(LUẬN văn THẠC sĩ) nghiên cứu sinh tổng hợp hoạt chất rhamnetin 3 0 rhamnoside ở vi khuẩn escherichia coli cải biến di truyền

HỌC VIỆN NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM

PHẠM THỊ UYÊN

NGHIÊN CỨU SINH TỔNG HỢP HOẠT CHẤT
RHAMNETIN-3-O-RHAMNOSIDE Ở VI KHUẨN
ESCHERICHIA COLI CẢI BIẾN DI TRUYỀN

Chuyên ngành:

Công nghệ sinh học

Mã số:

60 42 02 01

Người hướng dẫn khoa học:

TS. Nguyễn Huy Thuần
TS. Nguyễn Xuân Cảnh

NHÀ XUẤT BẢN ĐẠI HỌC NÔNG NGHIỆP - 2018

download by :


LỜI CAM ĐOAN
Tơi xin cam đoan đây là cơng trình nghiên cứu của riêng tôi, các kết quả
nghiên cứu được trình bày trong luận văn là trung thực, khách quan và chưa từng dùng
để bảo vệ lấy bất kỳ học vị nào.
Tôi xin cam đoan rằng mọi sự giúp đỡ cho việc thực hiện luận văn đã được

cám ơn, các thơng tin trích dẫn trong luận văn này đều được chỉ rõ nguồn gốc.
Hà Nội, ngày… tháng… năm…
Tác giả luận văn

Phạm Thị Uyên

i

download by :


LỜI CẢM ƠN
Tôi xin chân thành cảm ơn Học viện Nông nghiệp Việt Nam, Ban Quản lý đào
tạo, Khoa Công nghệ Sinh học đã quan tâm và tạo điều kiện thuận lợi cho chúng tơi
trong q trình học tập và thực hiện đề tài.
Tơi xin được bày tỏ lịng biết ơn sâu sắc tới TS. Nguyễn Huy Thuần (hướng dẫn
khoa học 1) và TS. Nguyễn Xuân Cảnh (hướng dẫn khoa học 2), những người đã tận
tình giúp đỡ và hướng dẫn tơi trong q trình nghiên cứu và hồn thành luận văn.
Tôi cũng xin gửi lời cảm ơn tới các thầy, cô và kỹ thuật viên tại Trung tâm sinh
học Phân tử - Viện Nghiên cứu và Phát triển công nghệ cao, Đại Học Duy Tân bao gồm
TS. Nguyễn Minh Hùng, TS. Nguyễn Thành Trung, TS. Nguyễn Thị Hà, TS. Lê Thành
Đô, TS. Hồ Viết Hiếu, TS. Trần Thị Thanh Thỏa và cử nhân Đặng Thị Kim Mai đã tạo
điều kiện cho tôi được sử dụng các trang thiết bị để tiến hành thí nghiệm.
Tơi xin được gửi lời cảm ơn tới bạn Võ Trần Khánh Huyền - học viên cao học tại
Trung tâm Sinh học Phân tử, em Nguyễn Hồng Phong, sinh viên K19 khoa Dược – Đại
học Duy Tân, đã tham gia trao đổi với tôi về các vấn đề thực hành thí nghiệm.
Tơi xin chân thành cảm ơn sự giúp đỡ và tạo điều kiện của Ban lãnh đạo trường
Đại học Duy Tân, Học viện Nông nghiệp Việt Nam, cùng tập thể cán bộ, công nhân
viên, đã tạo mọi điều kiện tốt nhất và giúp đỡ tôi trong suốt thời gian nghiên cứu.
Nhân dịp này, tôi xin bày tỏ lịng biết ơn sâu sắc đến gia đình, người thân, bạn bè,

những người luôn tạo điều kiện, động viên, giúp đỡ tơi trong q trình học tập, nghiên
cứu cũng như hoàn thành luận văn này.
Hà Nội, ngày… tháng… năm…
Tác giả luận văn

Phạm Thị Uyên

ii

download by :


MỤC LỤC
Lời cam đoan ..................................................................................................................... i
Lời cảm ơn ........................................................................................................................ ii
Mục lục ............................................................................................................................ iii
Danh mục chữ viết tắt ....................................................................................................... v
Danh mục bảng ................................................................................................................ vi
Danh mục hình, hiểu đồ .................................................................................................. vii
Thesis abstract.................................................................................................................. ix
Phần 1. Mởđầu ................................................................................................................ 1
1.1.

Tính cấp thiết của đề tài ...................................................................................... 1

1.2.

Mục tiêu nghiên cứu ............................................................................................ 1

1.3.

Phạm vi nghiên cứu ............................................................................................. 1

1.4.

Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài nghiên cứu.......................................... 2

1.4.1.

Ý nghĩa khoa học của đề tài nghiên cứu ............................................................. 2

1.4.2.

Ý nghĩa thực tiễn của đề tài nghiên cứu .............................................................. 2

Phần 2.Tổng quan tài liệu .............................................................................................. 3
2.1.

Khái quát về flavonoid ........................................................................................ 3

2.2.

Giới thiệu rhamnetin và một số dẫn xuất rhamnetin glycoside thường gặp........ 5

2.3.

Con đường sinh tổng hợp rhamnetin và dẫn xuất rhamnetin-3-o-rhamnoside ở
thực vật ................................................................................................................ 7

2.4.

Một số phương pháp nghiên cứu tổng hợp rhamnetin và dẫn xuất rhamnetin
glycoside.............................................................................................................. 9

2.4.1.

Vai trò của các enzyme. ...................................................................................... 9

2.4.2.

Một số phương pháp tổng hợp rhamnetin ......................................................... 13

2.5.

Các hoạt tính sinh học của rhamnetin ............................................................... 16

Phần 3. Vật liệu và phương pháp nghiên cứu ............................................................ 18
3.1.

Vật liệu nghiên cứu ........................................................................................... 18

3.1.1.

Đối tượng nghiên cứu ........................................................................................ 18

3.1.2.

Nội dung nghiên cứu ......................................................................................... 18

3.1.3.

Nguyên vật liệu ................................................................................................. 18

3.1.4.

Phương pháp nghiên cứu ................................................................................... 20

iii

download by :


3.2.

Đánh giá ảnh hưởng của các điều kiện nuôi cấy tới hiệu suất tổng hợp
rhamnetin-3-o-rhamnoside ................................................................................ 25

3.2.1.

Ảnh hưởng của môi trường tới hiệu suất tổng hợp rhamnetin-3-o-rhamnoside.
........................................................................................................................... 25

3.2.2.

Ảnh hưởng của nồng độ iptg tới hiệu suất tổng hợp rhamnetin-3-o-rhamnoside
........................................................................................................................... 28

3.2.3.

Ảnh hưởng của nhiệt độ tới hiệu suất tổng hợp rhamnetin-3-o-rhamnoside. ... 29

Phần 4. Kết quả và thảo luận ....................................................................................... 30
4.1.

Kết quả thí nghiệm tổng hợp và phát hiện rhamnetin-3-o-rhamnoside............. 30

4.1.1.

Kết quả nghiên cứu bổ sung cơ chất rhamnetin và tách chiết thu sản phẩm ..... 30

4.1.2.

Phân tích kết quả chuyển hóa bằng sắc ký bản mỏng ....................................... 30

4.1.3.

Phân tích kết quả chuyển hóa bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao
(hplc) ................................................................................................................. 31

4.1.4.

Phân tích kết quả chuyển hóa bằng phương pháp sắc ký lỏng ghép khối phổ .. 31

4.2.

Đánh giá và bàn luận ảnh hưởng của các điều kiện nuôi cấy tới hiệu suất sinh
tổng hợp rhamnetin-3-o-rhamnoside. ................................................................ 33

4.2.1.

Ảnh hưởng của môi trường tới hiệu suất tổng hợp rhamnetin-3-o-rhamnoside.
........................................................................................................................... 33

4.2.2.

Ảnh hưởng của nồng độ iptg tới hiệu suất tổng hợp rhamnetin-3-o-rhamnoside.
........................................................................................................................... 35

4.2.3.

Ảnh hưởng của nhiệt độ tới hiệu suất tổng hợp rhamnetin-3-o-rhamnoside. ... 36

Phần 5. Kết luận và kiến nghị ...................................................................................... 41
5.1.

Kết luận ............................................................................................................. 41

5.2.

Kiến nghị ........................................................................................................... 41

Tài liệu tham khảo .......................................................................................................... 42

iv

download by :


DANH MỤC CÁC CHỮ CÁI VIẾT TẮT
Từ viết tắt

Tên đầy đủ

4CC

4-coumaroyl-CoA

4CL

4-coumaroyl-CoA ligase

C4H

Cinnamic 4-hydroxylase

CHI

Chalcone isomerase

CHS

Chalcone synthase

CPR

cytochrome P450 reductase

DMSO

Dimethyl sulfoxide

F3H

Flavone 3β-hydroxylase

F3GT

Flavonol 3-O-glycosyltransferase

FLS

Flavonol synthase

GT

Glycosyltransferase

HPLC

High-performance liquid chromatography

IPTG

Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside

KLPT

Khối lượng phân tử

LB

Lysogeny broth

LC-ESI-MS/MS

Liquid Chromatography Electrospray Ionization
Tandem Mass Spectrometric

NDP

nucleotide diphosphate

OD

Optical density

OMT

O-methyltransferase

PAL

phenylalanine amoniac lyase

TAL

Tyrosine amoniac lyase

TB

Terrific Broth

TDP

Thymidine diphosphate

TLC

Thin layer chromatography

UDP

Uridine diphosphate

UGT

Uridine diphosphate glycosyltransferase

v

download by :


DANH MỤC BẢNG
Bảng 1.1. Phân loại một số lớp flavonoid thường gặp ở thực vật. .................................. 4
Bảng 2.1. Một số hoạt tính sinh học của rhamnetin ...................................................... 16
Bảng 3.1. Thành phần môi trường TB .......................................................................... 25
Bảng 3.2. Thành phần môi trường LB .......................................................................... 26
Bảng 3.3. Thành phần các dung dịch gốc dùng để pha môi trường M9 ....................... 26
Bảng 3.4. Thành phần môi trường M9 .......................................................................... 27

Bảng 4.1. Kết quả đo thử nghiệm hàm lượng rhamnetin-3-O-rhamnoside ở các môi
trường nuôi cấy khác nhau ............................................................................ 34
Bảng 4.2. Kết quả đo hàm lượng rhamnetin-3-O-rhamnoside tại các nồng độ IPTG
khác nhau ...................................................................................................... 35
Bảng 4.3. Kết quả đo hàm lượng rhamnetin-3-O-rhamnoside tại các mức nhiệt độ khác
nhau ............................................................................................................... 37
Bảng 4.4. So sánh hiệu quả chuyển hóa một số loại cơ chất với rhamnetin ................. 40

vi

download by :


DANH MỤC HÌNH, HIỂU ĐỒ
Hình 2.1.

Phân loại flavonoid dựa vào gốc aryl (vịng B) ......................................... 3

Hình 2.2.

Các cấu trúc khung cơ bản của một số nhóm flavonoid thường gặp ......... 4

Hình 2.3.

Phân bố của rhamnetin ở một số lồi thực vật ........................................... 5

Hình 2.4.

Rhamnetin và một số dẫn xuất của chúng .................................................. 6

Hình 2.5.

Tổng hợp rhamnetin glycoside ở thực vật .................................................. 8

Hình 2.6.

Cơ chế phản ứng của enzyme glycosyltransferases, (A).......................... 10

Hình 2.7.

Sản xuất rhamnetin từ quercetin thơng qua enzyme POMT7 .................. 15

Hình 3.1.

Sơ đồ hệ thống E. coli tái tổ hợp .............................................................. 19

Hình 3.2.

Sơ đồ chuyển hóa tạo sản phẩm rhamnetin-3-O-rhamnoside .................. 20

Hình 4.2.

Thí nghiệm đánh giá ảnh hưởng của mơi trường tới hiệu suất tổng hợp
rhamnetin-3-O-rhamnoside ...................................................................... 28

Hình 4.4.

Sản phẩm sau khi tinh sạch và đơng khơ ................................................. 30

Hình 4.5.

Sắc ký đồ phân tích vị trí của cơ chất rhamnetin và rhamnetin glycoside.
.................................................................................................................. 31

Hình 4.6.

Phân tích định tính sự tạo thành rhamnetin-3-O-rhamnoside .................. 32

Hình 4.7.

Phân tích LC-ESI-MS/MS ở chế độ negative mode. ............................... 32

Hình 4.8.

Sơ đồ phân mảnh MS/MS của rhamnetin rhamnoside ............................. 33

Biểu đồ 4.1. Đánh giá ảnh hưởng của môi trường tới hiệu suất tổng hợp rhamnetin-3O-rhamnoside ........................................................................................... 34
Biểu đồ 4.2. Đánh giá ảnh hưởng của nồng độ IPTG tới hiệu suất tổng hợp rhamnetin3-O-rhamnoside ........................................................................................ 36
Biểu đồ 4.3. Đánh giá ảnh hưởng của nhiệt độ tới hiệu suất tổng hợp rhamnetin-3-Orhamnoside ............................................................................................... 37

vii

download by :


TRÍCH YẾU LUẬN VĂN
Tên tác giả: Phạm Thị Uyên
Tên luận văn: “Nghiên cứu sinh tổng hợp hoạt chất rhamnetin-3-O-rhamnoside ở vi
khuẩn Escherichia coli cải biến di truyền”.
Chuyên ngành: Công nghệ Sinh học

Mã số: 60 42 02 01

Cơ sở đào tạo: Học Viện Nơng Nghiệp Việt Nam
Mục đích nghiên cứu:
Thiết lập quy trình sinh tổng hợp rhamnetin-3-O-rhamnoside ở vi khuẩn E. coli
cải biến di truyền và đánh giá ảnh hưởng của một số điều kiện ni cấy để tối ưu hóa
sản xuất hợp chất này.
Phương pháp nghiên cứu
Sử dụng phương pháp nuôi cấy vi sinh nuôi cấy vi khuẩn E. coli trên đĩa thạch
và trong ống nghiệm có sử dụng kháng sinh với nồng độ phù hợp
Tách chiết hoạt chất rhamnetin glycoside bằng phương pháp chiết pha lỏng-pha
lỏng sử dụng ethylacetate làm dung môi. Đông khô mẫu trên máy sấy thăng hoa.
Định tính và định lượng bằng phương pháp TLC, HPLC, LC-ESI-MS/MS.
Kết quả chính và kết luận
Việc tổng hợp rhamnetin-3-O-rhamnoside dựa trên E. coli tái tổ hợp có tính
khả thi và sản phẩm tạo thành được kiểm tra bằng các phương pháp như TLC,
HPLC, LC-ESI-MS/MS.
Tối ưu hóa các yếu tố ảnh hưởng trực tiếp tới ni cấy và chuyển hóa cơ chất
như chủng loại môi trường, nồng độ IPTG và nhiệt độ đã thu được sản lượng
rhamnetin-3-O-rhamnoside cao nhất đạt 12.6 mg/L.
Tìm hiểu, đánh giá tầm quan trọng của các sản phẩm flavonoid glycoside nói
chung và rhamnetin nói riêng trong các lĩnh vực y dược, mỹ phẩm, v.v. xây dựng cơ sở
cho các nghiên cứu phục vụ nhu cầu thực tiễn tạo các sản phẩm có nguồn gốc tự nhiên
và có giá trị cao trong đời sống.

viii

download by :

THESIS ABSTRACT
Master candidate: Pham Thi Uyen
Thesis title: “Study on the biosynthesis of the bioactive rhamnetin-3-O-rhamnoside in
genetically modified Escherichia coli”
Major: Biotechnology

Code: 60 42 0201

Educational organization: Vietnam National University of Agriculture (VNUA)
Research Objectives:
Investigation the biosynthesis of rhamnnetin-3-O-rhamnoside using genetically
engineered E. coli by supplementation of methylated flavonol, rhamnetin, and
evaluating the effect of culture conditions (medium, IPTG concentration and
temperature) to improve the production of target compounds.
Materials and Methods:
Recombinant E. coli was cultured in broth medium using antibiotics
(streptomycin, kanamycin and chloramphenicol) at appropriate concentrations.
Rhamnetin was supplemented into culture broth as substrate and the culture was
mainted to proceed whole cell bioconversion to produce rhamnetin-3-O-rhamnoside.
Extraction of rhamnetin glycoside was carried out by liquid-liquid extraction
using ethylacetate as solvent. Crude extract was obtained by the vacuum rotary drier.
The formation of product was confirmed by chromatographical methods such as
TLC, HPLC, LC-ESI-MS / MS.
Culture conditions such as type of medium, IPTG concentration and
temperature those effect to bacterial growth were screened to improve yield of
rhamnetin-3-O-rhamnoside.
Main findings and conclusions
The recombinant E. coli was proved to produce rhamnetin-3-O-rhamnoside by
TLC, HPLC and LC-ESI-MS/MS data.

Effect of culture medium, IPTG and temperature was investigated and resulted
in TB, 0.8 mM IPTG and 32ºC are the best parameters to enhance the production. The
highest yield of rhamnetin-3-O-rhamnoside was 12.6 mg/L.
Understanding and evaluating the importance of flavonoid glycoside as well as
and rhamnetin in particular in the fields of medicine, cosmetics, etc.
.

ix

download by :


PHẦN 1. MỞ ĐẦU
1.1. TÍNH CẤP THIẾT CỦA ĐỀ TÀI
Rhamnetin là một flavonoid thuộc nhóm flavonol, có vị trí methyl hóa ở
carbon số 7 (C7). Rhamnetin và dẫn xuất rhamnetin glycoside đã được chứng
minh có một số hoạt tính sinh học mạnh như kháng viêm, kháng khuẩn, ức chế
khối u rất mạnh. Tuy nhiên, việc chiết xuất rhamnetin glycoside từ thực vật gặp
nhiều khó khăn do chúng có hàm lượng thấp, dễ lẫn tạp nên đòi hỏi nhiều kỹ
thuật và thời gian thực hiện. Ngoài ra, việc tổng hợp chất này theo phương pháp
hóa hữu cơ cũng có hạn chế do tính tương tác khơng đặc hiệu của nhóm chức hóa
học theo mong muốn, điều kiện phản ứng và kỹ thuật tinh sạch phức tạp. Bởi
vậy, việc ứng dụng các thành tựu của sinh học phân tử, công nghệ vi sinh và
công nghệ lên men nhằm tổng hợp rhamnetin glycoside đã được đặt ra như một
giải pháp thay thế. Ở Việt Nam, các hợp chất thứ cấp thiên nhiên thuộc nhóm
flavonoid hầu hết đều được sinh tổng hợp và tách chiết trực tiếp từ thực vật ở quy
mơ phịng thí nghiệm. Các nghiên cứu về vi sinh vật cải biến di truyền tạo đường
hóa hợp chất thiên nhiên nói chung chưa được thực hiện và cho tới nay, chúng tôi
chưa tìm được cơng bố nào tương tự. Do đó, chúng tôi tiến hành thực hiện đề tài:
“Nghiên cứu sinh tổng hợp hoạt chất rhamnetin-3-O-rhamnoside ở vi khuẩn

Escherichia coli cải biến di truyền” nhằm áp dụng phương pháp đường hóa các
chất tự nhiên bằng vi khuẩn cải biến di truyền để tạo ra sản phẩm rhamnetin
glycoside, một trong những hợp chất có ý nghĩa quan trọng trong lĩnh vực y học,
mỹ phẩm, thực phẩm v.v.
1.2. MỤC TIÊU NGHIÊN CỨU
Thiết lập quy trình sinh tổng hợp hợp chất rhamnetin-3-O-rhamnoside
thơng qua sử dụng vi khuẩn E. coli cải biến di truyền và đánh giá ảnh hưởng của
các điều kiện nuôi cấy để tối ưu hóa sản xuất hợp chất mục tiêu.
1.3. PHẠM VI NGHIÊN CỨU
Đề tài được thực hiện tại phịng thí nghiệm thuộc Trung tâm Sinh học Phân
tử - Đại học Duy Tân – Đà Nẵng, thời gian thực hiện: 02/2017 - 10/2017.

1

download by :


1.4. Ý NGHĨA KHOA HỌC VÀ THỰC TIỄN CỦA ĐỀ TÀI NGHIÊN CỨU
1.4.1. Ý nghĩa khoa học của đề tài nghiên cứu
Kết quả nghiên cứu sẽ cung cấp các dẫn liệu khoa học và có tính hệ thống
về ni cấy tổng hợp rhamnetin-3-O-rhamnoside ở E. coli tái tổ hợp theo phương
pháp chuyển hóa sinh học trong điều kiện in-vivo (whole cell bioconversion).
1.4.2. Ý nghĩa thực tiễn của đề tài nghiên cứu
Kết quả của đề tài luận văn là cơ sở khoa học để phát triển hệ thống nuôi
cấy – lên men huyền phù tế bào E. coli tái tổ hợp nhằm tổng hợp nhanh hợp chất
ở qui mô lớn hơn (pilot). Hoạt chất rhamnetin-3-O-rhamnoside tổng hợp góp
phần ứng dụng vào sản xuất các loại thuốc, mỹ phẩm, thực phẩm chức giúp cải
thiện sức khỏe của con người.

2

download by :


PHẦN 2. TỔNG QUAN TÀI LIỆU
2.1. KHÁI QUÁT VỀ FLAVONOID
Các flavonoid là những chất có khung cơ bản theo kiểu C6-C3-C6, khung
cơ bản gồm 2 vòng benzen A và B nối với nhau qua 1 mạch 3 carbon.

Các flavonoid được phân loại dựa vào vị trí của gốc aryl (vịng B) và các
mức độ oxy hóa của mạch 3 carbon. Dựa vào vị trí vịng B trên mạch 3 carbon,
flavonoid được chia thành 3 nhóm: euflavonoid là các flavonoid có gốc aryl ở vị
trí C-2; isoflavonoid là các flavonoid có gốc aryl ở vị trí C-3; neoflavonoid là các
flavonoid có gốc aryl ở vị trí C-4 (Đại học Thành Đơ, 2015).

Euflavonoid

Isoflavonoid

Neoflavonid

Hình 2.1. Phân loại flavonoid dựa vào gốc aryl (vịng B)
Trong đó euflavonoid là nhóm được biết sớm nhất và lớn nhất. Bao gồm
các phân nhóm: flavan, flavan3-ol, flavan 4-ol, flavan 3,4-diol, anthocyanidin,
dihydrochalcon, chalcon, auron, flavanon, 3-hydroxy flavanon, flavon, flavonon.
Flavonol là một nhóm các flavonoid có khung cấu tạo là 3-hydroxylflavone,
là những chất kết tinh có màu vàng nhạt đến vàng, các dẫn chất flavonol gặp rất
phổ biến trong thực vật. Sự đa dạng của chúng bắt nguồn từ các vị trí khác nhau
của các nhóm phenolic –OH ( />
3

download by :


O+

Anthocyanidin

Dihydochacol

O

OH
O

Flavon

Flavonol

Chacon

Hình 2.2. Các cấu trúc khung cơ bản của một số nhóm flavonoid
thường gặp
Bảng 1.1. Phân loại một số lớp flavonoid thường gặp ở thực vật
Các phân lớp
flavonoid

Các đại diện thường gặp

Nguồn thực vật

Flavonols

Quercetin, kaempferol,
myricetin,

Hành, táo, trà, dâu, v.v.

Anthocyanidins

Cyanidin, Delphinidin,
Malvidin, Pelargonidin,

Các loại quả dâu đỏ, xanh, tím.

Flavanones

Hesperetin, Naringenin,
Eriodictyol

Nước ép cam, quýt, táo

Flavones

Apigenin, Luteolin

Hạt tiêu, ngũ cốc, mùi tây, cần
tây

Isoflavones

Daidzein, Genistein,
Glycilein

Cây họ Đậu

Flavanols

Monomers (Catechins):
Dimers và Polymers:
Theaflavins, Therubigins,
Proanthocyanidins

Catechins có mặt trong trà (đặc
biệt trà xanh), chocolate, nho,
dâu, táo.
Theaflavins

4

download by :


2.2. GIỚI THIỆU RHAMNETIN VÀ MỘT SỐ DẪN XUẤT RHAMNETIN
GLYCOSIDE THƯỜNG GẶP
Rhamnetin có cơng thức và khối lượng phân tử lần lượt là C16H12O7,
316,26g/mol. Rhamnetin kết tinh thường có màu vàng nhạt. Trong khi đó, cấu
trúc phân tử của nó được phát hiện bởi nhà hóa học người Áo – Josef Herzig
(1853-1942).

Piper rigrum

Acacia catechu

Artemisia annua

Ammi visnaga

Hình 2.3. Phân bố của rhamnetin ở một số loài thực vật
Cho tới nay, người ta đã tìm thấy rhamnetin phân bố ở nhiều loại thực vật
như Piper rigrum (hồ tiêu), Artemisia annua (thanh hao hoa vàng), Acacia
catechu (keo cao) và Ammi visnaga (cần Ami), v.v. Từ lâu, cây keo cao đã được
sử dụng trong y học cổ truyền Trung Quốc với tác dụng hạ sốt, kháng khuẩn.
Người ta đã tách được rhamnetin từ dịch chiết của cây với hàm lượng 13 mg/1 kg
nguyên liệu thô (Li et al., 2011).Cũng như các flavonoid khác, để tồn tại bền
vững và có hoạt tính sinh học mạnh rhamnetin thường được tìm thấy ở dạng
đường hóa. Cho tới nay, người ta đã tìm ra một số loại dẫn xuất có gắn đường
của hợp chất này (Hình 2.4).

5

download by :


HO
OH
O

H3CO

O
OH

O

OH

O

OH

H 3C
OH

Rhamnetin

Rhamnetin – 3 – rhamnoside

Rhamnetin – 3 – robinobioside

Rhamnetin – gentiobioside

Rhamnetin-3-O-neohesperidoside

Rhamnetin-5-glucoside

Hình 2.4. Rhamnetin và một số dẫn xuất của chúng

6

download by :


2.3. CON ĐƯỜNG SINH TỔNG HỢP RHAMNETIN VÀ DẪN XUẤT
RHAMNETIN-3-O-RHAMNOSIDE Ở THỰC VẬT
Chuỗi sinh tổng hợp rhamnetin bao gồm hai giai đoạn. Giai đoạn 1 xảy ra
trong lạp thể (plastid) nhằm cung cấp hai acid amin là L-tyrosine, L-phenylalanin
và manonyl-coA. Ở giai đoạn 2 xảy ra trong tế bào chất, các acid amin trên sẽ bị
tác động của các enzyme tyrosine amoniac lyase (TAL) hoặc phenylalanine
amoniac lyase (PAL) chuyển tyrosine hoặc phenylalanine thành các dẫn xuất
acid carboxylic, p-coumaric acid và acid cinnamic tương ứng. Nghiên cứu cho
thấy, acid cinnamic được chuyển hóa thành acid p-coumaric do sự tham gia xúc
tác của enzyme acid cinnamic 4-hydroxylase (C4H). Tiếp theo, 4-coumaroylCoA ligase (4CL) sẽ chuyển acid p-coumaric thành 4-coumaroyl-CoA. Ở mắt
xích quan trọng nhất, một phân tử p-coumaroyl-CoA sẽ phản ứng với ba phân tử
manonyl-CoA để tạo thành naringenin chalcone (có cấu trúc khung cơ bản C6 –
C3 – C6) dưới sự xúc tác của enzyme chalcone synthase (CHS). Chalcone là bộ
khung xương (skeleton structure) của hầu hết các loại flavonoid sau này.
Narigenin chalcone sau đó được biến đổi thành narigenin nhờ phản ứng tạo vòng
do sự xúc tác của chalcone isomerase (CHI). Từ đây với sự tham gia của hàng
loạt các enzyme khác như flavone 3β-hydroxylase (F3H), flavonol synthase
(FLS), O-methyltransferase (OMT) và Flavonol 3-O-glycosyltransferase (F3GT)
sẽ tạo ra các sản phẩm trung gian như dihydroflavonol, quercetin, rhamnetin và
rhamnetin-rhamnoside (Sung et al., 2011a; Thuan et al., 2013a; Kim et al., 2010)
(Hình 2.5).
Sản xuất rhamnetin được tổng hợp ở thực vật được thông qua nuôi cấy in
vitro chi Drosera trong nghiên cứu của Marczak et al.. Nhóm nghiên cứu tiến
hành ni cấy 6 lồi thuộc chi Drosera bao gồm D. adelae, D. aliciae, D.
capensis, D. cuneifolia, D. ramentacea và D. binata. Các mẫu được tách chiết
sau 8 tuần nuôi cấy bằng bộ chiết Soxhlet. Các mẫu được chiết với 50ml
chlorofrom hoặc 50ml methanol trong 12 giờ, sau đó chiết với 50ml methanol

trong 12h tiếp theo. Ngồi ra có thể chiết bằng sóng siêu âm, các mẫu được thêm
vào 20ml chloroform hoặc 20ml methanol, siêu âm tại 50 – 60Hz trong 5s và 5s
nghỉ, thực hiện trong 30 phút. Dịch chiết thu được ly tâm ở 13.000 vịng/phút
trong 15 phút. Thu dịch trên đem đơng khơ, sản phẩm đơng khơ được hịa tan với
3ml methanol và giữ ở -20oC. Các mẫu chạy HPLC được pha loãng 5 lần bằng

7

download by :


methanol để xác định thành phần. Phân tích HPLC thu được các flavnoid trong
đó có chứa rhamnetin (Marczak L et al., 2005).

( Trong đó: TAL: tyrosine ammonia lyase; 4CL: p-Coumaroyl-CoA lagase; PAL: phenyl ammonia lyase;
C4H: cinnamic acid 4-hydroxylase; CPR: cytochrome P450 reductase; CHS: chalcone synthase; CHI:
chanlcone isomerase; F3H: flavone 3β-hydroxylase; FLS: flavonol synthase; OMT: O-methyltransferase;
F3RT: Flavonol 3-O-glycosyltransferase.)

Hình 2.5. Tổng hợp rhamnetin-3-O-rhamnoside ở thực vật

8

download by :


2.4. MỘT SỐ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU TỔNG HỢP RHAMNETIN
VÀ DẪN XUẤT RHAMNETIN GLYCOSIDE
2.4.1. Vai trò của các enzyme
Dựa trên việc phát hiện ra con đường tổng hợp rhamnetin, người ta đã phân

loại ra 3 nhóm enzyme bao gồm nhóm thứ nhất tham gia vào tổng hợp cấu trúc
khung xương của flavonoid như 4-CL, CHS, CHI, v.v., các enzyme nhóm thứ hai
tham gia tổng hợp trực tiếp rhamnetin từ narigenin như F3H, FLS, OMT và
nhóm enzyme thứ ba là các glycosyltransferase tham gia tạo dẫn xuất glycoside
tương ứng.
Nghiên cứu sử dụng các enzyme này thơng qua phương pháp tạo dịng đưa
vào các vector biểu hiện có promoter mạnh và cuối cùng chuyển vào vật chủ
(host) sẽ cho phép tạo ra thể tái tổ hợp phục vụ mục đích sinh tổng hợp
rhamnetin và dẫn xuất glycoside. Dưới đây chúng tôi đề cập tới loại enzyme
tham gia tổng hợp đường hoạt hóa là O-glycosyltransferase và vai trị của nó.
2.4.1.1. Enzyme glycosyltransferase và q trình đường hóa
Glycosyltransferase (GT) là enzyme có chức năng chuyển nhóm glycosyl từ
cơ chất cho dưới dạng đường hoạt hóa (NDP-sugar) sang cơ chất nhận
(acceptor). Các enzyme GT thường được chia làm 2 nhóm chủ yếu là GT-A và
GT-B dựa trên sự phân bố các cấu trúc Rossman đặc trưng trong cấu tạo phân tử
của chúng. Theo cơ chế tác dụng, người ta lại phân chia GT thành các enzyme
đảo (inverting) và enzyme ngun (retaining) (hình 2.6). Theo đích tác dụng thì
ta có hai nhóm enzyme GT phổ biến là O- và C-glycosyltransferases. Trong đó,
O-glycosyltransferase sẽ chuyên trách chuyển nhóm glycosyl tới nguyên tử
oxygen của cơ chất nhận, tương tự, C-glycosyltransferases có nguyên tử nhận là
carbon trên aglycone của nó (Lairson et al., 2008; Thuan et al., 2013c).
Cơ chế đảo (invertion), theo đó cấu hình lập thể của liên kết bất đối
(anomeric bond) của NDP-hexose sẽ bị thay đổi (α→β hoặc β→α) sau khi phản
ứng xảy ra. Ngược lại theo cơ chế giữ nguyên (B) (retention) thì cấu hình lập thể
của liên kết này không thay đổi (α→α hoặc β→β).
Cho tới nay, người ta đã biết nhiều loại enzyme GT từ thực vật và vi sinh
vật, đặc biệt uridin diphosphate glycosyltransferase (UGT) từ thực vật được
nghiên cứu nhiều hơn cả. Ví dụ, Arabidopsis thaliana có 120 gene mã hóa cho
UGT. Các UGT từ thực vật mẫu khác như Medicago trancatula, Vitis vinifera,

9

download by :


Oryza sativa, Glycin max cũng đã được khám phá đặc tính sinh hóa. Bên cạnh đó
người ta cũng phát hiện được các GT từ vi sinh vật có khả năng xúc tác chuyển
nhiều loại phân tử đường hoạt hóa khác nhau có gắn các nhóm TDP, UDP và
GDP. Và do đó, chúng trở thành cơng cụ quan trọng để tổng hợp nhân tạo nhiều
hợp chất glycoside mới (Zhang et al., 2006).

Hình 2.6. Cơ chế phản ứng của enzyme glycosyltransferases, (A)
Trong khi đó GT của vi khuẩn lại có khả năng xúc tác cho phản ứng kết hợp
của nhiều loại cơ chất cho và nhận. Chúng được phát hiện thấy có nhiều điểm
gắn (binding pocket) trong cấu trúc phân tử hơn so với UGT từ thực vật và
thường là đặc hiệu khơng tuyệt đối. Do đó, phản ứng xúc tác bởi enzyme GT từ
vi sinh vật thường tạo nên nhiều loại sản phẩm đường hóa, một cơng cụ rất có ý
nghĩa trong công nghệ sinh học dược.
Con đường sinh tổng hợp đường NDP-rhamnose
Đường hoạt hóa NDP-L-rhamnose được tìm thấy có mặt trong một số loại
glycoprotein, exopolysaccharides (EPS) và trong thành phần của thành tế bào
nấm. Ở vi khuẩn, dTDP-L-rhamnose được sử dụng để tổng hợp các loại
glycolipid và polysaccharide phức hợp. Sinh tổng hợp của NDP-rhamnose ở vi
khuẩn được thực hiện bởi 3 gen mã hóa cho các enzyme 4,6-dehydratase (RmlB),
3,5-epimerase (RmlD) và 4-reductase. Trong đó, 4,6-dehydratase sẽ chuyển hóa
dTDP-D-glucose thành dTDP-4-keto-6-deoxyglucose, tiếp theo, sản phẩm trung

10

download by :

gian này bị chuyển thành dTDP-4-keto-rhamnose và cuối cùng bị khử thành
dTDP-rhamnose (Ma et al., 2002; Dong et al., 2007). Thực vật có riêng một loại
enzyme (Rhm, URS) có thể chuyển hóa UDP-Glucose to UDP-Rhamnose.

Hình 2.7. Sơ đồ sinh tổng hợp đường hoạt hóa NDP-rhamnose

11

download by :


Ngồi ra, thực vật cịn có một phân tử protein 2 thực hiện được cả hai chức
năng là thực hiện epimerase hóa ở vị trí C3, C5 (3,5-epimerization) và khử ở vị trí
C4 (4-reduction) (Watt et al., 2004). Tổng hợp UDP-rhamnose ở nấm cần có 2 gen
mã hóa cho các enzyme là UDP-glucose 4,6-dehydratase chuyển hóa UDP-glucose
thành UDP-4-keto-6-deoxyglucose. Tiếp theo, một enzyme hai chức năng (UDP4-keto-6-deoxyglucose-3,5-epimerase/-4-reductase) sẽ chuyển hóa UDP-4-keto-6deoxyglucose thành UDP-rhamnose (Martinez et al., 2012) (Hình 2.7).
Vai trị của q trình đường hóa hợp chất tự nhiên
Đường hóa (glycosylation) là một trong những quá trình cải biến phân tử
hợp chất tự nhiên quan trọng nhất, trong đó phân tử đường ở trạng thái hoạt
hóa của chất cho (donor) được chuyển đến chất nhận (acceptor), bằng sự hình
thành liên kết glycosidic. Cấu trúc của hợp chất glycoside phụ thuộc vào phân
tử đường (glycone) và phần gắn với đường (aglycone). Đường hóa thường là
bước cuối cùng trong q trình tổng hợp các chất chuyển hóa thứ cấp thực vật,
nó có ý nghĩa quan trọng về mặt hóa học và dược lý. Đường hóa flavonoid xảy
ra ở nhóm hydroxyl hoặc trực tiếp trên nguyên tử carbon của bộ khung. Các
enzyme chịu trách nhiệm cho việc đường hóa các flavonoid bao gồm các GT
được phân lập từ thực vật (Arabidopsis, Withania) hoặc từ vi khuẩn
(Streptomyces, Bacillus và Streptococus).

Do đặc tính cấu tạo, rhamnetin thường hịa tan tốt trong các dung mơi hữu
cơ phân cực như acetone, methanol và DMSO, nhưng ít hịa tan trong nước dẫn
đến hạn chế sự trao đổi qua màng tế bào. Sự liên kết của một hay nhiều gốc
đường vào các vị trí khác nhau của một phân tử rhamnetin tạo thành rhamnetin
glycoside giúp cải thiện độ hòa tan đồng thời tăng tính ổn định và tăng hoạt tính
sinh học so với phân tử ban đầu.
2.4.1.2. Một số enzyme tham gia vào quá trình tổng hợp phân tử đường hoạt
hóa ở vi khuẩn E. coli cải biến di truyền
Người ta đã xác định được chuỗi các enzyme tham gia vào q trình tổng
hợp các hợp chất đường hoạt hóa thường gặp như NDP-glucose, NDP-galactose,
NDP-glucoronate và các phân tử đường hiếm gặp như NDP-rhamnose, NDPfuctose, NDP-allose, NDP-arabinose… Trong thực tế, vì hàm lượng đường
hiếm trong E. coli rất thấp hoặc bằng không nên người ta thường tăng cường

12

download by :


biểu hiện các enzyme liên quan tham gia trong chu trình bằng cách tạo ra các
chủng E. coli tái tổ hợp mang gen mong muốn lấy từ các loài khác. Do E. coli
là đối tượng dễ tiến hành thao tác di truyền, bộ gene có kích thước nhỏ, vịng
đời ngắn nên ngày càng có nhiều chiến thuật sử dụng chúng trong sinh tổng
hợp các phân tử đường hiếm.
2.4.2. Một số phương pháp tổng hợp rhamnetin
2.4.2.1. Tổng hợp rhamnetin bằng nuôi cấy mô tế bào
Sản xuất rhamnetin ở thực vật được tiến hành nhờ ni cấy in-vitro một
số lồi trong chi Drosera. Nhóm nghiên cứu đã tiến hành ni cấy mơ của 6
loài bao gồm D. adelae, D. aliciae, D. capensis, D. cuneifolia, D. ramentacea
và D. binata. Nghiên cứu thành phần dịch chiết của các mẫu thu được cho
thấy sự có mặt của rhamnetin và isorhamnetin nhưng chỉ với hàm lượng vết

(Marczak et al., 2005).
2.4.2.2. Phương pháp tổng hợp in-vitro
Đây là phương pháp tổng hợp kinh điển đã được áp dụng từ lâu. Người ta
có thể tách chiết enzyme trực tiếp từ mô, tế bào thực vật hoặc biểu hiện dưới
dạng tái tổ hợp trong vật chủ khác rồi tinh sạch enzyme sử dụng cho phản ứng invitro. Sau đó sử dụng các phương pháp sắc ký nhằm phát hiện, định lượng và
định tính sản phẩm. Về sau, cùng với sự phát hiện ra các enzyme tham gia trong
chuỗi tổng hợp đường hoạt hóa thì có thể tiến hành tổng hợp bằng cách cho tất cả
các enzyme này cùng với GTs và cơ chất vào cùng một thời điểm để tiến hành
phản ứng (one-pot enzymatic reaction).
Sau này cùng với sự phát hiện ra các enzyme có khả năng xúc tác “mềm
dẻo” (flexibility) tức là chúng có thể tiếp nhận hàng loạt các phân tử đường hoạt
hóa hoặc aglycone khác nhau, người ta đã sáng tạo ra phương pháp mới gọi là invitro glycorandomization (tạm dịch là kỹ thuật đường hóa ngẫu nhiên in-vitro).
Bằng cách sử dụng phương pháp mới này, Thorson et al., đã tạo ra được hàng
loạt dẫn xuất glycoside của nhiều hợp chất như novobiocin, digitoxin,
vancomycin, colchicine và 4-methylumbelliferone (Griffith et al., 2005). Ví dụ
khác là gen Sa-OMT2 được tách dịng từ Streptomyces avermitilis MA-4680 sau
đó biểu hiện trong vi khuẩn E. coli. Enzyme dạng tinh sạch đã được dùng cho
phản ứng chuyển nhóm methyl vào vị trí 7-hydroxyl trên hàng loạt các chất như

13

download by :


isoflavone, daidzein và genistein, các flavones, kaempferol và flavanone
naringenin. Đặc biệt enzyme cũng sử dụng quercetin làm cơ chất từ đó tạo ra sản
phẩm là rhamnetin (Kim et al., 2006).
Ưu điểm của phương pháp này là nó kết hợp các thể mạnh của tổng hợp hóa
học với khả năng phản ứng đặc hiệu nhóm của enzyme trên các cơ chất tham gia.
Tuy nhiên, phương pháp này lại có 2 nhược điểm: thứ nhất là thiếu nguồn chất

đường hoạt hóa do hầu hết các loại đường hiếm phải tổng hợp bằng biện pháp
hóa học nên giá thành cao và sau đó phải tinh sạch cho đủ lượng cần thiết, thứ
hai là thiếu các enzyme GT đặc hiệu nhóm cần thiết do việc sàng lọc các enzyme
GT có hoạt tính là khơng hề dễ dàng.
2.4.2.3. Phương pháp tổng hợp in-vivo
Đường hóa hợp chất tự nhiên theo phương pháp in-vivo bao gồm tổng hợp
dựa trên chuyển hóa sinh học tự nhiên trong tế bào (bioconversion) và sử dụng
kỹ thuật di truyền (genetic engineering/combinatorial biosynthesis). Trong đó,
phương pháp đầu tiên cần bổ sung cơ chất ban đầu (aglycone) vào môi trường
nuôi cấy chủng sinh vật có mang gene tổng hợp đường hoạt hóa tự nhiên.
Phương pháp thứ 2 bao gồm việc gây đột biến xóa chuỗi tổng hợp đường hoạt
hóa tự nhiên ở vật chủ để cung cấp các hợp chất trung gian và/hoặc biểu hiện dị
dòng các thành phần của con đường này từ đó tạo ra các hợp chất đường lai mới.
POMT7, mã hóa cho 7-O-methyltransferase được phân lập từ Populus
deltoides, có khả năng chuyển một gốc methyl từ nhóm S-adenosyl-L-methionine
(SAM) sang nhóm 7-hydroxyl (7-OH) của quercetin. Để tối ưu hóa sự tổng hợp
rhamnetin, nhóm tác giả đã sử dụng một số chiến thuật bao gồm đưa gen này vào
4 loại vector biểu hiện khác nhau để sàng lọc vector phù hợp nhất. Sau đó, sửa
đổi con đường sinh tổng hợp của S-andeosyl-methionine (SAM) để tạo ra hàm
lượng cofactor tối đa cho phản ứng chuyển hóa nhóm methyl. Kết quả thể tái tổ
hợp E. coli chứa vector pETDuet được chèn gen POMT7 và gen tổng hợp SAM
có khả năng tổng hợp rhamnetin từ cơ chất quercetin với hàm lượng rất cao (111
mg/l) tăng gấp 2 lần so với chủng E. coli chỉ chứa POMT7 (Sung et al., 2011b)
(Hình 2.7). Nghiên cứu sâu hơn nữa, nhóm tác giả đã tiến hành gây tạo đột biến
điểm trên gen này và sàng lọc các gen đột biến phù hợp nhằm nâng cao năng suất
tổng hợp rhamnetin (Lee et al., 2011).

14

download by :

Hình 2.7. Sản xuất rhamnetin từ quercetin thơng qua enzyme POMT7
Nguồn: Sung et al., 2011a; Kim et al., 2010

Một số ví dụ khác về việc tổng hợp glycoside thơng qua con đường in vivo
như myricetin-3-O-rhamnoside, quercetin-3-O-rhamnoside, quercetin-3-Oalloside, kaempferol-3-O-rhamnoside, flavonoid gắn với đường UDP-Nacetylglucosamine hoặc flavonoid gắn với đường deoxy amino (Thuan et al.,
2013b; Thuan et al., 2013a; Pandey et al., 2016).
Ưu điểm quan trọng của những phương pháp này là chúng ta có thể sử dụng
cơ chất đầu vào có độ tinh sạch thấp, dễ dàng tăng sản lượng, điều chỉnh thời
gian tổng hợp và đặc biệt khả năng thu được hợp chất mới thơng qua q trình
lên men. Mặc dù vậy, phương pháp này vẫn tồn tại một số nhược điểm như: chỉ
thiên về việc sử dụng các hóa chất có sẵn, thường bị ảnh hưởng bởi độc tính của
sản phẩm hoặc cơ chất. Ví dụ, các cơ chất có tính kháng khuẩn cao sẽ giết chết vi
khuẩn trước khi q trình chuyển hóa xảy ra. Như vậy, phương pháp in-vivo sẽ
khó tạo ra được dẫn xuất của nhiều cơ chất kỳ vọng có đặc tính sinh học mới.

15

download by :