(LUẬN văn THẠC sĩ) nghiên cứu đặc tính phân tử và xác định phả hệ nguồn gốc của một số chủng parvovirus gây bệnh trên chó tại hà nội

HỌC VIỆN NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM

PHẠM HỒNG NGỌC

“NGHIÊN CỨU ĐẶC TÍNH PHÂN TỬ VÀ
XÁC ĐỊNH PHẢ HỆ NGUỒN GỐC CỦA MỢT SỚ
CHỦNG PARVOVIRUS GÂY BỆNH TRÊN CHĨ
TẠI HÀ NỘI”

Ngành:

Cơng nghê ̣ sinh ho ̣c

Mã số :

60 42 02 01

Người hướng dẫn khoa ho ̣c:

TS. Nguyễn Hữu Đức
TS. Đoàn Thi ̣Thanh Hương

download by :


NHÀ XUẤT BẢN HỌC VIỆN NÔNG NGHIỆP – 2019

download by :


LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan đây là kết quả nghiên cứu của riêng tôi. Các số liệu, kết quả
nêu trong luâ ̣n văn này là trung thực và chưa từng dùng để bảo vệ một học vị nào.
Tôi xin cam đoan rằng các thơng tin được trích dẫn trong luâ ̣n văn này đều được
chỉ rõ nguồn gốc và mọi sự giúp đỡ đều được cảm ơn.
Hà Nội, ngày

tháng

năm 2019

Tác giả luận văn

Phạm Hồng Ngọc

i

download by :


LỜI CẢM ƠN
Lời đầu tiên, tơi xin bày tỏ lịng kính trọng và biết ơn sâu sắc nhất tới TS. Đồn
Thị Thanh Hương – Trưởng phịng Miễn dịch học, Viện Công nghệ Sinh học và TS.
Nguyễn Hữu Đức – Trưởng bộ môn Công nghệ sinh ho ̣c Động Vâ ̣t, Khoa Công nghê ̣
sinh ho ̣c, Học viện Nông nghiệp Việt Nam là những người đã trực tiếp hướng dẫn, tận
tình chỉ bảo và tạo mọi điều kiện tốt nhất cho tôi được học tập và nghiên cứu trong suốt
quá trình thực hiện l ̣n văn.
Tơi cũng xin gửi lời cảm ơn sâu sắc tới các cô chú, anh chi ̣ cán bộ phịng Miễn
dịch học, Viện Cơng nghệ Sinh học đã ln tận tình chỉ bảo, động viên và cho tôi những
lời khuyên quý báu trong công việc cũng như cuộc sống.
Tiếp theo, tôi xin gửi lời cảm ơn đến các Thầy Cô trong khoa Công nghê ̣ Sinh ho ̣c

– Học viện Nông nghiệp Việt Nam, đã tận tình chỉ bảo cho tơi trong suốt q trình học
tập tại trường.
Tôi cũng xin được cảm ơn sự tài trợ của quỹ phát triển khoa học và công nghệ
quốc gia (NAFOSTED) cho đề tài mã số 106.02-2017.10 do TS. Đoàn Thị Thanh
Hương làm chủ nhiệm đã hỗ trợ cho tôi hồn thành nghiên cứu này.
Cuối cùng, tơi xin được bày tỏ lịng biết ơn vơ hạn đến Bố, Mẹ và tồn thể những
người thân trong gia đình cùng bạn bè đã ln hỗ trợ, động viên, khuyến khích tơi trong
suốt thời gian qua.
Tôi xin chân thành cảm ơn!
Hà Nội, ngày

tháng

năm 2019

Tác giả luận văn

Phạm Hồng Ngọc

ii

download by :


MỤC LỤC
Lời cam đoan .................................................................................................................i
Lời cảm ơn ................................................................................................................... ii
Mục lục ...................................................................................................................... iii
Danh mu ̣c bảng ............................................................................................................. v
Danh mu ̣c hı̀nh ............................................................................................................. vi

Danh mu ̣c chữ viế t tắ t..................................................................................................vii
Trı́ch yế u luâ ̣n văn ......................................................................................................viii
Thesis abstract .............................................................................................................. ix
Phần 1. Mở đầu ........................................................................................................... 1
1.1.

Mục tiêu .......................................................................................................... 2

1.2.

Nội dung.......................................................................................................... 2

Phần 2. Tổng quan tài liệu .......................................................................................... 3
2.1.

Lịch sử nghiên cứu về canine parvovirus ......................................................... 3

2.1.1.

Tình hình nghiên cứu trên thế giới ................................................................... 3

2.1.2.

Tình hình nghiên cứu tại Việt Nam .................................................................. 4

2.2.

Đặc điểm sinh học của parvovirus.................................................................... 4

2.2.1.

Cấu tạo chung .................................................................................................. 4

2.2.2.

Vị trí xếp loại................................................................................................... 6

2.2.3.

Nguồn gốc của các kiểu gen chủng CPV-2....................................................... 6

2.2.4.

Con đường xâm nhập và cách lây lan ............................................................... 8

2.2.5.

Cơ chế gây bệnh .............................................................................................. 8

2.2.6.

Triệu chứng lâm sàng và bệnh tích ................................................................... 9

2.2.7.

Các phương pháp chẩ n đoán .......................................................................... 10

2.2.8.

Vaccine phòng bệnh ...................................................................................... 11

Phần 3. Vật liệu và phương pháp............................................................................. 12
3.1.

Địa điểm, thời gian nghiên cứu ...................................................................... 12

3.2.

Vật liệu nghiên cứu........................................................................................ 12

3.2.1.

Nguyên liệu ................................................................................................... 12

3.2.2.

Dụng cụ và thiết bị......................................................................................... 12

3.2.3.

Hóa chất ........................................................................................................ 13

iii

download by :


3.3.

Phương pháp nghiên cứu ............................................................................... 14

3.3.1.

Phương pháp thu nhận mẫu ............................................................................ 14

3.3.2.

Phương pháp tách chiết dna tổng số ............................................................... 14

3.3.3.

Phương pháp PCR ......................................................................................... 16

3.3.4.

Phương pháp điện di trên gel agarose ............................................................. 17

3.3.5.

Phương pháp tinh sạch sản phẩm PCR ........................................................... 18

3.3.6.

Phân tích và xử lý số liệu ............................................................................... 18

Phần 4. Kết quả và thảo luận .................................................................................... 20
4.1.

Kế t quả thu nhâ ̣n dna tổ ng số ......................................................................... 20

4.2.

Kế t quả thu nhâ ̣n chuỗi gen VP2 .................................................................... 20

4.3.

Kế t quả giải trı̀nh tự và truy câ ̣p ngân hàng gen xác đinh
̣ chủng CPV............. 21

4.3.1.

Trı̀nh tự chuỗi gen Vp2 của mẫu TH1-VN ..................................................... 21

4.3.2.

Trı̀nh tự chuỗi gen VP2 của mẫu TH2-VN ..................................................... 24

4.3.3.

Trı̀nh tự chuỗi gen VP2 của mẫu HN-VN ...................................................... 27

4.4.

Phân tı́ch mức đô ̣ đồng nhất về nucleotide giữa các mẫu CPV hà nô ̣i so với các
chủng trên thế giới ......................................................................................... 30

Phần 5. Kết luận và kiến nghi ...................................................................................
42
̣
5.1.

Kế t luâ ̣n ......................................................................................................... 42

5.2.

Kiế n nghi .......................................................................................................
42
̣

Tài liệu tham khảo ....................................................................................................... 43

iv

download by :


DANH MỤC BẢNG
Bảng 3.1. Danh sách mẫu CPV thu thâ ̣p đươ ̣c ............................................................. 12
Bảng 3.2. Quy trình tách chiết DNA tổng số ................................................................ 15
Bảng 3.3. Thành phần của phản ứng PCR .................................................................... 17
Bảng 3.4. Chu trình nhiệt của phản ứng PCR ............................................................... 17
Bảng 3.5. Quy trình tinh sạch sản phẩm PCR .............................................................. 18
Bảng 3.6. Danh sách các chủng CPV sử du ̣ng trong nghiên cứu .................................. 19
Bảng 4.1. Nồ ng đô ̣ DNA của các chủng nghiên cứu .................................................... 20
Bảng 4.2. Bảng so sánh tỷ lê ̣ đồ ng nhấ t nucleotide và tỷ lê ̣ tương đồ ng amino acid
của các chủng CPV...................................................................................... 39

v

download by :

DANH MỤC HÌ NH
Hình 2.1. Cấu trúc capsid của CPV ............................................................................. 5
Hình 2.2. Một số q trình tiến hố của CPV-2 ở chó ................................................. 7
Hı̀nh 2.3. Vi ̣ trı́ Parvovirus tấ n công trên các nhung mao ruô ̣t gây x́ t hú t
niêm ma ̣c r ̣t ............................................................................................. 9
Hình 2.4. Triệu chứng khi mắc bệnh Parvo ở chó...................................................... 10
Hı̀nh 3.1. Mô ̣t sô trang thiế t bi trong
phòng thı́ nghiê ̣m ............................................. 13
̣
Hı̀nh 3.2. Sơ đồ quy trı̀nh thı́ nghiêm
̣ ........................................................................ 17
Hı̀nh 4.1. Kế t quả điê ̣n di sản phẩ m PCR thu nhận vùng gen VP2 ............................. 20
Hı̀nh 4.2. Kế t quả BLAST mẫu TH1-VN .................................................................. 23
Hı̀nh 4.3. Kế t quả BLAST của mẫu TH2-VN ............................................................ 26
Hı̀nh 4.4. Kế t quả BLAST của mẫu HN-VN ............................................................. 29
Hình 4.5. So sánh trình tự chuỗi nucleotide của gen VP2 các mẫu CPV phân lập
tại Hà Nô ̣i – Việt Nam với các chủng trên thế giới..................................... 35
Hình 4.6. So sánh trình tự chuỗi amino acid của gen VP2 các mẫu CPV phân lập
tại Hà Nô ̣i – Việt Nam với các chủng trên thế giới..................................... 38
Hình 4.7. Cây phả hệ xác định mối quan hệ về loài và genotype giữa các chủng
CPV nghiên cứu và các chủng CPV khác .................................................. 38

vi

download by :


DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT

Chữ viết tắt

Nghĩa Tiếng Việt

µl

Microlitre

bp

Base pair

ddNTP

dideoxynucleoside

nm

Nanomet

CPV

Canine Parvovirus

DNA

Deoxyribose Nucleic Acid

HA

Haemagglutination

ORF

Open Reading Frame

PCR

Polymerase Chain Reaction

vii

download by :


TRÍ CH YẾU LUẬN VĂN
Tên tác giả: Pha ̣m Hồ ng Ngo ̣c
Tên Luận văn: Nghiên cứu đặc tính phân tử và xác định phả hệ nguồn gốc của mô ̣t sớ
chủng Parvovirus gây bệnh trên chó tại Hà Nội
Ngành: Công nghê ̣ sinh ho ̣c

Mã số: 60420201

Tên cơ sở đào tạo: Học Viện Nơng Nghiệp Việt Nam
Mục đích nghiên cứu
Giải mã toàn bộ gen kháng nguyên VP2 của các mẫu CPV thu nhận tại Hà Nội.
Từ đó xác định genotype và nguồn gốc phả hệ của các chủng CPV đang lưu hành.
Phương pháp nghiên cứu
Nghiên cứu gồm 03 nô ̣i dung là giải mã gen kháng nguyên VP2, xác đinh
̣ kiể u

gen và mối quan hê ̣ di truyền của một số chủng CPV đang lưu hành tại Hà Nội. Vâ ̣t liệu
nghiên cứu là phân của chó nghi nhiễm Parvovirus đươ ̣c thu nhâ ̣n tại các phòng khám
thú y trên địa bàn Hà Nô ̣i. Nghiên cứu sử du ̣ng các phương pháp sinh học phân tử bao
gồ m tách chiế t DNA tổ ng số , PCR, điê ̣n di, giải trı̀nh tự trực tiế p, so sánh trı̀nh tự
nucleotide với các chủng của thế giới và xây dựng cây phân loa ̣i bằ ng các phầ n mề m tin
sinh ho ̣c.
Kết quả chính và kết luận
Thu nhâ ̣n và giải trı̀nh tự toàn bô ̣ ch̃i gen VP2 (gờ m 1755 bp, mã hóa cho 584
amino acid) của ba mẫu CPV thu nhận tại Hà Nội. Xác đinh
̣ đươ ̣c kiể u gen của ba mẫu
trong nghiên cứu là CPV-2c và có tỷ lệ đồng nhất cao về nucleotide (từ 98% đến
100%) so với các chủng trên thế giới. Xây dựng đươ ̣c cây phả hê ̣ nguồ n gố c của ba mẫu
CPV thu nhận ta ̣i Hà Nô ̣i với 30 chủng CPV trên thế giới. Từ đó, xác đinh
̣ ba mẫu trong
nghiên cứu có sự tương đờ ng cao với các chủng CPV Trung Quố c về mă ̣t di truyề n.

viii

download by :


THESIS ABSTRACT
Master candidate: Pham Hong Ngoc
Thesis title: Molecular characterization and phylogenic analysis of Canine Parvovirus
strains collected from Hanoi.
Major:Biotechnology

Code: 60420201

Educational organization: Vietnam National University of Agriculture (VNUA)

Research Objectives
Sequencing the antigen VP2 of CPV collected in Hanoi. Thereby identifying
genotypes and genealogy orgin of CPV strains in Hanoi.
Materials and Methods
The study includes 3 contents: sequencing antigen VP2, identifying genotypes
and genetic relationships of some CPV strains in Ha Noi. Research materials are the
faecal samples from parvovirus suspected dogs collected in Hanoi. The study uses
molecular biological methods including total DNA extraction, PCR, electrophoresis,
sequencing, comparing nucleotide sequences and phylogenetic analysis base on using
bioinformatic software.
Main findings and conclusions
Collecting and sequencing the entire VP2 gene (including 1755 bp, encoded for
584 amino acids) of the three CPV samples collected in Hanoi. The gene of the three
samples was identified as CPV-2c and had a high similarity (from 98% to 100%)
compared to the orther strains in the world. Phylogenetic analysis was built with three
CPV samples collected in Hanoi and 30 CPV strains in the world. Three samples in the
study were identified to has a high similarity to the genetically Chinese CPV strains.

ix

download by :


PHẦN 1. MỞ ĐẦU
Bệnh Parvo là một bệnh truyền nhiễm rất nghiêm trọng và nguy hiểm, có tỷ
lệ tử vong cao ở chó. Nguyên nhân của bệnh do Canine Parvovirus type 2 (CPV2) gây ra với đặc trưng là các dấu hiệu sốt, biếng ăn, giảm căn, viêm dạ dày, ruột.
Triệu chứng lâm sàng rõ ràng nhất ở chó con là nôn mửa, tiêu chảy.
Bệnh xuất hiện lần đầu tiên vào những năm 1970, lây nhiễm cho những
con chó ni trong nhà và nhanh chóng lan rộng trên tồn thế giới, và được xác
định là do CPV type 2 (CPV-2) gây ra. Tuy nhiên, cuối những năm 1980,

genotype CPV-2 đã hoàn toàn bị thay thế bởi một loại biến thể kháng nguyên
mới, được gọi là CPV-2a. Các tác giả đã chỉ ra 5 vị trí sai khác về amino acid ở
protein VP2 giữa các chủng CPV-2a và các chủng CPV-2 (Parrish et al., 1991).
Tiếp theo, trong khoảng thời gian từ năm 1984 đến năm 2000, trên thế giới, đã
xuất hiện thêm các biến thể mới bao gồm CPV-2b và CPV-2c. Trong đó CPV-2b
lần đầu tiên được phát hiện năm 1984 tại Mỹ (Parrish et al.,, 1991) và CPV-2c
lần đầu tiên được phát hiện năm 2000 tại Italia (Buonavoglia et al., 2001). Ở
Châu Á, các cơng bố về CPV vẫn cịn hạn chế. Các công bố gần đây cho thấy
CPV-2a và CPV-2b đã có mặt tại Trung Quốc (Zhong et al., 2014), CPV-2b có
mặt ở Hàn Quốc (Park et al., 2012) và CPV-2c có mặt ở Đài Loan (Chiang et al.,
2016). Tại Việt Nam, cho đến nay, các nghiên cứu về canine parvovirus chưa có
nhiều, và mới chỉ tập trung ở các nghiên cứu về bệnh lý và triệu chứng lâm sàng
(Hồ Đình Chúc và cs., 1993; Lê Thị Tài, 2006; Nguyễn Thị Lan và Khao
KEONAM, 2012; Nguyễn Thị Lan và Trần Trung Kiên, 2010). Nghiên cứu về
sinh học phân tử của CPV-2 được Nakamura và cộng sự tiến hành từ 2004 trên
các mẫu bệnh phẩm của chó và mèo tại thành phố Hồ Chí Minh (Nakamura et al.,
2004). Nghiên cứu này chỉ phát hiện có sự lưu hành của duy nhất biến thể CPV2b và cho rằng đây là loại virus phổ biến tại Việt Nam. Cũng tại thành phố Hồ
Chí Minh, cơng bố năm 2018 của Nguyễn Văn Dũng và cộng sự đã xác định các
chủng CPV đang lưu hành thuộc CPV-2c. Tuy nhiên, cho đến nay vẫn chưa có
nghiên cứu nào về CPV tại các địa phương khác của Việt Nam ngồi thành phố
Hồ Chí Minh.
Vì vậy, chúng tôi tiến hành nghiên cứu đề tài “Nghiên cứu đặc tính phân
tử và xác định phả hệ nguồn gốc của một số chủng Parvovirus gây bệnh trên

1

download by :


chó tại Hà Nội” nhằm xác định các genotype CPV gây bệnh trên chó đang lưu

hành tại Hà Nội.
1.1.

MỤC TIÊU

Giải mã toàn bộ gen kháng nguyên VP2 của các mẫu CPV thu nhận tại
Hà Nội. Từ đó xác định genotype và nguồn gốc phả hệ của các chủng CPV
đang lưu hành.
1.2.

NỘI DUNG

- Giải mã gen kháng nguyên VP2 của một số chủng CPV đang lưu hành
tại Hà Nội.
- Xác định kiểu gen của một số chủng CPV đang lưu hành tại Hà Nội.
- Xác định mối quan hệ di truyền của một số chủng CPV đang lưu hành tại
Hà Nội với các chủng CPV trên thế giới.

2

download by :


PHẦN 2. TỔNG QUAN TÀI LIỆU
2.1. LỊCH SỬ NGHIÊN CỨU VỀ CANINE PARVOVIRUS
2.1.1. Tình hình nghiên cứu trên thế giới
Trong những năm 1970, CPV-2 xuất hiện như một loại virus mới đối với chó
ni trong nhà, và lan rộng sang châu Á, Úc, New Zealand, châu Mỹ và châu Âu vào
đầu năm 1978 (Parrish et al., 1988, 1999). Loại virus này được xác định là CPV-2 để
phân biệt nó với virus nguyên thủy (MVC) hay còn được gọi là CPV type 1 (CPV-1)

(Carmichael et al., 1994). Nghiên cứu mối quan hệ phát sinh lồi cho thấy CPV-2 có
khả năng xuất hiện vài năm trước khi lan rộng toàn cầu trên chó vào năm 1978 và
1979 (Parrish et al., 1988; Shackelton et al., 2005; Hoelzer et al., 2008b). Kết quả
kiểm tra kháng thể cho thấy có sự xuất hiện của CPV-2 ở Hy Lạp và Bỉ từ năm 1974
đến năm 1976 (Schwers et al., 1979; Koptoulos et al., 1986), trong khi lần đầu phát
hiện CPV-2 ở Mỹ, Nhật Bản và Úc vào đầu năm 1978 (Parrish, 1999). Kể từ đấy,
virus đã phổ biến trên chó trên tồn cầu (Parrish, 1999). Năm 1979, những con sói
hoang dã ở Mỹ cũng bị lây nhiễm nặng (Thomas et al., 1984).
Tuy nhiên, chỉ sau khi xuất hiện từ 2-3 năm, CPV-2a đã thay thế toàn bộ
CPV-2 ở các nước này cũng như ở Pháp và Đan Mạch (Parrish et al., 1988). Các
tác giả đã chỉ ra 5 vị trí sai khác về amino acid ở protein VP2 giữa các chủng
CPV-2a và các chủng CPV-2 (Parrish et al., 1991).
Ngồi loại kháng ngun CPV-2a, cịn có hai loại biến thể kháng nguyên
khác là CPV-2b (hoặc VP2 426Asp) và CPV-2c (hoặc VP2 426Glu). CPV-2b lần
đầu tiên được phát hiện năm1984 tại Mỹ (Parrish et al., 1991b) và CPV-2c được
nhận dạng năm 2000 tại Ý (Buonavoglia et al., 2001). Tuy nhiên, theo nghiên cứu
của Decaro và cs năm 2007 cho thấy dòng CPV-2c lâu nhất đã được phân lập
năm 1996. Đây là bằng chứng cho thấy biến thể này đã được lưu hành ở Đức 4
năm trước khi được phát hiện lần đầu tiên ở Ý.
Kiểm tra huyết thanh thu được từ chó sói hoang dã (Canis latrans) giữa
năm 1979 và 1984 tại Mỹ cũng chỉ ra rằng chúng ban đầu đã bị nhiễm CPV-2
(Thomas et al., 1984), nhưng sau năm 1980 chó sói con đã bị nhiễm với CPV-2a
và CPV-2b (Parrish et al.,1988).
Các kiể u gen khác nhau của CPV-2 được xác định ở một số vị trí quan
trọng trên gen kháng nguyên VP2. Cụ thể như sau: giữa CPV-2a và CPV-2 được

3

download by :

phân biệt ở bốn vị trí Leu 87 Met, Thr 101 Ile, Gly 300 Ala và Tyr 305 Asp.
Giữa các genotype CPV-2a, 2b và 2c được xác định ở vị trí 426 (Asn ở CPV-2a,
Asp ở CPV-2b và Glu ở CPV-2c), là vị trí quan trọng trên gen kháng nguyên
VP2 của parvovirus (Martella et al., 2006; Miranda and Thompson, 2016). Mặc
dù các triệu chứng lâm sàng của chó nhiễm CPV-2c cũng tương tự như với chó
nhiễm CVP-2a và CPV-2b bao gồm chán ăn, nơn mửa, viêm dạ dày, ruột cấp
tính, tiêu chảy, đi ngoài ra máu nhưng mức độ bệnh nặng hơn và nguy hiểm hơn
(Aldaz et al., 2013; Decaro et al.,, 2008).
2.1.2. Tình hình nghiên cứu tại Việt Nam
Cho đến hiện nay, đã có một số nghiên cứu về bệnh Parvo trên chó, tuy
nhiên các nghiên cứu này mới chủ yếu tập trung vào khảo sát tỉ lệ nhiễm bệnh ở
một số tỉnh và khu vực (Trần Ngọc Bích et al., 2013; Nguyễn Thị Yến Mai et al.,
2018). Những nghiên cứu về virus gây bệnh, đặc biệt là các nghiên cứu về sinh
học phân tử chưa có nhiều.
Nakamura et al., 2004 đã công bố một nghiên cứu trên các mẫu CPV của
chó và mèo. Nghiên cứu này đã cho thấy có sự xuất hiện của chủng CPV-2b xuất
hiện ở Việt Nam. Nghiên cứu cũng chỉ ra rằng có thể sẽ có sự tiến hóa của chủng
CPV tại Việt Nam. Khảo sát mới nhấ t trên chó ta ̣i thành phố Hồ Chí Minh cho
thấy có 2 chủng CPV-2a và CPV-2c đang lưu hành trong đó CPV-2c có xu
hướng vượt trội (Nguyễn Văn Dũng, 2017; Nguyễn Văn Dũng và cs., 2018).
Nghiên cứu gần đây của Đoàn Thị Thanh Hương và cộng sư ̣ đã phát hiê ̣n
chủng Parvovirus type 2c đang lưu hành ta ̣i Hà Nội (Đoàn Thi ̣ Thanh Hương và
cs., 2018).
2.2. ĐẶC ĐIỂM SINH HỌC CỦA PARVOVIRUS
2.2.1. Cấu tạo chung
Canine Parvovirus có đường kính nhỏ (~25 nm), khơng có vỏ bao
phủ. Cấu trúc ba chiều của CPV-2 đã được xác định nhờ sử dụng tia X (Tsao et
al., 1991; Xie and Chapman, 1996). Loại virus này có bộ gen DNA thẳng, sợi
đơn âm, kích thước khoảng 5.2kb, chứa hai khung đọc mở (ORF). Một trong số

đó mã hóa các protein khơng cấu trúc NS1NS2 và một khung khác mã hóa hai
protein cấu trúc khác VP1 và VP2. Ở hai đầu của hệ gen, cấu trúc kẹp tóc đọc
xi ngược giống nhau có 150 base được sử dụng cho việc tái bản DNA virus
(Reed et al., 1988; Parrish, 1999).

4

download by :


Capsid chứa 60 tiểu đơn vị protein của VP1 (5-6 bản) và VP2 (54-55 bản),
những protein khác có chung cấu trúc. Các vùng mã hóa cho VP1 (727 amino
acid) và VP2 (584 amino acid) chồng lên nhau, trừ một vùng đầu N duy nhất có
143 amino acid ở VP1 (Tsao et al., 1991; Agbandje et al., 1993). Hai protein cấu
trúc được tạo ra bằng cách nối tiếp các mRNA của virus (Reedet et al., 1988;
Wang et al., 1998; Parrish and Kawaoka, 2005). Protein VP2 có thể được cắt gần
đầu N của nó bằng các proteaza của vật chủ để tạo ra một protein cấu trúc khác,
VP3, chỉ xuất hiện trong các virion hồn chỉnh (chứa DNA).
Các protein capsid có một lõi trung tâm gồm tám đoạn xoắn, β-barrel không
song song với vòng linh hoạt giữa các sợi β tương tác để tạo thành hầu hết các
capsid bề mặt. Các đặc điểm bề mặt của capsid bao gồm một vùng nhọn dài 22 Å
trên trục gấp ba lần, một trũng sâu 15 Å (hẻm núi) xung quanh cấu trúc hình trụ ở
trục gấp năm lần và một trũng sâu 15 Å (chỗ trũng) ở trục gấp hai lần. Ngoài ra, trục
gấp ba lần là vùng kháng nguyên nhất của capsid và hoạt động như một mục tiêu để
trung hòa các kháng thể (Tsao et al., 1991; Agbandje et al., 1993).

Hình 2.1. Cấu trúc capsid của CPV (Xie Q. và Chapman, 1996).
Nguồn: />
5

download by :


2.2.2. Vị trí xếp loại
CPV-2 thuộc chi Protoparvovirus, họ Parvoviridae, đã được đưa vào trong
loài Carnivore protoparvovirus 1 theo Uỷ ban quốc tế về phân loại virus (Tijssen et
al., 2011).
2.2.3. Nguồn gốc của các kiểu gen chủng CPV-2
Mối quan hệ phát sinh lồi giữa các CPV-2 phân lập từ chó và các virus từ
mèo (FPV), chồn (MEV), chó gấu mèo (RDPV) và cáo xanh (BFPV) cho thấy rằng
tất cả các chủng CPV xuất phát từ một tổ tiên chung và các chủng này rất giống với
virus từ các động vật hoang dã bao gồm gấu mèo và cáo (Allison et al., 2012, 2013).
CPV-2 có khả năng xuất hiện khi có đột biến cho phép liên kết với thụ thể
transferrin của chó (TfR) type 1 (Truyen et al., 1996a; Shackelton et al., 2005;
Allison et al., 2012). Một số nghiên cứu đã chứng minh rằng TfR đóng vai trị
quan trọng trong tính nhạy cảm của các tế bào nhiễm virus này (Hueffer et al.,
2003; Palemo et al., 2006).
CPV-2 và FPV giống nhau 98% trình tự DNA, nhưng có các vật chủ riêng,
tính kháng nguyên và haemagglutination (HA) được kiểm soát bởi capsid protein
(Chang et al., 1992; Truyen et al., 1995; Shackelton et al., 2005). Việc trao đổi
chéo thành cơng và thích nghi với vật chủ mới có liên quan đến sự thay đổi một
vài amino acid (Truyen et al.,1995). Sự thay đổi về gen này đã đủ để CPV-2 có
được vật chủ chó, nhưng lại mất khả năng tái bản trên mèo (Chang et al., 1992;
Truyen and Parrish, 1992). Ba sự khác biệt ở VP2 amino acid 93 (Lys sang Asn),
103 (Val sang Ala), 323 (Asp sang Asn) giữa FPV và CPV-2 bắ t đầu cho sự thay
đổi vật chủ sang chó. Sự thay đổi của VP2 amino acid 80 (Lys sang Arg), 564
(Asn sang Ser) và 568 (Ala sang Gly) liên quan đến việc mất khả năng tái bản
trên mèo (Truyen et al., 1994) và được thể hiện ở Hình 2.2. Tuy nhiên, amino
acid 232 (Val sang Ile) và 375 (Asp sang Asn) cũng thay đổi giữa các trình tự
của FPV và CPV-2. Biến thể amino acid 375 chỉ tìm được một số dòng phân lập

ban đầu của CPV-2 và các biến thể sau của CPV lại quay về Asp, có thể thấy
375Asn không quan tro ̣ng trong viê ̣c thay đổ i vâ ̣t chủ từ mèo sang chó của CPV
trong tự nhiên. Mă ̣t khác, amino acid VP2 375 cùng với VP2 323 xác định độ pH
của HA (Parrish, 1991a,b; Chang et al., 1992).
Sự tiến hóa tồn cầu trong tự nhiên của CPV-2 bằng CPV-2a trong thời gian 23 năm cho thấy CPV-2a có lợi thế dịch tễ học mạnh mẽ hơn CPV-2 (Parrish et al.,
1988). CPV-2a trở thành dịng chủ yếu mới và trải qua q trình tiến hóa xa hơn

6

download by :


nữa, tăng số đột biến điểm trong nhiều dòng khác. Một vài đột biến đã làm thay đổi
tính kháng nguyên của capsid và có tần số cao trong quần thể virus (Maya et al.,
2013). Chủng CPV-2a xuất hiện năm 1979 chỉ khác năm hoặc sáu amino acid so với
CPV-2 (Parrish et al., 1991b). Sự thay đổi amino acid 87 (Met sang Leu), 300 (Ala
sang Gly) và 305 (Asp sang Tyr) cho phép CPV-2a tái bản được trên mèo (hình 2.2).
Các thay đổi khác cũng xảy ra trong gene protein capsid giữa CPV-2 gốc và CPV2a, amino acid 101 (Ile sang Thr), 297 (Ser sang Ala) và 555 (Val sang Ile) (Tsao et
al., 1991; Agbandje et al., 1993; Truyen et al.,1996a).

Hình 2.2. Một số q trình tiến hố của CPV-2 ở chó.
Ng̀ n: />Chú thích: Các số trên hình là vị trí amino acid của CPV và FPV

Ngồi CPV-2a, cịn có hai loại biến thể kháng nguyên khác là CPV-2b
(hoặc VP2 426Asp) và CPV-2c (hoặc VP2 426Glu). CPV-2b lần đầu tiên được
phát hiện năm 1984 tại Mỹ (Parrish et al., 1991b) và CPV-2c được phát hiện tại
Ý năm 2000 (Buonavoglia et al., 2001). Tuy nhiên, nghiên cứu của Decaro và cs
cho thấy dòng CPV-2c lâu nhất đã được phân lập năm 1996, do đó cung cấp bằng
chứng cho thấy biến thể này đã được lưu hành ở Đức 4 năm trước khi được phát
hiện ở Ý (Decaro et al., 2007).

7

download by :


Sự khác biệt giữa ba loại biến thể kháng nguyên có liên quan sự thay đổi
tại vị trí amino acid 426 (Asn ở CPV-2a, Asp ở CPV-2b và Glu ở CPV-2c). Sự
đột biến này ảnh hưởng đến vùng kháng nguyên chính (nhân tố quyết định kháng
nguyên A), nằm trong protein VP2.
Từ phân tích trình tự DNA của CPV-2a và CPV-2b, đã cho thấy biến thể
thứ hai khác biệt chỉ có hai amino acid so với biến thể đầu tiên trong protein
VP2. Hai thay đổi cụ thể của CPV-2b đã dẫn đến sự khác biệt ở VP2 426 và 555
trong vùng VP2 (Hình 2.2). Tuy nhiên, chỉ có sự khác biệt ở amino acid 426
đươ ̣c công nhận là nhân tố quyết định kháng nguyên cho CPV-2b (Parrish et al.,
1991b). Vì CPV-2b và CPV-2c khác với CPV-2a chỉ ở một vị trí duy nhất (VP2
426), hiện nay một số tác giả chỉ coi chúng là các biến thể của CPV-2a thay cho
các dòng phụ (Organtini et al., 2015).
2.2.4. Con đường xâm nhập và cách lây lan
Canine Parvovirus lây lan qua tiếp xúc miệng với phân bị nhiễm hoặc bề mặt
bị ô nhiễm (ví dụ: đất, giày, đồ chơi cho chó, v.v.). Nguồn nhiễm trùng CPV là chất
thải phân của chó bị nhiễm bệnh. CPV có thể được tìm thấy ở những nơi có chó xuất
hiện như: chuồng ni, cửa hàng vật nuôi, nơi trú ẩn, công viên và sân chơi (Black
et al., 1979). Chó bị nhốt trong nhà và khơng tiếp xúc với những con chó khác có ít
cơ hội tiếp xúc với CPV hơn. Nó dễ dàng truyền qua lơng hoặc bàn chân của những
con chó bị nhiễm bệnh và các vật thể bị ô nhiễm như lồng hoặc giày.
CPV có thể tồn tại trong đất 5 tháng hoặc hơn nếu điều kiện thuận lợi. Phân
của những con chó bị nhiễm bệnh làm ô nhiễm những nơi như bệnh viện thú y,
cửa hàng thú cưng, chuồng trại và các cơ sở sản xuất giống thương mại. Những
cơ sở bị ô nhiễm này là nguồn lây nhiễm thứ cấp cho những chú chó nhạy cảm

(Jacob et al., 1980).
2.2.5. Cơ chế gây bệnh
Virus xâm nhập vào cơ thể qua miệng khi chó con ăn thức ăn nhiễm nguồn
bệnh hoặc tiếp xúc với các bề mặt đã từng tiếp xúc với nguồn bệnh. Thời gian ủ
bệnh trong 3–7 ngày trước khi biểu hiện ra bên ngoài.
Khi xâm nhập vào cơ thể, virus tái bản với số lượng lớn trong các hạch
bạch huyết (Stann et al., 1984). Sau vài ngày, lượng virus đáng kể đã được giải
phóng vào máu. Trong 3–4 ngày tiếp theo, các virus này đi đến các cơ quan có
chứa các tế bào phân chia nhanh chóng như tủy xương và các tế bào đường ruột

8

download by :


nhạy bén và tạo thành các cơ quan bao gồm bạch cầu hạt nhân eosinophilic lớn.
Trong tủy xương, virus phá hủy các tế bào mới của hệ thống miễn dịch và sau đó
loại bỏ cơ chế bảo vệ tốt nhất của cơ thể.

Hın
̣ ́ Parvovirus tấ n công trên các nhung mao ruô ̣t
̀ h 2.3. Vi trı
gây xuấ t huyế t niêm ma ̣c ruô ̣t
Nguồ n: Canine Parvovirus Infection and Other Viral Enteritides

Virus gây ra nhiều tổn hại nhất ở đường tiêu hóa. Trong thành ruột chứa
nhiều nhung mao và vi nhung mao, giúp tăng diện tích tiếp xúc và dễ dàng hấp
thu các chất dinh dưỡng. Virus tấn công các hốc Lieberkuhn (Hı̀nh 2.3), gây hoại
tử biểu mơ ruột và bào mịn các nhung mao khơng thể hấp thu các chất dinh
dưỡng và gây ra hiện tượng tiêu chảy (McCandlish, 1981). Khi hàng rào ngăn

cách vi khuẩn tiêu hóa bị phá vỡ, sẽ xuất hiện hiện tượng tiêu chảy có máu và vi
khuẩn có thể xâm nhập vào cơ thể gây nhiễm trùng lan rộng. CPV gây tiêu chảy
và nôn mửa dẫn đến mất nước nghiêm trọng và tử vong.
2.2.6. Triệu chứng lâm sàng và bệnh tích
Triệu chứng lâm sàng ở những con chó mắc bệnh Parvo là trầm cảm, chán
ăn, nôn mửa, sốt cao và tiêu chảy (Kramer et al.,, 1980). Phân lỏng, hoặc bị chảy
nước hoặc có máu trong các trường hợp bị nhiễm nặng. Chó tiếp tục nơn mửa và
tiêu chảy, dẫn đến tình trang nhanh chóng và tử vong. Thời gian phát bệnh tùy
thuộc vào lượng virus nhiễm.

9

download by :


Các dấu hiệu lâm sàng thường xuất hiện từ 3 đến 5 ngày sau khi bị nhiễm
virus và thường kéo dài từ 5 đến 7 ngày (Fletcher et al., 1979). Tỷ lệ mắc bệnh và
tử vong thay đổi tùy theo độ tuổi của chó bị nhiễm bệnh và mức độ nghiêm trọng
của bệnh.
Viêm cơ tim cũng được quan sát thấy ở các chó con mới sinh đã có các dấu
hiệu lâm sàng sau khi bị nhiễm trùng vài tuần (Meunier et al., 1984; Sime et al.,
năm 2015). Tuy nhiên, triê ̣u chứng này hiện nay khá hiếm.

Hình 2.4. Triệu chứng khi mắc bệnh Parvo ở chó.
Ng̀ n: />
2.2.7. Các phương pháp chẩ n đoán
a. Chẩn đoán huyế t thanh học
ELISA (Enzyme Linked Immunosorbent Assay) dựa trên sự kết hợp đặc
hiệu giữa kháng nguyên và kháng thể, trong đó kháng thể được gắn với một
enzyme. Khi cho thêm cơ chất thích hợp vào phản ứng, enzyme sẽ thủy phân cơ

chất thành một chất có màu. Sự xuất hiện màu chứng tỏ đã xảy ra phản ứng đặc
hiệu giữa kháng thể với kháng nguyên và thông qua cường độ màu mà biết được
nồng độ kháng nguyên hay kháng thể cần phát hiện.
Các xét nghiệm ELISA nhanh chóng, tương đối rẻ và có thể được thực
hiện trong bất kỳ phòng khám thú y nên đã trở thành xét nghiê ̣m phổ biế n nhấ t để
xác đinh
̣ parvovirus ở chó con (Waner et al., 2003).

10

download by :


Ngoài ELISA, xét nghiê ̣m ngưng kế t hồ ng cầ u (Haemagglutination – HA)
cũng là mô ̣t xét nghiê ̣m đơn giản và nhanh chóng để phát hiện CPV trong phân
(Carmichael et al., 1980).
b. Chẩn đoán bằ ng phương pháp sinh học phân tử
Gần đây, kỹ thuật PCR ngày càng được sử dụng như một cơng cụ để chẩn
đốn nhiễm trùng parvovirus trên chó. Phương pháp này cho chẩn đốn nhanh
chóng và chính xác. Ngoài ra, PCR còn có thể được xác đinh
̣ đươ ̣c kiể u gen của
chủng virus gây bê ̣nh bằ ng viê ̣c sử du ̣ng các că ̣p mồ i đă ̣c hiê ̣u.
Các sản phẩ m PCR còn đươ ̣c sử du ̣ng để giải trı̀nh tự trưc̣ tiế p cho kế t quả
là các trı̀nh tư ̣ nucleotide. Cùng với viê ̣c sử du ̣ng các phầ n mề m sinh ho ̣c, có thể
xác đinh
̣ đươ ̣c tỷ lê ̣ tương đồ ng và phân tı́ch nguồ n gố c phả hê ̣ của các chủng
CPV-2 từ các khu vưc̣ điạ lý khác nhau trên thế giới. Từ đó cũng có thể xác đinh
̣
đươ ̣c đường hướng tiế n hóa của virus.
2.2.8. Vaccine phịng bệnh

Phương pháp chính để kiểm sốt bệnh ở vật nuôi trong nhà là tiêm chủng.
Sau khi xuất hiện bệnh, vaccine dựa trên virus sống đã sớm phát triển, loại
vaccine CPV đầu tiên có mặt vào năm 1979.
Các loại vaccine này có vẻ an tồn và mang lại khả năng miễn dịch bảo vệ và
kiểm soát được bệnh. Tuy nhiên, virus vẫn được phân bố rộng rãi trong tự nhiên, và
nếu những con chó con khơng được tiêm chủng và hoặc do kháng thể của mẹ can
thiệp vào tiêm chủng thì chúng trở thành nhiễm bệnh tự nhiên (Parrish, 1999).
Nghiên cứu thưc̣ nghiê ̣m năm 2014 của Wilson cho thấ y tiêm vaccine
chủng CPV-2b sẽ bảo vệ chéo chố ng la ̣i cả chủng CPV-2a và CPV-2c, thậm chı́
là cả chủng CPV-2 hiê ̣n đã khơng cịn x́ t hiê ̣n nhiều (Wilson et al., 2014).
Đô ̣ tuổ i khuyế n cáo nên tiêm chủng vaccine phòng ngừa CPV là từ 10 – 12
tuần tuổ i, muô ̣n nhấ t là 16 tuần tuổ i đố i với tấ t cả các vaccine CPV (Alman et al.,
2017). Ngoài ra, trong nghiên cứu mới đây nhấ t của Jin và cs cho thấ y vi ̣trı́ tiêm
vaccine ta ̣i huyê ̣t houhai tăng khả năng miễn dich
̣ ở chó (Jin et al., 2019).

11

download by :


PHẦN 3. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP
3.1. ĐỊA ĐIỂM, THỜI GIAN NGHIÊN CỨU
- Địa điểm nghiên cứu: Phòng Miễn dịch học – Viện Công nghệ sinh học –
Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam.
- Thời gian nghiên cứu: Từ tháng 01/2018 – 05/2019.
3.2. VẬT LIỆU NGHIÊN CỨU
3.2.1. Nguyên liệu
Mẫu bệnh phẩm nghi nhiễm Canine Parvovirus được thu nhận tại các phòng
khám thú y Hà Nội.

Bảng 3.1. Danh sách mẫu CPV thu nhận ở Hà Nội sử dụng
trong nghiên cứu giải mã gen
STT

Kí hiệu

1

TH1VN

2

TH2VN

Fox

HN-VN

Becgi
e lai

3

Giống

Fox

Tuổi

Triệu chứng

điển hình

Mẫu bệnh
phẩm

3 tháng

Tiêu chảy, phân
lẫn máu

Phân và nước
phân

4 tháng

Nôn mửa, tiêu
chảy

Phân và nước
phân

3 tháng

Nôn và tiể u ra
máu

Phân và nước
phân

3.2.2. Dụng cụ và thiết bị

a. Thiế t bi ̣
- Tủ lạnh thường; tủ lạnh âm sâu -80oC (Sanyo, Nhật Bản);
- Tủ ấm 37oC (Nhật Bản);
- Máy ly tâm Centrifuge 5415D (Eppendorf, Đức)
- Máy PCR GeneAtlas 322 (Astec, Nhâ ̣t Bản);
- Máy điện di kiểm tra sản phẩm PCR (Bio-Rad, Mỹ);
- Máy soi gel Dolphin-Doc (Wealtech, Mỹ);

12

download by :

Tiêm
chủng
Không

Không

Không


- Máy ổn nhiệt (Bio-Rad, Mỹ)
- Máy Votex VM-10 (Daihan, Hàn Quố c)
- Máy vi tı́nh (HP, Mỹ)
- Lò vi sóng (Sam Sung, Hàn Quốc)

Hın
phòng thı́ nghiê ̣m
̣
̀ h 3.1. Mô ̣t sô trang thiế t bi trong

b. Dụng cụ
- Bộ pipetman (10µl, 20µl, 100µl, 200µl, 1000µl và 5000 µl).
- Dao, kéo, panh, kẹp.
- Các loại ống Eppendorf.
- Đầu côn.
3.2.3. Hóa chất
- Bộ Kit tách chiết GeneJET genomic DNA purification Kit của hãng
Thermo (Mỹ).
- Bộ Kit Dream Taq PCR master mix của hãng Thermo (Mỹ).
- Bộ Kit tinh sạch GeneJET PCR purification Kit và GeneJET Gel
Extraction Kit của hãng Thermo (Mỹ).
- Dung dich
̣ TAE
- Dung dich
̣ Ethidium Bromide
- Gel Agarose
- Cồ n tuyê ̣t đố i
- Nước cấ t

13

download by :


3.3. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

Hın
̣
̀ h 3.2. Sơ đồ quy trın
̀ h thı́ nghiêm

3.3.1. Phương pháp thu nhận mẫu
Mẫu bệnh phẩm được cung cấp bởi phòng Miễn dịch học, Viện Công nghệ
Sinh học, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam.
Các mẫu bệnh phẩm là các tăm bông chứa phân của chó nghi nhiễm
Parvovirus được thu thập từ các phòng khám thú y trên địa bàn Hà Nội.
Các mẫu này đã được chấn đoán sơ bộ bằng quan sát triệu chứng lâm sàng
và kiểm tra bệnh tích. Tiếp đó được xác định dương tính với CPV bằng bộ kit
chẩn đoán nhanh Canine Parvovirus Antigen Test Kit. Blot Test (BINOTE) tại
phòng khám thú y.
Mẫu được bảo quản ở nhiệt độ -200C.
3.3.2. Phương pháp tách chiết DNA tổng số
Toàn bộ DNA tổng số được thu nhận bao gồm DNA của nhân tế bào chủ và
DNA của hệ gen virus bằng cách sử dụng bộ kit tách chiết DNA tổng số theo
đúng hướng dẫn của nhà sản xuất.
Để thu nhận DNA tinh sạch, người ta cần loại bỏ những thành phần tạp
nhiễm, mà quan trọng nhất là protein. Sự tách chiết dựa trên nguyên tắc hòa tan
khác nhau của các phân tử khác nhau (nucleic acid/protein) trong hai pha khơng
hịa tan (phenol, chloroform/nước).
Phương pháp tiến hành theo thứ tự:

14

download by :