(LUẬN văn THẠC sĩ) nghiên cứu sản xuất kháng thể IGY tinh khiết dùng để phòng và trị bệnh newcastle (ND)

HỌC VIỆN NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM

KOULDKIENG VILAYVONG

NGHIÊN CỨU SẢN XUẤT KHÁNG THỂ IGY TINH KHIẾT
DÙNG ĐỂ PHÒNG VÀ TRỊ BỆNH NEWCASTLE (ND)

Ngành:

Thú y

Mã số:

8640101

Người hướng dẫn khoa học: PGS.TS. Lê Văn Phan

NHÀ XUẤT BẢN HỌC VIỆN NÔNG NGHIỆP - 2019

download by :


LỜI CẢM ĐOAN
Tơi xin cảm đoan đây là cơng trình nghiên cứu của riêng tôi, các số liệu, kết quả
nghiên cứu được trình bày trong luận văn là trung thực, khách quan và chưa từng được
công bố trong bất kỳ cơng trình nào khác.
Tơi xin cảm đoan rằng các thơng tin trích dẫn trong luận văn đều đã được chỉ rõ
nguồn gốc.
Tôi xin chân thành cảm ơn!
Hà Nội, ngày

tháng

năm 2019

Tác giả luận văn

KouldKieng Vilayvong

i

download by :


LỜI CẢM ƠN
Qua thời gian học tập và rèn luyện tại Học viện Nông nghiệp Việt Nam, dưới sự
giúp đỡ, dạy dỗ tận tình của các thầy, cơ giảng viên Khoa Thú Y về kiến thức chuyên
môn cũng như tư cách đạo đức của người Thạc sĩ thú y trong thời đại mới. Tơi đã có thể
trưởng thành hơn về cả mặt nhận thức và học thuật.
Nhân dịp hoàn thành luận văn tốt nghiệp chuyên ngành Thạc sĩ thú y, cho phép tơi
được bày tỏ lịng biết ơn chân thành và sâu sắc nhất tới các thầy, cô giảng viên. Xin
được gửi lời cảm ơn sâu sắc nhất đến PGS. TS. Lê Văn Phan giảng viên bộ môn Vi sinh
vật-Truyền nhiễm, Phó trưởng Phịng thí nghiệm trọng điểm Cơng nghệ sinh học Thú
Y-Khoa Thú Y-Học viện Nông nghiệp Việt Nam, đã tạo điều kiện và tận tình giúp đỡ,
trang bị kiến thức chun mơn để tơi có đủ năng lực hồn thành khóa luận.
Xin được cảm ơn tới tồn thể anh chị nhân viên Phịng thí nghiệm trọng điểm
Cơng nghệ sinh học Thú Y-Khoa Thú Y-Học viện Nông nghiệp Việt Nam đã tận tình
hướng dẫn và tạo điều kiện cho tôi thực tập và làm việc tại Bệnh viện.
Tôi xin được bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc nhất đến gia đình, bạn bè, những người
đã ln động viên, sát cánh cùng tơi trong suốt q trình học tập và hoàn thành luận văn
tốt nghiệp này.

Xin chân thành cảm ơn!
Hà Nội, ngày

tháng

năm 2019

Tác giả luận văn

KouldKieng Vilayvong

ii

download by :


MỤC LỤC
Lời cảm đoan .................................................................................................................... i
Lời cảm ơn ........................................................................................................................ ii
Mục lục ........................................................................................................................... iii
Danh mục chữ viết tắt ...................................................................................................... vi
Danh mục bảng ............................................................................................................... vii
Danh mục hình ............................................................................................................... viii
Danh mục biểu đồ ............................................................................................................ ix
Trích yếu luận văn ........................................................................................................... x
Thesis abstract................................................................................................................ xiii
Phần 1. Đặt vấn đề ......................................................................................................... 1
1.1.

Tính cấp thiết của đề tài ..................................................................................... 1

1.2.

Mục tiêu nghiên cứu của đề tài .......................................................................... 2

1.3.

Ý nghĩa khoa học và thực tiễn............................................................................ 2

1.3.1.

Ý nghĩa khoa học ............................................................................................... 2

1.3.2.

Ý nghĩa thực tiễn ................................................................................................ 3

Phần 2. Tổng quan tài liệu ............................................................................................. 4
2.1.

Lịch sử nghiên cứu bệnh Newcastle .................................................................. 4

2.1.1.

Giới thiệu chung về bệnh ................................................................................... 4

2.1.2.

Lịch sử bệnh và tình hình bệnh ở trên thế giới và ở Việt Nam .......................... 4

2.2.

Một vài nét khái quát về virus newcastle ........................................................... 6

2.2.1.

Phân loại ............................................................................................................. 6

2.2.2.

Hình thái và cấu trúc của virus Newcastle ......................................................... 7

2.2.3.

Đặc tính sinh học của virus Newcastle .............................................................. 8

2.2.4.

Dịch tễ học ....................................................................................................... 13

2.2.5.

Triệu chứng ...................................................................................................... 17

2.2.6.

Bệnh tích .......................................................................................................... 18

2.2.7.

Chẩn đốn ........................................................................................................ 19

2.2.8.

Phịng bệnh Newcastle ..................................................................................... 20

2.3.

Đáp ứng miễn dịch chống virus newcastle ...................................................... 23

2.3.1.

Đáp ứng miễn dịch không đặc hiệu.................................................................. 23

iii

download by :


2.3.2.

Đáp ứng miễn dịch đặc hiệu............................................................................. 23

2.3.3.

Miễn dịch chống bệnh Newcastle .................................................................... 24

2.4.

Kháng thể IGY ................................................................................................. 26

2.4.1.

Kháng thể IgY là gì? ........................................................................................ 27

2.4.2.

Chuyển IgY vào lịng đỏ trứng......................................................................... 27

2.4.3.

Cấu chúc kháng thể của IgY ............................................................................ 29

2.4.4.

Tách chiêt IgY từ lòng đỏ trứng gà .................................................................. 31

Phần 3 Đối tượng - nội dung - phương phápnghiên cứu .......................................... 33
3.1.

Đối tượng, địa điểm và thời gian nghiên cứu ................................................... 33

3.2.

Nội dung nghiên cứu ........................................................................................ 33

3.3.

Vật liệu nghiên cứu .......................................................................................... 33

3.4.

Phương pháp nghiên cứu .................................................................................. 34

3.4.1.

Phương pháp gây miễn dịch trên gà ................................................................. 34

3.4.2.

Phương pháp lấy và bảo quản huyết thanh ...................................................... 35

3.4.3.

Phương pháp xác định hiệu giá kháng thể và độ dài đáp ứng miễn dịch
sau khi tiêm vaccine bằng phản ứng HI ........................................................... 35

3.4.4.

Phương pháp tách chiết kháng thể IgY từ lòng đỏ trứng gà ............................ 42

3.4.5.

Phương pháp xác định đặc tính của kháng thể IgY.......................................... 42

3.4.6.

Phương pháp đánh giá hiệu quả phòng và điều trị Newcastle ......................... 44

3.4.7.

Phương pháp xử lý số liệu ................................................................................ 45

Phần 4. Kết quả và thảo luận ....................................................................................... 46
4.1.

Kết quả kiểm tra hiệu giá kháng thể Newcastle trong huyết thanh gà
trước khi gây miễn dịch ................................................................................... 46

4.2.

Khảo sát hiệu giá kháng thể newcastle trong huyết thanh gà sau khi gây
miễn dịch .......................................................................................................... 47

4.2.1.

Kết quả kiểm tra hiệu giá kháng thể trong huyết thanh của gà sau khi gây
miễn dịch .......................................................................................................... 47

4.3.

Khảo sát hiệu giá kháng thể newcastle trong lòng đỏ trứng gà được gây
miễn dịch .......................................................................................................... 49

4.3.1.

Kết quả theo dõi tỷ lệ trứng của gà .................................................................. 49

4.3.2.

Kết quả kiểm tra hiệu giá kháng thể trong lòng đỏ trứng của gà sau khi
gây miễn dịch ................................................................................................... 51

iv

download by :


4.3.3.

So sánh hàm lượng kháng thể trong lòng đỏ trứng của lô gà được tiêm
vaccine và lô gà được tiêm vaccine kết hợp với virus cường độc vô hoạt....... 53

4.4.

Mối tương quan giữa hiệu giá kháng thể của gà qua huyết thanh và qua
lòng đỏ trứng gà ............................................................................................... 53

4.5.

Kết quả tách chiết kháng thể IgY ..................................................................... 57

4.6.

Khảo sát đánh giá hiệu quả phòng và điều trị của sản phẩm kháng thể IgY .............58

4.6.1.

Thông tin trại thử nghiệm ................................................................................ 58

4.6.2.

Kết quả phòng và trị bệnh Newcastle bằng chế phẩm kháng thể IgY ............. 59

Phần 5. Kết luận và kiến nghị ...................................................................................... 62
5.1.

Kết luận ............................................................................................................ 62

5.2.

Kiến nghị .......................................................................................................... 62

Tài liêu tham khảo .......................................................................................................... 63
Phụ lục .......................................................................................................................... 68

v

download by :


DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT
Chữ viết tắt
APMV
ARN
CPE
F
FAO
HA
HGKT

HI

Nghĩa tiếng Việt
Avian paramyxovirus
Acid ribonucleic
Cytophathic Effect
Funsion protein
Food Agriculture Organization
Haemagglutination test
Hiệu giá kháng thể
Haemagglutination Inhibition test

HN
IgA

Haemagglutinin neuraminidase
Immunoglobulins A

IgD
IgE
IgY
IgG
IgM
IPCI
IVPI
KDa
L
LD50
LĐT

Immunoglobulin d
Immunoglobulin e
Yolk Immunoglobulin
Immuno Globulin G
Immuno Globulin M
Intracerebral pathogenicity index
Intravenous pathogenicity index
Kilodalton
Large protein
Lethal Dose 50
Lịng đỏ trứng

M
MDT
NK
NP
OIE
PBS
µl
µg
SDS

Matrix protein
Mean Death Time
Nature kill
Nuclecapsid protein
Office International Epizooties
Phosphate buffered saline
Microlit
Microgarm

Sodium Doecyl Sulfate

TN

Thí nghiệm

vi

download by :


DANH MỤC BẢNG
Bảng 2.1. So sánh một số đặc tính của kháng thể (KT) sản xuất từ huyết thanh
động vật (IgG) và kháng thể sản xuất từ trứng gia cầm (IgY) (Schade
et al., 2005) .................................................................................................. 30
Bảng 3.1. Quy trình gây miễn dịch cho gà bằng vaccine sau khi bắt về ...................... 34
Bảng 3.2. Trình tự tiến hành phản ứng HA .................................................................. 37
Bảng 3.3. Trình tự phản ứng HA để chuẩn độ 4 HA.................................................... 38
Bảng 3.4. Trình tự tiến hành phản ứng HI để đánh giá kháng thể chủ động của
gà sau khi gây miễn dịch .............................................................................. 39
Bảng 3.5. Trình tự tiến hành phản ứng HI để đánh giá kháng thể thụ động
chuyền qua lòng đỏ trứng............................................................................. 40
Bảng 4.1. Kết quả kiểm tra hiệu giá kháng thể của gà hậu bị mới bắt về trước khi
gây miễn dịch ............................................................................................... 46
Bảng 4.2. Kết quả kiểm tra hiệu giá kháng thể trong huyết thanh của lơ gà thí
nghiệm I, thí nghiệm II và lơ đối chứng ...................................................... 47
Bảng 4.3. Theo dõi tình hình đẻ của gà ........................................................................ 49
Bảng 4.4. Kết quả kiểm tra hiệu giá kháng thể trong lịng đỏ trứng của lơ gà thí
nghiệm I, thí nghiệm II và lơ đối chứng ...................................................... 51
Bảng 4.5. Kết quả kiểm tra hiệu giá kháng thể trong huyết thanh gà và trong

lòng đỏ trứng (trên cùng 1 lô gà) ở lô TN I và lô TN II............................... 54
Bảng 4.6. Thông tin về chế phẩm kháng thể IgY dùng để phòng và trị bệnh
Newcastle ..................................................................................................... 60
Bảng 4.7. Kết quả phòng và trị bệnh Newcastle bằng chế phẩm kháng thể IgY ......... 61

vii

download by :


DANH MỤC HÌNH
Hình 2.1. Cấu trúc của virus Newcastle ........................................................................... 8
Hình 2.2. Phương thức lây lan chủ yếu của bệnh Newcastle ......................................... 15
Hình 2.3. Minh họa sự phân bố các loại kháng thể trong trứng gà ................................ 28
Hình 2.4. Cấu trúc kháng thể IgG và IgY ...................................................................... 29
Hình 2.5. Quy trình cơng nghệ sản xuất chế phẩm kháng thể IgY tại Học viện
Nơng Nghiệp Viêt Nam (Thú Y).................................................................... 32
Hình 3.1. Phản ứng ngăn trở ngưng kết hồng cầu HI ..................................................... 41
Hình 4.1. Điện di kháng thể IgY trên gel SDS-PAGE sau tách chiết ............................. 57
Hình 4.2. Kết quả mổ khám gà mắc bệnh Newcastle ..................................................... 58
Hình 4.3. Kết quả mổ khám gà mắc bệnh Newcastle ..................................................... 59

viii

download by :


DANH MỤC BIỂU ĐỒ
Biểu đồ 4.1.

Biến động hiệu giá kháng thể trong huyết thanh của gà lơ thí
nghiệm (TN I, TN II) và lô đối chứng..................................................... 49

Biểu đồ 4.2.

Hiệu giá kháng thể trong lịng đỏ trứng của gà lơ thí nghiệm I, lơ
gà thí nghiệm II và lơ đối chứng ............................................................. 52

Biêu đồ 4.3.

Hiệu giá kháng thể trong lòng đỏ trứng của lơ gà thí nghiệm I và
lơ gà thí nghiệm II sau khi gây miễn dịch ............................................... 53

Biểu đồ 4.4.

So sánh hiệu giá kháng thể trung bình trong huyết thanh và trong
lịng đỏ trứng của gà lơ TN I sau khi gây miễn dịch ............................... 55

Biểu đồ 4.5.

So sánh hiệu giá kháng thể trung bình trong huyết thanh và trong
lịng đỏ trứng của gà lơ TN II sau khi gây miễn dịch.............................. 56

ix

download by :


TRÍCH YẾU LUẬN VĂN
Tên tác giả: Kouldkieng VILAYVONG

Tên luận văn: Nghiên cứu sản xuất kháng thể IgY tinh khiết dùng để phòng và trị bệnh
Newcastle (ND)
Ngành: Thú Y

Mã số: 8640101

Tên cơ sở đào tạo: Học viện Nông nghiệp Việt Nam
A. Mục đích nghiên cứu
- Nghiên cứu đáp ứng miễn dịch của gà trước và sau khi tiêm vaccine Newcaste.
- Đánh giá mối tương quan hiệu giá kháng thể Newcastle trong huyết thanh và
trong lòng đỏ trứng gà.
- Nghiên cứu tách chiết kháng thể IgY đặc hiệu cho virus Newcastle từ lòng đỏ
trứng gà và ứng dụng trong phòng và trị bệnh Newcastle.
B. Vật liệu và phương pháp nghiên cứu
- Địa điểm nghiên cứu: Phịng thí nghiệm trọng điểm Cơng nghệ sinh học Thú
Y- Bệnh viện thú y-Ngô Xuân Quảng-Trâu Quỳ-Gia Lâm-Hà Nội.
- Thời gian nghiên cứu: 10/2018-9/2019.
Vật liệu nghiên cứu:
- Vaccine Newcastle: Vaccine vô hoạt nhũ dầu COR4+IB+ND+EDS của công
ty Intervet.
- Virus cường độc vô hoạt Newcastle phân lập từ thực địa (do Phịng thí nghiệm
trọng điểm Cơng nghệ sinh học Thú Y-Khoa học thú y cung cấp).
- Kháng nguyên chuẩn Newcastle cho phản ứng HI (được cung cấp bởi Phịng
thí nghiệm trọng điểm Cơng nghệ sinh học Thú Y-Khoa Thú Y-Học viện Nông nghiệp
Việt Nam).
- Gà hậu bị (khỏe mạnh về lâm sàng) giống gà Isa Brown 16 tuần tuổi.
- Trang thiết bị, hóa chất thí nghiệm dùng trong chẩn đốn, xét nghiệm
Newcastle của Phịng thí nghiệm trọng điểm công nghệ sinh học Thú y-Khoa Thú YHọc viện Nông nghiệp Việt Nam.
- Các nguyên vật liệu khác: chuồng nuôi, thức ăn nước uống cho gà.
Nội dung nghiên cứu

- Nghiên cứu đáp ứng miễn dịch của gà trước và sau khi tiêm vaccine Newcaste.

x

download by :


- Đánh giá mối tương quan hiệu giá kháng thể Newcastle trong huyết thanh và
trong lòng đỏ trứng gà.
- Nghiên cứu tách chiết kháng thể IgY đặc hiệu cho virus Newcastle từ lòng đỏ
trứng gà và ứng dụng trong phòng và trị bệnh Newcastle.
- Nghiên cứu ứng dụng kháng thể tinh khiết trong phòng và điều trị bệnh
Newcastle trên gà tại trại gà có dịch Newcastle.
Phương pháp nghiên cứu:
Để tiến hành nghiên cứu và thực hiện được các nội dung đã đề ra của đề tài
chúng tôi đã sử dụng kết hợp những phương pháp nghiên cứu thường quy và hiện đại
trong lĩnh vực thú y:
- Phương pháp gây miễn dịch trên gà
- Phương pháp lấy và bảo quản huyết thanh
- Phương pháp xác định hiệu giá kháng thể và độ dài đáp ứng miễn dịch sau khi
tiêm vaccine bằng phản ứng HI
- Phương pháp tách chiết kháng thể IgY từ lòng đỏ trứng gà
- Phương pháp xác định đặc tính của kháng thể IgY
- Phương pháp đánh giá hiệu quả phòng và điều trị bệnh Newcastle
- Phương pháp xử lý số liệu
C. Kết quả chính và kết luận
Trong nghiên cứu này chúng tôi sử dụng gà Isa Brown 16 tuần tuổi được chia
làm 3 lơ thí nghiệm. Lơ TN I tiêm vaccine kết hợp với virus Newcastle cường độc vô
hoạt, lô TN II tiêm vaccine Newcastle và lô đối chứng gà không được tiêm vaccine sau
khi bắt về. Kết quả đánh giá đáp ứng miễn dịch của gà thí nghiệm ở các lô như sau:

Hiệu giá kháng thể trung bình trong huyết thanh gà trước khi tiến hành thí
nghiệm (Ngày 0) đạt 10,4 log2 ở lô TN I, 10,3 log2 lô TN II và 10 log2 ở lô đối chứng.
Sau quá trình gây miễn dịch bằng vaccine kết hợp với virus Newcastle cường độc, hiệu
giá kháng thể ở lô TN I liên tục tăng lên và đạt mức cao nhất là 11 log2 ở tuần thứ 13 và
15. Lô TN II sau quá trình gây miễn dịch bằng vaccine, hiệu giá kháng thể đạt cao nhất
10,9 log2 ở tuần thứ 11 và bắt đầu giảm dần theo thời gian và đạt 10,3 log2 ở tuần thứ
15. Lô TN ĐC hiệu giá kháng thể trung bình trong huyết thanh liên tục giảm trong q
trình thí nghiệm và hiệu giá kháng thể đạt 8,7 log2 ở tuần thứ 15.
- HGKT Newcastle có trong huyết thanh tỉ lệ thuận với hiệu giá trong lịng đỏ
trứng gà, cụ thể là:
- Ở lơ TN I hàm lượng kháng thể trong huyết thanh tăng dần 10,8 log2 ở tuần
thứ 7 tăng lên 11 log2 ở tuần thứ 15, hiệu giá kháng thể trong lòng đỏ trứng đạt 7,33
log2 ở tuần 7 và tăng lên 8,67 log2 ở tuần 15 kể từ khi bắt đầu gây miễn dịch.

xi

download by :


- Ở lô TN II hiệu giá kháng thể trong huyết thanh và lòng đỏ trứng lần lượt là
10,8 log2 và 8 log2 ở tuần thứ 7 sau đó giảm dần theo thời gian, ở tuần thứ 15 hiệu giá
kháng thể lần lượt là 10,3 log2 và 7,67 log2.
- Sản phẩm IgY sau tinh chế đã loại bỏ được các protein khác trong lòng đỏ
trứng và chỉ chứa protein IgY.
- Đàn gà được tiêm kháng thể nhanh hồi phục sức khỏe và ăn uống trở lại bình
thường sau 2 ngày điều trị. Ngồi ra có thể cải thiện nhanh tình trạng sức khỏe đàn,
giảm tỷ lệ chết và loại thải khi đàn gà bị Newcastle.

xii

download by :


THESIS ABSTRACT
Master candidate: Kouldkieng Vilayvong
Thesis title: Research and Production of Antibody (IgY) Product for Prevention and
Treatment of Newcastle Disease in Chickens.
Major: Veterinary Medicine

Code: 8640101

Educational organization: Vietnam National University of Agriculture (VNUA)
A. Research Objectives
- Studying on the immune response of chickens before and after Newcaste
vaccine immunization.
- Evaluation of the correlation of Newcastle antibody titer in layer serum and in
its egg yolk.
- Research on extraction of IgY antibodies specific for Newcastle disease virus from
chicken egg yolk and its application on prevention and treatment of Newcastle disease.
B. Material and Research Methods
- Research location: Key Laboratory of Veterinary Biotechnology-College of
Veterinary Medicine-Vietnam National University of Agriculture.
Ngo Xuan Quang-Trau Quy-Gia Lam-Hanoi.
- Research period: 10/2018-9/2019.
Material
- Newcastle vaccine: Inactivated emulsion oil COR4+IB+ND+EDS of Intervet.
- Inactivated virulent Newcastle virus (supported by Key Laboratory of
Veterinary Biotechnology-College of Veterinary Medicine-Vietnam National Universi ty of Agriculture) isolated from field.
- Newcastle virus antigen using for HI test (supported by Key Laboratory of
Veterinary Biotechnology-College of Veterinary Medicine-Vietnam National Universi ty of Agriculture).

- Healthy chicken layers of Isa Brown of 16 weeks old were used for experiment.
- Laboratory equipment and reagents used for experiment were supported by
Key Laboratory for Veterinary Biotechnology-College of Veterinary MedicineVietnam National University of Agriculture.
- Other materials: Facilities, food, water for raising chicken.

xiii

download by :


Research content
- Studying on the immune response of chickens before and after Newcaste
vaccine immunization.
- Evaluation of the correlation of Newcastle antibody titer in layer serum and in
its egg yolk.
- Study on extraction of specific IgY antibodies for Newcastle virus from
chicken egg yolk.
- Application of pure IgY antibodies for prevention and treatment of Newcastle
disease in chicken farms.
Methods
In order to conduct research and to carry out the contents of the project, a
combination of modern and regular methods in the field of Veterinary Medicine was used:
- Method for chicken immunization
- Method for serum sampling and storing
- HI Method for determining antibody titre and length of immune response
after vaccination
- Method for extraction IgY antibodies from chicken egg yolk
- Methods for characterization of IgY antibodies
- Evaluation of the effectiveness of IgY antibodies on prevention and treatment
of Newcastle disease.

- Data processing methods
Main findings and conclusions
In this study, we used 16-week-old Isa Brown chickens divided into 3
experimental groups. Group I was vaccinated with Newcastle vaccine plus with
inactivated virulent Newcastle virus, group II was only vaccinated with Newcastle
vaccine and control group was not vaccinated. Results of immune response of
experimental chickens in different groups were as following:
The mean of antibody titer of chicken before vaccination (day 0) in group I was
10.4 log2, group II was 10.3 log2 and control group was 10 log2. After vaccine
immunization, the mean of antibody titer of chicken in group I was constantly increased
and reached a peak of 11 log2 at weeks of 13 and 15 after vaccination. In group II,
antibody titer peaked at 10.9 log2 at week 11 and started to decrease over time and
reached 10.3 log2 at week 15. In control group, the mean of antibody titer was
continuously decreased during the experiment, antibody titer was 8.7 log2 at week 15.

xiv

download by :


- Newcastle-specific antibody titer obtained in layer serum is proportional to
titer obtained in the egg yolk, in detail:
- Group I, antibody titer increased gradually from 10.8 log2 at week 7 to 11 log2
at week 15 after vaccination, while antibody titer in egg yolk was 7.33 log2 at week 7
and increased to 8.67 log2 at week 15 after.
- In group II, antibody titers in serum and egg yolk were 10.8 log2 and 8 log2 at
week 7, respectively, then decreased over time, at week 15 antibody titer was 10, 3 log2
and 7.67 log2, respectively.
- The final IgY product is very pure and contains only IgY protein without other
egg yolk proteins.

- Newcastle-infected poultry farms were treated with IgY product and the results
showed that all chickens recovered quickly and become normally after 2 days of
treatment. In addition, it was possible to quickly improve the health of the herd, reduced
the mortality and elimination of the chickens when infected with Newcastle disease.

xv

download by :


PHẦN 1. ĐẶT VẤN ĐỀ
1.1. TÍNH CẤP THIẾT CỦA ĐỀ TÀI
Trong những năm gần đây, ngành chăn nuôi ở Việt Nam tương đối phát
triển so với các ngành nông nghiệp khác. Đặc biệt ngành chăn ni gia cầm
chiếm vị trí quan trọng thứ hai trong tổng giá trị sản xuất của ngành chăn ni
Việt Nam. Nó đã cung cấp một lượng thực phẩm lớn cho nhu cầu tiêu dùng
của con người trong nước cũng như xuất khẩu.
Cùng với sự phát triển đó thì tình hình dịch bệnh trong các đàn gia cầm
cũng ngày một tăng cao như các bệnh truyền nhiễm và bệnh ký sinh trùng.
Phương thức chăn nuôi nhỏ lẻ là phương thức chiếm ưu thế dẫn đến dịch bệnh
thường xuyên xảy ra, gây ảnh hưởng nghiêm trọng và đang là một thách thức
lớn đối với ngành chăn nuôi gia cầm. Điển hình, một số bệnh nguy hiểm của
gà thường xuyên xảy ra làm lây lan nhanh trong đàn, gây tỷ lệ ốm và chết cao
như Newcastle, Gumboro và Viêm phế quản truyền nhiễm. Trong đó, gà bị
bệnh Newcastle sẽ lây lan nhanh, tỷ lệ mắc bệnh cao, tỷ lệ chết cao.
Theo quyết định số 07/2016/TT-Bộ Nông Nghiệp và Phát triển nông
thôn, Bệnh gây ra bởi virus Paramyxovirus serotype 1 thuộc nhóm Paramy xoviridae. Chúng gây bệnh tích trên đường hơ hấp, tiêu hóa và tác động đến
hệ thần kinh. Bệnh thường nhiễm ghép với các bệnh khác và tỷ lệ chết rất cao.
Bệnh Newcastle thường xảy ra trên gà ở mọi lứa tuổi, vào tất cả các mùa trong
năm. Vì vậy, việc phịng chống bệnh trở thành một vấn đề đáng quan tâm

trong chăn ni gà nói riêng và chăn ni gia cầm nói chung. Để ngăn chặn,
khống chế dịch bệnh Newcastle, nhiều biện pháp đã được đề ra, nhưng con
đường duy nhất để ngăn ngừa bệnh có hiệu quả là sử dụng vaccine, tạo miễn
dịch chủ động cho đàn gà.
Ở Việt Nam, để phòng bệnh Newcastle cho đàn gà thường sử dụng
vaccine Lasota cho đàn gà con dưới 2 tháng tuổi, sử dụng vaccine Mukte-swar
cho gà trên 2 tháng tuổi. Ngồi 2 loại vaccine trên, ta cịn sử dụng một số loại
vaccine Newcastle nhập ngoại như Avinew, ND “S”, Medivac ND clone 45,
Nobilis ND Lasota, Nobilis ND clone 30.
Thực tế đã cho thấy rằng trong quá trình sử dụng vaccine phịng bệnh
cho đàn gà khơng phải lúc nào cũng cho kết quả tốt, có cơ sở chăn nuôi đã sử

1

download by :


dụng vaccine cho đàn gà nhưng bệnh vẫn xảy ra. Nghiên cứu vấn đề này nhiều
tác giả cho rằng: khả năng đáp ứng miễn dịch của đàn gà với virus Newcastle
chịu ảnh hưởng của nhiều yếu tố khác nhau như kháng thể thụ động ở gà con,
dinh dưỡng.
Hiện nay, theo xu hướng chăn nuôi sạch, hạn chế sử dụng kháng sinh
trong chăn nuôi, tăng cường sử dụng các biện pháp sinh học sử dụng kháng
thể điều trị là liệu pháp tiềm năng trong điều trị bệnh. Tuy nhiên, hiện tại trên
thị trường đang phổ biến dạng kháng thể đục, loại kháng thể này khi tiêm dễ
gây sưng, viêm, khó bảo quản lâu dài do nhu cầu sản xuất ra kháng thể hạn
chế.Việc khắc phục được các nhược điểm trên là vô cùng cần thiết.
Xuất phát từ những thực tiễn của sản xuất, cập nhật những công nghệ
tiên tiến, làm cơ sở nghiên cứu chế tạo chế phẩm sinh học phù hợp nhất trong
phịng và điều trị bệnh Newcastle, chúng tơi tiến hành đề tài: Nghiên cứu sản

xuất kháng thể IgY tinh khiết dùng để phòng và trị bệnh Newcastle (ND).
1.2. MỤC TIÊU NGHIÊN CỨU CỦA ĐỀ TÀI
- Nghiên cứu đáp ứng miễn dịch của gà trước và sau khi tiêm vaccine
Newcaste.
- Đánh giá mối tương quan giữa hiệu giá kháng thể Newcastle trong huyết
thanh và trong lòng đỏ trứng gà.
- Nghiên cứu tách chiết kháng thể IgY đặc hiệu cho virus Newcastle từ lòng
đỏ trứng gà và ứng dụng trong phòng và trị bệnh Newcastle.
1.3. Ý NGHĨA KHOA HỌC VÀ THỰC TIỄN
1.3.1. Ý nghĩa khoa học
Đề tài được thực hiện sẽ góp phần chứng minh rằng tách chiết kháng thể
IgY đặc hiệu cho virus Newcastle từ lòng đỏ trứng gà có ý nghĩa thực tiễn trong
ứng dụng phịng và trị bệnh. Đồng thời đề tài cũng đánh giá mối tương quan giữa
hiệu giá kháng thể Newcastle trong huyết thanh và trong lòng đỏ trứng gà. Các
phương pháp tách chiết kháng thể IgY đặc hiệu cho virus Newcastle từ lòng đỏ
trứng gà và kháng thể nghiên cứu được ứng dụng trong phòng và trị bệnh
Newcastle sẽ là tiền đề cho các nghiên cứu tiếp theo trong việc sản xuất kháng
thể IgY tinh khiết dùng để phòng và trị bệnh Newcastle cũng như các bệnh khác
trên gà.

2

download by :


1.3.2. Ý nghĩa thực tiễn
Đề tài thực hiện sẽ là cơ sở cho việc nghiên cứu sản xuất kháng thể IgY từ
lòng trứng gà. Kháng thể IgY từ trứng gà được tạo ra thành công sẽ giúp cho
những con gà không bị ảnh hưởng bởi các tác dụng phụ trong quá trình điều trị
bằng huyết thanh kháng Newcastle được sản xuất ngun từ lịng đỏ. Ngồi ra,

với quy trình tinh sạch kháng thể IgY từ lòng đỏ trứng đơn giản, tiết kiệm chi phí
và sản lượng tăng, từ đó làm giảm giá thành sản xuất của kháng thể xuống. Chính
vì vậy, việc sử dụng kháng thể IgY tinh khiết dùng để phòng và trị bệnh
Newcastle cho gà trở nên phổ biến hơn, đóng góp to lớn cho ngành cơng nghiệp
chăn nuôi gia cầm.

3

download by :


PHẦN 2. TỔNG QUAN TÀI LIỆU
2.1. LỊCH SỬ NGHIÊN CỨU BỆNH NEWCASTLE
Bệnh Newcastle ( Newcastle disease-ND) hay còn được gọi là bệnh gà rù là
bệnh truyền nhiễm cấp tính của lồi gà, có triệu trứng và bệnh tích gần giống với
bệnh Cúm gà. Đặc trưng của bệnh là hiện tượng viêm, xuất huyết và loét niêm
mạc đường tiêu hóa (Nguyễn Bá Hiên và cs., 2012)
2.1.1. Giới thiệu chung về bệnh
Bệnh Newcastle gây ra bởi virus paramyxo type 1 (APMV-1), Virus
Paramyxo có 9 serotype được đặt tên từ APMV-1 đến APMV-9. Virus Newcastle
có khả năng gây nhiễm cho hơn 200 lồi gia cầm khác nhau. Gà mọi giống, mọi lứa
tuổi đều có thể cảm nhiễm và bị bệnh. Tính nghiêm trọng của bệnh phụ thuộc vào
chủng virus gây bệnh và vật chủ nhiễm bệnh. Những chủng độc lực yếu ( không gây
bệnh) có thể làm cho bệnh trầm trọng hơn khi kế phát các vi sinh vật gây bệnh khác
hoặc do tác động bất lợi của các yếu tố môi trường (Alexander, 2001).
Thiệt hại kinh tế do bệnh gây ra: Newcastle là bệnh gây ra những thiệt hại
kinh tế lớn nhất so với các bệnh gây ra ở gia cầm. Ở các nước phát triển, sự thiệt
hại không chỉ do các vụ dịch gây ra mà cịn phải tính đến những chi phí khổng lồ
cho các chương trình vaccine phịng bệnh, kể cả một số nước đã sạch bệnh cũng
cần chi một khoản tiền khá lớn cho việc giám sát virus. Ở các nước đang phát

triển, bệnh có tính chất dịch địa phương (endemic), cần phải trả một khoản tiền
lớn để hạn chế các yếu tố làm cho bệnh bùng phát. Hiện nay tại nhiều quốc gia,
trong các cộng đồng dân cư, đặc biệt là ở các vùng nông thôn, nguồn cung cấp
protein trong bữa ăn hàng ngày chủ yếu là trứng và thịt gà, bệnh Newcastle đã
làm ảnh hưởng nghiêm trọng tới số lượng và chất lượng bữa ăn, do đó ảnh hưởng
đến sức khỏe con người.
2.1.2. Lịch sử bệnh và tình hình bệnh ở trên thế giới và ở Việt Nam
Bệnh Newcastle được coi bùng phát lần đầu tiên tại quần đảo Java ở
Indonesia và ở Newcastle-upon-Tyne (Anh) vào năm 1926 (Doyle, T.M., 1935),
Tuy nhiên có nhiều báo cáo cho thấy bệnh tương tự đã xảy ra ở Trung Âu từ
trước năm 1926; Năm 1833, Peteni lần đầu tiên đã mô tả về một trận dịch tả gà ở
Hungari; Năm 1880, Denprato (Ý) đã phân biệt bệnh dịch tả gà với bệnh tụ huyết
trùng; Năm 1901, Xentani đã tìm ra căn bệnh là do virus gây ra. Theo trích dẫn

4

download by :


của (Levine, 1964), Qchi và Hashimoto đã phát hiện thấy bệnh ở Hàn Quốc vào
năm 1924; (MacPherson, 1956) lại cho rằng nguyên nhân cái chết của gà tại các
hòn đảo phía Tây Scotland vào năm 1896 là do bệnh Newcastle.
Vào năm 1927, Doyle đã phân lập được mầm bệnh trong ổ dịch của gà tại
Newcastle (Anh) và đã chứng minh rằng virus phân lập được có tính kháng
ngun khác với bệnh dịch tả gà bằng các phản ứng huyết thanh học. Từ đó, ơng
đã lấy tạm tên bệnh là “Newcastle disease” để tránh nhầm lẫn với các bệnh khác,
ngoài ra bệnh còn được gọi với các tên khác pseudo-fowl pest, pseudovogel-pest,
avian pest, avian distemper, Korean fowl plague và pneumuoencephalitis. Gần
đây bệnh còn được gọi là avian paramyxovirus type 1 (APMV-1). Tên viết tắt
ND hiện nay được dùng phổ biến để chỉ bệnh Newcastle gây ra bởi chủng có độc

lực (virulent strain of virus).
Trong những năm tiếp theo, bệnh Newcastle được phát hiện ở nhiều quốc
gia như Ấn Độ, Philippin, Triều Tiên, Nhật Bản, Autralia và một số nước Trung
Á như Palestin, Syria. Khi chiến tranh thế giới thứ hai bùng nổ, bệnh Newcastle
đã lan tới châu Âu qua đảo Sicily và Italy.
Tại Việt Nam, theo Phạm Văn Huyến bệnh được đề cập lần đầu tiên vào
năm 1933 và được gọi là Dịch tả gà Đông Dương. Một vụ dịch xảy trên gà ở
Nam Bộ vào năm 1938, được mô tả là có triệu chứng giống với bệnh Newcastle.
Ở Việt Nam, bệnh Newcastle được đề cập đến từ rất lâu và lan truyền suốt
từ Bắc đến Nam. Năm 1949, tại Nha Trang Jacottot và Lelouet đã phân lập được
virus Newcastle bằng phản ứng ngưng kết hồng cầu (HA) và phản ứng ngăn trở
ngưng kết hồng cầu (HI).
Theo (Trần Đình, 1979-1984), đã xác định độc lực của các chủng virus
vaccine Newcastle đang sử dụng ở Việt Nam bằng phương pháp đã chuẩn hóa
của FAO. Độc lực được xác định dựa trên 3 chỉ số MDT, IPCI và IVPI, kết quả
cho thấy 3 chủng virus Newcsatle đang sử dụng hiện nay có độc lực ổn định.
Chủng hệ I thuộc nhóm Mesogen, cùng loại với chủng H nhưng có độc lực cao
hơn và đặc tính gây bệnh khác với chủng H, do đó Hệ I có thể có nguồn gốc từ
chủng Mukteswar.
Trong đầu những năm của thập niên 70, chăn nuôi gà công nghiệp ngày
càng phát triển cùng với đó ở một số cơ sở chăn nuôi đã xảy ra những vụ dịch
lớn về bệnh Newcastle. Năm 1973, ở nơng trường Thành Tơ có đến gần 100.000

5

download by :


gà chết chỉ trong vòng 10 ngày. Năm 1974, ở xí nghiệp Cầu Diễn bị chết 2/3
trong tổng số 300.000 con trong vòng 2 tháng. Các trang trại khác cũng bị thiệt

hại nặng nề do bệnh Newcastle gây ra như Nhân Lễ, Đông Anh (Nguyễn Bá Huệ,
và cs., 1978).
Theo (Phan Văn Lục, 1994), đã theo dõi 6 cơ sở chăn ni gà ở các tỉnh
phía Bắc từ năm 1980-1991. Các cơ sở đều đạt tiêu chuẩn vệ sinh thú y, quy
cách chăn nuôi, nhưng đã xảy ra 5 vụ dịch Newcastle. Trong số các vụ dịch
này, có 4 vụ ở gà nhỏ, 1 vụ ở gà trưởng thành, dịch xảy ra vào các vụ đông
xuân từ tháng 10 đến tháng 3 năm sau. Do đó tác giả đã đề xuất lịch sử dụng
vaccine thích hợp là: 7 ngày, 21-28 ngày, 50-58 ngày và 133-140 ngày;
Vaccine sử dụng là Lasota và Hệ I bằng phương pháp nhỏ mũi hoặc tiêm dưới
da tùy từng loại vaccine.
Từ khi phát hiện bệnh đến nay, bệnh Newcastle thường xuyên xảy ra tại các
địa phương trong cả nước, gây thiệt hại đáng kể cho ngành chăn nuôi gà.
2.2. MỘT VÀI NÉT KHÁI QUÁT VỀ VIRUS NEWCASTLE
2.2.1. Phân loại
Virus Newcastle thuộc họ Paramyxoviridae.
Họ Paramyxoviridae được chia thành 2 subfamily:
- Subfamily Paramyxovirinae có 3 giống:
+ Giống Rubulavirus bao gồm các virus gây quai bị, parainfluenza 2 và 4 gây
bệnh ở động vật có vú, virus gây bệnh Newcastle và các Avian Paramyxo-virus.
+ Giống Respirovirus gồm Parainfluenza 1 và 3 gây bệnh ở động vật có vú.
+ Giống Morbillivirus gồm virus gây bệnh sởi, dịch tả trâu bò và bệnh Care
ở chó.
Giống thứ 4 được gọi là Megamyxovirus gồm Nipah và Hendra virus cũng
được đề nghị xếp vào subfamily này. Tuy nhiên, kết quả giải trình tự tồn bộ bộ
gen của virus Newcastle cho thấy paramyxovirus gây bệnh ở gia cầm hoàn toàn
khác với các rubulavirus khác, đủ bằng chứng để xếp chúng vào một giống khác
trong subfamily này.
Có 9 serogroup thuộc Avian Paramyxovirus từ APMV-1 đến APMV-9,
trong đó virus Newcastle (APMV-1) là virus quan trọng nhất. Ngoài ra các
APMV-2, APMV-3, APMV-6, APMV-7 cũng có khả năng gây bệnh cho gà.

6

download by :


- Subfamily Pneunoviridae gồm 2 giống: Giống Pneumovirus gồm các
virus gây viêm phổi ở động vật có vú và giống Metapneumovirus gồm các
virus gây bệnh viêm phổi gia cầm (do đó mà người ta có ý định gọi giống này
là avian pneumovirus).
2.2.2. Hình thái và cấu trúc của virus Newcastle
Virus Newcastle thuộc họ Paramyxoviridae, là một ARN virus sợi đơn,
kích thước phân tử khoảng 500kb, bộ gen có chứa 15.186 nucleotid. Newcastle là
virus đa hình thái đặc trưng cho giống Rubulavirus, thường có hình trịn với
đường kính 100-500nm, có các sợi nhỏ rộng khoảng 100nm và chiều dài thay
đổi. Virus có vỏ bọc lipid bên ngồi. Virus có cấu trúc nucleocapsid dạng xoắn
ốc, đường kính 17-18nm. Vỏ bọc được phủ bởi các gai (glycoprotein HN-F) dài
8-12nm.
Hệ gen của virus Newcastle là chuỗi đơn ARN để truyền thông tin và mật
mã di truyền các protein của virus. Virus có trọng lượng phân tử ARN nặng 5,25,7×106 dalton xấp xỉ 15 kilobaes (Kb). Mật mã di truyền của ARN virus chứa 6
gen mã hóa các thơng tin di truyền tổng hợp các protein cấu trúc sau:
- Large polymerase protein (L): là men polymerasa liên kết trực tiếp ARN
với nucleocapsid.
- Haemagglutinin-Neuraminidaza (HN): Chiếm số lượng lớn trong tổng số
protein của virus. Có đặc tính ngưng kết hồng cầu và có hoạt tính của men
Neuraminidaza có tác dụng cắt đứt các thụ thể hồng cầu. Protein HN là những
thụ thể lớn hơn nằm trên bề mặt của phân tử Paramyxovirus.
- Fusion protein (F): Là những thụ thể nhỏ hơn nằm trên bề mặt của virus,
có tác dụng liên hợp các tế bào bị nhiễm virus với nhau để tạo thành tế bào
khổng lồ đa nhân.

- Nucleocapsid protein (NP): Giống như Histin, là một protein bảo vệ ARN.
- Matrix protein (M): Có tác dụng gắn ARN của virus với vỏ bọc.
- Phospho protein (P): Hình ống dài và xoắn ốc nhiều vòng nhưng chưa rõ
chức năng.

7

download by :


Hình 2.1. Cấu trúc của virus Newcastle
Nguồn: chicucthuydnai.gov.vn

Các protein cấu trúc sắp xếp quanh một trục theo hình xoắn ốc, rỗng ở giữa,
bên trong là axit nucleic quyết định hình dạng của virus. Trình tự các protein cấu
trúc trong bộ gen của virus là 3´N-P-M-F-HN-L5.
Virus Newcastle có khả năng ngưng kết hồng cầu bằng cách liên kết các
protein HN với các cảm thụ quan trên bề mặt của hồng cầu. Đặc tính ngưng kết
hồng cầu và khả năng ngăn trở ngưng kết hồng cầu là cơng cụ chẩn đốn có hiệu
quả đối với bệnh Newcastle.
Hồng cầu gà thường được sử dụng trong các phản ứng kiểm tra ngưng kết
hồng cầu. Ngồi ra, virus Newcastle cịn gây ngưng kết hồng cầu của các lồi
động vật lưỡng cư, các lồi bị sát và các lồi gia cầm khác.
2.2.3. Đặc tính sinh học của virus Newcastle
Virus Newcastle là virus có vỏ bọc, có hoạt tính bề mặt nên nó có một số
đặc tính sinh học đặc trưng sau:

8

download by :

 Tính kháng ngun
Phản ứng trung hịa virus và phản ứng kết tủa khuếch tán trong thạch có thể
thấy sự khác nhau giữa các chủng Newcastle. Hiện nay, phương pháp mới để
phân biệt sự khác nhau giữa các chủng virus Newcastle là sử dụng kỹ thuật
kháng thể đơn dòng. Với kỹ thuật này, có thể phát hiện được sự sai khác rất nhỏ
giữa các chủng virus Newcastle cũng như sự thay đổi aminoacid của ác epitop.
Nghiên cứu các epitop của virus Newcastle, Irio cùng cộng sự đã dùng
phương pháp kháng thể đơn dòng để phân loại virus Newcastle thành các nhóm
khác nhau.
 Khả năng ngưng kết hồng cầu
(Burnet, F. M, 1942) là người đầu tiên đã cho rằng virus Newcastle có đặc
tính ngưng kết hồng cầu gà.
Virus Newcastle có khả năng gây ngưng kết hồng cầu bằng cách liên kết
protein HN với các receptor có trên bề mặt hồng cầu. Ứng dụng đặc tính này,
người ta sử dụng phản ứng ngăn trở ngưng kết hồng cầu (Hemagglutinin
Inhibition Test -HI) để chẩn đoán bệnh.
Hồng cầu gà thường được sử dụng để làm phản ứng, tuy nhiên virus
Newcastle đều gây ngưng kết hồng cầu lồi lưỡng thê, bị sát và lồi chim. Tất cả
các chủng virus Newcastle có khả năng gây ngưng kết hồng cầu gà, người, chuột
lang, chuột bạch; nhưng khả năng ngưng kết hồng cầu bò, dê, cừu, lợn, ngựa thay
đổi tùy theo chủng virus.
 Hoạt tính của men Neuraminidase
Men Neuraminidase là một phần trong kháng nguyên HN, tất cả các virus
thuộc giống Rubulavirus đều có men này. Men Neuraminidase cắt đứt các thụ thể
trên bề mặt hồng cầu khiến cho hiện tượng ngưng kết hồng cầu dần dần bị tan ra.
 Khả năng liên hợp và dung giải hồng cầu
Virus Newcastle và các avian paramyxovirus khác có khả năng dung giải
hồng cầu hoặc liên hợp các tế bào theo cùng một cơ chế. Sau khi virus bám vào

các điểm thụ thể sẽ liên hợp với màng virus với màng tế bào khiến cho các tế bào
liên hợp lại với nhau. Hiện tượng này tương tự như hình thành thể hợp bào khi
hạt virus nảy mầm từ các tế bào. Màng của tế bào hồng cầu sẽ bị dung giải cũng
là kết quả của hiện tượng liên hợp màng tế bào.

9

download by :