(LUẬN văn THẠC sĩ) xác định chỉ thị phân tử liên kết chặt với gen ph3 và khảo nghiệm các tổ hợp lai cà chua mang gen ph3 vụ xuân hè tại gia lâm hà nội

HỌC VIỆN NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM

BÙI THỊ THÊU

XÁC ĐỊNH CHỈ THỊ PHÂN TỬ LIÊN KẾT CHẶT
VỚI GEN Ph3 VÀ KHẢO NGHỊÊM CÁC TỔ HỢP
LAI CÀ CHUA MANG GEN Ph3 VỤ XUÂN HÈ
TẠI GIA LÂM- HÀ NỘI

Ngành:

Công nghệ sinh học

Mã số:

60 42 02 01

Người hướng dẫn khoa học: TS. Trần Ngọc Hùng
GS.TS. Phan Hữu Tơn

NHÀ XUẤT BẢN ĐẠI HỌC NƠNG NGHIỆP - 2017

download by :


LỜI CAM ĐOAN
Tơi xin cam đoan đây là cơng trình nghiên cứu của riêng tôi, các kết quả nghiên
cứu được trình bày trong luận văn là trung thực, khách quan và chưa từng dùng bảo vệ
để lấy bất kỳ học vị nào.
Tôi xin cam đoan rằng, mọi sự giúp đỡ cho việc thực hiện luận văn đã được cảm
ơn, các thơng tin trích dẫn trong luận văn đều được chỉ rõ nguồn gốc.

Hà Nội, ngày... tháng...năm 2017
Tác giả luận án

Bùi Thị Thêu

i

download by :


LỜI CẢM ƠN
Trong suốt thời gian học tập, nghiên cứu và hồn thành luận văn, tơi đã nhận
được sự hướng dẫn, chỉ bảo tận tình của các thầy cơ giáo, sự giúp đỡ, động viên của bạn
bè, đồng nghiệp và gia đình.
Nhân dịp hồn thành luận văn, cho phép tơi bày tỏ lịng kính trọng và biết ơn sâu
sắc tới GS. TS. Phan Hữu Tôn và TS. Trần Ngọc Hùng đã tận tình hướng dẫn, dành
nhiều thời gian, cơng sức và tạo điều kiện cho tơi trong suốt q trình học tập và thực
hiện đề tài.
Tơi xin bày tỏ lịng biết ơn chân thành tới Ban Giám đốc, Ban Quản lý đào tạo,
Bộ môn Sinh học phân tử và CNSH ứng dụng, Khoa Công nghệ sinh học, Học viện
Nông nghiệp Việt Nam đã tận tình giúp đỡ tơi trong q trình học tập, thực hiện đề tài
và hồn thành luận văn.
Tôi xin gửi lời cảm ơn tập thể lãnh đạo, cán bộ viên chức Bộ môn Công nghệ
sinh học, Viện Nghiên cứu Rau quả đã giúp đỡ và tạo điều kiện cho tơi trong suốt q
trình thực hiện đề tài.
Xin chân thành cảm ơn gia đình, người thân, bạn bè, đồng nghiệp đã tạo mọi
điều kiện thuận lợi và giúp đỡ tơi về mọi mặt, động viên khuyến khích tơi hoàn thành
luận văn.
Xin trân trọng cảm ơn!
Hà Nội, ngày....tháng ... năm 2017

Tác giả luận văn

Bùi Thị Thêu

ii

download by :


MỤC LỤC
Lời cam đoan ..................................................................................................................... i
Lời cảm ơn ........................................................................................................................ ii
Mục lục ........................................................................................................................... iii
Danh mục chữ viết tắt ....................................................................................................... v
Danh mục bảng ................................................................................................................ vi
Danh mục các hình ......................................................................................................... vii
Trích yếu luận văn ......................................................................................................... viii
Thesis abstract.................................................................................................................. ix
Phần 1. Mở đầu ............................................................................................................... 1
1.1.

Tính cấp thiết của đề tài ...................................................................................... 1

1.2.

Mục tiêu nghiên cứu ........................................................................................... 2

1.3.

Phạm vi nghiên cứu ............................................................................................ 2

1.4.

Ý nghĩa khoa học và thực tiễn ............................................................................ 3

Phần 2. Tổng quan tài liệu ............................................................................................. 4
2.1.

Tổng quan về cây cà chua................................................................................... 4

2.1.1.

Danh pháp và phân loại ...................................................................................... 4

2.1.2.

Nguồn gốc, lịch sử và cách sử dụng cà chua ...................................................... 4

2.1.3.

Tình hình sản xuất cà chua trên thế giới và Việt Nam ....................................... 5

2.2.

Nghiên cứu về bệnh sương mai trên cà chua ...................................................... 9

2.2.1.

Triệu chứng và dấu hiệu bệnh sương mai........................................................... 9

2.2.2.

Nguyên nhân gây bệnh ..................................................................................... 11

2.2.3.

Đặc điểm phát sinh, phát triển và gây hại của bệnh ......................................... 12

2.3.

Chỉ thị phân tử và ứng dụng chỉ thị phân tử trong chọn giống cây trồng ......... 13

2.3.1.

Chỉ thị phân tử .................................................................................................. 13

2.3.2.

Ứng dụng của chỉ thị phân tử trong chọn tạo giống cây trồng ......................... 18

2.4.

Tình hình nghiên cứu về tính kháng bệnh sương mai và chọn tạo giống cà
chua kháng bệnh ............................................................................................... 19

2.4.1.

Các nghiên cứu ngoài nước .............................................................................. 19

2.4.2.

Các nghiên cứu trong nước ............................................................................... 24

Phần 3. Vật liệu và phương pháp nghiên cứu ............................................................ 26

iii

download by :


3.1.

Địa điểm nghiên cứu......................................................................................... 26

3.2.

Thời gian nghiên cứu ........................................................................................ 26

3.3.

Đối tượng và vật liệu nghiên cứu ..................................................................... 26

3.4.

Nội dung nghiên cứu ........................................................................................ 26

3.5.

Phương pháp nghiên cứu .................................................................................. 26

3.5.1.

Phương pháp xác định chỉ thị phân tử liên kết chặt với gen Ph3 ..................... 26

3.5.2.

Phương pháp xác định kiểu gen Ph3 của các tổ hợp lai cà chua ...................... 32

3.5.3.

Đánh giá năng suất, đặc điểm nơng sinh học và tình hình sâu bệnh của
các tổ hợp lai cà chua ở vụ Xuân Hè tại Gia Lâm- Hà Nội .............................. 32

3.5.4.

Phương pháp xử lý số liệu ................................................................................ 34

Phần 4. Kết quả và thảo luận ....................................................................................... 35
4.1.

Kết quả khảo sát sự đa hình với gen Ph3 của các chỉ thị phân tử .................... 35

4.2.

Kết quả xác định mức độ liên kết của chỉ thị phân tử thông qua đánh giá
sự tương đồng giữa kiểu gen và kiểu hình tính kháng bệnh ............................. 38

4.3.

Kết quả ứng dụng chỉ thị phân tử LB3 xác định kiểu gen Ph3 của các tổ

hợp lai cà chua mang gen Ph3 .......................................................................... 44

4.4.

Kết quả đánh giá năng suất, đặc điểm nơng sinh học và tình hình sâu
bệnh của các tổ hợp lai cà chua ở vụ Xuân Hè tại Gia Lâm - Hà Nội. ............. 48

4.4.1.

Kết quả đánh giá đặc điểm sinh trưởng của các tổ hợp lai cà chua .................. 48

4.4.2.

Kết quả đánh giá đặc điểm quả của các tổ hợp lai cà chua .............................. 49

4.4.3.

Kết quả đánh giá năng suất các tổ hợp lai cà chua ........................................... 51

4.4.4.

Tình hình nhiễm sâu bệnh ngồi đồng ruộng của các tổ hợp lai ...................... 52

Phần 5. Kết luận và kiến nghị...................................................................................... 54
5.1.

Kết luận............................................................................................................. 54

5.2.

Kiến nghị .......................................................................................................... 54

Tài liệu tham khảo .......................................................................................................... 56
Phụ lục .......................................................................................................................... 62

iv

download by :


DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT
Từ viết tắt

Nghĩa Tiếng Việt

AFLP

Amplified Fragment Length Polymorphism

AVRDC

Agriculture Vegetables Reseacher and Development Center

Bp

Base pair

CAPs

Cleaved Amplified Polymorphic Sequence

cM

centiMorgan

DNA

Deoxyribonucleic acid

dNTP

Deoxyribonucleotide triphosphate

ĐC

Đối chứng

FAO

Food and Agriculture Organization of the United Nations

FAVRI

Fruit and Vegetable Research Institue

F- Primer

Forward Primer

IPM

Intergrated Pest Management

kb

Kilobase

MAS

Marker Assisted Selection

PCR

Polymerase Chain Reaction

QTL

Quantitative Trait Loci

RADP

Random Amplified Polymorphic DNA

RFLP

Restriction Fragment Length Polymorphism

RNA

Ribonucleic Acid

R- Primer

Reserve Primer

SCAR

Sequence Characterised Amplification Regions

SSR

Simple Sequence Repeat

TAE

Tris – Acetate – EDTA

TE

Tris- EDTA

Tm

Melting temperature

v

download by :

DANH MỤC BẢNG
Bảng 2. 1.

Diện tích và sản lượng cà chua trên toàn thế giới giai đoạn 2012- 2014 .......... 6

Bảng 2. 2.

Diện tích và sản lượng cà chua trên cả nước giai đoạn 2014- 2016 ........... 7

Bảng 2. 3.

Diện tích, năng suất và sản lượng cà chua một số tỉnh trồng chính
trên cả nước giai đoạn 2014- 2016 .............................................................. 8

Bảng 3.1.

Danh sách các giống cà chua nghiên cứu ................................................. 27

Bảng 3. 2.

Thành phần phản ứng PCR với mồi.......................................................... 29

Bảng 3. 3.

Chu trình nhiệt cho phản ứng PCR ........................................................... 29

Bảng 3. 4.

Các tổ hợp lai cà chua tiến hành xác định kiểu gen Ph3 ......................... 32

Bảng 4. 1.

Đặc điểm các chỉ thị phân tử thể hiện tính đa hình với gen Ph3 ............. 35

Bảng 4. 2.

Kiểu hình, kiểu gen và trao đổi chéo của quần thể F2 của tổ hợp lai
08TP03-15-3-1 × 08TP73-10-4 ................................................................ 39

Bảng 4. 3.

Khoảng cách di truyền của các chỉ thị phân tử ......................................... 44

Bảng 4. 4.

Kiểu gen Ph3 của các tổ hợp lai cà chua khảo nghiệm............................ 45

Bảng 4. 5.

Đánh giá tính kháng bệnh sương mai của các tổ hợp lai cà chua khảo
nghiệm ....................................................................................................... 46

Bảng 4. 6.

Chiều cao cây và dạng hình sinh trưởng của các tổ hợp lai cà chua
vụ Xuân Hè năm 2017 tại Gia Lâm- Hà Nội ............................................ 48

Bảng 4. 7.

Đặc điểm quả các tổ hợp lai cà chua vụ Xuân Hè năm 2017 tại Gia LâmHà Nội ....................................................................................................... 50

Bảng 4. 8.

Năng suất của các tổ hợp lai cà chua vụ Xuân Hè năm 2017 tại Gia LâmHà Nội........................................................................................................ 51

Bảng 4. 9.

Biểu hiện bệnh hại ngoài đồng ruộng các tổ hợp lai cà chua vụ Xuân
Hè năm 2017 tại Gia Lâm- Hà Nội .......................................................... 53

vi

download by :


DANH MỤC CÁC HÌNH
Hình 2. 1.

Năng suất cà chua trên cả nước và hai miền Nam Bắc giai đoạn
2014- 2016 .................................................................................................. 7

Hình 2. 2.

Triệu chứng bệnh sương mai trên thân, lá và quả cà chua ........................ 10

Hình 2. 3.

Chu kỳ vịng đời của nấm Phytophthora infestans ................................... 12

Hình 2. 4.

Ngun tắc cơ bản của phản ứng PCR ...................................................... 15

Hình 2.5.

Vị trí của gen Ph3 trong bản đồ chỉ thị phân tử RFLP tại vai dài
của nhiễm sắc thể số 9 (Botstein et al., 2006). .......................................... 22

Hình 2.6.

Bản đồ liên kết các gen (QTL) liên quan đến tính kháng bệnh sương
mai của cà chua: LB-1 và LB-2- QTL kháng bệnh sương mai (Fray
et al., 1998); Ph1, Ph2, Ph3 - gen kháng bệnh sương mai
(Chunwongse et al., 2002). ....................................................................... 23

Hình 2.7.

Ảnh điện di của chỉ thị SCAR phát triển từ chỉ thị AFLP (L87) ( Park et
al., 2010) (1- kháng bệnh, 2-6 nhiễm bệnh, 7-16 kháng bệnh)......................... 24

Hình 3. 1.

Vùng khảo sát chỉ thị phân tử liên kết với gen Ph3 trên nhiễm sắc
thể số 9 ...................................................................................................... 28

Hình 3.2.

Sơ đồ tạo quần thể F2 của tổ hợp lai 08TP03-15-3-1 x 08TP73-10-4 ...... 30

Hình 3.3.

Lây nhiễm bệnh nhân tạo trên lá tách rời .................................................. 31

Hình 3. 4.

Quá trình phân lập nấm sương mai (A-mẫu bệnh, B- Phân lập trên
mơi trường V8, C- Hình dạng bọc bào tử động dưới kính hiển vi). ......... 31

Hình 4. 1.

Ảnh điện di sản phẩm PCR của chỉ thị TOM 236..................................... 36

Hình 4. 2.

Ảnh điện di sản phẩm PCR của chỉ thị SSR383 ....................................... 36

Hình 4. 3.

Ảnh điện di sản phẩm PCR của chỉ thị SSR69 ......................................... 37

Hình 4. 4.

Ảnh điện di sản phẩm PCR của chỉ thị LB3 ............................................. 37

Hình 4. 5.

Ảnh điện di sản phẩm PCR của chỉ thị SCU602F3R3 .............................. 37

Hình 4. 6.

Ảnh điện di sản phẩm PCR của chỉ thị LB3 của quần thể F2 các cá
thể từ 1 đến 35 (08TP03-15-3-1 x 08TP73-10-4) ..................................... 43

Hình 4. 7.

Ảnh điện di sản phẩm PCR của chỉ thị SCU602F3R3 quần thể F2 các
cá thể từ 1 đến 37 (08TP03-15-3-1 x 08TP73-10-4)................................. 43

Hình 4. 8.

Ảnh điện di chỉ thị LB3 của tổ hợp lai cà chua khảo nghiệm ................... 45

Hình 4. 9.

Đánh giá tính kháng bệnh sương mai của các tổ hợp lai cà chua
mang gen Ph3............................................................................................ 47

vii

download by :


TRÍCH YẾU LUẬN VĂN
Tên tác giả: Bùi Thị Thêu
Tên luận văn: Xác định chỉ thị phân tử liên kết chặt với gen Ph3 và khảo nghiệm các tổ
hợp lai cà chua mang gen Ph3 vụ Xuân Hè tại Gia Lâm- Hà Nội.
Ngành: Công nghệ sinh học

Mã số: 60 42 02 01

Tên cơ sở đào tạo: Học Viện Nông Nghiệp Việt Nam
Mục đích nghiên cứu:
Xác định chỉ thị phân tử DNA liên kết chặt với gen Ph3 và tuyển chọn được tổ
hợp lai cà chua lai F1 mang gen Ph3 triển vọng trong vụ Xuân Hè tại Gia Lâm – Hà Nội.
Phương pháp nghiên cứu:
Tiến hành khảo sát đa hình 5 chỉ thị TOM236, SSR383, SSR69, LB3 và
SCU602F3R3 với vật liệu giống thí nghiệm (đã biết kiểu gen Ph3) và xác định mức độ
liên kết của chỉ thị phân tử thông qua đánh giá sự tương đồng giữa kiểu gen và kiểu
hình kháng bệnh bằng lây nhiễm nhân tạo (phương pháp lá tách rời) với chủng nấm
sương mai (Phytophthora infestans) thu thập và phân lập tại Viện Nghiên cứu Rau Quả
của quần thể F2 từ tổ hợp lai (08TP03-15-3-1 x 08TP73-10-4). Ứng dụng chỉ thị phân
tử được xác định liên kết chặt với gen Ph3 thu được từ thí nghiệm trên để xác định kiểu
gen Ph3 và đánh giá kiểu hình của 5 tổ hợp lai cà chua (V1, V2, V3, V4 và V5) mang
gen Ph3. Bố trí thí nghiệm theo khối ngẫu nhiên hoàn toàn, 3 lần nhắc lại với các tổ hợp
lai cà chua từ V1 đến V5, trong đó V1 là giống Savior được dùng làm đối chứng để tiến
hành khảo nghiệm.
Kết quả chính và kết luận:
Qua kết quả đánh giá, so sánh sự tương đồng giữa kiểu gen Ph3 của 5 chỉ thị
nghiên cứu và kiểu hình kháng bằng lây nhiễm trên 96 cá thể ngẫu nhiên của quần thể
F2 từ tổ hợp lai (08TP03-15-3-1 x 08TP73-10-4), đã lựa chọn được 2 chỉ thị: LB3 với
khoảng cách di truyền 2,3 cM và chỉ thị SCU602F3R3 với khoảng cách bằng 3,1 cM,
liên kết chặt với gen Ph3 kháng bệnh sương mai ở cà chua. Kết quả này là cơ sở giúp
chọn tạo giống cà chua chứa gen kháng hữu hiệu Ph3 bằng chỉ thị phân tử đạt độ chính
xác cao. Kết quả đánh giá kiểu gen Ph3 sử dụng chỉ thị phân tử LB3 và khảo nghiệm
các tổ hợp lai cà chua mang gen Ph3 trong vụ Xuân Hè tại Gia Lâm- Hà Nội cho thấy
tổ hợp lai triển vọng phục vụ sản xuất: V4 (08TP85-2-3-5-1-1-1-10 x 11FAV-10-3)
mang gen Ph3 ở trạng thái dị hợp tử; có nhiều đặc điểm tốt như thuộc nhóm sinh trưởng
vơ hạn, có khối lượng trung bình quả đạt 100g, độ Brix bằng 3,5%, năng suất thực thu
đạt 76,23 tấn/ha, năng suất cà chua thương phẩm đạt 72,63 tấn/ha, chống chịu tốt với
chủng nấm bệnh sương mai nghiên cứu.

viii

download by :


THESIS ABSTRACT
Master candicate: Bui Thi Theu
Thesis title: Identification of DNA molecular marker closely linked to Ph3 resistant
gene and evaluation of tomato hybrid combinations containing Ph3 gene in Spring
Summer season at Gia Lam- Hanoi.
Major: Biotechnology

Code: 60 42 02 01

Education organization: Vietnam National University of Agriculture
Research Objectives:
To identify DNA molecular markers closely linked to Ph3 gene and find out a
promising tomato hybrid combinations containing Ph3 gene in Spring Summer season
at Gia Lam- Hanoi.
Materials and Methods:
We have evaluated the polymorphism of 5 markers TOM236, SSR383, SSR69,
LB3 và SCU602F3R3 on experimental varieties (Ph3 genotype was denified) and identified
marker linkage level by assessing Ph3 genotype and resistant phenotype of F2 population of
cross combination (08TP03-15-3-1 x 08TP73-10-4) after infecting (by detached – leavflets
method) with the isolates of Phytophthora infestans which were collected and isolated at
Fruit and Vegetable Research Institute. From above 5 markers, a marker closely linked with
Ph3 gene were used for identification Ph3 genotype and evaluate phenotype of 5 tomato
cross combinations (V1, V2, V3, V4 and V5) that containing Ph3 gene. Experiment were
designed by randomized Complete Block with 3 replications of 5 tomato cross

combinations above, in which V1 (Savior) was used as the control variety for testing.
Main findings and conclusions:
After assessing Ph3 genotype and resistant phenotype of 96 F2 randomized
individuals of cross combination (08TP03-15-3-1 x 08TP73-10-4), we have identified 2
markers closely linked to Ph3: LB3 marker and SCU602F3R3 marker with genetic
distance of 2,3 cM and 3,1 cM , respectively. This result is the basis for breeding tomato
varieties containing Ph3 resistant gene through molecular marker. The result of
identification Ph3 genotype by using LB3 marker and testing tomato cross combinations
containing Ph3 gene in the Spring Summer season at Gia Lam- Ha Noi shown that: V4
(08TP85-2-3-5-1-1-1-10 x 11FAV-10-3) is a promising variety containing Ph3
heterozygous genotype with many good characteristics such as infinite growth, average
fruit weight reach 100 g, Brix ~ 3,5 %, actual yield reach 76.23 tons/ha, commercial yield
reach 72.63 tons/ha and strongly resistant to studied isolate of Phytophthora infestans.

ix

download by :


PHẦN 1. MỞ ĐẦU
1.1. TÍNH CẤP THIẾT CỦA ĐỀ TÀI
Cây cà chua (Solanum lycopersicum L.) thuộc họ Cà (Solanaceae) có
nguồn gốc ở miền Trung, Nam và Bắc Mỹ là một trong những loại rau ăn quả
được trồng rộng rãi và tiêu thụ phổ biến nhất hiện nay. Diện tích trồng cà chua
của Việt Nam trong 5 năm trở lại đây khơng có sự biến động nhiều, mỗi năm
nước ta trồng khoảng 21-24 nghìn ha, với năng suất xấp xỉ 26 tấn/ha, chỉ bằng
60% so với năng suất trung bình của tồn thế giới (FAO 2015). Có nhiều ngun
nhân dẫn đến năng suất cịn thấp chủ yếu là do chưa có giống tốt và kháng được
nhiều sâu bệnh hại bệnh. Trong đó đặc biệt là bệnh sương mai là đối tượng gây
hại phổ biến và tương đối nghiêm trọng cho cà chua trong giai đoạn trồng từ

tháng 1 đến tháng 4 ở khu vực đồng bằng sông Hồng.
Bệnh sương mai (late blight) do nấm Phytophthora infestans gây ra là
một trong những bệnh gây hại hủy diệt nhất ở hầu hết các vùng trồng cà chua và
khoai tây trên toàn thế giới. Bệnh có thể gây hại ở mọi thời kỳ sinh trưởng và
phát triển của cây. Nấm bệnh gây hại nhiều bộ phận của cà chua như: thân, lá,
quả và hạt (Rubin et al., 2001; Rubin and Cohen, 2004a). Bệnh có thể tiềm ẩn và
truyền qua đất, hạt giống và bào tử có khả năng phát tán được trong khơng khí.
Bệnh gây hại nghiêm trọng, ảnh hưởng lớn tới năng suất (có thể làm giảm năng
suất tới 60- 70%) và làm giảm phẩm chất cà chua, khoai tây ở một số vùng của
Hà Nội, Hải Phòng, Lào Cai và Đà Lạt (Nguyễn Văn Viên, 1998). Để hạn chế
bệnh, biện pháp phổ biến nhất đang được áp dụng hiện nay là phun thuốc trừ nấm.
Tuy nhiên, hiệu quả phun thuốc hóa học cũng có hạn chế do xuất hiện nhiều
chủng nấm sương mai có khả năng kháng metalaxyl, một hoạt chất chính trong
các loại thuốc trị bệnh sương mai. Việc sử dụng các giống cà chua kháng bệnh
sương mai cùng với việc thực hành quản lý cây trồng hiệu quả có thể cung cấp
một mơi trường an tồn, bền vững và giảm thiểu chi phí sản xuất liên quan đến
phun thuốc trừ nấm (Wang et al., 2016).
Trên thế giới, những nghiên cứu ban đầu tính kháng bệnh sương mai trên
cà chua đã phát hiện được một số gen kháng như gen Ph1 nằm trên nhiễm sắc thể
số 7 (Collard et al., 2005), gen Ph2 nằm trên nhiễm sắc thể số 10 (Morgante and
Olivieri, 1993), gen Ph3 nằm trên nhiễm sắc thể số 9 (Clayberg et al., 1965).

1

download by :


Gen Ph3 cung cấp tính kháng hàng loạt các isolate của tác nhân gây bệnh, do đó
nó chính là mục tiêu để các nhà chọn tạo giống đưa vào trong các giống thương
mại thơng qua nhiều chương trình chọn tạo giống cà chua khác nhau. Một số chỉ

thị phân tử liên kết với gen Ph3 đã được công bố như các chỉ thị SCAR và chỉ thị
CAPs (Robbins et al., 2010; Park et al., 2013; Trương Thị Hồng Hải và cs.,
2013). Khoảng cách di truyền giữa gen với chỉ thị có thể thay đổi tùy theo vật
liệu giống mang gen cụ thể. Các chỉ thị phân tử liên kết với gen Ph3 kháng bệnh
sương mai đã được công bố trên nguồn vật liệu nghiên cứu khác nhau, mức độ
liên kết cũng rất khác nhau. Vì thế dựa trên những chỉ thị phân tử liên kết chặt
với gen kháng Ph3 đã được công bố, chúng tôi tiến hành nghiên cứu để xác định
và lựa chọn lại những chỉ thị liên kết chặt và có độ chính xác cao ứng dụng trong
chọn tạo giống cà chua kháng bệnh sương mai trên nguồn vật liệu của chúng tôi.
Chọn tạo giống cà chua chống chịu bệnh sương mai bằng chỉ thị phân tử
đã được thực hiện ở Viện nghiên cứu Rau quả trong những năm gần đây. Kết quả
đã xác định được gen Ph3 là một gen trội khơng hồn tồn và kháng hữu hiệu
được với nhiều chủng nấm gây bệnh sương mai, phân lập từ các vùng sản xuất cà
chua chính của Việt Nam. Các nhà khoa học của Viện cũng đã lai tạo được 4 tổ
hợp cà chua lai có chứa gen Ph3 kháng bệnh sương mai (Trịnh Khắc Quang và
Trần Ngọc Hùng, 2012; Kết quả đề tài, 2009-2012). Tuy nhiên, trước khi đưa ra
sản xuất thì cần phải so sánh với giống lai Savior và đánh giá lại những đặc điểm
tốt để tuyển chọn được tổ hợp lai cà chua kháng bệnh sương mai, tiến tới công
nhận giống và phát triển mở rộng ra sản xuất. Xuất phát từ những lý do đó, chúng
tơi đã thực hiện đề tài “Xác định chỉ thị phân tử liên kết chặt với gen Ph3 và
khảo nghiệm các tổ hợp lai cà chua mang gen Ph3 vụ Xuân Hè tại Gia LâmHà Nội”.
1.2. MỤC TIÊU NGHIÊN CỨU
Xác định chỉ thị phân tử liên kết chặt với gen Ph3 kháng bệnh sương mai
cà chua, ứng dụng xác định kiểu gen Ph3 của các tổ hợp lai cà chua và khảo
nghiệm tuyển chọn được tổ hợp lai cà chua mang gen Ph3 có năng suất cao, chất
lượng tốt trong vụ Xuân Hè tại Gia Lâm- Hà Nội.
1.3. PHẠM VI NGHIÊN CỨU
- Đề tài tiến hành thí nghiệm trên các chỉ thị phân tử liên kết với gen Ph3
và các tổ hợp lai cà chua mang gen Ph3.

2

download by :


- Thời gian thực hiện: Vụ Xuân Hè năm 2017
- Địa điểm thực hiện: Viện Nghiên cứu Rau quả, Trâu Quỳ, Gia Lâm,
Hà Nội.
1.4. Ý NGHĨA KHOA HỌC VÀ THỰC TIỄN
1.4.1. Ý nghĩa khoa học
Ở Việt Nam, việc nghiên cứu xác định chỉ thị phân tử liên kết chặt với
gen kháng bệnh sương mai Ph3 và ứng dụng chỉ thị phân tử DNA trong chọn tạo
giống cà chua chứa gen kháng bệnh sương mai Ph3 chưa được nghiên cứu nhiều.
Hai chỉ thị phân tử LB3 và SCU602F3R3 liên kết chặt với gen Ph3 với lần
lượt khoảng cách di truyền là 2,3 cM và 3,1 cM là cơ sở để các nhà chọn tạo
giống cà chua sử dụng chọn lọc bằng chỉ thị phân tử đạt độ chính xác cao.
1.4.2. Ý nghĩa thực tiễn của đề tài
Tổ hợp lai V4 lai giữa mẫu giống 08TP85-2-3-5-1-1-1-10 với 11FAV10-3 chứa gen Ph3 dị hợp tử kháng bệnh sương mai,có năng suất cao, chất lượng
tốt góp phần phát triển sản xuất cà chua ở nước ta.

3

download by :


PHẦN 2. TỔNG QUAN TÀI LIỆU
2.1. TỔNG QUAN VỀ CÂY CÀ CHUA
2.1.1. Danh pháp và phân loại
Cà chua (Solanum lycopersicum L.) thuộc chi Lycopersicon Toum, họ cà
Solanaceae. Chi Lycopersicon Toum gồm hai chi phụ: Eriopersicon,

và

Eulycopersicon. Chi phụ Eulycopersicon có lồi L.esculentum Mill bao gồm các
loài phụ sau: L.esculentum ssp. Spontaneum (cà chua hoang dại), L.esculentum
ssp. Cultum (cà chua trồng) (Phạm Hồng Cúc, 2008). Họ Solanaceae bao gồm
các cây rau quan trọng khác như ớt và ớt chuông (Capsicum ssp.), khoai tây
(Solanum tuberosum), cà tím (Solanum melongena), cà chua xanh (Physalis
ixocarpa) và thuốc lá (Nicotiana tabacum). Danh pháp phân loại của cà chua vẫn
là một vấn đề đang được tranh luận. Vào năm 1753, nhà thực vật học Linnaeus
gọi nó là Solanum lycopersicon; 15 năm sau Philip Miller thay thế bằng
Lycopersicon esculentum (Taylor, 1986). Gần đây, các nhà phân loại học đã giới
thiệu lại tên thường dùng cà chua là Solanum lycopersicon (Heuvelink, 2005).
2.1.2. Nguồn gốc, lịch sử và cách sử dụng cà chua
Theo các nhà nghiên cứu, tất cả các lồi cà chua hoang dại có liên quan
đều có nguồn gốc từ vùng Andean. Tổ tiên nhiều khả năng nhất là cà chua hoang
dại L.esculentum var. Cerasiforme- loài bản địa trong vùng nhiệt đới và cận nhiệt
đới nước Mỹ. Cà chua ban đầu chỉ được trồng như cây cảnh: quả cà chua được
xem như có chất độc bởi có quan hệ gần gũi với cà độc dược (Solanum
dulcamara). Từ giữa thế kỷ 16, cà chua được trồng và tiêu thụ ở phía Nam châu
Âu; tiếp đó là Trung Quốc, phía Nam và Đông Nam châu Á. Một số sản phẩn từ
cà chua đã được sản xuất và tiêu thụ vào cuối thế kỷ 19 như nước súp, nước
chấm và nước sốt cà (Heuvelink, 2005).
Cà chua có thể được sử dụng để ăn tươi hay chế biến dưới nhiều dạng
khác nhau. Ba sản phẩm chính được chế biến từ cà chua đó là: (i) cà chua được
bảo quản; (ii) cà chua khô dạng bột hay quả; (iii) thực phẩm chế biến từ cà chua.
Ngoài ra, cà chua thường được sử dụng như một cây mơ hình để nghiên cứu về
đa dạng sinh học, tế bào học, hóa sinh học, nghiên cứu phân tử và di truyền bởi là

4

download by :


cây tự thụ phấn, sinh trưởng phát triển dễ dàng, chu trình sống ngắn và dễ dàng
để thao tác; nghiên cứu sinh lý và hóa sinh học về tình trạng ngủ nghỉ, quá trình
nảy mầm và phát triển hạt. (Heuvelink, 2005).
Ở Việt Nam, một số nhà nghiên cứu cho rằng cà chua được du nhập từ
thời Thực dân Pháp đô hộ (Nguyễn Văn Thắng và Bùi Thị Mỳ, 1996). Cà chua
được trồng ngồi đồng ruộng, trong nhà kính, nhà lưới và thậm chí trong điều
kiện khơng thuận lợi. Thực tế, các hộ nông dân nước ta đã nhận thức rõ vai trị
của cà chua và tăng diện tích trồng lên hàng năm song chủ yếu ở các tỉnh Hưng
Yên, Hải Dương, Bắc Ninh, Hà Nam và Nam Định (Hà Nội, 2001- 2003).
2.1.3. Tình hình sản xuất cà chua trên thế giới và Việt Nam
2.1.3.1. Tình hình sản xuất cà chua trên thế giới
Cà chua là cây rau ăn quả được trồng và tiêu thụ ở hầu hết các nước trên
thế giới. Chọn tạo giống cà chua được bắt đầu thực hiện ở châu Âu (Italia)
khoảng 200 năm trước. Ở Mỹ, chọn tạo giống cà chua được thực hiện vào những
năm 70 của thế kỷ 19 (Stuber, 1994; Umaerus,1994). Năng suất cà chua ở Mỹ
tăng từ 10,1 tấn/ha trong những năm 20 của thế kỷ 20 đến 72,4 tấn trong những
năm 90 và đến năm 2004 là 102,0 tấn/ha. Đóng góp vào sự nhảy vọt về năng suất
trên thì vai trị của cơng tác giống là 50%, cịn lại là do tác động của các biện
pháp kỹ thuật và đầu tư khác.Trong q trình thuần hóa, chọn lọc giống, con
người đã làm cho tính đa dạng nguồn gen bị xói mịn, tăng nguy cơ nhiễm nhiều
loại sâu bệnh hại trong điều kiện môi trường bất thuận.
Sản lượng cà chua sản xuất ra liên tục tăng mạnh trong những năm gần
đây. Theo số liệu của Tổ chức Nông lương Liên hợp quốc (FAO) (bảng 2.1), diện
tích cà chua sản xuất năm 2014 đạt 5.024 nghìn ha tăng 528 nghìn ha so với năm
2010 (đạt 4.496 ha). Tốc độ gia tăng về diện tích sản xuất chậm. Sản lượng cà
chua tăng 12,4% từ 151.895 nghìn tấn (2010) lên 170.751 nghìn tấn (2014). Mức

gia tăng về sản lượng thấp là do sự tăng năng suất không đáng kể trong những
năm vừa qua từ 33,7 tấn/ha (2010) lên 34,0 tấn/ha (2014).
Trong đó, đến năm 2014, châu Á có diện tích cà chua trồng lớn nhất thế
giới chiếm trên 55%, tiếp đến là châu Phi chiếm khoảng 24%, châu Âu 10%, khu
vực châu Mỹ 9% và các nơi khác là 10% (FAO, 2015).

5

download by :


Bảng 2.1. Diện tích và sản lượng cà chua trên tồn thế giới
giai đoạn 2012- 2014
Năm 2012

Năm 2013

Năm 2014

Châu lục

Diện
tích
(1000ha)

Châu Phi

1.129,0

18.608,0

1.167,0

18.558,0

1.214,0

19.253,0

Châu Mỹ

475,0

25.325,0

459,0

24.886,0

470,0

26.870,0

Châu Á

2.803,0

95.712,0

2.818,0

98.845,0

2.836,0

101.638,0

Châu Âu

509,0

21.674,0

490,0

20.878,0

499,0

22.734,0

9,0

472,0

8,0

553,0

4,0

255,0

4.942,0 163.719,0

5.024,0

170.751,0

Châu Đại Dương
Tồn thế giới

Sản
lượng
(tấn)

4.926,0 161.792,0

Diện
tích
(1000ha)

Sản
lượng
(tấn)

Diện
Sản lượng
tích
(tấn)

(1000ha)

Nguồn: FAOSTAT (2015)

Theo số liệu thống kê FAO (2015), 5 nước có sản lượng cà chua lớn nhất
lần lượt là Trung Quốc, Ấn Độ, Thổ Nhĩ Kỳ, Ai Cập. Trung Quốc là nước đứng
đầu thế giới về diện tích sản xuất cũng như sản lượng cà chua tạo ra trong suốt
giai đoạn từ 2012 đến nay. Năm 2014, sản lượng cà chua của Trung Quốc đạt
52.723 tấn chiếm 31% tổng sản lượng cà chua thế giới, Ấn Độ đạt 11%, Thổ Nhĩ
Kỳ là 7%... Trên thế giới, năng suất cà chua trung bình đạt trên 30 tấn/ha (năm
2013: 33,1 tấn; năm 2014: 34,0 tấn). Mức độ chênh lệch về năng suất thể hiện rõ
rệt theo trình độ khoa học cơng nghệ và vùng lãnh thổ. Mỹ là nước có năng suất
cà chua cao nhất, đạt 88,8 tấn/ha gấp 4,18 lần năng suất cà chua của Ấn Độ và
1,69 lần so với Trung Quốc năm 2014 (FAO, 2015).
Cà chua là mặt hàng xuất khẩu của nhiều nước trên thế giới. Mexico là
nước đứng đầu trong xuất khẩu cà chua đạt 1.535 nghìn tấn, chiếm hơn 20% khối
lượng xuất khẩu trên tồn thế giới (2013) (FAO, 2015).
2.1.3.2. Tình hình sản xuất cà chua ở Việt Nam
Ở Việt Nam, cà chua đã và đang trở thành một loại rau ăn quả phổ biến
với diện tích trồng hàng năm từ 20- 25 nghìn ha. Theo thống kê năm 2016, diện

6

download by :


tích trồng cà chua trên cả nước là 23.868,6 ha tăng 1,09 lần so với năm 2012, với
năng suất trung bình đạt 276,5 tạ/ha, tổng sản lượng đạt 655.442,1 tấn.
Bảng 2.2. Diện tích và sản lượng cà chua trên cả nước giai đoạn 2014- 2016
Năm 2014

Diện tích
(ha)
Miền Bắc

Sản lượng
(tấn)

Năm 2015
Diện tích Sản lượng
(ha)
(tấn)

Năm 2016
Diện tích
(ha)

Sản lượng
(tấn)

11.035,1

236.808,8 10.655,4

235.608,3

11.255,9

247.506,7

Miền Nam 14.622,1

518.881,3 12.685,7

500.351,4

12.612,8

407.935,5

Cả nước

755.690,2 23.341,1

735.959,7

23.868,6

655.422,1

25.657,2

Nguồn: Tổng cục Thống kê (2017)

400
350
300
250

Miền Bắc
Miền Nam

Cả nước

200
150
100
50
0

2014

2015

2016

Hình 2.1. Năng suất cà chua trên cả nước và hai miền Nam Bắc
giai đoạn 2014- 2016
Nguồn: Tổng cục Thống kê (2017)

Do tính chất đặc trưng như cơ cấu mùa vụ và điều kiện sinh thái mà ở
nước ta cà chua thường được trồng tập trung ở các tỉnh Đồng bằng sông Hồng
(Hà Nội, Hải Dương, Nam Định…) và các tỉnh Tây Nguyên (Lâm Đồng, Gia
Lai…) được thể hiện trong bảng 2.3.

7

download by :


Bảng 2.3. Diện tích, năng suất và sản lượng cà chua một số tỉnh trồng chính
trên cả nước giai đoạn 2014- 2016

2014
Tỉnh/Tp

Diện Năng
tích
suất
(ha) (tạ/ha)

Hà Nội 1.159,2

2015
Sản
lượng
(tấn)

Năng
Diện
suất
tích (ha)
(tạ/ha)

2016
Sản
lượng
(tấn)

Diện Năng
tích
suất
(ha) (tạ/ha)

Sản
lượng
(tấn)

292,8 33.935,7 1.161,8 297,2 34.528,2 1.265,6 288,3

36.491,6

Hải Dương1.067,0

251,1 26.790,1

988,0 250,9 24.786,7 1.007,0 251,8

25.359,1

Nam Định 1.231,0

206,0 25.362,0 1.324,0 249,9 33.086,0 1.465,0 261,5

38.315,0

Bắc Giang 825,4

211,5 17.457,3

18.991,5

Lâm Đồng9.140,0

470,3 429.842,7 8.101,2 528,5 428.168,6 7.097,9 426,2 337.028,3

781,9 211,0 16.491,7 880,8 215,6

Nguồn: Tổng cục Thống kê (2017)

Trong ba năm gần đây (giai đoạn 2014-2016), mặc dù có sự sụt giảm đáng
kể, Lâm Đồng vẫn là tỉnh dẫn đầu trong cả nước về diện tích và sản lượng cà
chua hàng năm. Năm 2016, diện tích trồng cà chua của Lâm Đồng là 9.140,0 ha
chiếm khoảng 30% diện tích cà chua trên cả nước, sản lượng chiếm 51% tổng
sản lượng cà chua cả nước. Nhìn vào những con số trên có thể thấy: Năng suất cà
chua là rất đáng ghi nhận ở Lâm Đồng.
Sản xuất cà chua ở nước ta có một số tồn tại chủ yếu: Chưa có bộ giống
tốt cho từng vụ trồng, sản xuất còn manh mún, chưa có sản phẩm hàng hố lớn
cho chế biến cơng nghiệp. So với các nước trong khu vực, sản xuất cà chua ở
Việt Nam có lợi thế rõ rệt về khí hậu, thời tiết và đất đai; đặc biệt các tỉnh phía
Bắc phù hợp cho sinh trưởng, phát triển của cà chua. Diện tích phát triển cà chua
cịn rất lớn vì trồng trong vụ đơng, khơng ảnh hưởng đến 2 vụ lúa nhưng sản
phẩm lại là trái vụ so với Trung Quốc. Các vùng trồng cà chua đều có nguồn lao
động lớn, nơng dân có kinh nghiệm canh tác nên giá thành có khả năng cạnh
tranh cao (Báo cáo tổng kết đề tài, 2001-2005).
Khu vực Hà Nội cà chua được trồng chủ yếu theo 3 vụ như sau (Báo cáo
tổng kết đề tài, 2001-2005):
- Vụ Đông Xuân: Gieo tháng 10 – 11 và thu hoạch vào tháng 1 - 2 dương

8

download by :

lịch. Cà chua tăng trưởng trong mùa khô, ấm áp nên phát triển tốt năng suất cao.
Khó khăn chính là giá bán thấp và bị bệnh sương mai nặng khi thu hoạch.
- Vụ Xuân Hè: Gieo từ tháng 12 - 1 và thu hoạch tháng 3 - 4 dương lịch.
Cà chua tăng trưởng hồn tồn trong mùa khơ nhưng ra hoa kết trái trong những
tháng nóng nhất trong năm. Mặt khác, ở giai đoạn đầu vụ trời âm u, mưa phùn
nhiều, số giờ nắng ít nên bệnh sương mai xuất hiện phá hại nặng.
- Vụ Hè Thu: Gieo từ tháng 6- 7 và thu hoạch tháng 9- 10 dương lịch.
Giống cà chua vụ này phải chịu nhiệt, chống virus, quả cứng, khơng nứt và có
màu đỏ đẹp khi chín. Đây là vụ cà chua khó làm nhưng giá bán được lại rất cao.
Trong giai đoạn từ năm 2011 đến nay, bộ giống cà chua đã có sự chọn lọc
đáng kể, các giống cao sản có dạng bán hữu hạn, năng suất cao, phẩm chất quả
tốt, như quả cứng, chín đỏ đẹp, đặc biệt là các giống có khả năng chịu nhiệt,
kháng virus xoăn vàng lá, bệnh sương mai chiếm ưu thế (70,3%). Trong sản xuất,
một số giống có dạng hình vô hạn đã được đưa vào sản xuất ở môt số vùng
chun canh, có trình độ thâm canh cao (Đặng Văn Niên và cs., 2013).
2.2. NGHIÊN CỨU VỀ BỆNH SƯƠNG MAI TRÊN CÀ CHUA
Bệnh sương mai được phát hiện từ cuối thế kỷ 19 đã góp phần vào việc
thiết lập bệnh học thực vật cũng như nghiên cứu mô tả. Quần thể nấm
Phytophthora infestans trên toàn cầu liên tục thay đổi, với sự xuất hiện của các
chủng mới linh hoạt khiến bệnh sương mai đã và đang tiếp tục trở thành mối đe
dọa của an ninh lương thực toàn cầu (Whisson et al., 2016).
2.2.1. Triệu chứng và dấu hiệu bệnh sương mai
Trên lá cà chua
Trên lá, vết bệnh xuất hiện đầu tiên ở đầu lá, mép lá hoặc gần cuống lá.
Các vết bệnh bắt đầu như những điểm không xác định, ngậm nước, khuếch rộng
một cách nhanh chóng vào trong, làm màu xanh nhạt đi chuyển thành các vết
bệnh màu đen- nâu nhạt và lan rộng ra diện tích lớn của lá. Trong điều kiện thời
tiết ẩm ướt, các vết bệnh trên bề mặt cuống lá có thể được bao phủ bởi mốc xám
đến trắng (dễ nhầm lẫn với bệnh phấn trắng). Ở mặt dưới các vết bệnh lớn hơn,

thường xuất hiện một vòng sinh trưởng của mốc của tác nhân gây bệnh trong thời
tiết ẩm ướt. Cùng với sự phát triển của bệnh, tán lá chuyển từ màu vàng, sang
nâu, xoăn lá, teo lại và chết đi (Scot, 2008).

9

download by :


Trên thân cà chua
Vết bệnh ban đầu có hình bầu dục nhỏ hoặc hình dạng khơng đều đặn; sau
đó lan rộng bao quanh, kéo dài dọc thân cành, màu nâu hoặc sẫm, hơi lõm và ủng
nước. Khi trời ẩm ướt, thân cành bị bệnh giịn, tóp nhỏ và dễ gãy. Khi trời khô
ráo vết bệnh không phát triển thêm, màu nâu xám, cây có thể tiếp tục sinh trưởng
(Vũ Triệu Mân và Lê Lương Tề, 2001).
Trên hoa cà chua
Trên hoa vết bệnh màu nâu hoặc màu đen xuất hiện ở đài hoa ngay sau
khi nụ được hình thành. Bệnh lan sang cánh hoa, nhị hoa và cuống hoa làm cho
cả chùm hoa bị rụng (Black et al., 1996b).
Trên quả cà chua
Trên quả vết bệnh có thể xuất hiện ở núm hoặc giữa quả, lúc đầu màu nâu
nhạt, sau thành nâu đậm hoặc nâu đen, vết bệnh lan khắp bề mặt quả (Hà Nội,
2001-2003). Khi thời tiết ẩm ướt có thể xuất hiện một lớp mỏng các hệ sợi nấm
trắng. Các quả cà chua bị nhiễm bệnh có thể bị teo lại, rụng và khơng bao giờ
chín (Scot, 2008). Hạt trong quả bệnh cũng bị hại, hạt bị bệnh nặng thường nhỏ
hơn hạt khỏe, vết bệnh màu nâu chiếm một phần hoặc toàn bề mặt hạt. Quả nếu
bị bệnh nặng sẽ thối rửa và hạt bị đen lại (Zhu et al., 2006).

Nguồn: />
Hình 2.2. Triệu chứng bệnh sương mai trên thân, lá và quả cà chua

10

download by :


2.2.2. Nguyên nhân gây bệnh
Bệnh sương mai (Late blight) do nấm Phytophthora infestans (Mont.) de
Bary gây hại trên các bộ phận thân, lá, quả cà chua và khoai tây ở mọi thời kỳ
sinh trưởng. Hiện tại, để phòng trừ bệnh người ta thường dùng thuốc hóa học. Do
nấm bệnh thường xuyên thay đổi tính độc nên hiệu quả của việc phịng trừ bằng
thuốc hóa học ngày càng ít có tác dụng (Vũ Triệu Mân và Lê Lương Tề, 2001).
Nấm Phytophthora infestans (Mont) de Bary thuộc bộ Peronosporales,
lớp Phycomycetes, thuộc loại nấm di tản có hai dạng A1 và A2 tùy theo vùng
sinh thái, chu kỳ phát triển hoàn toàn gồm giai đoạn sợi nấm, sinh sản vơ tính
và sinh sản hữu tính tạo ra bào tử trứng. Nấm này sinh sản vơ tính bằng bào tử
phân sinh, dưới 2 hình thức nảy mầm trực tiếp và gián tiếp, muốn tồn tại phải
có cây ký chủ. Hình thức sinh sản hữu tính xuất hiện khi 2 dạng A1 và A2
cùng tồn tại, bào tử trứng có thể tồn tại trong tự nhiên không cần cây ký chủ.
Những nghiên cứu về mối quan hệ giữa các dạng chủng sinh học của nấm với
các giống cà chua chứa các gen kháng đã giúp chỉ ra phương hướng mới trong
cơng tác phịng trừ bệnh bằng con đường tạo giống kháng bệnh (Vũ Triệu
Mân và Lê Lương Tề, 2001).
Nấm Phytophthora infestans có khả năng hình thành nhiều chủng khác
nhau. Dựa trên lý thuyết “gen đối gen”, Vũ Triệu Mân và Lê Lương Tề cho rằng
nấm này ở Việt nam gồm có 16 chủng: chủng đơn và hỗn hợp. Số lượng chủng
nấm thay đổi tùy thuộc vào vùng sinh thái trồng trọt khác nhau. Ý nghĩa chính
của việc xác định chủng nấm là để xác định được một giống cà chua nhiễm và
kháng với những chủng nấm ở một vùng sinh thái nhất định. Từ đó thay đổi cơ
cấu giống trong phạm vi tồn tại của chúng hoặc tiến hành lai tạo giống chống

chịu bệnh cho vùng sinh thái đó (Kết quả đề tài 2001- 2005).
Về cấu tạo, sợi nấm sương mai có hình ống, đơn bào, nhiều nhân. Thời kỳ
tiềm dục ở lá 2 ngày, quả là 3- 10 ngày (Vũ Triệu Mân và Lê Lương Tề, 2001).
Quá trình xâm nhiễm của nấm bệnh bắt đầu khi bào từ nẩy mầm trực tiếp trên mô
của cây ký chủ, trong điều kiện có bề mặt nước và nhiệt độ trên 210C (thích hợp
250C). Sau xâm nhập, nấm phát triển nhanh ở nhiệt độ 220C- 240C. Trên 350C,
nấm không phát triển được mà bảo tồn trong tàn dư thực vật, bùng phát gây hại
khi gặp điều kiện thuận lợi (Fray et al., 1998, 2005).

11

download by :


Hình 2.3. Chu kỳ vịng đời của nấm Phytophthora infestans
Nguồn: />
Nguồn bệnh truyền từ năm này qua năm khác bằng sợi nấm, bào tử trứng
trên tàn dư cây cà chua bị bệnh, sợi nấm còn tồn tại trong hạt cà chua. Trong thời
kỳ cây sinh trưởng, bệnh lây lan phát triển nhanh chóng bằng bào tử phân sinh
(Vũ Triệu Mân và Lê Lương Tề, 2001).
2.2.3. Đặc điểm phát sinh, phát triển và gây hại của bệnh
Các điều kiện thời tiết, đất đai, phân bón và kỹ thuật canh tác có ảnh
hưởng đến sự phát sinh, phát triển và gây hại của bệnh trên đồng ruộng (Vũ Triệu
Mân và Lê Lương Tề, 2001).
- Ảnh hưởng của thời tiết: Độ ẩm, lượng mưa, nhiệt độ và độ chiếu sáng
hàng ngày có ảnh hưởng lớn đến sự phát sinh, phát triển của nấm bệnh sương
mai cà chua. Bệnh phát sinh, phát triển mạnh ở vụ Đông Xuân và vụ Xuân Hè
khi mưa phùn kéo dài. Tiểu khí hậu trong ruộng cà chua tạo điều kiện phát sinh
các ổ bệnh, từ đó lan ra ruộng và cánh đồng cà chua.
- Ảnh hưởng của đất đai: Đất đai liên quan đến chế độ nước, dinh dưỡng

của cà chua và nguồn nấm bệnh. Ở đất thịt, đất thấp trũng bệnh thường nặng hơn
nơi đất cát, đất cao thoát nước. Ở những vùng đất bạc màu bệnh có xu hướng nhẹ
hơn so với những vùng đất màu mỡ.
- Ảnh hưởng của phân bón: Bón kết hợp giữa phân chuồng, phân vô cơ

12

download by :


(N, P, K) cân đối, hợp lý làm tăng sức chống chịu của cây với bệnh sương mai.
- Tính chống bệnh của giống: Các giống cà chua khác nhau có mức độ
nhiễm kháng bệnh khác nhau.
- Thời vụ: Vụ cà chua trồng sớm bị bệnh mốc sương nhẹ, bệnh chỉ hại ở
giai đoạn cuối khi thu hoạch. Cà chua vụ Xuân Hè thường bị hại nặng giai đoạn
vườn ươm đến khi cây ra hoa.
2.3. CHỈ THỊ PHÂN TỬ VÀ ỨNG DỤNG CHỈ THỊ PHÂN TỬ TRONG
CHỌN GIỐNG CÂY TRỒNG
2.3.1. Chỉ thị phân tử
Chỉ thị phân tử có thể hiểu đơn giản chúng như các cột mốc nằm trên
trình tự DNA trong hệ gen. Sự hiện diện của các cột mốc và khoảng cách tương
đối giữa chúng phản ánh mức độ biến dị giữa các cá thể, giống hay một loài
trong quần thể. Chỉ thị phân tử cho phép xác định được các locus gen hay gen
quy định những tính trạng của cây trồng (Chen et al., 1997). Từ những năm 1980,
công nghệ chỉ thị DNA được phát hiện và áp dụng nhiều vì các chỉ thị phát hiện
gen này khơng nhạy cảm với mơi trường, được tạo ra nhiều có thể dùng để theo
dõi chọn lọc hầu hết các gen quy định các tính trạng nơng học quan trọng và từ
đó giúp tăng đáng kể hiệu quả của chọn tạo giống cây trồng.
Chỉ thị phân tử dựa trên DNA là công cụ hữu hiệu trong nhiều lĩnh vực
khác nhau như: phân loại học, chọn tạo giống thực- động vật và kỹ thuật di

truyền (Jonah et al., 2011). Chỉ thị DNA không bị giới hạn về số lượng, ổn định
và không chịu tác động của các yếu tố môi trường cũng như các giai đoạn phát
triển của thực vật. Một chỉ thị DNA lý tưởng phải đạt các yêu cầu sau: Bản chất
cho đa hình cao, di truyền đồng trội, xuất hiện nhiều trong genome, dễ tiếp cận,
phân tích nhanh và dễ dàng. Tuy nhiên, gần như khơng thể tìm thấy một chỉ thị
phân tử nào có thể thỏa mãn tất cả những điều kiện trên. Tùy thuộc vào những
nghiên cứu mà người ta sử dụng một hệ thống chỉ thị thỏa mãn được một số điều
kiện (Nguyễn Duy Bảy và cs., 2001).
Chỉ thị DNA có ứng dụng đặc biệt nếu thể hiện sự khác biệt giữa các cá
thể cùng loài hay khác loài dựa trên khả năng phân biệt giữa đồng hợp tử và dị
hợp tử bao gồm : chỉ thị đa hình và chỉ thị đơn hình. Chỉ thị đồng trội chỉ ra sự
khác biệt về kích thước, ngược lại chỉ thị trội chỉ sự có mặt hay vắng mặt
(Chunwongse et al., 1998). Chỉ thị DNA phân thành ba nhóm dựa vào phương

13

download by :


pháp phát hiện: Chỉ thị dựa trên cơ sở của phản ứng PCR, chỉ thị dựa trên cơ sở
lai DNA và chỉ thị dựa trên những chuỗi có trình tự lặp lại (Xu et al., 1997).
2.3.1.1. Chỉ thị dựa trên cơ sở lai DNA
 Chỉ thị RFLP (Restriction fragment length polymorphism- Đa hình chiều
dài các đoạn phân cắt giới hạn)
Chỉ thị này được các nhà di truyền học lần đầu tiên giới thiệu trong nghiên
cứu lập bản đồ các gen liên quan đến bệnh ở người. Trong chỉ thị RFLP, enzyme
cắt giới hạn được sử dụng để cắt DNA genome thành nhiều mảnh DNA có độ dài
khác nhau. Các đa hình RFLP sinh ra bởi những đột biến tự nhiên ở những điểm
cắt giới hạn trong DNA bộ gen như đảo đoạn, thêm, mất đoạn DNA hoặc đột
biến điểm tùy thuộc vào mỗi giống, mỗi lồi thậm chí mỗi cá thể. Mỗi lồi sinh

vật có một bộ gen đặc hiệu trong cấu trúc. Vì vậy các đoạn DNA được cắt ra bởi
những enzyme giới hạn sẽ có kích thước khác nhau có thể được dùng như các
dấu hiệu di truyền để xem xét các mẫu giống. Sự nhận biết các đoạn cắt được
thực hiện nhờ kỹ thuật lai với các đoạn DNA với mẫu dò (Botstein et al., 1980).
Chỉ thị RFLP là chỉ thị đồng trội, có khả năng biểu hiện ở tất cả các allen
của cùng một locus gen. Hạn chế của chỉ thị này là tốn nhiều thời gian và cơng
sức, địi hỏi phịng thí nghiệm với nhiều trang thiết bị kỹ thuật cao, đặc biệt là
tiêu hao một lượng lớn DNA mà số lượng đa hình thu được khá ít, thậm chí ở
một số lồi khó nhận được đa hình (Lưu Thị Ngọc Huyền, 2003).
2.3.1.2. Chỉ thị phân tử dựa trên cơ sở tái bản DNA
Phản ứng chuỗi trùng hợp hay kỹ thuật PCR (Polymerase Chain Reaction)
do Kary Mullis đưa ra, giúp phát hiện sự đa hình DNA dựa trên cơ sở nhân bản
các đoạn DNA với số lượng lớn trong ống nghiệm.
 Phương pháp PCR
Khái niệm
PCR là phương pháp nhân nhanh một đoạn phân tử DNA trong ống
nghiệm. Đây là một kỹ thuật nhằm tạo ra hàng triệu đoạn DNA đồng nhất từ một
hỗn hợp các phân tử bao gồm RNA, protein, polysacharide, DNA khơng có chức
năng và DNA có chức năng di truyền. Ngày nay, PCR được dùng rất phổ biến
trong nhiều lĩnh vực về sinh học (Bùi Chí Bửu và Nguyễn Thị Lang, 2004).
Nguyên tắc
Nguyên tắc cơ bản của phản ứng PCR là khuếch đại một đoạn gen quan

14

download by :


tâm bằng mồi đặc hiệu kết hợp với hoạt động của enzyme chịu nhiệt polymerase
như Taq DNA polymerase trong một chu trình nhiệt hợp lý. Tác động của mồi

được xem như yếu tố đánh dấu hoạt động của enzyme polymerase khi nó được
gắn kết vào DNA mạch đơn dùng làm khuôn trong giai đoạn bắt cặp. Mồi bên
trái tác động trên sợi DNA chiều 3’- 5’ còn được gọi là mồi xuôi, mồi bên phải
tác động trên sợi DNA chiều 5’- 3’. Tóm lại, khi các mồi kết hợp với sợi DNA
đối lập của nó trong điều kiện một khoảng cách đã được kích hoạt, các đoạn
DNA này có thể sẽ được khuếch đại lên theo phản ứng chuỗi với enzyme
polymerase (Bùi Chí Bửu và Nguyễn Thị Lang, 2005).
Phản ứng PCR được thực hiện trên cơ sở sinh tổng hợp DNA theo nhiều chu
kỳ nối tiếp nhau, mỗi chu kỳ gồm 3 bước như sau (Hồ Thị Thùy Dương, 2002).
Bước 1: Biến tính (Denature): Giai đoạn này được thực hiện ở nhiệt độ
cao (94- 950C) trong vòng 30 giây đến 1 phút, làm cho phân tử DNA mạch kép
tách hoàn toàn thành 2 mạch đơn.
Bước 2: Bắt cặp (Annealing): Nhiệt độ được hạ thấp đến mức cho phép
các mồi bắt cặp được với mạch khuôn dao động từ 55- 650C, trong 30 giây- 1
phút, tùy thuộc vào nhiệt độ nóng chảy Tm của các mồi sử dụng.
Bước 3: Kéo dài (Extension)
Dưới tác động của enzyme DNA polymerase, các nucleotide lần lượt gắn
vào mồi theo nguyên tắc bổ sung với mạch khuôn ở nhiệt độ 720C trong thời gian
từ 30 giây đến vài phút.

Hình 2.4. Nguyên tắc cơ bản của phản ứng PCR
Nguồn:

15

download by :