(LUẬN văn THẠC sĩ) nghiên cứu phương pháp vi ghép trong nhân giống cây có múi

HỌC VIỆN NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM

DƢƠNG THỊ HẢI YẾN

NGHIÊN CỨU PHƯƠNG PHÁP VI GHÉP
TRONG NHÂN GIỐNG CÂY CÓ MÚI

Ngành:

Khoa học cây trồng

Mã số:

8620110

Người hướng dẫn khoa học:

TS. Đoàn Thu Thủy

NHÀ XUẤT BẢN HỌC VIỆN NÔNG NGHIỆP - 2018

download by :


LỜI CAM ĐOAN
Tơi xin cam đoan đây là cơng trình nghiên cứu của riêng tôi. Các số liệu, kết quả
nêu trong luận án là trung thực, khách quan và chƣa từng dùng để bảo vệ lấy bất kỳ học
vị nào.
Tôi xin cam đoan rằng mọi sự giúp đỡ cho việc thực hiện luận án đã đƣợc cảm
ơn, các thông tin trích dẫn trong luận án đƣợc ghi rõ nguồn gốc.
Hà Nội, ngày

tháng

năm 2018

Tác giả luận văn

Dƣơng Thị Hải Yến

i

download by :


LỜI CẢM ƠN
Tôi xin chân thành cảm ơn Ban giám đốc học viện, Ban chủ nhiệm khoa Nông
học, đặc biệt là các thầy, cô giáo đã truyền đạt cho tôi những kiến thức bổ ích trong q
trình học tập và rèn luyện tại Học viện Nông nghiệp Việt Nam.
Tôi xin bày tỏ sự biết ơn sâu sắc và chân thành nhất tới TS.Đồn Thu Thủy, Bộ
mơn Di truyền & Chọn tạo Giống cây trồng, Học viện Nông nghiệp Việt Nam, ngƣời đã
dành nhiều thời gian và tâm huyết tận tình hƣớng dẫn, giúp đỡ tơi trong q trình thực
hiện luận văn tốt nghiệp.
Tôi xin chân thành cảm ơn PGS.TS. Hà Viết Cƣờng- Trung tâm nghiên cứu
Bệnh cây, các thầy cô trong bộ môn Di truyền và Chọn giống cây trồng đã giúp đỡ tơi
trong q trình thực tập và hồn thành luận văn tốt nghiệp.
Cuối cùng tôi xin bày tỏ sự biết ơn, những tình cảm thân thƣơng nhất gửi đến
gia đình, ngƣời thân, bạn bè, những ngƣời đã ln bên cạnh động viên, khích lệ tơi
trong q trình học tập và hồn thành luận văn.
Một lần nữa tơi xin chân thành cảm ơn!
Hà Nội, ngày

tháng

năm 2018

Tác giả luận văn

Dƣơng Thị Hải Yến

ii

download by :


MỤC LỤC
Lời cam đoan ..................................................................................................................... i
Lời cảm ơn ........................................................................................................................ ii
Mục lục ........................................................................................................................... iii
Danh mục chữ viết tắt ....................................................................................................... v
Danh mục bảng ................................................................................................................ vi
Danh mục hình ................................................................................................................ vii
Trích yếu luận văn ......................................................................................................... viii
Thesis abstract................................................................................................................... x
Phần 1. Mở đầu ............................................................................................................... 1
1.1.

Tính cấp thiết ...................................................................................................... 1

1.2.

Mục tiêu của đề tài.............................................................................................. 2

1.2.1.

Mục tiêu tổng quát .............................................................................................. 2

1.2.2.

Mục tiêu cụ thể ................................................................................................... 2

1.3.

Phạm vi nghiên cứu ............................................................................................ 2

1.3.1.

Đối tƣợng nghiên cứu ......................................................................................... 2

1.3.2.

Địa điểm và thời gian nghiên cứu ....................................................................... 2

1.4.

Ý nghĩa khoa học và thực tiễn ............................................................................ 3

1.4.1.

Ý nghĩa khoa học ................................................................................................ 3

1.4.2.

Ý nghĩa thực tiễn ................................................................................................ 3

Phần 2. Tổng quan tài liệu ............................................................................................. 4
2.1.

Cơ sở khoa học của đề tài ................................................................................... 4

2.2.

Nguồn gốc, phân loại cây có múi ....................................................................... 4

2.2.1.

Nguồn gốc........................................................................................................... 4

2.2.2.

Phân loại ............................................................................................................. 5

2.3.

Tình hình sản xuất và tiêu thụ quả có múi trong nƣớc và trên thế giới .............. 6

2.3.1.

Tình hình sản xuất, tiêu thụ quả có múi trên thế giới ......................................... 6

2.3.2.

Tình hình sản xuất tiêu thụ quả có múi ở việt nam ............................................ 8

2.4.

Nghiên cứu phƣơng pháp nhân giống cây có múi .............................................. 9

2.4.1.

Kỹ thuật nhân giống bằng cách ni cấy mơ...................................................... 9

2.4.2.

Quy trình nhân giống in vitro ............................................................................. 9

iii

download by :


2.4.3.

Ảnh hƣởng chất điều hịa sinh trƣởng trong ni cấy mô tế bào thực vật........ 11

2.5.

Khái niệm vi ghép............................................................................................. 12

2.5.1.

Quá trình hình thành vết ghép .......................................................................... 12

2.5.2.

Các yếu tố ảnh hƣởng đến vi ghép ................................................................... 14

2.6.

Một số thành tựu trong nhân giống cây có múi ................................................ 19

2.6.1.

Nghiên cứu về vi ghép thực vật trên thế giới ................................................... 19

2.6.2.

Nghiên cứu về vi ghép thực vật trong nƣớc ..................................................... 24

Phần 3. Vật liệu và phƣơng pháp nghiên cứu ............................................................ 27
3.1.

Vật liệu, địa điểm và thời gian nghiên cứu ....................................................... 27

3.1.1.

Vật liệu nghiên cứu ........................................................................................... 27

3.1.2.

Thời gian và địa điểm nghiên cứu .................................................................... 27

3.2.

Nội dung nghiên cứu ........................................................................................ 27

3.3.

Phƣơng pháp nghiên cứu .................................................................................. 28

Phần 4. Kết quả nghiên cứu và thảo luận .................................................................. 35
4.1.

Nghiên cứu công thức khử trùng các loại hạt bƣởi và hạt quất bằng các dung
dịch khử trùng ................................................................................................... 35

4.2.

Nghiên cứu ảnh hƣởng của ga3 đến tỷ lệ hạt nảy mầm .................................... 38

4.3.

Nghiên cứu phƣơng pháp khử trùng phù hợp đối với đoạn cành giâm chuẩn bị
chồi ghép........................................................................................................... 43

4.4.

Nghiên cứu ảnh hƣởng của môi trƣờng đến tỷ lệ bật mầm của chồi ghép ....... 45

4.5.

Nghiên cứu ảnh hƣởng của tuổi gốc ghép đến tỷ lệ sống của vi ghép ............. 49

4.6.

Nghiên cứu ảnh hƣởng của kích thƣớc đỉnh sinh trƣởng đến tỷ lệ sống của vi
ghép .................................................................................................................. 51

4.7.

Nghiên cứu ảnh hƣởng của phƣơng pháp ghép đến tỷ lệ nảy mầm của mắt
ghép .................................................................................................................. 53

4.8.

Nghiên cứu ảnh hƣởng của môi trƣờng đến tỷ lệ ra rễ của cây vi ghép ........... 57

4.9.

Kết quả kiểm tra bệnh của các cây vi ghép ...................................................... 59

Phần 5. Kết luận và kiến nghị...................................................................................... 61
5.1.

Kết luận............................................................................................................. 61

5.2.

Kiến nghị .......................................................................................................... 62

Tài liệu tham khảo .......................................................................................................... 63

Phụ lục .......................................................................................................................... 69

iv

download by :


DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT
Chữ viết tắt
BAP

Nghĩa tiếng Việt
6-Benzyl Amino Purin

Cs

Cộng sự

ĐC

Đối chứng

GA3

Gibberellin

IAA

Indoly Acetic Acid

MS

Murashige - Skoog (1962)

NAA

α - Napthalen Acetic Acid

v

download by :


DANH MỤC BẢNG
Bảng 2.1.

Các lồi cam qt thực sự có ý nghĩa trong thực tiễn sản xuất ................................ 6

Bảng 2.2.

Sản lƣợng một số cây ăn quả có múi của thế giới và các châu lục .......................... 7

Bảng 2.3.

Diện tích, năng suất, sản lƣợng cây có múi nƣớc ta năm 2005-2013...................... 8

Bảng 4.1.

Ảnh hƣởng công thức khử trùng đến tỉ lệ vô trùng của hạt quất ........................... 35

Bảng 4.2.

Ảnh hƣởng của công thức khử trùng đến tỷ lệ vô trùng của hạt bƣởi ................... 37

Bảng 4.3.

Ảnh hƣởng của GA3 đến tỷ lệ nảy mầm của hạt quất ............................................ 39

Bảng 4.4.

Ảnh hƣởng của GA3 đến tỉ lệ nảy mầm của hạt bƣởi ............................................. 41

Bảng 4.5.

Ảnh hƣởng của các dung dịch khử trùng đến tỉ lệ vô trùng của đoạn cành giâm
giống cam Vân Du ...................................................................................................... 43

Bảng 4.6.

Ảnh hƣởng của các dung dịch khử trùng đến tỷ lệ vô trùng của đoạn cành giâm
giống cam Sunkit ........................................................................................................ 44

Bảng 4.7.

Ảnh hƣởng của các dung dịch khử trùng đến tỉ lệ vô trùng của đoạn cành giâm
giống cam V2 .............................................................................................................. 44

Bảng 4.8.

Ảnh hƣởng của môi trƣờng đến khả năng ra chồi của cành cam Vân Du. (sau 50

ngày nuôi cấy) ............................................................................................................. 46

Bảng 4.9.

Ảnh hƣởng của môi trƣờng đến khả năng ra chồi của cành cam Sunkit (sau 50
ngày nuôi cấy) ............................................................................................................. 47

Bảng 4.10. Ảnh hƣởng của môi trƣờng đến khả năng ra chồi của cành cam V2 (sau 50 ngày
nuôi cấy) ...................................................................................................................... 48
Bảng 4.11. Ảnh hƣởng của tuổi gốc ghép bƣởi đến tỷ lệ sống của vi ghép ............................. 49
Bảng 4.12. Ảnh hƣởng của tuổi gốc ghép quất đến tỷ lệ sống của vi ghép.............................. 50
Bảng 4.13. Ảnh hƣởng của kích thƣớc đỉnh sinh trƣởng cam đến tỷ lệ sống của vi ghép ..... 52
Bảng 4.14. Ảnh hƣởng phƣơng pháp ghép với sự phát triển gốc ghép bƣởi ........................... 53
Bảng 4.15. Ảnh hƣởng phƣơng pháp ghép với sự phát triển gốc ghép quất ............................ 54
Bảng 4.16. Ảnh hƣởng của môi trƣờng đến tỷ lệ ra rễ của cây vi ghép giống cam Vân Du..... 57
Bảng 4.17. Ảnh hƣởng của môi trƣờng đến tỷ lệ ra rễ của cây vi ghép giống cam Sunkit ....... 58
Bảng 4.18. Ảnh hƣởng của môi trƣờng đến tỷ lệ ra rễ của cây vi ghép giống cam V2 .......... 58
Bảng 4.19. Kết quả kiểm tra phát hiện vi khuẩn Ca. Liberibacter asiaticus (bệnh
Huanglongbing = Greening) trên cây cam vi ghép ................................................. 60

vi

download by :


DANH MỤC HÌNH
Hình 4.1. Ảnh hƣởng cơng thức khử trùng đến sự nảy mầm hạt quất ......................... 36
Hình 4.2. Ảnh hƣởng công thức khử trùng đến sự nảy mầm của hạt bƣởi .................. 38
Hình 4.3.

Ảnh hƣởng của nơng độ GA3 đến khả năng nẩy mầm của hạt quất .................. 39

Hình 4.4. Hạt quất nảy mầm sau 4 tuần trong môi trƣờng có nồng độ GA3 khác
nhau ...................................................................................................... 40
Hình 4.5. Ảnh hƣởng của nồng độ GA3 đến khả năng nẩy mầm của hạt bƣởi ............ 41
Hình 4.6. Cành giâm sử dụng BAP nồng độ 1 và 1,5 mg/l (sau 50 ngày ni cấy) .... 42
Hình 4.7. Mẫu sạch (bên trái) và mẫu nhiễm bệnh (bên phải) sau khử trùng đoạn cành
giâm.............................................................................................................. 45
Hình 4.8. Cành giâm trong mơi trƣờng MS bổ sung BAP nồng độ 1 mg/ l ở cam V2
(trái) và 1,5 mg/l ở cam Vân Du (sau 50 ngày nuôi cấy) ............................. 49
Hình 4.9. Vi ghép cam V2 trên gốc quất theo phƣơng pháp ghép hàm ếch sau 10 ngày
(bên trái), sau khi nảy mầm đƣợc 20 ngày (phải) ........................................ 55
Hình 4.10. Vi ghép cam Vân Du trên gốc quất theo phƣơng pháp ghép nêm sau 10 ngày
(bên trái), sau khi nảy mầm đƣợc 20 ngày (phải) ........................................ 55
Hình 4.11. Vi ghép cam Vân Du trên gốc bƣởi theo phƣơng pháp ghép nêm sau 10 ngày
(bên trái), sau khi nảy mầm đƣợc 20 ngày (phải) ........................................ 56
Hình 4.12. Vi ghép cam V2 trên gốc bƣởi theo phƣơng pháp ghép hàm ếch ghép sau 10
ngày ghép (trái), sau 20 ngày bật mầm (phải) ............................................. 56
Hình 4.13. Ghép chữ chữ T ngƣợc (cam Sunkit)............................................................ 56
Hình 4.14. Kết quả kiểm tra bệnh trên cây sau vi ghép .................................................. 60

vii

download by :


TRÍCH YẾU LUẬN VĂN
Tên tác giả: Dƣơng Thị Hải Yến
Tên luận án: Nghiên cứu phƣơng pháp vi ghép trong nhân giống cây có múi
Chuyên ngành: Khoa học cây trồng

Mã số: 8620110

Tên cơ sở đào tạo: Học Viện Nông Nghiệp Việt Nam
Mục đích nghiên cứu
- Xác định đƣợc quy trình kỹ thuật vi ghép nhằm tạo ra cây có múi in vitro
sạch bệnh.
Phƣơng pháp nghiên cứu
 Nghiên cứu về gốc ghép trong vi ghép.
- Tiến hành khử trùng đối với hạt quất và hạt bƣởi trên bốn loại hóa chất, gồm:
Cồn, Javen, Presept và HgCl2. Từ đó đánh giá tỷ lệ vô trùng khi vào mẫu cũng nhƣ khả
năng nảy mầm của các loại hạt sau khi khử trùng.
- Hạt quất và hạt bƣởi đƣợc cấy trong các môi trƣờng MS bổ sung nồng độ GA3
khác nhau để từ đó xác định mức GA3 tốt nhất cho sự nảy mầm của hạt.
 Nghiên cứu về chồi ghép trong vi ghép.
-Khử trùng các loại cành giâm trên 3 loại hóa chất khử trùng khác nhau, gồm
Javen, Presept, HgCl2 từ đó xác định phƣơng pháp khử trùng tốt nhất cho sự phát triển
cành giâm.
- Cành giâm của 3 giống cam đƣợc cấy vào môi trƣờng chứa BAP với các nồng
độ khác nhau, nhằm xác định nồng độ BAP thích hợp nhất cho sự bật chồi và phát triển
của cành giâm.
 Nghiên cứu phƣơng pháp vi ghép.
- Gốc ghép bƣởi và quất qua các tuần tuổi từ 2-5 tuần đem ghép với các loại
cành cam nhằm tìm ra tuổi gốc ghép thích hợp nhất với vi ghép.
- Cắt đỉnh sinh trƣởng 3 giống cam với các kích thƣớc khác nhau đem ghép,từ
đó xác định kích thƣớc đỉnh phù hợp nhất trong vi ghép.
- Chồi ghép 3 giống cam đem ghép lần lƣợt với các gốc ghép bƣởi và quất, theo
3 phƣơng pháp: Nêm, Chữ T, hàm ếch. Từ đó tìm ra phƣơng pháp có hiệu quả nhất đối
với gốc ghép bƣởi và quất.
- Cây sau vi ghép đƣợc chuyển sang môi trƣờng chứa nồng độ α-NAA khác

nhau để xác định nồng độ thích hợp cho sự ra rễ của cây vi ghép sau 1-4 tuần.

viii

download by :


Kết quả chính và kết luận
1. Khi tăng thời gian xử lí cồn 700 từ 1 đến 9 phút thì tỉ lệ mẫu nhiễm cũng giảm
xuống. Tỷ lệ nảy mầm của hạt bƣởi đạt cao nhất khi khử trùng bằng cồn 700 trong 7
phút ở hạt quất chỉ đạt 36,8%. Bên cạnh đó, tỷ lệ mẫu nhiễm của hạt bƣởi vẫn nhỏ hơn
hạt quất do hạt quất có lớp màng nhầy bên ngồi rất khó bóc tách. Với ba dung dịch khử
trùng còn lại vẫn chƣa đạt đƣợc hiệu quả cao khi sử dụng. Để phá ngủ và rút ngắn thời
gian nảy mầm của hạt gốc ghép cần bổ sung 80mg/l GA3 vào môi trƣờng MS, từ 35
ngày xuống 22 ngày đối với hạt quất; từ 30 ngày xuống 22 ngày đối với hạt bƣởi.
2. Đối với việc khử trùng các đoạn cành giâm cho thấy Presept cho thấy hiệu quả
kém nhất trong việc khử trùng trên cả ba đối tƣợng cành giâm. Xử lý HgCl2 0,1% trong
15 phút cho hiệu quả khử trùng tốt nhất đối với việc khử trùng giống cam Vân Du và
Sunkit, trong khi Javen 5% trong 15 phút lại tỏ ra hiệu quả với giống cam V2. Khi bổ
sung vào môi trƣờng MS 1mg/l BAP đối với cam Sunkit và cam V2; bổ sung 1,5 mg/l
BAP đối với cam Vân Du, cho thấy tác dụng tích cực đối với sự bật mầm và chất lƣợng
chồi, giúp cây phát triển to, khỏe, lá xanh đậm.
3. Nếu sử dụng gốc ghép quá non (2 tuần tuổi) hoặc quá già (5 tuần tuổi) cho tỷ lệ
cây vi ghép sống thấp hơn so với gốc ghép từ 3-4 tuần tuổi. Ngồi ra, kích thƣớc đỉnh
sinh trƣởng có ảnh hƣởng đến hiệu quả quá trình vi ghép. Vi ghép với đỉnh sinh trƣởng
1mm là quá nhỏ, do đó cây vi ghép không thể tái sinh chồi và bị chết. Khi tiến hành vi
ghép ở đỉnh sinh trƣởng có kích thƣớc 3mm cho thấy hiệu quả tốt nhất, trên cả ba giống
cam nghiên cứu. Phƣơng pháp ghép hàm ếch cho hiệu quả ghép cao nhất, hai phƣơng
pháp ghép nêm và ghép chữ T cho hiệu quả kém hơn. Giữa 3 giống cam thì giống V2
cho hiệu quả ghép tốt nhất, tiếp sau là giống cam Sunkit và kém nhất là giống cam Vân

Du. Môi trƣờng ra rễ cho kết quả tốt nhất với cả 3 giống cam thí nghiệm là bổ sung 1ml
α -NAA/l vào môi trƣờng nuôi cây vi ghép.
4. Kết quả cho thấy sự thành công của vi ghép khi 100% mẫu lá cây vi ghép đem
test đều cho kết quả âm tính với bệnh Greening, cây sạch bệnh, sinh trƣởng tốt.

ix

download by :


THESIS ABSTRACT
PhD candidate: Duong Thi Hai Yen
Thesis title: Research on micrografting in propagation some varieties of Citrus sinensis
Major: Crop science

Code: 8620110

Educational organization: Vietnam National University of Agriculture (VNUA)
Research Objectives
- Identification of in vitro micrografting techniques for disease-free of some
varieties of Citrus sinensis production.
Materials and Methods
 Research on rootstock in micro-grafting.
-Produce sterilization for kaffir and grapefruit seeds on four chemicals,
including Alcohol, Javen, Presept and HgCl2. The germination of seeds after
germination is evaluated.
Grapefruit and grapefruit seed are grown in different concentrations of GA3 to
determine the best GA3 for germination.
 Research on grafting in micro-grafts.
- Sterilization of cuttings on 3 different types of disinfectants, including Javen,

Presept, HgCl2, which determine the best method of sterilization for branch development.
- The cuttings of the three cultivars were inoculated into BAP media at different
concentrations to determine the BAP concentration most suitable for the shooting
setting of cuttings.
 Research on micro-grafting.
Grafting of grapefruit and oranges in weeks 2-5 weeks old, grafted with orange
branches to find the graft root age most suitable for the graft.
- Cutting the top three varieties of orange with different sizes to graft, then
determine the most suitable peak size in the graft.
-Grass grafted with grapefruit and lemongrass grafted with 3 methods. From
there, find the most effective method for grafting and grafting.
Post-transplanted
microorganisms
were
transferred
to
different
concentrations of NAA to determine the appropriate concentration for rooting of the
microorganism after 1-4 weeks
 Study on the method of second grafting in clonal propagation.

x

download by :


-In order to improve the efficiency of micro-grafting, the second grafting was
carried out according to the method of Su and Chu (1984). Grafts of the posterior
grafted variety at 4-8 weeks of age were grafted onto 9 months old grapefruit pomace to
determine the effect of grafting.

Main findings and conclusions
1. When increasing the processing time of sterilization by alcohol 70 degrees
from 1 to 9 minutes, the infected sample rates were reduced from 100% (1 minute) to
4,7% (9 minutes) but the seed germination rates were very low. The germination rate of
pomelo seed was highest when sterilization by alcohol 700 for 7 minutes - 54.44% and
36,82% for the kumquat.The remaining 3 disinfectants remain unsuccessful when used.
To break the sleep and shorten the germination time of pomelo and kumquat seeds need
to add 80mg / l GA3 to the MS medium, specifically: from 35 days to 22 days for
kumquat; from 30 days to 22 days for pomelo seeds.
2. Presept showed the least efficiency in sterilization on all three branch of
Van Du, Sunkit, V2. Treatment by 0.1% HgCl 2 for 15 minutes gaves the best
antiseptic efficiency for Van Du and Sunkit, while 5% Javen for 15 minutes proved
effective for V2.
The addition of BAP to MS medium has a positive effect on shoot quality compared to
the control. For each variety, the BAP concentration is different. For Sunkit and V2
oranges, the suitable medium for sprouting is MS medium supplemented with 1mg /l
BAP while for Van Du orange best medium is supplemented with 1.5 mg /l BAP, which
helps to grow fast, healthy, dark green leaves.
3. If the rootstock is too young (2 weeks old) or too old (5 weeks of age), the
rate of live grafting is lower than 3-4 weeks rootstock. The size of the meristem
influences the efficiency of the micrografting. The microplant with a 1mm size of
meristem is too small, so the plant can not regenerate shoots and die. With a 3mm size
of meristem, after one week of follow-up, the highest shoot yield was 26,7% for Van
Du orange, 16,7% for V2 and 13,3% for Sunkit orange.
Method Grafting “Ham ech” is the best effective. Among the three varieties of orange,
V2 is the best for grafting, followed by the Sunkit orange and the least orange Van Du.
The best rooting medium for all three cultivars was supplemented with 1ml α NAA / l
into the culture medium.
4. The results showed that the success of micro-grafting when 100% of the
sample of micro-leaves are negative results, disease-free plants, good growth.

xi

download by :


PHẦN 1. MỞ ĐẦU
1.1. TÍNH CẤP THIẾT
Khí hậu Việt Nam là khí hậu nóng ẩm nhiệt đới rất thuận lợi cho các loại
cây trồng khác nhau sinh trƣởng và phát triển. Trong nhiều loại cây trồng khác
nhau ấy thì cây có múi là một chủng loại cây ăn trái chiếm vị thế quan trọng trên
thế giới. Thật vậy, ngoài vai trò cung cấp một lƣợng vitamin dồi dào cho sức
khỏe con ngƣời, cây có múi cịn là loại cây mang lại giá trị kinh tế cao và làm
tăng ngoại tệ đáng kể nhờ xuất khẩu. Việt Nam là một trong những nƣớc bản địa
của vùng phát sinh cây có múi, và cho đến nay cây có múi giữ vị trí quan trọng
trong ngành sản xuất trái cây.
Tuy đem lại nguồn kinh tế cao nhƣng cây có múi lại nhiễm nhiều bệnh
nguy hiểm và trồng cây có múi vẫn đang đứng trƣớc những thách thức lớn.
Trong đó bệnh vàng lá Greening do vi khuẩn Liberobacter asiaticus là quan
trọng nhất và đang đƣợc nhiều nƣớc trên thế giới đầu tƣ nghiên cứu tìm biện
pháp phịng trừ. Bệnh Vàng lá Greening là bệnh có tính hủy diệt cao, bệnh xuất
hiện ở khắp các vùng trồng cây có múi, lây lan mạnh làm suy yếu cây, từ đó làm
giảm năng suất và phẩm chất quả.
Bên cạnh đó một số bệnh khác cũng khơng kém phần quan trọng, nhất là
trong giai đoạn hiện nay. Đó là bệnh Tristeza do Closterovirus gây ra, virus tác
động làm hỏng mạch dẫn libe trong cây xuống rễ làm cây suy yếu và phát triển
kém, cây lùn, quả méo mó, năng suất kém (Lê Mai Nhất, 2008).
Để giữ đƣợc và khai thác tốt hơn các vùng cây ăn quả truyền thống, đáp
ứng nhu cầu giống tốt cho thị trƣờng trong nƣớc và tiến tới xuất khẩu cần áp
dụng các quy trình kỹ thuật mới, dùng giống tốt, sạch bệnh. Nhân giống bằng các

phƣơng pháp cơng nghệ tiên tiến có ý nghĩa vô cùng quan trọng và hết sức cần
thiết, trong đó vi ghép cây là hƣớng đi cần đƣợc quan tâm trong sản xuất cây có
múi hiện nay.
Việc áp dụng các phƣơng pháp kĩ thuật trong đó có phƣơng pháp nhân
giống in vitro có nhiều ƣu điểm: Đảm bảo đƣợc các đặc điểm di truyền tốt của
cây mẹ, tạo quần thể cây con đồng nhất, tỷ lệ nhân giống cao, số lƣợng giống lớn,
tạo nguồn giống sạch bệnh (nuôi cấy trong điều kiện vô trùng), tăng tuổi thọ cho
cây, thời gian nhân giống nhanh.

1

download by :


Xuất phát từ thực tiễn đó,chúng tơi thực hiện đề tài:
“Nghiên cứu phương pháp vi ghép trong nhân giống cây có múi”
nhằm tạo giống cây tốt, sạch bệnh phục vụ sản xuất và mở rộng diện tích sản
xuất. Kết quả nghiên cứu là cơ sở duy trì phẩm chất tốt của cây mẹ để nhân
giống ra sản xuất đại trà, đồng thời bổ sung thêm kiến thức nhân giống về cây
có múi nói chung.
1.2. MỤC TIÊU CỦA ĐỀ TÀI
1.2.1. Mục tiêu tổng quát
Thành lập đƣợc quy trình vi ghép cây có múi nhằm tạo ra tạo ra cây có
múi in vitro sạch bệnh.
1.2.2. Mục tiêu cụ thể
-

Xác định đƣợc dung dịch khử trùng cho hạt gốc ghép và chồi ghép 3

giống cam: Vân Du, Sunkit, V2.

-

Xác định đƣợc môi trƣờng nuôi cấy hạt và chồi ghép phục vụ cho vi ghép.

- Xác định đƣợc phƣơng pháp vi ghép đỉnh sinh trƣởng có tỷ lệ thành cơng
cao nhất.
-

Giám định bệnh trên các cây đã vi ghép thành công.

1.3. PHẠM VI NGHIÊN CỨU
1.3.1. Đối tƣợng nghiên cứu
- Hạt các loại cây có múi: Bƣởi và quất.
- Gốc ghép bƣởi dại đủ tiêu chuẩn của cây gốc ghép.
- Chồi ghép của 3 giống cam quýt thu thập: Cam Vân Du, Sunkit, V2.
1.3.2. Địa điểm và thời gian nghiên cứu
1.3.2.1. Địa điểm
- Các mẫu giống cam Vân Du, Sunkit, V2 đƣợc trồng tại khu nhà lƣới thí
nghiệm của Bộ mơn Di truyền và chọn giống cây trồng – Học viện Nông nghiệp
Việt Nam.
- Các thí nghiệm về vi ghép đƣợc tiến hành tại phịng thí nghiệm ni cấy
mơ thuộc Bộ mơn Sinh lý Thực vật – Học viện Nông nghiệp Việt Nam.
1.3.2.2. Thời gian
Thời gian nghiên cứu từ tháng 2 năm 2017 đến tháng 3 năm 2018.

2

download by :

1.4. Ý NGHĨA KHOA HỌC VÀ THỰC TIỄN
1.4.1. Ý nghĩa khoa học
Kết quả nghiên cứu của đề tài là những dẫn liệu khoa học có giá trị về các
phƣơng pháp vi ghép cũng nhƣ đánh giá tác động các hóa chất trong mỗi quá
trình nhằm nâng cao hiệu quả để áp dụng trong nhân giống cây có múi.
Kết quả nghiên cứu của đề tài sẽ góp phần bổ sung thêm những tài liệu
khoa học, phục vụ cho công tác giảng dạy cũng nhƣ nghiên cứu trên cây có múi.
1.4.2. Ý nghĩa thực tiễn
Kết quả nghiên cứu sẽ đóng góp dữ liệu trong quy trình trồng và chăm sóc
cây có múi, đặc biệt là đề xuất đƣợc mức độ hiệu quả trong việc tạo chồi, tạo rễ
trên cây vi ghép.
Việc tạo đƣợc cây có múi bệnh S0 bằng kỹ thuật vi ghép đỉnh sinh trƣởng
sẽ là nguyên liệu cơ bản để sản xuất cây giống sạch bệnh cung cấp cho sản xuất,
khắc phục hiện tƣợng suy thoái, sâu bệnh.

3

download by :


PHẦN 2. TỔNG QUAN TÀI LIỆU
2.1. CƠ SỞ KHOA HỌC CỦA ĐỀ TÀI
Cây có múi có cấu tạo hoa lƣỡng tính và là cây giao phấn nên các cây
trồng từ hạt (cây thực sinh) có tính biến dị lớn thƣờng khơng duy trì đƣợc những
đặc tính của cây mẹ. Vì vậy trong q trình sản xuất ngƣời nơng dân ít khi nhân
giống bằng phƣơng pháp gieo hạt mà đa phần là nhân giống vơ tính. Qua các q
trình nhân giống vơ tính bằng cách ghép, chiết cành, giâm cành, hoặc ni cấy
invitro nhiều giống duy trì đƣợc một số đặc tính tốt của cây mẹ nơi ngun sản,
ngồi ra nó cịn thể hiện một số đặc tính tốt hơn.
Trong thực tiễn sản xuất đa số ngƣời nông dân sử dụng phƣơng pháp chiết

cành và ghép cành để nhân giống cây có múi. Ngày nay, với sự phát triển của
khoa học cơng nghệ, việc nhân giống cây có múi bằng phƣơng pháp vi ghép ngày
càng trở nên phổ biến, các cây ghép sinh trƣởng nhanh, phát triển tốt và sớm ra
hoa đậu quả, không chỉ vậy, cây vi ghép làm giảm thiểu tỷ lệ mắc các bệnh trên
cây có múi so với các phƣơng pháp nhân giống thông thƣờng. Đây là những cơ
sở khoa học cơ bản cho thực hiện đề tài.
2.2. NGUỒN GỐC, PHÂN LOẠI CÂY CÓ MÚI
2.2.1. Nguồn gốc
Trên thế giới, cây có múi có lịch sử trồng trọt từ rất lâu đời. Cây có múi
đƣợc trồng ở vùng Đông Nam châu Á cách đây khoảng 4.000 năm trƣớc Công
nguyên (Webber, 1967). Nhiều kết quả nghiên cứu cho rằng cam quýt đang đƣợc
trồng hiện nay đều có nguồn gốc từ vùng nhiệt đới và cận nhiệt đới Đông Nam
châu Á. Tanaka (1979) đã vạch ra đƣờng ranh giới vùng xuất xứ của giống thuộc
chi Citrus từ phía Đơng Ấn Độ (chân dãy Hymalaya) qua Úc, miền Nam Trung
Quốc, Nhật Bản…. Hàn Ngạn Trực đời Tống trong “Quýt lục” đã ghi chép về
phân loại và các giống ở Trung Quốc. Điều này cũng khẳng định thêm về nguồn
gốc các giống cam chanh (Citrus sinensis Osbeck) và các giống quýt ở Trung
Quốc theo đƣờng ranh giới gấp khúc Tanaka. (Trần Thế Tục, 1998). Nhiều tác
giả cho rằng nguồn gốc quýt Kinh (Citrus nobilis Lour) là ở miền Nam Việt Nam.
Thực tế ở Việt Nam ta từ bắc chí nam ở vùng nào cũng có trồng cam sành với
nhiều vật liệu giống với các tên địa phƣơng khác nhau mà không nơi nào trên thế
giới có nhƣ: cam sành Bố Hạ, cam sành Hàm Yên, Yên Bái, Cam sen Yên Bái,

4

download by :


Cam sen Đình Cả - Bắc Sơn, cam bù Hà Tĩnh… (Trần Thế Tục, 1998).
Nguồn gốc bƣởi trùm là ở tây Ấn Độ, cịn nguồn gốc của bƣởi thì ở

Malaisia (Chawalit Nigomdhnm, 1992). Sau đó đƣợc trồng rộng rãi ở Trung
Quốc, miền nam nƣớc Nhật, tây Ấn Độ, Địa Trung Hải, Mỹ. Theo Tơn Thất
Trình (1995) bƣởi có nguồn gốc ở Ấn Độ. Nhƣ vậy các tác giả trong và ngồi
nƣớc nghiên cứu về nguồn gốc thấy rằng: Bƣởi có nguồn gốc từ Ấn Độ, Trung
Quốc và các nƣớc Đông Nam Á thuộc vùng khí hậu nhiệt đới và Á nhiệt đới
nóng. Giống cam Washington navel là có nguồn gốc từ Bahia, Brazil và có thể là
đột biến của giống cam ngọt “Seleta” đƣợc nhập nội vào Úc năm 1824, ở Florida
(Mỹ) năm 1835, California năm 1870 và từ Washington D.C (Hartman and Dele
E. Kester Davies, 1983).
2.2.2. Phân loại
Vấn đề phân loại cam quýt đƣợc nhiều tác giả nghiên cứu trong nhiều thời
kì khác nhau. Đầu tiên là Lines (1753) đã sắp xếp và đƣa giống Citrus vào hệ
thống thực vật học và chia thành 2 loài Citrus medica (L) và Citrus aurantium (L).
Sau đó là Gallenzio (1811); Dekaedol (1824); Bona Via (1888-1890); Engle
(1897); Swingle (1911 - 1916); Markovie (1921); Tanaka (1927 - 1932); Luxe
(1929- 1941); Dzukovskii (1971) và nhiều tác giả khác. (Boun Keaua Vongsalath
2005). Trên thế giới hiện nay ngƣời ta sử dụng các hệ thống phân loại của Swingle,
Tanaka và Hogdson. Trong hệ thống phân loại công bố năm 1943 trong tác phẩm
“Citrus industry” Swingle chia cam qt ra làm 16 lồi. Tanaka chia thành 144
lồi, cịn Dzukovskii chia thành 157 loài (1971). Nhà nghiên cứu cam quýt ngƣời
Mỹ Hogdson, trên cơ sở phân tích, phê phán cả 2 hệ thống phân loại, tạo ra một hệ
thống phân loại mới bao gồm 16 loài từ hệ thống của Swingle và hơn 20 loài từ hệ
thống của Tanaka (Hoàng Ngọc Thuận, 2004; Trần Thế Tục và cs., 1998).
Sự phân loại cam qt khá phức tạp vì có các yếu tố nhƣ: vịng di thực và
khả năng thích ứng rộng, có rất nhiều giống (Cultivars) trong sản xuất và các dạng
con lai của giống này (Hybrids), hiện tƣợng hạt đa phôi, đột biến và hiện tƣợng đa
bội thể cũng là những nhân tố gây khó khăn cho phân loại cam quýt (Phạm Văn
Côn, 1997). Cam quýt thuộc bộ cam quýt (Rutales), họ cam quýt (Rutaceae), đƣợc
phân chia làm 130 giống (genera) với những đặc điểm chung nhƣ cây có mang
tuyến dầu (chủ yếu phân bố ở lá), bầu lọc nối trên đài hoa, lá phần lớn có đỉnh viền

răng cƣa, quả thảo gồm 2 hay nhiều noãn bên trong, 130 giống này nằm trong họ

5

download by :


phụ khác nhau, trong đó họ phụ hoa hồng (Aurantirideae) là có ý nghĩa nhất. Sự
phân loại chi tiết hơn dƣới họ phụ Aurantirideae có tộc Citereae (28 giống) và tộc
phụ Citrnae (13 giống), 3 nhóm: “tiền cam quýt”, “gần cam quýt”, và nhóm “cam
quýt thực sự” (True Citrus group) đƣợc phân bố từ Citreace và tộc phụ Citrnae
(Trần Nhƣ Ý và Đào Thanh Vân, 2000).
Cam quýt gồm 100 đến 160 loài khác nhau, Tanaka quan sát thực tiễn sản
xuất và cho rằng các giống (Cultivars) cam quýt quả trong quá trình trồng trọt đã
biến dị trở thành giống mới. Ông quan sát ghi chép tỷ mỉ đặc điểm hình thái của
các giống đã biến dị này và phân chúng thành một lồi mới hoặc giống mới có
tên khoa học với tên khoa học đƣợc bắt đầu bằng tên giống hoặc loài đã sinh ra
chúng và kết thúc bằng chữ Horticulturre. Tanaka, Swingle đã phân chia cam
quýt ra thành 16 loài, tuy nhiên các nhà khoa học vẫn phải dùng bảng phân loại
của Tanaka để gọi tên các giống cam quýt vì bảng phân loại này chi tiết đến từng
giống. Có 10 lồi quan trọng nhất trong nhóm True Citrus group và nhóm con lai
đƣợc liệt kê ở bảng bảng sau và một số nhóm con lai phổ biến, đây là những lồi
đƣợc trồng phổ biến và có ý nghĩa với con ngƣời, có thể đƣợc mơ tả nhƣ sau (Vũ
Cơng Hậu, 2000; Đƣờng Hồng Dật, 2003).
Bảng 2.1. Các ồi ca

qu t thực sự c

nghĩa trong thực tiễn sản uất

Tên tiếng anh

Tên tiếng việt

1 C.sisnensis Osbeck
2 C.aurantium L
3 C.reticulata Blanco

Sweets Orange
Sour Orange
Mandarin

Cam ngọt
Cam chua
Quýt

4 C.limon Osbreck

Lemon

Chanh núm

5
6
7
8
9

Citron
Lime

Trioliate
Shadock
Pomelo

Chanh yên
Chanh vỏ mỏng
Chanh đắng
Bƣởi
Bƣởi chùm

Kumquat

Quất

STT

Tên loài

C.medica L
C.aurantifolia Swingle
C.trifolia L
C.grandis L
C.paradishi L

10 C.fortunenna Swingle

2.3. TÌNH HÌNH SẢN XUẤT VÀ TIÊU THỤ QUẢ CĨ MÚI TRONG
NƢỚC VÀ TRÊN THẾ GIỚI
2.3.1. Tình hình sản xuất, tiêu thụ quả có múi trên thế giới
Theo số liệu của USDA (2015), diện tích cây có múi cho thu hoạch trên

6

download by :


thế giới năm 2013 là.812.018ha, sản lƣợng đạt 8,049 triệu tấn, sản lƣợng năm
2014 đạt 91,081 triệu tấn. Năm 2015 sản lƣợng cam giảm % do năng suất cam
của Braxin, Trung Quốc, các nƣớc thuộc Liên minh Châu Âu và Mỹ giảm. Sản
lƣợng quýt và chanh tăng, song tổng sản lƣợng cây có múi năm 2015 giảm so với
năm 2014, chỉ đạt 88,4 3 triệu tấn.
Sản xuất quả có múi trên thế giới chủ yếu tập trung vào 4 chủng loại chính
là: cam, quýt (bao gồm quýt và các dạng lai), bƣởi (bao gồm bƣởi chùm grapefruit và bƣởi thƣờng - pummelo), chanh (bao gồm chanh núm - lemon và
chanh giấy - lime).
Bảng 2.2. Sản ƣợng
Sản ƣợng 2008 (tấn)

ột số cây ăn quả c
Bƣởi Chù

úi của thế giới và các châu ục

Chanh

Cam

Quýt

Thế giới
Châu Ai Cập

Phi Nam Mỹ

4.943,602
2.215
380 .976

13.439,211
32.974
233.005

67.695,B02
2.138,425
1.430,272

28.556.834
75S.105
135.000

Châu Mỹ
Mỹ Mexico
Chầu Pháp
Âu Ý

1.407,950

637.750

9.138,980

478.090

394.865
324.400

2.224,3S2
600

4.306,633
600

409.037
2.3.942

7.000
567.546
23.000

550.000
917.166
-

2.527,453
3.454,125
601.000

786 119
15.622.593
-

187.000

22.000

2.429,000
5.250
82.000

439.670
<55.000
350.000

1.066,000
6 70.000

Trung Quốc
Việt Nam
Châu Á Ẩn Độ
Nhật
Thái Lan

Nguồn: FAO (2010)

Năm 2014, sản lƣợng cam đạt 52,01 triệu tấn, trong đó 30,135 triệu tấn
cho tiêu dùng nội địa, 21,514 triệu tấn cho chế biến và 3,995 triệu tấn cho xuất
khẩu; quýt và tangerin đạt 2,511 triệu tấn, trong đó 24,890 triệu tấn cho tiêu thụ
nội địa, 1,388 triệu tấn cho chế biến và 2,501 triệu tấn cho xuất khẩu; bƣởi chùm
và pummelo đạt 5,208 triệu tấn, trong đó 5,118 triệu tấn cho tiêu thụ nội địa, 89
nghìn tấn cho chế biến và 830 nghìn tấn cho xuất khẩu và chanh đạt 283 triệu
tấn, trong đó 4,4 triệu tấn tiêu thụ nội địa 1,54 triệu tấn cho chế biến và 1,589
triệu tấn cho xuất khu (USDA, 2015).
Nƣớc sản xuất nhiều cam nhất là Braxin, năm 2014 sản lƣợng cam của

Braxin là 1,80 triệu tấn, tiếp theo là Trung Quốc, Mỹ sản lƣợng 13 triệu tấn. Đối

7

download by :


với qt thì Trung Quốc lại là nƣớc có sản lƣợng lớn nhất, năm 2014 đạt 1,850
triệu tấn, tiếp theo là Ma Rốc đạt 1,10 triệu tấn, Nhật Bản đạt 89 nghìn tấn. Trung
Quốc cũng là nƣớc sản xuất bƣởi nhiều nhất với sản lƣợng là 3,1 triệu tấn năm
2014, tiếp theo là Mỹ 950 nghìn tấn. Với chanh đƣợc sản xuất nhiều ở Mê Xi Cô
đạt 2,250 triệu tấn năm 2014 (USDA, 2015).
2.3.2. Tình hình sản xuất tiêu thụ quả có múi ở Việt Nam
Theo thống kê của Cục Trồng trọt (Bộ Nông nghiệp và PTNT), cam, bƣởi,
quýt nằm trong top 15 loại cây trồng có diện tích lớn nhất (trên 100.000ha) và
sản lƣợng lớn nhất (trên 100.000 tấn/năm) trong sản xuất cây ăn quả nƣớc ta hiện
nay, cùng với chuối, xoài, nhãn, vải, thanh long, dứa, sầu riêng, chơm chơm, mít,
chanh, na và ổi.
Trong đó, một số địa phƣơng ở vùng Trung du miền núi phía Bắc đã hình
thành đƣợc vùng sản xuất hàng hóa, mang lại giá trị kinh tế cao và khẳng định
đƣợc thƣơng hiệu sản phẩm trên thị trƣờng. Tổng diện tích cam, quýt, bƣởi của
vùng khoảng 43.500ha, chiếm 23,5% diện tích cây ăn quả tồn vùng
(184.400ha), chiếm 60% diện tích cam, qt, bƣởi phía Bắc (72.600ha) và bằng
27,6% diện tích cam, quýt, bƣởi cả nƣớc (157.400ha).
Bảng 2.3. Diện tích, năng suất, sản ƣợng cây c
Chỉ tiêu

Nă

2005 Nă

2010

Nă

úi nƣớc ta nă

2011

Nă

2012

2005-2013
Nă

2013

DT cả nƣớc (ha)

87.2

139.545,9

138.251,2

139.592,3

142.287,4

- Miền Bắc

29.8

47.611,5

47.007,1

47.522,5

48.192,2

- Miền Nam

57.3

91.934,7

91.243,7

92.069,8

93.096,2

DT cho SP (ha)

60.1

114.481,4

112.959,1

116.248,6

117.726,5

- Miền Bắc

19.9

39.472,8

38.117,6

39.019,9

38.808,8

- Miền Nam

40.2

75.008,8

74.841,4

77.228,4

78.917,7

100,9

121,9

113,0

112,8

112,7

74,0

76,12

78,6

80,4

82,5

NSTB cả nƣớc
(tạ/ha)
- Miền Bắc
- Miền Nam
SL cả nƣớc (tấn)
- Miền Bắc

114,2
141,75
606.4 1.308.393,7

147.3
331.854,3

128,6
126,9
125,4
1.350.220,0 1.382.263,0 1.399.702,4
339.729,0
361320,0
373753,6

- Miền Nam

459.2

1.010.491,0

976.539,5

102094,2

1026948,8

Nguồn Tổng cục Thống kê (2015)

8

download by :

Cây ăn quả có múi (cam, chanh, quýt, bƣởi) có giá trị dinh dƣỡng và kinh tế
cao, đƣợc xác định là một trong những cây ăn quả chủ lực trong việc phát triển nền
nơng nghiệp hàng hóa, phục vụ tiêu dùng và xuất khẩu. Tuy nhiên, tình hình sản
xuất cây có múi ở nƣớc ta chƣa ổn định, mặc dù trình độ thâm canh đƣợc nâng lên,
năng suất tăng và sản lƣợng cũng tăng (năm 2010 đạt 1.308.393, tấn, năm 2011 đạt
1.350.220 tấn, năm 2012 đạt 1.382.263,0 và năm 2013 đạt 1.399.702,4 tấn). Diện
tích sản xuất cây có múi lên xuống bấp bênh. Năm 2010 diện tích cây có múi là
139.545,9 ha, năm 2011 chỉ còn 138.251, ha, năm 2012 lại tăng lên là 139.592,3
ha và đạt 142.28,4 ha năm 2013 (Tổng cục Thống kê, 2015).
2.4. NGHIÊN CỨU PHƢƠNG PHÁP NHÂN GIỐNG CÂY CÓ MÚI
2.4.1. Kỹ thuật nhân giống bằng cách nuôi cấy mô
Trong trƣờng hợp cây ăn quả lâu năm, kỹ thuật ghép đang chiếm vị trí
hàng đầu trong nhân giống vì kết hợp đƣợc khả năng chống chịu của gốc hoang
dã với mắt ghép có ƣu điểm năng suất và phẩm chất tốt. Tuy nhiên trong lúc
ghép theo kỹ thuật truyền thống, do thời gian trồng gốc ghép kéo dài và kích
thƣớc mắt ghép khá lớn nên bệnh virus có thể truyền lây.
Để khắc phục nhƣợc điểm trên, kỹ thuật ghép đỉnh sinh trƣởng gọi tắt là vi
ghép đƣợc thử nghiệm và mang lại kết quả tốt. Về nguyên tắc, vi ghép là nuôi
cấy đỉnh sinh trƣởng nhƣng qua dinh dƣỡng của gốc ghép. Đỉnh sinh trƣởng làm
mắt ghép có kích thƣớc từ 0,2 - 0,5 mm, đƣợc tách từ búp non đang sinh trƣởng
mạnh của cây mẹ trƣởng thành, gốc ghép là cây mới nảy mầm từ hạt của giống
hoang dại, tồn bộ cây ghép đƣợc ni dƣỡng trong điều kiện ống nghiệm vô
trùng. Những cây ghép thu đƣợc bằng phƣơng pháp này hoàn toàn sạch bệnh và
mang đặc điểm di truyền của cây mẹ cho mắt ghép
2.4.2. Quy trình nhân giống in vitro
Để nhân giống in vitro cây trồng cần thực hiện tốt các kĩ thuật chủ yếu sau:
 Giai đoạn 1: Lựa chọn mẫu từ vật liệu làm gốc nuôi cấy
Trong nuôi cấy in vitro cây con mang những đặc tính và tính trạng của cây
mẹ ban đầu nên giai đoạn này cần chọn cây mẹ cẩn thận, cây mẹ thƣờng là cây
ƣu việt, khỏe, có giá trị kinh tế cao. Sau đó chọn cơ quan để lấy mẫu thƣờng là

mơ non, đoạn thân có chồi ngủ, lá non, hoa non, hạt… Mô chọn để ni cấy
thƣờng là mơ có khả năng tái sinh cao trong môi trƣờng nuôi cấy sạch bệnh, giữ
đƣợc các đặc tính sinh học quý của cây mẹ, ít nguy cơ biến dị.

9

download by :


 Giai đoạn 2: Thiết lập hệ thống cấy vô trùng
Là giai đoạn chuyển mẫu vật từ ngồi vào mơi trƣờng nuôi cấy để tạo
nguyên liệu sạch bệnh cho nhân giống, giai đoạn này đƣợc tiến hành theo các bƣớc:
(i) Chuẩn bị môi trƣờng nuôi cấy vô trùng.
(ii) Khử trùng bề mặt mẫu vật và chuẩn bị các môi trƣờng nuôi cấy
(iii) Cấy mẫu vật đã khử trùng vào ống nghiệm hoặc bình ni cấy có sẵn
mơi trƣờng nhân tạo (giai đoạn này còn gọi là cấy mẫu in vitro).
Sau khi khử trùng (phần thích hợp của thực vật), mẫu cấy sẽ đƣợc chuyển
vào môi trƣờng nuôi cấy trong điều kiện vơ trùng và ni trong phịng ni cấy
với điều kiện nhiệt độ, ánh sáng phù hợp.Những mẫu cấy còn sống sau khi khử
trùng sẽ đƣợc chuyển sang giai đoạn 3.
 Giai đoạn 3: Nhân nhanh chồi
Ở giai đoạn này yêu cầu cần phải sử dụng các chất kích thích sinh trƣởng
để thúc đẩy hình thành các cơ quan phụ hoặc cấu trúc khác mà từ đó có thể phát
sinh thành cây hoàn chỉnh trực tiếp qua nách hoặc đỉnh sinh trƣởng. Hoặc chồi
mới hình thành gián tiếp qua giai đoạn mô sẹo. Giai đoạn nhân chồi quyết định
hiệu quả của q trình ni cấy mơ, cây đƣợc nhân nhanh theo nhu cầu của
ngƣời nuôi cấy. Khi mẫu cấy sạch đã tạo ra đƣợc các cụm chồi và các phôi vơ
tính sinh trƣởng tốt, q trình ni cấy sẽ bƣớc vào giai đoạn sản xuất. Thành
phần và điều kiện môi trƣờng cần đƣợc tối ƣu hóa nhằm đạt đƣợc mục tiêu nhân
nhanh. Quy trình cấy chuyển để nhân nhanh chồi thƣờng trong khoảng 1-2 tháng

tùy loài cây. Tỉ lệ nhân nhanh khoảng 2 - 8 lần sau 1 lần cấy chuyển. Giai đoạn
này thƣờng kéo dài 10 - 36 tháng.
 Giai đoạn 4: Tạo rễ (tạo cây hoàn chỉnh)
Các chồi hình thành trong q trình ni cấy có thể phát rễ tự sinh, nhƣng
thông thƣờng các chồi này phải cấy chuyển sang một mơi trƣờng khác để kích
thích tạo rễ. Ngƣời ta thƣờng sử dụng chất kích thích trƣởng thuộc nhóm auxin
nhƣ: IAA, NAA, IBA. Thơng thƣờng giai đoạn này cần 2 - 8 tuần. Khi cây có đủ
các bộ phận rễ, thân, lá đảm bảo cây sinh trƣởng, phát triển bình thƣờng, tiến
hành đƣa cây ra ngồi mơi trƣờng tự nhiên.
 Giai đoạn 5: Chuyển cây ra đất trồng
Đây là giai đoạn đầu, cây đƣợc chuyển từ điều kiện vơ trùng của phịng thí

10

download by :


nghiệm ra ngồi mơi trƣờng tự nhiên. Giai đoạn này quyết định khả năng ứng
dụng của quy trình nhân giống in vitro. Đối với đa số các loài cây trồng thì chỉ
sau khi chồi đã ra rễ và tạo cây hồn chỉnh mới đƣợc chuyển ra ngồi vƣờn ƣơm.
Q trình thích nghi với điều kiện bên ngồi của cây u cầu cần đƣợc chăm sóc
đặc biệt. Vì cây đƣợc chuyển từ mơi trƣờng bão hịa hơi nƣớc sang vƣờn ƣơm
với những điều kiện khó khăn hơn, nên vƣờn ƣơm cần đáp ứng các yêu cầu: Che
cây non bằng nilon bao phủ và có hệ thống phun sƣơng cung cấp độ ẩm và làm
mát cây; giá thể cây trồng có thể là đất mùn, hoặc các hỗn hợp nhân tạo không
chứa đất, mùn cƣa và bọt biển,… Giai đoạn này thƣờng đòi hỏi 4 - 16 tuần.
2.4.3. Ảnh hưởng chất điều hịa sinh trưởng trong ni cấy mơ tế bào thực vật
Ngƣời ta đã phát hiện thấy 5 nhóm chất điều tiết sinh trƣởng ở thực vật đó
là auxin, cytokinin, ethylen, giberelin, axit absixic. Những chất này đƣợc phân
thành các nhóm dựa vào tính tƣơng đồng về cấu trúc và chức năng sinh lý, tuy

nhiên về chức năng nhiều khi chúng có tác động chồng chéo và hỗ trợ nhau. Cịn
một số nhóm khác điều khiển từng giai đoạn sinh trƣởng nhất định. Trong nuôi
cấy mô tế bào ngƣời ta thƣờng sử dụng ba nhóm chất điều tiết sinh trƣởng là dẫn
xuất của auxin, cytokinin và giberelin.
Nhóm auxin là nhóm kích thích sinh trƣởng chính đƣợc các nhà sinh lý
học thực vật phát hiện và quan tâm sớm nhất. Auxin là những hoocmon thực vật
có tác dụng kích thích sinh trƣởng, kéo dài tế bào và phân hoá cơ quan, kiểu tác
động của nó liên quan đến làm chuyển đổi và mềm hố màng tế bào. Nhóm auxin
bao gồm các chất sau: 2,4 diclorophenoxy axetic axit (2,4D), α-naphtylaxetic
axit(NAA), indolaxetic axit (IAA), trong đó 2,4D dễ gây độc nhƣng có tác dụng
kích quá trình phân chia tế bào và thƣờng đƣợc sử dụng nhiều nhất, α-NAA có
tác dụng tạo rễ cho cây con.
Nhóm giberelin là nhóm đƣợc phát hiện qua nghiên cứu bệnh nấm lúa von.
Nhóm này tác động làm tế bào dãn ra và phân chia, làm cây lùn có thể cao lên
nhƣ: ngô lùn thành ngô cao, đậu dạng bụi thành dạng đứng. Đại diện cho nhóm
này là axit giberilic (GA3), đƣợc sử dụng rộng rãi trong nơng nghiệp.
Nhóm cytokinin là nhóm chất hố học có ảnh hƣởng quyết định đến kích
thích phân chia tế bào. Đại diện cho nhóm cytokinin gồm: Kinetin; 6 - Benzyl
amino purine (BAP); 6- Dimethylalylamino purine (2iP); Zeatin. Hiện nay một
thế hệ mới của chất điều hòa sinh trƣởng, nhƣ thidiazuron (TDZ) - một cytokinin

11

download by :


thuộc các phenylureas, đang nổi lên nhƣ là một thay thế thành công cho tái sinh
trực tiếp với tần số cao của phơi vơ tính.
Trong ni cấy tùy từng loại mơ và mục đích ni cấy có thể sử dụng
riêng rẽ từng nhóm auxin hoặc cytokinin hoặc sử dụng kết hợp cả 2 nhóm auxin

và cytokinin với hàm lƣợng khác nhau.
2.5. KHÁI NIỆM VI GHÉP
Về nguyên tắc, vi ghép là kỹ thuật phối hợp giữa ghép và nuôi cấy đỉnh
sinh trƣởng nhƣng thông qua sự dinh dƣỡng tự nhiên của gốc ghép. Mắt ghép là
đỉnh sinh trƣởng có kích thƣớc nhỏ 0,2 – 0,5mm đƣợc tách ra từ các chồi non tạo
thành trong nuôi cấy in vitro từ cành cây mẹ trƣởng thành. Gốc ghép thƣờng là
những cây con mới nảy mầm, nhƣng cũng có thể sử dụng các cành giâm có rễ
hoặc các đoạn chồi thu đƣợc nhờ vi nhân giống.
Khi tiến hành kỹ thuật vi ghép, trên gốc ghép và đỉnh sinh trƣởng mắt
ghép, ngƣời ta tạo vết ghép tại vùng tƣợng tầng, là nơi tế bào phân chia mạnh, để
khi tiến hành ghép, áp 2 phần này lại với nhau sẽ có sự tiếp hợp và tạo ra cây
ghép. Tồn bộ cây ghép đƣợc ni trong điều kiện vô trùng, những cây ghép thu
đƣợc bằng phƣơng pháp này hoàn toàn sạch bệnh và mang đặc điểm di truyền
của cây mẹ cho mắt ghép; đồng thời tận dụng các đặc tính của gốc ghép hoang
dại nhƣ tính kháng bệnh và khả năng thích ứng với mơi trƣờng địa phƣơng.
Kỹ thuật vi ghép sẽ góp phần tạo ra một số lƣợng lớn cây giống hoàn toàn
sạch bệnh dùng làm nguyên liệu cho sản xuất đại trà. Ngoài ra, vi ghép cịn đƣợc
dùng để nghiên cứu tính khơng tƣơng hợp giữa chồi ghép và gốc ghép, và các
khía cạnh về mô học và sinh lý học của kỹ thuật ghép.
2.5.1. Quá trình hình thành vết ghép
Ehsan et al. (2015) đã tiến hành nghiên cứu về mặt giải phẫu hình thái của
quá trình hình thành vết ghép ở cây xƣơng rồng (Opuntia spp.). Ơng nhận thấy
rằng về mặt mơ học, q trình hình thành vết ghép khi tiến hành vi ghép cũng diễn
ra tƣơng tự nhƣ tất cả các quá trình hàn gắn vết ghép bình thƣờng. Kết quả quan
sát của ông cho thấy quá trình hình thành vết ghép phát triển qua 5 giai đoạn:
 Quá trình phát triển của lớp hoại tử
 Quá trình nhân nhanh của cầu nối mơ sẹo tại bề mặt ghép
 Q trình biệt hố tạo thành mô tƣợng tầng mới

12

download by :


 Q trình phục hồi lại các mơ mạch mới
 Q trình phục hồi tính liên tục của biểu bì tại vị trí vết ghép
Trong suốt những giờ đầu tiên sau khi gốc ghép và chồi ghép tiếp xúc với
nhau, khơng có bằng chứng nào cho thấy tƣợng tầng có hoạt động. Tuy nhiên,
sau khi ghép 24 giờ, quan sát thấy có sự hình thành của lớp hoại tử trên cả gốc
ghép và chồi ghép. Lớp hoại tử này là một lớp khác biệt tạo thành từ những tế
bào chết và có màu sậm. Bằng chứng đầu tiên về sự phân chia tế bào chính là sự
phát triển của cầu nối mô sẹo tại bề mặt tiếp xúc giữa chồi ghép và gốc ghép, đây
là quá trình khởi phát của giai đoạn thứ hai hình thành vết ghép. Quá trình này
quan sát thấy ở tất cả các cây ghép trong khoảng thời gian từ ngày thứ nhất đến
ngày thứ tƣ sau khi ghép. Những vùng tế bào nhu mô mềm nằm cạnh lớp hoại tử
bắt đầu phân chia tại nhiều vị trí khác nhau dọc theo bề mặt bên trong của mô bị
tổn thƣơng, trên cả gốc ghép và chồi ghép. Tại một số vùng, q trình nhân mơ
sẹo xảy ra dựa trên quá trình phân chia tế bào, tuy nhiên, cũng có thể quan sát
thấy có những khối tế bào vô tổ chức. Sau vài ngày, các tế bào nhu mô mềm của
phần vỏ và phần lõi sẽ phân chia để tạo thành một khối mô sẹo nhiều lớp ở phía
trên và phía dƣới vùng hoại tử, tạo thành một cầu nối vật lý liên kết giữa chồi
ghép và gốc ghép.
Trong suốt giai đoạn sớm của quá trình hình thành cầu nối mô sẹo, các tế
bào phân chia thƣờng dài và tƣơng đối nhỏ so với các tế bào nhu mô đặc trƣng ở
các mô gốc ghép và chồi ghép. Tuy nhiên, vào khoảng ngày thứ 28, khi mô sẹo
phân chia lấp đầy các khoảng trống trên vùng ghép, các tế bào này tăng trƣởng và
có hình thái giống với các tế bào nhu mơ bình thƣờng. Vào khoảng ngày thứ 12,
tế bào hoạt động rất mạnh mẽ trên bề mặt ghép của cả gốc ghép và chồi ghép, thể
hiện ở q trình nhân mơ sẹo dọc theo vết ghép. Trong q trình tăng trƣởng, các
tế bào mơ sẹo này sẽ tái hấp thu các vật chất hoại tử, sau đó, vùng hoại tử này sẽ

biến mất. Q trình hàn gắn vết thƣơng của mô tƣợng tầng dọc theo cầu nối mô
sẹo (giai đoạn thứ ba) cũng bắt đầu sau ngày thứ 12. Q trình biệt hố tế bào sẽ
bắt đầu ở các tế bào nhu mô nằm gần các mô mạch bị tổn thƣơng. Các tế bào đã
tạo thành trƣớc đó bắt đầu kéo dài, hƣớng về phía cầu nối mơ sẹo. Ở giai đoạn
này có thể quan sát thấy các tế bào với vách thứ cấp dày, các tế bào này đều tăng
trƣởng định hƣớng theo chiều dọc trên cả gốc ghép và chồi ghép.
Khoảng 28 ngày sau khi ghép có thể xác định đƣợc khả năng tƣơng hợp
hay không tƣơng hợp của chồi ghép và gốc ghép, đồng thời, có thể nhận thấy

13

download by :