(LUẬN văn THẠC sĩ) nghiên cứu đa dạng sinh học của hải miên (porifera) tại đảo cồn cỏ, tỉnh quảng trị

Nghiên cứu đa dạng sinh học của Hải miên (Porifera) tại Đảo Cồn Cỏ, tỉnh
Quảng Trị

LÊ THÀNH LONG

download by :


LỜI CẢM ƠN

Tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành và sâu sắc tới TS. Trần Mỹ Linh, người đã
tận tình hướng dẫn, chỉ bảo, giúp đỡ và hỗ trợ tơi trong suốt q trình học tập,
nghiên cứu và hồn thành tốt luận văn này.
Tôi cũng xin gửi lời cảm ơn chân thành tới Ths. Phan Minh Tuấn và các cán
bộ Phịng Phát triển Cơng nghệ y sinh, Trung tâm Phát triển công nghệ cao, Viện
Hàn lâm Khoa học và Cơng nghệ Việt Nam đã t ận tình giúp đỡ và hỗ trợ tôi trong
suốt thời gian thực hiện đề tài.
Tôi cũng xin gửi lời cảm ơn tới các cán bộ Phòng tài nguyên sinh vật và
Phòng nghiên cứu cấu trúc, Viện Hóa sinh biển, Viện Hàn lâm Khoa học và Cơng
nghệ Việt Nam đã nhiệt tình giúp đỡ tơi trong thời gian thu thập số liệu và vật liệu
nghiên cứu để thực hiện luận án.
Nhân dịp này tôi cũng xin bày tỏ lịng biết ơn tới các thầy cơ, bạn bè và gia
đình đã chỉ dẫn và giúp đỡ tôi trong suốt thời gian qua.
Xin chân thành cảm ơn.

Hà Nội, ngày tháng 1 năm 2016
Học viên

Lê Thành Long

download by :

MỤC LỤC
LỜI CẢM ƠN
MỤC LỤC
MỞ ĐẦU .................................................................................................................... 1
CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU.................................................................. 3
1.1 Giới thiệu chung về hải miên ............................................................................... 3
1.2 Đặc điểm cấu tạo và sinh lý .................................................................................. 4
1.3 Đặc điểm sinh sản và phát triển ............................................................................ 6
1.4 Đa dạng sinh học của hải miên ............................................................................. 6
1.4.1 Hệ thống phân loại hải miên ............................................................................. 6
1.4.2 Tình hình nghiên cứu về đa dạng sinh học và phát sinh chủng loại của hải
miên ............................................................................................................................ 7
1.5 Chỉ thị trong đánh giá đa dạng sinh học.............................................................. 12
1.6 Các chỉ thị DNA trong đánh giá đa dạng sinh học hải miên.............................. 14
CHƯƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ....................... 16
2.1 Vật liệu ............................................................................................................... 16
2.1.1 Đối tượng nghiên cứu ..................................................................................... 16
2.1.2 Hóa chất .......................................................................................................... 16
2.1.2 Trang thiết bị ................................................................................................... 17
2.2 Phương pháp nghiên cứu.................................................................................... 18
2.2.1 Phương pháp xử lý mẫu nghiên cứu ............................................................... 18
2.2.2 Phương pháp tách DNA tổng số từ hải miên .................................................. 18
2.2.3 Phương pháp PCR ........................................................................................... 19
2.2.4 Phương pháp điện di kiểm tra kết quả ............................................................ 20
2.2.5 Phương pháp xử lý trình tự nucleotide ........................................................... 20
CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ......................................................... 23
3.1 Kết quả tách chiết DNA tổng số ........................................................................ 23
3.2 Kết quả PCR và xác định trình tự các đoạn DNA chỉ thị .................................. 24

3.3 Phân tích đa dạng di truyền của các mẫu hải miên nghiên cứu ......................... 25
3.4 Cây phát sinh chủng loại .................................................................................... 30
CHƯƠNG 4: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ......................................................... 32
4.1 Kết luận .............................................................................................................. 32
4.2 Kiến nghị ............................................................................................................ 32
TÀI LIỆU THAM KHẢO ...................................................................................... 33
PHỤ LỤC ................................................................................................................. 36

download by :


CHỮ VIẾT TẮT VÀ KÍ HIỆU

CTAB

Cetyl Trimethyl Amoni Bromid

DNA

Deoxyribonucleic acid

rDNA 18S

Gen ribosome DNA 18S

ETDA

Ethylenediamine tetraacetic acid

PCR

Polymerase Chain Reaction

RAPD

Random Amplified Polymorphism DNA

RFLP

Restriction fragment length polymorphism

RNA

Ribonucleic acid

TAE

Tris Acetate EDTA

Taq

Thermus aquaticus

Tm

Nhiệt độ nóng chảy (Melting Temperatures)

UV

Ultraviolet (light)

download by :


DANH MỤC BẢNG
Bảng 1.1: So sánh một số đặc điểm cấu tạo giữa các lớp hải miên ........................... 7
Bảng 1.2: Số lượng loài hải miên qua các nghiên cứu tại Việt Nam ....................... 11
Bảng 2.1: Danh sách mẫu hải miên .......................................................................... 16
Bảng 2.2: Danh sách mẫu hải miên .......................................................................... 17
Bảng 2.3: Thành phần cho phản ứng PCR với thể tích 25µl ................................... 19
Bảng 2.4: Chu trình nhiệt phản ứng PCR ................................................................ 20
Bảng 2.5: Danh sách trình tự của một số các loài hải miên lưu trữ trên ngân hàng
Genbank ................................................................................................................... 21
Bảng 3.1: Độ tương đồng (%) giữa trình tự nucleoitde của các mẫu hải miên nghiên
cứu và các trình tự tham khảo tương ứng ................................................................ 25

download by :


DANH MỤC HÌNH
Hình 1.1: Sơ đồ các kiểu cấu tạo cơ thể của hải miên ............................................... 5
Hình 1.2: Sơ đồ Khu vực nghiên cứu tại Đảo Cồn Cỏ ............................................ 12
Hình 3.1: Kết quả điện di DNA tổng số của mẫu Hải miên .................................... 23
Hình 3.2: Ảnh điện di sản phẩm PCR mẫu hải miên bằng mồi 18S ........................ 24
Hình 3.3: Trình tự gen 18S mẫu hải miên ................................................................ 27
Hình 3.4: Cây phát sinh chủng loại của 6 mẫu hải miên và các trình tự tham khảo
dựa vào đoạn DNA chỉ thị trên rDNA 18S .............................................................. 30

download by :

MỞ ĐẦU
Ngành Porifera (được Grant phân loại năm 1836), tên thường gọi là hải
miên, là một trong những loài động vật biển có độ đa dạng cao nhất đồng thời đóng
vai trị quan trọng trong hệ sinh thái biển. Đặc biệt, hải miên được đánh giá là nhóm
sinh vật biển chứa nhiều hợp chất mới mang các hoạt tính sinh học liên quan y dược như chống ung thư, hỗ trợ điều trị thần kinh, tăng khả năng miễn dịch, giảm
đau, kháng virus, kháng vi sinh vật, vi khuẩn lao...
Việt Nam có nguồn tài nguyên sinh vật biển phong phú, đặc biệt là các lồi
hải miên. Tuy nhiên, chỉ có một số ít nghiên cứu về hải miên ở biển Việt Nam liên
quan tới thành phần loài và phân bố của hải miên tại các vùng biển thuộc vịnh Nha
Trang và vịnh Hạ Long. Gần đây, các nghiên cứu về thành phần hóa học của một số
lồi hải miên tại biển Việt Nam đã phân lập được nhiều hợp chất có cấu trúc mới và
nhiều hoạt chất có giá trị. Mặc dù vậy, hướng nghiên cứu về hải miên còn khá mới
mẻ, đáng chú ý là chưa có nghiên cứu nào ở mức độ sinh học phân tử hay đánh giá
đa dạng di truyền đối với hải miên ở biển Việt Nam. Từ trước tới nay, nghiên cứu
đa dạng loài hải miên mới dừng ở đa dạng hình thái. Số lượng loài hải miên tại Việt
Nam khá nhiều, nhiều loài có hình thái tương đối giống nhau; do vậy, các nghiên
cứu đánh giá đa dạng hải miên ở cấp độ sinh học phân tử sẽ góp phần tìm hiểu và
phát triển tiềm năng ứng dụng của hải miên. Do đó, vấn đề cấp thiết hiện nay là
phải phát huy được những giá trị và tiềm năng ứng dụng của hải miên bằng các
nghiên cứu thích hợp và có hệ thống.
Khu vực nghiên cứu được lựa chọn là Khu bảo tồn biển đảo Cồn Cỏ thuộc
tỉnh Quảng Trị. Đây là khu vực biển được đánh giá là một trong những vùng có
mức độ đa dạng sinh học biển khá cao ở Việt Nam, trong đó nhóm hải miên xuất
hiện phong phú cả về số lượng và thành phần loài.
Trên cơ sở đó, luận văn “Nghiên cứu đa dạng sinh học của Hải miên
(Porifera) tại Đảo Cồn Cỏ, tỉnh Quảng Trị” được thực hiện. Luận văn này có
mục tiêu bước đầu nghiên cứu phát triển các chỉ thị sinh học phân tử nhằm đánh giá
đa dạng di truyền và đa dạng sinh học, góp phần hỗ trợ cho việc định lồi một số
mẫu hải miên thu thập được ở tại Đảo Cồn Cỏ, tỉnh Quảng Trị.

1

download by :


Nội dung của luận văn gồm:
1. Tách chiết DNA tổng số từ các mẫu hải miên nghiên cứu.
2. Tối ưu hóa các điều kiện PCR để nhân dịng các đoạn DNA chỉ thị.
3. Đánh giá đa dạng di truyền của các mẫu hải miên nghiên cứu.

2

download by :


CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1 Giới thiệu chung về hải miên
Ngành Porifera (được Grant phân loại năm 1836), tên thường được gọi là hải
miên hay bọt biển, được tìm thấy trong hầu hết các môi trường nước, tuy nhiên, hải
miên sinh sống phổ biến và đa dạng nhất trong mơi trường biển. Theo Van Soest và
cộng sự, 2016, có 8701 loài hải miên được ghi nhận [20], được phân loại thành 4
lớp, trong đó lớp Demospongiae (được Sollas phân loại năm 1885) là lớp đa dạng
nhất, chiếm 80% số loài hải miên được biết cho tới nay. Hải miên được coi là động
vật đa bào chưa hoàn thiện (Parazoa). Hải miên là nhóm động vật sống bám, tuy
vậy một số lồi có khả năng vận động nhờ vào tế bào chất hay roi. Màu sắc, hình
dạng, kích thước cơ thể các loài hải miên rất đa dạng: loài bé nhất khoảng vài
milimét, lồi lớn nhất có thể tới hàng mét. Hải miên hầu như có mặt trên tồn thế
giới, sinh sống trong một loạt các môi trường dưới đại dương, từ các vùng cực đến
các vùng nhiệt đới [11]. Thường hải miên phân bố ở các vùng yên tĩnh, bởi vì trầm

tích khuấy động bởi sóng hoặc dịng sẽ chặn các lỗ chân lơng, làm cho chúng khó
khăn trong việc ăn và thở [7]. Phần lớn hải miên thường được tìm thấy trên bề mặt
vững chắc như đá, nhưng một số lồi có thể gắn vào trầm tích mềm mại [9].
Hải miên dồi dào hơn ở vùng biển ôn đới nhưng ít đa dạng hơn so với vùng
nhiệt đới, có thể vì các sinh vật con mồi của chúng phong phú ở vùng biển nhiệt đới
[11]. Hải miên thuộc lớp Hexactinellida (hải miên thủy tinh) là phổ biến nhất ở
vùng biển Bắc cực và các khu vực sâu của vùng biển ôn đới và nhiệt đới cơ thể hải
miên thủy tinh rất xốp cho phép trích xuất thực phẩm từ các vùng biển nghèo thức
ăn mà không cần phải hoạt động nhiều. Hải miên thuộc lớp Demospongiae và hải
miên lớp Calcarea (hải miên đá vôi) phong phú và đa dạng ở các vùng nước có độ
sâu ít hơn [14].

3

download by :


1.2 Đặc điểm cấu tạo và sinh lý
Hải miên được coi là động vật đa bào chưa hoàn thiện (Parazoa) vì có các
đặc điểm sau [3]:
-

Cơ thể đa bào nhưng chưa có mơ phân hóa. Có nhiều lỗ thủng trên thân,

trong thân có các khe, rãnh .
-

Đối xứng phóng xạ hay chưa có kiểu đối xứng ổn định.

-

Biểu bì có các tế bào gai dẹp, có lớp tế bào cổ áo làm nhiệm vụ dẫn nước

vào và đẩy nước ra.
-

Tầng trung gian khá dày có các tế bào amip và gai xương. Xương là canxi,

silic hay sợi collagen (spongin).
-

Chưa có miệng, tiêu hóa nội bào, bài tiết và hơ hấp bằng thẩm thấu.

-

Chưa có tế bào thần kinh, phản ứng với kích thích theo kiểu cảm ứng.

-

Sinh sản vơ tính bằng chồi hay mầm, sinh sản hữu tính bằng trứng và tinh

trùng. Phân hóa các lá phơi chưa ổn định, ấu trùng sống tự do.
Các lồi hải miên có hình dạng rất phong phú, trường hợp đơn giản nhất là
cơ thể có dạng một cái cốc, có đáy bám vào giá thể, đối diện với đáy là lỗ thoát
nước (osculum) thành cơ thể có nhiều lỗ thủng thơng nước (được gọi là ostium).
Nước từ ngoài vào xoang cơ thể qua ostium và thốt ra theo osculum. Nước vào
xoang khơng chỉ theo một ống thẳng mà có thể đi qua nhiều khoang khác nhau có
lát cắt tế bào cổ áo. Xoang cơ thể còn được gọi là xoang trung tâm hay xoang vị giả
(pseudogastrula). Tùy theo mức độ phức tạp của hệ ống dẫn nước và các phòng roi
lát bằng các tế bào cổ áo mà chia thành các kiểu cấu tạo cơ thể hải miên khác nhau

[3]. Có 4 kiểu cấu trúc cơ thể:
-

Kiểu ascon: có rãnh dẫn nước thơng trực tiếp với xoang.

-

Kiểu sycon: nước qua hốc lõm mới vào xoang vị giả.

-

Kiểu leucon: có hệ thống rãnh và hốc phức tạp.

-

Kiểu ragon: có hệ thống phức tạp hơn nhiều (ví dụ Leuconic aspera chỉ cao
7cm, dày 1cm nhưng có tới 20.000 khoang và 80.000 rãnh dẫn nước)

4

download by :


Hình 1.1: Sơ đồ các kiểu cấu tạo cơ thể của hải miên
Các loại tế bào của hải miên bao gồm : Thành cơ thể 2 lớp tế bào, giữa là
tầng trung giao (còn gọi là tầng keo – mesohyl). Lớp ngồi là biểu mơ dẹp, che chở
cho cơ thể. Lớp tế bào trong là tế bào cổ áo có roi (cổ áo của các tế bào cổ áo xem
dưới kính hiển vi điện tử thấy đó là vành ngun sinh chất gồm nhiều que tế bào
chất, ken dày với nhau). Roi của tế bào cổ áo hoạt động liên tục để đưa dòng nước
vào cơ thể hải miên. Khả năng lọc nước là rất lớn, với 1cm2 có thể lọc được 20 lít

nước trong một ngày. Tầng trung giao gồm nhiều loại tế bào: hình sao có chức phận
liên kết, gai xương có nhiệm vụ nâng đỡ, amip làm nhiệm vụ thực vào và hình
thành các loại tế bào khác khi cần biến đổi. Hoạt động sinh lý nhờ vào tế bào cổ áo
tạo dòng nước liên tục mang thức ăn và oxy qua các lỗ và thải ra theo osculum
(thức ăn gồm 4/5 là vụn bã hữu cơ, 1/5 là sinh vậy nhỏ). Trong xoang vị giả có các
tế bào amip thực bào. Ngồi ra có sự trợ giúp của các vi sợi quanh các lỗ [3].
Bộ khung CaCO3 hay SiO2 hoặc chất hữu cơ (sợi spongin) giống tơ tằm với
hàm lượng iơt cao (14%) có thể là nhiều trục hay một trục, xếp riêng lẻ hay từng bó.
Sợi spongin do nhiều tế bào hình thành, mỗi tế bào là một đoạn, từ các tấm spongin
có thể hủy từng đám tế bào để hình thành nên các lưới sợi.

5

download by :


1.3 Đặc điểm sinh sản và phát triển
Hải miên có cả 2 hình thức sinh sản vơ tính và hữu tính. Đối với sinh sản vơ
tính, có 3 cách là : phân mảnh, nảy chồi và bằng cách sản xuất gemmules. Những
mảnh vỡ của hải miên có thể tách ra bởi các dịng chảy và sóng. Chúng sử dụng các
tính di động của pinacocytes, choanocytes và tái định hình của mesohyl lại gắn
mình vào một bề mặt phù hợp và sau đó xây dựng lại bản thân như hải miên nhỏ
nhưng diễn ra theo một quá trình trong một vài ngày. Một mảnh hải miên chỉ có thể
tái sinh nếu nó chứa cả collencytes để sản xuất mesohyl và archeocytes để sản xuất
tất cả các loại tế bào khác [21]. Một số rất ít lồi sinh sản bằng cách nảy chồi [5].
Phần lớn hải miên lưỡng tính. Tế bào sinh dục được hình thành từ tế bào amip hay
tế bào cổ áo. Chúng ở trong tầng trung giao và nằm dưới các phịng roi. Tinh trùng
khi chín sẽ lọt vào phịng roi, theo dịng nước ra ngồi tìm cá thể khác để thụ tinh.
Sau đó hợp tử phát triển, hình thành phôi nang lưỡng cực (amphiblastula), tức là tế
bào phôi ở hai cực khác nhau [3].

Hải miên trong vùng ôn đới sinh sống ít nhất trong một vài năm, nhưng một
số lồi sống ở vùng nhiệt đới và cũng có thể ở những đại dương sâu có thể sống 200
năm hoặc hơn. Một số ít bị vơi hóa chỉ tăng 0.2 mm mỗi năm và nếu tỉ lệ đó là hằng
số thì vật mẫu có kích thước 1 m phải được khoảng 5000 năm tuổi. Một số loài hải
miên bắt đầu sinh sản hữu tính khi chỉ một vài tuần tuổi, trong khi những loài khác
chờ đợi cho đến khi vài năm tuổi [21].
1.4 Đa dạng sinh học của hải miên
1.4.1 Hệ thống phân loại hải miên
Hải miên được phân loại theo truyền thống thành ba lớp: lớp
Demospongiae, lớp Calcarea (hải miên đá vôi) và lớp Hexactinellida (hải miên thủy
tinh). Các nghiên cứu phát sinh chủng loại gần đây đã chỉ ra rằng trong lớp
Demospongiae có sự phân biệt về phát sinh loài nên người ta chia lớp này thành
Demospongiae và Homoscleromorpha. Hiện nay, Homoscleromorpha đã được các
nhà khoa học công nhận là lớp thứ tư của hải miên [5] [20].

6

download by :


Trong

bảng

thống

kê

hải

miên

(Catalogue

of

Life,

xác định
lớp Calcarea có 715 lồi (81 giống, 24 họ, 5 bộ); lớp Demospongiae có 7260 lồi
(916 giống, 99 họ, 23 bộ); lớp Hexactinellida có 618 lồi (194 giống, 20 họ, 5 bộ);
lớp Homoscleromorpha có 103 lồi (8 giống, 2 họ, 1 bộ).
Bảng 1.1: So sánh một số đặc điểm cấu tạo giữa các lớp hải miên
Calcarea

Hexactinellida Demospongiae Homoscleromorpha

Loại tế

Nhân đơn,

Lớp tế bào

Nhân đơn,

bào

màng đơn

ngoài là hợp

màng đơn bên

bên ngồi

bào

ngồi

CaCO3 (Có

Silica

Silica

Silica

1,3 hay 4

(6 tia)

(có 1 hay 4

(4 tia)

Gai

trục)
Sợi
Spongin

Khơng có

Bộ khung

Được làm

ngồi

bằng
CaCO3 nếu

Nhân đơn, màng đơn
bên ngồi

trục)
Khơng có

Ở nhiều lồi

Ở nhiều lồi

Khơng có

Ở một số lồi

Khơng có

có
Hình

Asconoid,

dáng cơ

syconoid,

thể

leuconoid

Syconoid,

Leuconoid

Leuconoid

Sylleibid hoặc
leuconoid

1.4.2 Tình hình nghiên cứu về đa dạng sinh học và phát sinh chủng loại của hải
miên


Các nghiên cứu ngoài nước:
Theo World Porifera Database (2016), có hơn 8700 lồi hải miên được ghi

nhận, trong đó lớp Demospongiae (được Sollas phân loại năm 1885) là lớp đa dạng

7

download by :


nhất, chiếm tới 80% số loài hải miên được biết cho tới nay. Nhiề u loài hải miên trên
thế giới còn chưa được phát hiện và thống kê do các nghiên cứu hiện nay chủ yếu
tập trung ở một số vùng biển lớn như khu vực biển Caribbean, Địa Trung Hải và
Châu Úc trong khi rất nhiều vùng biển khác như khu vực đơng nam Thái Bình
Dương, vùng biển Đơng Nam Á...vẫn chưa được khảo sát đầy đủ. Các công trình
mơ tả đầu tiên về hải miên ở biển Đơng được thực hiện vào những năm cuối của thế
kỷ 18 và giữa thế kỷ 19 từ các bộ sưu tập của các nhà buôn châu Âu và một số điều
tra khoa học khởi thủy. Cho đến gần đây, có khoảng 1500 loài hải miên đã được
xác định ở khu vực biển Đơng. Tuy nhiên, cịn nhiều lồi chưa được phát hiện và
định loại một cách rõ ràng [21].
Việc đặt Porifera vào đúng vị trí trong cây phát sinh chủng loại của các cơ
thể đa bào nói chung và động vật đa bào nói riêng là q trình nghiên cứu lâu dài và
khó khăn. Nhóm sinh vật này lúc đầu được xếp vào nhóm thực vật-động vật và sau
đó thuộc Zoophyta hoặc Mesozoa và cuối cùng Parazoa. Chỉ sau khi kỹ thuật sinh
học phân tử phát triển thì mới có thể đặt nhóm có đặc điểm hình thái thuộc nhóm
Porifera trở thành một giới duy nhất: Metazoa. Những bằng chứng đầu tiên là việc
phát hiện và tách được những phân tử gắn kết tế bào-tế bào và mạng lưới tế bào ở
trong hải miên. Các phân tử này có độ tương đồng cao về trình tự và có chức năng
tương tự với các phân tử tương đương ở metazoan. Phần lớn nghiên cứu hải miên
dựa vào hệ thống phân loại truyền thống theo đặc điểm hình thái bộ khung
(skeleton) của hải miên trên cơ sở các cơng trình được xuất bản từ những thế kỷ
trước [5]. Trong một số cơng trình gần đây, các nhà khoa học trên thế giới đã kết
hợp các đặc điểm sinh học khác vào hệ thống phân loại hải miên như các chỉ thị
sinh học phân tử, hóa sinh…trong đó các chỉ thị phân tử đã có đóng góp quan trọng
trong việc phát hiện những lồi mới, lồi khó phân biệt về hình thái cũng như làm
sáng tỏ mối quan hệ phát sinh chủng loại ở hải miên [20].

Những công bố khoa học về đa dạng của sinh vật biển trong một vài thập kỷ
qua cho thấy đa dạng sinh học biển, trong đó có hải miên chưa được đánh giá đúng
ở tất cả các cấp độ từ di truyền, loài, hệ sinh thái và quy mô (không gian và thời
gian). Hàng loạt các marker phân tử đã được dùng ở các mức độ khác nhau để giải

8

download by :


quyết quá trình phát sinh chủng loại của Porifera. Adams và cộng sự (1999) sử
dùng trình tự gen 18S rRNA để nghiên cứu mối quan hệ trong họ Porifera và tìm
thấy bằng chứng Demospongiae/Hexactinellida hình thành một nhóm riêng biệt và
Calcarea khơng thuộc vào nhóm này mà họp thành một nhánh với bộ Ctenophora.
McInerney và cộng sự (1999) xem xét tiềm năng của gen 18S và 28S rRNA khi
nghiên cứu bộ Astrophorida và phát hiện ra rằng vùng 700 bp ở đầu 5’ của 28S
rRNA có tiềm năng phân biệt ở mức độ họ và lồi của nhóm này, trong khi đoạn
gen 18S rRNA dài 1300 bp lại có mức độ đa dạng thấp . Alvarez và cộng sự (2000)
phân tích mối quan hệ họ hàng của họ Axinellidae sử dụng một phần trình tự gen
28S rRNA và số liệu về hình thái và thấy rằng các lồi trong họ Axinellidae đều có
cùng nguồn gốc (monophyly) theo số liệu hình thái và paraphyly theo số liệu phân
tử. Borchiellini và cộng sự (2001) đã cố gắng giải quyết trả lời câu hỏi là Porifera là
mono- hay là paraphyly sử dụng trình tự đầy đủ của gen 18S rDNA và chỉ ra rằng
Porifera là paraphyly. Vùng nối thứ nhất và thứ hai (internal transcribed spacer,
ITS-1 và ITS-2) giữa các gen 18S, 5,8 S và 28S ribosome RNA cũng đã được sử
dụng để nghiên cứu mối quan hệ trong và giữa các loài [22][6][16]. Ở các lồi động
vật khơng xương sống khác gen 12S rDNA cũng như 16S rDNA của ty thể đã được
sử dụng phân tích đa dạng sinh học và phát sinh chủng loại [8]. Tiểu đơn vị
cytochrome c oxidase I (COI) cũng đã được sử dụng làm marker phân tử cho nhiều
loài khác nhau từ động vật bậc thấp đến cao [17].

 Trong nước:
Những nghiên cứu về hải miên ở biển Việt nam cịn rất ít. Một vài cơng trình
được công bố như nghiên cứu của Lindgren, phát hiện của Dawydoff (trích dẫn bởi
Azzini và cộng sự, 2007), và những nghiên cứu trên bộ sưu tập hải miên ở Nha
Trang của Lévi (1961) và gần đây là cơng trình về nghiên cứu về hải miên “boring
sponges" [13]. Trong bảng thống kê hải miên ở biển Đông, Hooper và cộng sự
(2000) [12] xác định có khoảng 176 lồi hải miên thuộc lớp Demospongiae trong
đó có 129 lồi (được xác định ở mức độ loài) ở bờ biển của Việt Nam. Azzini và
cộng sự, (2007) [16] phát hiện tổng số có 63 loài Demosponge ở các đảo của Vịnh
Hạ Long. Trong số đó, có 36 lồi được xác định lồi hồn chỉnh và 23/36 loài lần

9

download by :


đầu tiên phát hiện có mặt ở bờ biển Việt nam. Dựa trên cơ sở các tài liệu đã công bố
từ năm 1952 đến nay, Thái Quang Minh (2013) [18], đã thống kê tổng cộng 299
loài (124 giống, 65 họ, 18 bộ và 4 lớp) được ghi nhận có mặt tại Việt Nam, chủ yếu
khảo sát ở khu vực biển Vịnh Hạ Long và Vịnh Nha Trang. Lớp Demospongiae
chiếm 94% với 281 loài (46 họ, 12 bộ). Trong số này, chỉ có 181 lồi được xác định
tên khoa học đầy đủ, các lồi cịn lại chỉ được xác định ở mức độ trên lồi (giống,
họ), cần có thêm phân tích về hình thái hoặc kết hợp với các chỉ thị khác như hóa
học, sinh học phân tử [18]. Các lồi hải miên thường gặp ở biển Việt Nam thuộc
lớp Demospongiae với 12 họ sau: Niphatidae, Halichondriidae, Desmacellidae,
Microcionidae, Axinellidae, Chalinidae, Ianthellidae, Irciniidae, Mycalidae,
Petrosiidae, Spongiidae, Thorectidae. Đáng chú ý là các công bố về hải miên ở Việt
Nam đều tập trung vào hải miên thu thập ở các rạn san hô và đảo thuộc vịnh Nha
Trang (miền Nam Việt Nam) và vịnh Hạ Long (miền Bắc Việt Nam) mà chưa có
cơng bố mang tính hệ thống về thành phần các lồi hải miên ở khu vực biển miền

Trung Việt Nam. Trên thực tế, các nhà khoa học ước tính cịn nhiều lồi hải miên ở
Việt Nam chưa được phát hiện và định loại một cách rõ ràng.
Các đợt điều tra khảo sát sinh vật biển trong những năm gần đây của các nhà
khoa học thuộc Viện Tài nguyên và Môi trường biển và Viện Hải dương học tại
một số vùng biển như đảo Cát Bà, Côn Đảo, Trường Sa, vịnh Hạ Long...) cho thấy
hải miên xuất hiện khá đa dạng về thành phần lồi và có trữ lượng lớn. Chẳng hạn
như, 6 loài hải miên (Gellius varius, Dysidea cinerea, Haliclona subarmigera,
Mycale plumosa, Ircinia echinata, Amorphinopsis excavans) được phát hiện ở khu
vực đông nam đảo Cát Bà; 5 loài (Clathria vulpine, Petrosia nigricans,
Xestospongia testudinaria, Stylissa flabelliformis, Gellius var fibrosa) được xác
định ở vùng biển quanh đảo Cơn Đảo và 3 lồi (Petrosia nigricans, Ianthella basta,
Xestospongia testudinaria) ở vùng biển đảo Trường Sa. Các loài này thường phân
bố chủ yếu trong các rạn san hô, vùng ven biển và xung quanh các đảo vùng biển
Việt Nam.

10

download by :


Bảng 1.2: Số lượng loài hải miên qua các nghiên cứu tại Việt Nam
Tác giả

Địa điểm

Lồi

Lồi

(được thống kê)

(được mơ tả cụ thể)

Lindgren (1898)

Nha Trang

20

Lévi (1961)

Nha Trang

28

Tran Ngoc Loi,

Nha Trang

6

Việt Nam

160

142

Việt Nam

176

129

Nha Trang

89

Hạ Long

63 (demosponge)

Azzini và cộng sự

Vịnh Hạ

63 (demosponge)

(2007)

Long

Thái Quang Minh

Việt Nam

24

Tran Dinh Nam
(1965)
Nguyen Van Chung

và cộng sự (1978)
Hooper và cộng sự
(2000)
Chervyakova
(2007)
Pansinie và cộng sự
(2007)
23*/36

299

(2013)
Chú thích: * : Lồi lần đầu tiên phát hiện ở Việt Nam
1.4.3 Giới thiệu về Khu bảo tồn biển đảo Cồn Cỏ.
Đảo Cồn Cỏ, tỉnh Quảng Trị là Khu bảo tồn biển thứ 4 của Việt Nam, có
tổng diện tích 4.532 ha, được chia thành 3 phân khu: phân khu bảo vệ nghiêm ngặt,
phân khu phục hồi sinh thái và phân khu phát triển. Toàn bộ khu vực này có hệ sinh
vật biển vơ cùng phong phú, dồi dào cả về trữ lượng và thành phần loài sinh vật,
đặc biệt là các loài hải miên. Các nghiên cứu về hải miên ở Đảo Cồn Cỏ bước đầu
đã thu thập được một số mẫu hải miên như: Xestospongia testudinaria, Niphates

11

download by :


sp., Spongia sp., Stylissa flabelliformis …. Việc nghiên cứu tính đa dạng sinh học
và đánh giá đa dạng di truyền của các loài hải miên thuộc Khu bảo tồn biển Đảo
Cồn Cỏ có ý nghĩa quan trọng, sẽ góp phần nâng cao giá trị đa dạng sinh học của
các loài hải miên ở Việt Nam.

Hình 1.2: Sơ đồ Khu vực nghiên cứu tại Đảo Cồn Cỏ
1.5 Chỉ thị trong đánh giá đa dạng sinh học
Đa dạng sinh học là thuật ngữ thể hiện tính đa dạng của các thể sống, lồi và
quần thể, tính biến động di truyền giữa chúng trong các quần xã và hệ sinh thái. Đa
dạng sinh học được thể hiện ở ba cấp độ: đa dạng di truyền, đa dạng về loài và đa
dạng về hệ sinh thái [1]. Đa dạng di truyền được cho là sự khác biệt của các đặc
tính di truyền giữa các quần thể và giữa các cá thể trong một loài hay một quần thể.
Đa dạng loài chỉ mức độ phong phú về số lượng loài hoặc loài phụ trên quả đất, ở
một vùng địa lý, trong một quốc gia hay trong một sinh cảnh nào đó [1].
Đa dạng di truyền có vai trị và ý nghĩa hết sức quan trọng đối với nghiên
cứu sinh học và phát triển bền vững nguồn tài nguyên thiên nhiên. Từ những kết
quả đánh giá đa dạng di truyền, các nhà khoa học có thể quy hoạch và bảo tồn các

12

download by :


nguồn gen quý nhằm duy trì đa dạng sinh học hoặc hỗ trợ quá trình chọn tạo giống.
Nghiên cứu đa dạng sinh học đã được thực hiện từ khá lâu với nhiều cách tiếp cận
khác nhau chẳng hạn như thông qua các dữ liệu kiểu hình (chỉ thị hình thái), thành
phần protein và hoạt chất (chỉ thị hóa sinh) hay sự khác biệt (đa hình) trong DNA
(chỉ thị DNA). Mỗi loại chỉ thị đều có những ưu - nhược điểm , lựa chọn chỉ thị
đánh giá phụ thuộc vào mục đích của từng nghiên cứu.
 Chỉ thị hình thái:
Nghiên cứu đa dạng sinh học dựa trên chỉ thị hình thái là phương pháp đánh
giá thơng qua các đặc điểm hình thái (hình dạng, kích thước, đặc điểm các bộ
phận). Với ưu điểm là dễ dàng tiếp cận, khơng địi hỏi các thiết bị đắt tiền cũng như
quy trình phức tạp. Tuy nhiên, việc sử dụng chỉ thị hình thái có những hạn chế như

số lượng các chỉ tiêu hình thái có hạn, sự tác động của mơi trường, phụ thuộc vào
giai đoạn nhất định của quá trình phát triển; mang tính chất thống kê nên cần thực
hiện với số lượng lớn, có nhiều tính trạng do đa gen quy định mà khơng phải tồn
bộ gen đều biểu hiện ra kiểu hình để có thể đánh giá được [2].
 Chỉ thị sinh hóa:
Protein và các hoạt chất trao đổi khác là sản phẩm của quá trình biểu hiện
gen ở sinh vật. Nghiên cứu sự khác biệt trong thành phần của các sản phẩm này có
thể giúp xác định những khác biệt về mặt di truyền giữa các cá thể và loài khác
nhau. Bush và cộng sự, (1978) khẳng định điện di protein là phương pháp hữu hiệu
có thể giúp phân biệt, nhận diện giữa các loài và phân loại sinh vật.
Chỉ thị sinh hố là loại chỉ thị có bản chất là đa hình protein, bao gồm chỉ thị
isozyme và các loại protein dự trữ. Chỉ thị protein và chỉ thị enzyme thuộc loại
đồng trội có độ tin cậy cao. Tuy nhiên, do số lượng không nhiều và sự biểu hiện
chúng phụ thuộc vào giai đoạn sinh trưởng và phát triển của cá thể, nên các chỉ thị
protein và isozyme được ứng dụng tương đối hạn chế. [2]
 Chỉ thị phân tử DNA

13

download by :


Từ thập kỷ 80 của thế kỷ trước, các kỹ thuật chỉ thị DNA được bắt đầu và
phát triển nhanh chóng trở thành lĩnh vực quan trọng trong sinh học phân tử. Các
chỉ thị DNA được sử dụng rộng rãi trong nghiên cứu và chọn lọc. Các chỉ thị DNA
được xây dựng để phát triển các chỉ thị DNA cho nghiên cứu đa dạng di truyền,
phát sinh loài, phân loại, đánh dấu và xác định gen.
Chỉ thị phân tử ADN có thể là một gen hoặc những đoạn ADN đặc hiệu, có
tính ổn định cao và có thể xác định trong tất cả các loại mơ với độ chính xác cao mà
không bị ảnh hưởng bởi điều kiện của môi trường. Các chỉ thị này đã được ứng

dụng và mang lại những kết quả đáng tin cậy, có giá trị khơng chỉ với nghiên cứu
đa dạng di truyền mà cịn với nhiều lĩnh vực công nghệ sinh học khác.
Chỉ thị phân tử được chia làm hai nhóm chính: i) Chỉ thị dựa trên cơ sở
nguyên lý lai ADN: chỉ thị RFLP và ii) Chỉ thị dựa trên cơ sở nhân bản ADN bằng
kỹ thuật PCR: RAPD, AFLP, SSR,...).
1.6 Các chỉ thị DNA trong đánh giá đa dạng sinh học hải miên
Porifera là một trong số những động vật nguyên sinh khó xác định. Hầu hết
các lồi hải miên khơng có cuống, phát triển trên nền cứng và sống ở đó trong suốt
cuộc đời, điều này lý giải tại sao các nhà nghiên cứu lúc đầu xem hải miên giống
thực vật hơn so với động vật. Mặc dù cấu trúc đơn giản nhưng hải miên rất đa dạng
về hình dạng và kích thước, tùy thuộc vào hình dạng và thành phần của bộ khung
(skeleton) tạo thành từ các tế bào và mạng lưới collagen. Hiện nay, nhiều vấn đề về
sinh học của hải miên vẫn chưa được tìm hiểu rõ, như sự phát sinh chủng loại và
tiến hóa, q trình phát triển và sinh sản, cơ chế phân tử của quá trình sinh tổng hợp
các hợp chất thứ cấp, đáp ứng với biến đổi của môi trường...
Nhiều chỉ thị phân tử (chỉ thị DNA) đã được sử dụng ở các mức độ khác
nhau để tìm hiểu quá trình phát sinh chủng loại của hải miên, nghiên cứu mối quan
hệ trong và giữa các lồi hay [19][15] [10]. Có thể liệt kê 3 nhóm chỉ thị phân tử
như sau:

14

download by :


- Trình tự trên ribosome DNA: 18S, 28S, vùng nối thứ nhất và thứ hai: ITS-1
và ITS-2 (internal transcribed spacer) giữa các gen 18S; 5,8S và 28S rRNA.
- Trình tự DNA ty thể gồm gen COI (cytochrome oxidase subunit I) và tồn
bộ hệ gen ti thể.
- Trình tự các gen giữ nhà (nuclear housekeeping genes).

15

download by :


CHƯƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1 Vật liệu
2.1.1 Đối tượng nghiên cứu
Các mẫu hải miên được thu thập sử dụng hệ thiết bị lặn SCUBA ở độ sâu từ
5-8 m vào tháng 5/2012 tại Khu bảo tồn biển Đảo Cồn Cỏ, tỉnh Quảng Trị. Các mẫu
nghiên cứu được các chuyên gia thuộc Viện Tài nguyên và Môi trường biển và
Viện Hải dương học, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam xác định tên
khoa học dựa vào phân tích hình thái; các tiêu bản được lưu giữ tại Viện Hóa sinh
biển, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam. Danh sách các mẫu nghiên
cứu và tọa độ nơi khảo sát thu mẫu được liệt kê ở bảng 2.1. Các mẫu được rửa sạch
với nước cất và bảo quản trong đá lạnh trên tàu, sau đó bảo quản lâu dài ở -80oC.
Bảng 2.1: Danh sách mẫu hải miên
STT

Ký hiệu mẫu

Tên

Tọa độ thu mẫu

1

CC12

Mycale laevis

17o09’07’’N-107o119’35’’E

2

CC13

Biemna sp.

17o09’29’’N-107o20’53’’E

3

CC34

Hyrtios eretus

17o09’04’’N-107o20’39’’E

4

CC40

Dictyonella pelligera

17o09’04’’N-107o20’39’’E

5

CC46

Niphates sp.

17o09’04’’N-107o20’39’’E

6

CC48

Erylus formolus

17o09’07’’N-107o119’35’’E

2.1.2 Hóa chất
Agarose (Sigma)
Bộ kit tinh sạch DNA tổng số (Fermentas)

16

download by :


Bộ kit tinh sạch sản phẩm PCR (Fermentas)
Bộ kit dùng cho phản ứng PCR (Roche)
Các mồi cho phản ứng PCR đặt của (Sigma)
Nitơ lỏng
Proteinase K (Fermentas)
Sobitol
Dung dịch: Phenol: Chloroform: Isoamyl alcohol (25:24:1)

Dung dịch : Chloroform: Isoamyl alcohol (24:1)
Etanol (Fermentas)
RNase A (Fermentas)
H2O vô trùng (Fermentas)
Marker 1 kb (Fermentas)
2.1.2 Trang thiết bị
Bảng 2.2: Danh sách mẫu hải miên
Ứng dụng

Thiết bị

Hãng sản xuất

Ly tâm

Centrifuge 5415R

Eppendorf CHLB Đức

Cân

Vibra GS 203

Japan

Điện di

Điện di Agarose

Bio-rad

10µl, 20 µl, 100 µl, 200 µl,

Pipetman

1ml

Eppendorf

Khử trùng

HVE-50

Hirayama, Nhật Bản

PCR

PCR 9700

(Applied, Biosystem).

Vortex

Rotolab, OSI

17

download by :

Bể ổn nhiệt Julabo TW12

Germany

Lị vi sóng

Samsung

Ổn/gia nhiệt

Tủ lạnh sâu – 750C, Tủ
lạnh -200C

Tủ lạnh

Chụp ảnh

Sanyo, Nhật Bản

Tủ lạnh thường

Sanyo, Nhật Bản

Máy soi chụp ảnh gel

Phamarcia

Tủ cấy

Sanyo, Nhật Bản

2.2 Phương pháp nghiên cứu
2.2.1 Phương pháp xử lý mẫu nghiên cứu
Mẫu hải miên được xử lý theo trình tự như sau:
- Chuẩn bị các ống nhựa 50 ml (ống corning) được ghi kí hiệu thứ tự tương ứng
với các mẫu. Rửa sạch các mẫu bằng nước sạch rồi cho vào các ống corning tương
ứng.
- Rót nước biển vào các ống corning sao cho ngập mẫu. Để ngâm mẫu ít nhất 3
giờ tại nhiệt độ phòng.
- Đổ nước biển, rửa lại mẫu nhiều lần dưới vịi nước chảy.
- Phơi khơ mẫu ở nhiệt độ phịng trên giấy thấm.
- Các mẫu khơ được bảo quản trong ống corning sạch có silicagel hút ẩm.
2.2.2 Phương pháp tách DNA tổng số từ hải miên
+ Dùng chày cối sứ đã khử trùng nghiền 1 mảnh mẫu có kích thước 2 cm3 trong
nitơ lỏng cho tới khi thành bột mịn, sau đó chuyển sang ống eppendorf 2 ml.
+ Rửa lại 2 lần với dung dịch rửa(100 mM Tris HCl, pH 8.0; 300 mM Sorbital, 5
mM EDTA, pH 8.0; 0.5% NaH2PO4)

18

download by :


+ Sau đó thêm 1ml lysis buffer (2% CTAB; 100 mM Tris HCl, pH 8.0; 1.5 M
NaCl; 20 mM EDTA, pH 8.0; 0.1% β-mercaptorthanol) và 40 µl Proteinase K (20
mg/ml). Sau đó ủ ở bể ủ nhiệt 65oC trong 1 giờ.
+ Sau đó DNA tổng số sẽ được tủa với isopropanol, rửa lại với cồn 70% và hòa lại
DNA bằng nước tinh khiết khử ion vô trùng .
2.2.3 Phương pháp PCR
Phản ứng PCR bao gồm nhiều thành phần khác nhau trong một chu trình

nhiệt, các thành phần này đều ảnh hưởng đến kết quả PCR. Bên cạnh các yếu tố về
độ đặc hiệu của mồi nhân, thành phần phản ứng, chu trình nhiệt, nồng độ và độ tinh
sạch của DNA khn đóng vai trị quyết định sự thành cơng của phản ứng PCR.
Sản phẩm DNA tổng số tách chiết ở quy trình trên được tinh sạch bằng kit tinh sạch
Wizard SV Gel and PCR clean-up System (Promega) để đảm bảo độ tinh sạch cho
phản ứng PCR. Nồng độ DNA tổng số sau khi được xác định bằng máy Nanodrop
(Thermo), được pha lỗng bằng nước cất vơ trùng tới nồng độ 50 ng/µl. Thành phần
phản ứng và chu trình chạy PCR được thể hiện ở Bảng 2.3 và 2.4.
Bảng 2.3: Thành phần cho phản ứng PCR với thể tích 25µl
Thành phần phản ứng

Nồng độ đầu

Nồng độ cuối

Thể tích

Dream buffer

10X

1X

2.5µl

MgCl2

25mM

0.5mM

0.5µl

dNTPs

10mM

0.8mM

2 µl

Mồi xi (F)

10 pmol/µl

0.2 pmol/µl

0.5 µl

Mồi ngược(R)

10 pmol/µl

0.2 pmol/µl

0.5 µl

Dream Taq DNA-

5U/ µl

0.1 U/ µl

0.5 µl

100 ng/ µl

10 ng/ µl

1 µl

polymerase
DNA khuôn

19

download by :