tả vịt, VG-04, ELD50, EID50, LD50, gene US7

x

download by :

THESIS ABSTRACT
Author: Vu Thi Ngoc
Thesis title: “Evaluating some biological characteristics of duck viral enteritis VG-04
after storage”.
Specicalization: Veterinary medicine

Code: 60.64.01.01

Training Facility: Vietnam National University of Agriculture
Research purpose:
The purpose of this research is evaluating some biological characteristics of
duck viral enteritis VG-04 after storage time in different storage formats.
Research methods:
In this study, a virulent virus strain of VG-04 was examined for some biological
and molecular characteristics.
The indexes as as the fifty percent egg lethal dose (ELD50), 50% egg infectious
dose (EID50) and the 50% lethal dose (LD50) were determined by the method of Reed
and Muench (1938).
The total DNA of virus was extracted and then added directly into PCR
reaction tube and using AccuPower PCR Premix kit (Bioneer). This kit contains Taq
DNA polymerase and components-necessary for DNA amplification process. PCR
products will be checked on agarose gel and is sent to Macrogen Company located in
Korea To analyze GEN sequence.
US7 gene sequence after sequence analysis will be analyzed by DNAstar and
BioEdit software and then compared to the reference genome sequence which is
published in GenBank bank.
Phylogenetic tree is built by MEGA6 software and use algorithms MEGA6
Likelyhood Maximum. Ability to adapt and stabilize when transmitting of life through

duck embryo virulent strain VG - 04 were evaluated by means of infusion in
embryonated duck eggs 13 days old.
Main Results and Conclusions:
The result of this research showed that the virus strain VG-04 was capable of
being grown and developing stably on the 13 days old duck embryonated eggs,indexes
EID50 and ELD50 of viral after storage at -860C for all kinds of storage 2 (swabs and
water fresh eggs) were are105,29/0,2 ml; 107,56 /0,2 ml và 105,27/0,2 ml và 107,46/0,2ml,
respectively. The results of the experimental infection of ducks showed that the virus

xi

download by :


strain VG-04 could replicate and kill the ducks with typical symptoms and lesions. The
50% lethal dose (LD50) of the virus strain VG-04 for duck (swabs and water fresh eggs)
was about 109,13/0,5 ml.
The nucleotide (nt) sequence analysis of the US7 gene showed that duck viral
enteritis virus strain VG-04 was closely related to the live attenuated vaccine strain of
duck enteritis virus DP-EG-2000, sharing 100% similarity in nt.When comparing the
virus strain of VG-04 with other worldwide representative virus strains of duck viral
enteritis, the rate of nucleotide similarity ranged from 96.5 to 99.6%.
Therefore, after 10 years at -860C preservation of specimens and fresh eggs in
the form of water, strain VG-04 remained stable in biological characteristics, may be
less virulent strains selected as standards to study about such the disease.

xii

download by :

PHẦN 1. MỞ ĐẦU
1.1. TÍNH CẤP THIẾT CỦA ĐỀ TÀI
Chăn ni thủy cầm chiếm một vị trí quan trọng trong ngành chăn nuôi gia
cầm của Việt Nam, mang lại nguồn thu nhập quan trọng cho người chăn ni. Vịt
là lồi thuỷ cầm được chăn nuôi nhiều nhất. Việt Nam hiện thuộc tốp 10 quốc gia
có sản lượng thịt và trứng vịt lớn nhất thế giới. Năm 2014 tổng đàn gia cầm cả
nước đạt 328,1 triệu con, trong đó, tổng đàn thủy cầm là 86,2 triệu con, riêng đàn
vịt đạt trên 69 triệu con, đứng thứ 2 trên thế giới sau Trung Quốc (Nguyễn Văn
Tốn, 2014). Một trong những bệnh quan trọng nhất và gây thiệt hại kinh tế nặng
nề cho ngành chăn nuôi vịt ở Việt Nam và thế giới là bệnh dịch tả vịt (OIE,
2010). Virus gây bệnh dịch tả vịt là một loại DNA virus thuộc họ Herpesvirideae,
nhóm Herpesvirus. Bệnh gây nên tình trạng bại huyết, xuất huyết cho vịt với tỷ lệ
chết cao (Nguyễn Bá Hiên và Huỳnh Thị Mỹ Lệ., 2013). Theo Quyết định số
63/2005/QĐ - BNN và Quyết định số 64/2005/QĐ - BNN được Bộ Nông nghiệp
và Phát triển nông thôn ban hành ngày 13/10/2005 thì bệnh dịch tả vịt được coi là
bệnh truyền nhiễm nguy hiểm của động vật, phải áp dụng các biện pháp phòng
bệnh bắt buộc. Bệnh dịch tả vịt là một trong 7 bệnh phải tiêm phòng bắt buộc và
yêu cầu tỷ lệ tiêm phòng đạt 100%.
Thực trạng cho thấy ngành chăn nuôi vịt nước ta đang phải đương đầu với
nhiều thách thức. Với quy mô chăn nuôi lẻ tẻ, chủ yếu theo hộ gia đình, khơng có
tính tập trung nên việc phịng chống bệnh là hết sức khó khăn. Trong chăn nuôi
vịt, phương thức chăn nuôi, điều kiện chăn nuôi và vệ sinh phịng bệnh... giữa
các hộ chăn ni vịt rất khác nhau và những điều này đã ảnh hưởng rất lớn đến
hiệu quả của việc phòng chống dịch. Ở nước ta, bệnh dịch tả vịt vẫn thường
xuyên xảy ra ở nhiều địa phương nhưng khơng có những báo cáo thống kê cụ thể.
Nhận thức được tầm quan trọng của bệnh dịch tả vịt, đã có nhiều nghiên cứu về
bệnh dịch tả vịt và virus gây bệnh dịch tả vịt được tiến hành. Nhiều loại vacxin
dịch tả vịt cũng đã được nghiên cứu, sản xuất và lưu hành trên thị trường.
Thực tế cho thấy, yếu tố quyết định trong công tác phòng chống dịch bệnh

là vacxin nhưng để đánh giá được hiệu lực bảo hộ của vacxin dịch tả vịt thì việc
có được chủng virus dịch tả vịt cường độc phân lập từ thực địa đạt tiêu chuẩn
dùng cho phương pháp công cường độc để đánh giá chất lượng vacxin là vô
cùng quan trọng và cần thiết. Hiện tại khoa Thú y, Học viện Nông nghiệp Việt
1

download by :


Nam đang lưu giữ được chủng virus cường độc dịch tả vịt VG - 04 đạt tiêu
chuẩn để phục vụ nghiên cứu và giảng dạy. Tuy nhiên, những chủng virus này
nếu không được bảo quản tốt sẽ thay đổi đặc tính sinh học, nhất là độc lực và
tính kháng ngun.
Vì vậy chủng virus này cần được lưu giữ và bảo tồn trong điều kiện tối ưu
nhất, đảm bảo sự ổn định lâu dài các đặc tính sinh học của chủng. Xuất phát từ
tình hình thực tế, chúng tơi tiến hành đề tài “Đánh giá một số đặc tính sinh học
của chủng virus cường độc dịch tả vịt VG – 04 sau thời gian bảo quản”. Kết
quả của nghiên cứu này sẽ là cơ sở cho việc bảo tồn nguồn gen phục vụ công tác
nghiên cứu và giảng dạy tại khoa Thú y, Học viện Nông Nghiệp Việt Nam.

1.2. MỤC TIÊU NGHIÊN CỨU
Đánh giá được một số đặc tính sinh học và sinh học phân tử của chủng
virus dịch tả vịt cường độc VG – 04 sau thời gian bảo quản ở các dạng lưu trữ
khác nhau.

2

download by :

PHẦN 2. TỔNG QUAN TÀI LIỆU
2.1. GIỚI THIỆU VỀ BỆNH DỊCH TẢ VỊT VÀ VIRUS GÂY BỆNH
DỊCH TẢ VỊT
Dịch tả vịt (Pestisanatum) là một bệnh truyền nhiễm có tính lây lan mạnh
của loài thuỷ cầm do một loại Herpesvirus thuộc họ Herpesviridae gây ra. Bệnh
có triệu chứng chủ yếu là sốt cao, chảy nước mắt sưng đầu, chân mềm yếu, bại
liệt, phân xanh và có biến đổi bệnh lý xuất huyết nội tạng (Nguyễn Như Thanh
và cs., 2001).
2.1.1. Lịch sử và phân bố bệnh
Tại Hà Lan, bệnh dịch tả vịt lần đâu tiên được xác định trên một đàn vịt
năm 1923. Ở những vịt có triệu chứng ủ rũ, khát nước và chết sau 1 ngày không
phân lập được vi khuẩn nhưng vẫn gây bệnh cho vịt khỏe bằng nước chiết phủ
tạng của vịt ốm sau khi qua nến lọc Chamberland L3 (Baudet, 1923). Lần đầu
tiên virus được phân lập trên vịt năm 1943 (Boss, 1943) và được cấy truyền trên
vịt qua 18 đời. Nguyên nhân gây bệnh có tên chính thức là Duck virus enteritis
(DVE) tại hội nghị thú y thế giới lần thứ XIV (OIE, 2000).
Kể từ vụ dịch đầu tiên được phát hiện ở Hà Lan, bệnh đã nhanh chóng
được xác định tại các nước khác thuộc Châu Âu, như Bỉ (1964), Pháp (1970) sau
đó là ở Anh và Đức. Châu Mỹ, căn bệnh lần đầu tiên phát hiện năm 1967 tại New
York (Leibovitz and Hwang, 1967). Sau đó, nước Mỹ đã ghi nhận những vụ dịch
lớn gây ra do virus này như đợt dịch xảy ra năm 1973 ở miền nam Dakota với
gần 40% thủy cầm bị chết, hoặc năm 1979 tại Michigan. Ở Châu Á, bệnh lần đâu
tiên được ghi nhận ở Ấn Độ năm 1963, sau đó là Trung Quốc và Thái Lan
(Voxapeer, 1978).
Ở Việt Nam, những ca nhiễm bệnh do virus dịch tả vịt được ghi nhận từ
năm 1963, tuy nhiên tại thời điểm đó chưa phân lập được virus gây bệnh. Virus
lần đầu tiên được phân lập năm 1969 ở những đàn vịt mắc bệnh vùng Hà Nội và
có thể ni cấy trên màng niệu và xoang niệu phôi vịt 10 ngày tuổi (Trần Minh
Châu, 1980). Tiếp theo đó là những báo cáo về vịt nhiễm bệnh ở nhiều địa
phương khác trên cả nước như Thanh Hố, Ninh Bình, Vĩnh Phúc, Thái Bình,

Nghệ An, Hà Tĩnh, Quảng Bình, Cao Bằng, Hải Dương, Hưng Yên, Kiên Giang,
3

download by :


Hậu Giang, Đồng Tháp và Cần Thơ. Việt Nam là một trong những nước bị bệnh
dịch tả vịt gây thiệt hại nặng nề nhất (OIE, 2006).
Năm 1999, bệnh đã làm chết 51.752 trong tổng số 123.851 vịt. Năm 2000,
có 2.964 vịt chết vì bệnh dịch tả vịt trong tổng số 6.747 vịt. Năm 2001 phát hiện
có 24.478 vịt chết trong 46.993 vịt. Năm 2002, bệnh xảy ra ở 33.831 vịt gây chết
15.680 con và năm 2004 số vịt chết vì bệnh dịch tả vịt là 22.447 (bảng 2.1).
Như vậy, bệnh dịch tả vịt là căn bệnh cần được quan tâm, nghiên cứu sâu
nhằm góp phần giảm thiệt hại về kinh tế cho người chăn ni.
Bảng 2.1. Tình hình bệnh dịch tả vịt ở một số nước châu Á
Năm
1996

1997
1998

1999

2000

2001

2002
2003

2004

Quốc gia

Số vịt mắc bệnh (con)

Số vịt chết (con)

Malaysia

138400

22430

Singapore

3000

400

Trung Quốc

2000

1100

Ấn Độ

424

17

Malaysia

770

770

Malaysia

100

100

Ấn Độ

1215

119

Malaysia

2500

50

Nepal

100

74

Việt Nam

123851

51752

Ấn Độ

141

85

Việt Nam

6747

2964

Ấn Độ

1434

396

Malaysia

790

790

Thái Lan

1414

998

Việt Nam

46993

24478

Ấn Độ

1660

681

Việt Nam

33831

15680

Ấn Độ

2430

888

Thái Lan

3693

1121

Ấn Độ

2857

879

Thái Lan

4500

4120

Việt Nam

41762

22447

Nguồn: Annual animal disease status

4

download by :


2.1.2. Truyền nhiễm học
2.1.2.1. Loài mắc bệnh
Vịt trời, vịt mỏ nhọn và vịt đầu đỏ đều đều có thể mắc bệnh. Các loài thuỷ
cầm khác như ngan, ngỗng, thiên nga và một số loài chim hoang dã cũng cảm
nhiễm bệnh (Friend and Pearson, 1973; Docherty and Franson, 1992). Vịt là loài
cảm nhiễm nhất, các giống vịt ở mọi lứa tuổi đều có thể mắc bệnh. Tỷ lệ vịt mắc
bệnh và chết có thể lên tới 100%. Mức độ cảm nhiễm có thể khác nhau tùy theo
giống vịt trong đó lồi ít cảm nhiễm nhất với virus gồm giống vịt nhọn đi và
vịt xám (họ Anatideae) (Sandhu and Leibovitz, 2008). Ngồi 34 lồi thuộc bộ
Anseriformes cịn có thêm 14 lồi thuỷ cầm cảm nhiễm với bệnh dịch tả vịt
(Kaleta et al., 2007).
Trong phịng thí nghiệm, vịt con là động vật thí nghiệm cảm nhiễm nhất
đối với bệnh. Virus dịch tả vịt có khả năng nhân lên ở gà nhỏ hơn 2 tuần tuổi
(Jansen, 1968).
2.1.2.2. Mùa vụ phát bệnh
Dịch bệnh bùng phát phụ thuộc vào điều kiện thời tiết, mùa sinh sản của
vịt và ảnh hưởng của nhân tố stress, tuy nhiên thường nổ ra nhiều nhất vào tháng
4-6 hàng năm (Sarmah and Sarmah, 1996). Ở Việt Nam, bệnh xảy ra quanh năm
nhưng phát triển mạnh vào thời vụ chăn nuôi vịt và trùng với thời vụ thu hoạch
lúa thường là tháng 5-6 và 10-11 (Phạm Sỹ Lăng và Nguyễn Thiện, 2002).
2.1.2.3. Lứa tuổi mắc bệnh
Bệnh xảy ra ở vịt mọi lứa tuổi, tuy nhiên vịt từ 15 ngày tuổi trở đi bị
nhiễm nhiều nhất (Nguyễn Xuân Bình và cs, 2006).
2.1.2.4. Chất chứa virus
Ở vịt bị nhiễm bệnh, virus có trong máu, các cơ quan phủ tạng, nhiều nhất
là ở gan và lách. Tại Việt Nam đã nghiên cứu sự nhân lên của virus ở cơ thể vịt
bị gây nhiễm nhân tạo. Sau khi gây nhiễm virus 24 giờ, virus đã nhân lên, xâm

nhập vào máu nhưng số lượng cịn ít. Đến 48 giờ, virus đã xuất hiện trong nước
mắt, nước mũi. Và đến 72 giờ, khi vịt bị bệnh nặng, bắt đầu ỉa chảy thì tế bào
niêm mạc đường tiêu hố do tác động của virus bị huỷ hoại, tróc ra cùng với dịch
tiết có nhiều virus, theo phân bài xuất ra ngoài (Trần Minh Châu, 1987). Vịt bệnh
mang virus rất lâu và có thể tái phát bệnh ở thể ẩn tính.
Virus dịch tả vịt có thể tiềm tàng trong cơ thể vịt và có khả năng tái hoạt
5

download by :


động trở lại. Sau 3 tuần gây nhiễm khơng tìm thấy virus dịch tả vịt trong lỗ huyệt
nhưng 7-9 tuần sau gây nhiễm, DNA virus dịch tả vịt được xác định ở một số cơ
quan như não hạch lâm ba ngoại vi, lách, tuyến ức và túi Bursa.
2.1.2.5. Đường xâm nhập và cách lây lan
Virus xâm nhập chủ yếu trong tự nhiên qua đường tiêu hoá của vịt. Vịt
bệnh bài xuất căn bệnh theo phân, nước mắt, nước mũi làm ô nhiễm thức ăn nước
uống và bệnh lây lan sang vịt khoẻ và các động vật cảm nhiễm khác. Jansen
(1964) cho rằng, nguồn nước và các động vật thuỷ sinh trong đó cũng đóng vai trị
nhất định trong việc truyền lây căn bệnh. Khi dịch xảy ra, việc bán chạy vịt bệnh
và mổ thịt vịt ốm đều làm cho bệnh lan đi rất nhanh và xa. Bệnh lây lan rất nhanh
và mạnh theo phương thức truyền lây gián tiếp nhưng phương thức truyền lây trực
tiếp từ mẹ sang con cũng có thể xảy ra (Jansen, 1964; Burgess and Yuill, 1981).
Trong phịng thí nghiệm, có thể gây bệnh bằng cách tiêm dưới da, bắp thịt,
tiêm tĩnh mạch hoặc nhỏ mũi.
2.1.3. Triệu chứng và bệnh tích
2.1.3.1. Triệu chứng
Thời gian nung bệnh đối với bệnh dịch tả vịt là 3-4 ngày. Những biểu hiện
của vịt bệnh bao gồm lờ đờ, khơng thích vận động, không muốn xuống nước. Ở
vịt lớn khi lùa ăn một số con rớt lại sau đàn, có dấu hiệu liệt, thân nhiệt cao. Ở vịt

đẻ, virus gây giảm sản lượng trứng hoặc có khi ngừng đẻ. Vịt bệnh thường ủ rũ,
bỏ ăn, đứng một chân, đầu rúc vào cánh. Trong đàn vịt nhiều con có tiếng kêu
khản đặc. Vịt thường sưng mi mắt, niêm mạc mắt đỏ. Lúc đầu chảy nhiều nước
mắt làm ướt cả vùng lông dưới mi mắt. Sau nước mắt đặc lại có màu vàng như
mủ đóng đầy khoé mắt và có khi làm 2 mi mắt dính lại với nhau. Vịt bệnh có khi
khó thở, tiếng thở khò khè. Từ mũi chảy ra chất niêm dịch lúc đầu trong, sau đặc
lại. Nước mũi khô, quánh lại quanh khoé mũi. Nhiều con đầu sưng to, sờ nắn có
cảm giác đầu mềm như quả chuối chín. Hầu, cổ cũng có thể sưng do tổ chức liên
kết dưới da bị phù thũng. Lúc mới bị bệnh, vịt khát nên uống nhiều nước. Sau vài
ngày vịt ỉa chảy, phân rất lỗng, có mùi khắm và có màu trắng xanh. Hậu mơn
bẩn, lơng dính bết đầy phân (Nguyễn Như Thanh và cs., 2001).
Một số triệu chứng khác như sợ ánh sáng, có biểu hiện thần kinh cũng
được ghi nhận ở vịt bệnh. Vịt đực bị sa dương vật và niêm mạc có những vết loét
(Phạm Quang Hùng, 2003).
6

download by :


2.1.3.2. Bệnh tích
Vịt chết với các biểu hiện như xác chết gầy và bẩn; da vùng đầu, cổ, ngực,
bụng, đùi xuất huyết lấm tấm. Tổ chức liên kết dưới da vùng đầu, cổ thuỷ thũng,
có dịch trong suốt hơi hồng hoặc hơi vàng. Gan, lách, thận và cơ tim có biểu hiện
sưng, tụ huyết hoặc xuất huyết, ở gan có những điểm hoại tử màu trắng đục, to
bằng đầu đinh ghim hoặc to hơn (Trần Kim Anh, 2004).
Bệnh tích đặc trưng là ở đường tiêu hố có những chấm xuất huyết, nhiều
nhất là ở dạ dày tuyến và trực tràng, bên trên phủ lớp màng giả khó bóc. Ruột
non xuất huyết thành những vịng nhẫn nhìn từ ngồi vào thấy có màu nâu hoặc
tím rất đặc trưng (Trần Minh Châu, 1996).
2.1.4. Biện pháp can thiệp và phòng bệnh dịch tả vịt

2.1.4.1. Biện pháp can thiệp
Bệnh dịch tả vịt là bệnh do virus gây ra nên vẫn chưa có thuốc điều trị đặc
hiệu. Biện pháp tốt nhất nên tiêu hủy toàn bộ vịt bị bệnh quá nặng hoặc chết. Tuy
nhiên, với đàn vịt mới chớm mắc vài con thì có thể can thiệp bằng cách tiêm
vacxin nhược độc cho toàn đàn với liều gấp 2-3 lần liều sử dụng. Những vịt nào
đã bị nhiễm virus thì sẽ phát bệnh ngay, cịn những vịt chưa bị nhiễm virus sẽ
được bảo hộ bằng hiện tượng cản nhiễm. Nếu tiêm sớm và kết hợp với chăm sóc
đàn vịt tốt thì có thể cứu được tới 90% vịt (Trần Minh Châu, 1980). Nên tăng
cường thêm các biện pháp chăm sóc bồi dưỡng nhằm tăng cường sức đề kháng
cho vịt.
Phạm Gia Ninh và Nguyễn Đức Tâm (2002) cho rằng, vịt khoẻ mạnh có
tiếp xúc với mầm bệnh trong ổ dịch phải được tiêm phịng vì vịt phát triển miễn
dịch chỉ trong một ngày sau khi tiêm phòng.
2.1.4.2. Phòng bệnh
- Vệ sinh phòng bệnh: đối với những nơi chưa có bệnh tốt nhất nên tự túc
con giống. Khi tạo đàn không nên nhập chung nhiều đàn nhỏ lại. Lị ấp trứng
cũng khơng nên ấp trứng của q nhiều đàn. Sau mỗi lần ấp trứng cần tẩy uế lị
ấp rồi sát trùng kỹ bằng hơi formol. Khơng chăn vịt, ngan, ngỗng từ nơi có nhiều
nguồn nước chảy tới để đề phòng sự lây nhiễm qua nguồn nước. Tuyệt đối không
cho các loại gia cầm, thuỷ cầm khác vào trại. Nên tẩy uế sát trùng định kỳ
chuồng nuôi. Chuồng trại vịt bố trí cách xa khu dân cư. Cổng trại phải có hố sát
7

download by :


trùng (Chloramin 3%). Hạn chế người đi lại, người ra vào trại phải sát trùng giày
dép, tay chân (Phạm Quang Hùng, 2003; Lê Hồng Mận, 2005).
- Vacxin phòng bệnh: vacxin vơ hoạt và nhược độc được xử dụng để
phịng bệnh có hiệu quả bệnh dịch tả vịt. Vacxin vơ hoạt tạo được miễn dịch cho

đàn vịt nhưng hiệu lực thấp hơn so với vacxin nhược độc. Chủng virus nhược
độc được sử dụng để sản xuất vacxin, virus thích nghi trên phôi vịt, phôi gà, và tế
bào Fibroblast phôi gà một lớp. Vacxin có độ an tồn cao và hiệu lực tốt, thời
gian miễn dịch dài, sau khi tiêm vacxin 9 tháng vịt vẫn cịn miễn dịch. Vacxin sử
dụng an tồn với cả vịt con một ngày tuổi. Vacxin được chế biến dưới 2 dạng
vacxin tươi và vacxin đông khô (Lê Hồng Mận, 1999).
Những khuyến cáo về sử dụng vacxin đã được đưa ra bao gồm tiêm phòng
cho vịt con ngay sau khi vịt nở với đàn vịt ở vùng dịch bị uy hiếp hay tiêm phòng
cho vịt vào lúc vịt từ 2-3 tuần tuổi ở vùng không bị dịch uy hiếp. Sau khi vịt nở
từ đàn vịt bố mẹ đã được phòng bệnh dịch tả vịt. Sau 45 ngày cần tiêm lại và sau
1 năm thì cứ 6 tháng lại tiêm phòng 1 lần (Nguyễn Như Thanh và cs., 2001;
Phạm Quang Hùng, 2003 ). Vịt được tiêm phòng 2 lần trong năm ở thời điểm
cuối xuân đầu hè và sau lần tiêm thứ nhất 6 tháng (Lê Hồng Mận, 1999). Nguyễn
Xn Bình và cs (2006) cho rằng, khơng cần tiêm cho vịt con trước 2 tuần tuổi.
Do trong thời gian này, vịt con vẫn còn tồn tại kháng thể được truyền qua lịng đỏ
trứng nên có khả năng xảy ra phản ứng trung hoà làm giảm hiệu lực của vacxin.
Theo Quyết định số 63/2005/QĐ-BNN của Bộ Nông nghiệp và Phát triển Nơng
thơn việc tiêm phịng vacxin bắt buộc đối với bệnh dịch tả vịt gồm:
Đối tượng tiêm phòng: Vịt, ngan các lứa tuổi.
Phạm vi tiêm phòng: Các cơ sở chăn ni tập trung, chăn ni hộ gia đình
trong phạm vi cả nước.
Tiêm phòng định kỳ mỗi năm 2 lần, tuỳ theo lứa tuổi.
Liều lượng, đường tiêm, gia cầm trong diện tiêm theo sự hướng dẫn của
nhà sản xuất vacxin.
2.1.5. Chẩn đốn
Để chẩn đốn bệnh dịch tả vịt có nhiều phương pháp được sử dụng, dưới
đây là sơ đồ chẩn đoán bệnh dịch tả vịt theo tiêu chuẩn ngành của Bộ Nông
nghiệp và phát triển nông thôn 10 TCN 815-2006.

8

download by :


2.1.5.1. Chẩn đoán lâm sàng
Dựa vào dịch tễ, triệu chứng, bệnh tích đặc trưng của bệnh.
2.1.5.2. Chẩn đốn virus học
a. Phát hiện virus
- Mẫu gan, lách, thận được xử lý thành huyễn dịch 10% với PBS
(Phosphate Buffered Saline) có chứa 1.000.000 UI/lit Penicillin và 1000 mg/lit
Streptomycin.
- Ly tâm 2.000 vòng/15ph. Lấy dịch trong ở trên
- Kiểm tra vô trùng: Trên môi trường nước thịt BHI, hoặc trên môi trường
thạch máu.
b. Phân lập virus
* Phân lập trên vịt con
Tiêm huyễn dịch bệnh phẩm đã được xử lý như trên cho vịt con (0,7-1 kg)
với liều 0,5 ml/con vào dưới da hay bắp lườn. Nếu bệnh phẩm có virus dịch tả
vịt, vịt sẽ biểu hiện triệu chứng, bệnh tích đặc trưng của bệnh dịch tả vịt.
* Phân lập trên trứng vịt có phôi
Tiêm 0,2 ml huyễn dịch bệnh phẩm đã xử lý vào xoang niệu mô hoặc
màng nhung niệu phôi vịt 12-13 ngày. Virus dịch tả vịt gây chết phôi sau 4-10
ngày với đặc trưng: da phôi xuất huyết lan rộng. Thu hoạch gan phôi và nước
niệu để phân lập virus.
* Phân lập trên tế bào xơ phôi vịt (Duck Embryo Fibroblast-DEF)
Cấy tế bào DEF trên các lọ nuôi cấy T25 hoặc đĩa nuôi cấy (đĩa nuôi cấy 6
lỗ, 24 lỗ), sau 2-3 ngày tế bào mọc thành thảm (khoảng 70%) thì gây nhiễm
huyễn dịch bệnh phẩm đã xử lý: 500µl/lỗ hoặc lọ. Việc cấy chuyển 2 lần là cần
thiết trong quá trình phân lập.
Quan sát bệnh tích tế bào (CPE-Cytopathic pathogene effect): đặc trưng

với đám tế bào to, tròn và trở nên hoại tử sau 2-4 ngày sau đó.
Thu hoạch hỗn dịch tế bào, đông tan, ly tâm và thu phần nước trong cho
giám định virus.
c. Phương pháp giám định virus
9

download by :


* Phương pháp trung hồ trên trứng vịt có phơi (VN-Virus Neutralization).
- Chuẩn bị:
+ Pha loãng virus phân lập: Nồng độ 10-1-10-9 với dung dịch PBS.
+ Lô đối chứng dương: Trộn kháng huyết thanh dương tính dịch tả vịt với
các nồng độ virus đã pha loãng theo tỷ lệ 1:1.
+ Lơ đối chứng âm: Trộn huyết thanh âm tính với các nồng độ virus đã
pha loãng theo tỷ lệ 1:1.
+ ủ hỗn hợp trên ở nhiệt độ 370C/1h.
- Tiến hành:
+ Tiêm hỗn hợp trên vào xoang niệu mô phôi trứng (0,2ml/phôi),
5 phôi/nồng độ.
+ Phôi được ấp tiếp ở tủ ấp 370C trong 10 ngày. Loại bỏ những phôi chết
trước 24h.
+ Phơi chết trong 4-10 ngày, có bệnh tích cịi cọc, xuất huyết lan rộng.
- Đánh giá kết quả:
Tính tốn chỉ số trung hoà NI (neutralization index). Nếu kết quả phân lập
và giám định dương tính với kháng huyết thanh chuẩn (bằng phương pháp trung
hồ VN), kết luận có virus dịch tả vịt.
* Phương pháp trung hoà trên tế bào xơ phôi vịt (DEF).
- Chuẩn bị:
+ Tế bào DEF trên đĩa nuôi cấy tế bào 96 lỗ đã nuôi cấy được 2-3 ngày.

+ Pha loãng virus phân lập: các nồng độ 10-1-10-9 với môi trường MEM.
+ Lô đối chứng dương: Trộn kháng huyết thanh dương tính dịch tả vịt với
các nồng độ virus đã pha lỗng theo tỷ lệ 1:1.
+ Lơ đối chứng âm: trộn huyết thanh âm tính với các nồng độ virus đã pha
loãng theo tỷ lệ 1:1.
- Tiến hành:
+ Gây nhiễm hỗn hợp trên vào đĩa đã nuôi cấy tế bào DEF (đĩa 96 lỗ),
100µl/lỗ, 8 lỗ/nồng độ.

10

download by :


+ ủ đĩa nuôi cấy ở tủ ấm CO2 ở 370C/1h.
+ Đổ bỏ hỗn hợp trên, cho môi trường nuôi cấy MEM 100µl/lỗ.
+ Tiếp tục ủ đĩa ni cấy ở tủ ấm CO2 ở 370C.
+ Kiểm tra bệnh lý tế bào (CPE) trong 3-7 ngày với biểu hiện tế bào co
tròn và tụ lại thành đám, thời gian lâu tế bào có hiện tượng hoại tử.
- Đánh giá kết quả:
Tính tốn chỉ số trung hồ NI (neutralization index). Nếu thuỷ cầm chưa
tiêm phịng, phát hiện có kháng thể dịch tả vịt (bằng phương pháp trung hoà SN),
kết luận thủy cầm đã nhiễm virus dịch tả vịt.
2.1.5.3. Chẩn đoán bằng phương pháp PCR (Polymerase Chain Reaction)
Pritchard et al.1999 đã phát triển phương pháp PCR để phục vụ cho việc
phân lập virus dịch tả vịt ở Việt Nam. Phương pháp này cho phép phân biệt
nhanh và chính xác giữa bệnh dịch tả vịt với một số bệnh do Herpesvirus gia cầm
khác gây nên như bệnh Marek, bệnh viêm thanh khí quản truyền nhiễm và bệnh
do Herpesvirus gây ra ở ngỗng.
Một phản ứng PCR gồm có 6 thành phần tham gia:

1) DNA làm khuôn;
2) Hai đoạn mồi (bao gồm mồi xuôi và mồi ngược);
3) Enzym DNA-polymerase chịu nhiệt;
4) Môi trường đệm cung cấp ion Magiê (Mg++);
5) Phần nucleotid ở dạng deoxynucleotid (ký hiệu dNTP);
6) Nước tinh khiết.
Về nguyên lý, PCR là một phản ứng tổng hợp dây chuyền nucleic acid
tương tự xảy ra trong cơ thể sinh vật. Từ trình tự nucleotide của mạch DNA
khuân mẫu với sự xúc tác của enzyme DNA polymerase, một mạch DNA mới
được tổng hợp. Quá trình này cần sự hiện diện của những mồi chuyên biệt. Mồi
là những đoạn DNA ngắn, có khả năng bắt cặp bổ sung với một đầu của mạch
khuôn và DNA polymerase sẽ nối dài mồi để hình thành mạch mới. Nếu ta cung
cấp hai mồi chuyên biệt bắt cặp bổ sung với hai đầu của một trình tự DNA, ta sẽ
chỉ tổng hợp được đoạn DNA nằm giữa hai mồi này.
11

download by :


Về cơ chế, phản ứng tổng hợp dây chuyền có sự xúc tác của enzyme DNA
polymerase là sự hình thành cầu nối phospho-diester giữa nhóm OH đầu 3’ của
đoạn oligonucleotide mồi với nhóm Phosphate đầu 5’ mononucleotide cần gắn
vào và giải phóng pyrophosphate.
Trong q trình diễn ra phản ứng, trên lý thuyết, số lượng mạch DNA mới
được tổng hợp phụ thuộc vào số lượng khuân mẫu ban đầu và sẽ tăng lên theo
cấp số nhân ở mỗi chu kỳ tiếp theo, do một mạch DNA được tổng hợp ở chu kỳ
trước, sau khi biến tính, tham gia vào q trình tổng hợp ở chu kì lại trở thành 2
khuân mẫu để tạo nên 2 mạch DNA mới. Như vậy khoảng 20 chu kì, số lượng
bản sao mới được tổng hợp lên đến hàng triệu.
Trên thực tế, quá trình phản ứng diễn ra rất phức tạp, không giống nhau ở

mọi chu kì do sự thay đổi thành phần các chất tham gia phản ứng. Ở đây là sự
cân bằng thích hợp của các phân tử như sản phẩm mới được tổng hợp, khuân
mẫu, số lượng, hoạt tính DNA polymerase, mồi, các deoxyribonucleotide. Sự lai
giữa các phân tử DNA bổ sung với nhau có thể xảy ra giữa mồi và khuân mẫu,
mồi và sản phẩm mới hoặc giữa sản phẩm mới với sản phẩm mới thay đổi theo
mỗi chu kì.
Mỗi chu kì của phản ứng PCR gồm 3 giai đoạn:
Giai đoạn 1: giai đoạn biến tính, tất cả DNA mạch kép làm khuân mẫu ban
đầu hoặc sản phẩm mới được làm biến tính thành các mạch đơn bởi nhiệt độ cao
hơn nhiệt độ nóng chảy của các phân tử DNA, thường là 940C – 950C với thời
gian 30 giây- 1 phút. Ở nhiệt độ này các liên kết hydro giữa các base của 2 mạch
bổ sung bị phá hủy.
Giai đoạn 2: Giai đoạn lai, bắt cặp xảy ra khi nhiệt độ được hạ thấp đến
nhiệt độ thích hợp (thường thấp hơn nhiệt độ nóng chảy của mồi 50C) và mồi sẽ
bắt cặp với khuân mẫu. Trong thực nghiệm nhiệt độ này trong khoảng 40-700C
tùy thuộc vào nhiệt độ nóng chảy của mồi sử dụng.
Giai đoạn 3: Giai đoạn tổng hợp kéo dài nhiệt độ được tăng lên 720C là
nhiệt độ thích hợp nhất cho DNA polymerase hoạt động tổng hợp. DNA
polymerase kết hợp với phức hợp mồi – khuân nhận các deoxyribonucleotide tự
do ngồi mơi trường gắn vào đầu 3’của mồi và kéo dài sản phẩm (Kidd and
Ruano, 1995).
12

download by :