(LUẬN văn THẠC sĩ) nghiên cứu ảnh hưởng của a mangostin từ vỏ quả măng cụt (garcinia mangostana l ) lên vi khuẩn streptococcus mutans trên biofilm và định hướng ứng dụng

Bạn đang xem bản rút gọn của tài liệu. Xem và tải ngay bản đầy đủ của tài liệu tại đây (2.37 MB, 79 trang )

VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM
VIỆN SINH THÁI VÀ TÀI NGUYÊN SINH VẬT
------*****------

NGUYỄN VŨ ANH

NGHIÊN CỨU ẢNH HƢỞNG CỦA αMANGOSTIN TỪ VỎ QUẢ MĂNG CỤT
Garcinia mangostana L. LÊN VI KHUẨN
Streptococcus mutansTRÊN BIOFILM VÀ ĐỊNH
HƢỚNG ỨNG DỤNG
Chuyên ngành: Sinh học thực nghiệm
Mã số: 60420114

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC SINH HỌC

Người hướng dẫn khoa học: TS. NGUYỄN THỊ MAI PHƢƠNG

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN

download by :

HÀ NỘI - 2015

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN

download by :

LỜI CẢM ƠN
---------------

Trong quá trình thực hiê ̣n luận văn khoa học , tôi đã nhận được r ất nhiều sự
giúp đỡ, khích lệ và động viên của các Thầy, Cô giáo, các bạn đồng nghiệp, bạn bè
và những người thân trong gia đình. Qua đây, tơi xin được gửi lời cảm ơn sâu sắ c
của mình đế n những cá nhân và tập thể đã hế t lòng giúp đỡ để tơi có th

ể hoàn

thành bản ḷn văn này.
Trước hế t , tơi xin bày tỏ

lịng biết ơn sâu sắc tới TS

. Ngũn Thi ̣ Mai

Phương, phịng Sinh hóa Thực vật , Viê ̣n Công nghê ̣ sinh học , Viê ̣n Hàn lâm Khoa
học và Công nghệ Viê ̣t Nam đã tận tình hướng dẫn trong suố t quá trình học tập và
thực hiê ̣n nghiên cứu.
Tôi xin chân thành cảm ơn các cán bộ nghiên c ứu của phòng Sinh hóa thực
vật, Viê ̣n Cơng nghê ̣ sinh học , Viê ̣n Hàn lâm Khoa h ọc và Công nghệ Viê ̣t Nam ,
ban lãnh đạo Viện Công nghệ sinh họcđã nhiê ̣t tình giúp đỡ và tạo điề u kiê ̣n thuận
lợi để tôi hoàn thành bản luận văn này.
Cuố i cùng , tôi xin cảm ơn gia đình thân yêu , bạn bè , người thân và đ ồng
nghiệp - những người đã luôn luôn ở bên tôi, luôn động viên , khích lệ và là chỗ
dựa vững chắ c cho tôi trong suố t quá trình học tập và nghiên cứu.

Hà Nội, 18tháng 12 năm 2015
Học viên

Nguyễn Vũ Anh

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN

download by :

CÁC THUẬT NGỮ VIẾT TẮT
EPS

exopolysaccharide

GTF

glucosyltransferase

HPLC

high performance liquid chromatography

NMR

nuclear magnetic resonance

NSM

nước súc miệng

PTS

sugar-phosphotransferase system

TLC

thin layer chromatography

TSA

tryptic soy agar

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN

download by :

MỤC LỤC

MỞ ĐẦU ........................................................................................................... 1
Chƣơng 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU .............................................................. 4
1.1. Bệnh sâu răng và vi khuẩn Streptococus mutans ................................. 4
1.1.1. Bệnh học sâu răng............................................................................. 4
1.1.1.1 Nguyên nhân gây sâu răng.............................................................. 4
1.1.1.2. Mảng bám răng (dental plaque) ..................................................... 5
1.1.1.3. Cơ chế gây sâu răng ...................................................................... 6
1.1.1.4. Vi khuẩn Streptococcus mutans ...................................................... 7
1.1.2. Tình hình bệnh sâu răng trên thế giới và Việt Nam ........................... 9
1.1.3. Các biện pháp ngăn ngừa sâu răng .................................................. 10
1.1.3.1. Sử dụng chất kháng khuẩn ........................................................... 10
1.1.3.2. Sử dụng chất thay thế đường ........................................................ 12
1.1.3.3. Liệu pháp thay thế (replacement therapy) ................................... 12
1.1.3.4. Vacxin .......................................................................................... 13

1.1.3.5. Kiể m soát sự hình thành biofilm.................................................. 13
1.2. Một số cơ chế thích nghi acid của vi khuẩn xoang miệng.................. 15
1.2.1. Bơm proton F-ATPase .................................................................... 16
1.2.2. Sự thay đổi của màng tế bào vi khuẩn khi thích nghi acid .............. 17
1.2.3. Sự sinh các chất kiềm ..................................................................... 18
1.2.3.1. Urease ......................................................................................... 18
1.2.3.2. Hệ thống arginin deiminase (ADS) .............................................. 19
1.3. Giới thiệu về cây măng cụt .................................................................. 20
1.3.1. Đặc điểm sinh học .......................................................................... 20
1.3.2. Các chất xathone trong măng cụt .................................................... 20
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN

download by :

1.3.3. Sinh tổng hợp các chất xanthone ..................................................... 21
1.3.4. Tác dụng sinh học của các chất xanthone trong cây măng cụt ......... 23
1.3.4.1. Hoạt tính kháng khuẩn ................................................................. 23
1.3.4.2. Hoạt tính kháng nấm.................................................................... 23
1.3.4.3. Tác dụng chống oxi hóa ............................................................... 23
1.3.4.4. Tác dụng chống viêm (anti-inflamation) ...................................... 24
1.3.4.5. Hoạt tính chống ung thư .............................................................. 24
Chƣơng 2 : NGUYÊN LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP ..................................... 25
2.1. Chủng vi sinh vật và các điều kiện nuôi cấy ....................................... 26
2.2. Nguyên liệu thực vật ............................................................................ 26
2.3. Hóa chất và thiết bị .............................................................................. 26
2.4. Phƣơng pháp nghiên cứu .................................................................... 27
2.4.1. Các phương pháp nghiên cứu tế bào ............................................... 27
2.4.1.1. Chuẩn bị dịch tế bào .................................................................... 27
2.4.1.2. Đo mức độ sinh acid của tế bào (pH drop) .................................. 27

2.4.2. Các phương pháp xác định hoạt đô ̣ enzyme .................................... 28
2.4.2.1. Chuẩn bị tế bào thấm ................................................................... 28
2.4.2.2. Xác định hoạt đợ enzyme phosphoryl hóa đường (PTS) ............... 28
2.4.2.3. Xác định hoạt độ enzyme F – ATPase .......................................... 29
2.4.2.4. Xác định hoạt độ enzyme glucosyltransferase (GTF) .................. 29
2.4.3. Các phương pháp nghiên cứu về biofilm......................................... 30
2.4.3.1. Tạo biofilm .................................................................................. 30
2.4.3.2. Xác đi ̣nh thành phầ n biofilm ........................................................ 31
2.4.3.3. Quan sát cấu trúc biofilm dưới kính hiển vi huỳnh quang quét lase
.. ............................................................................................................... 31
2.5. Đánh giá sƣ̣ tích lũy của α-mangostin trên biofilm ............................ 32
2.6. Tinh sạch hoạt chất khoáng khuẩn S. mutans từ vỏ quả măng cụt... 32
2.6.1. Tách các hợp chất polyphenol bằng phương pháp sắc ký lớp mỏng
(TLC) ....................................................................................................... 32
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN

download by :

2.6.2. Phân tích cấu trúc hóa học bằng cộng hưởng từ hạt nhân (NMR) ... 33
2.7. Xử lý số liệu .......................................................................................... 33
Chƣơng 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ...................................................... 34
3.1. Nghiên cứu quy trình chiết xuất α-mangostin từ vỏ quả măng cụt .. 34
3.1.1. Tách chiết phân đoạn có chứa -mangostin từ vỏ quả măng cụt ..... 34
3.1.2. Tinh sạch -mangostin từ vỏ quả măng cụt .................................... 36
3.1.2.1. Lựa chọn hê ̣ dung môi thích hợp để chạy cột sắ c ký silica gel ..... 36
3.1.2.2. Tinh sạch -mangostin trên cột sắc ký silica gel sử dụng hệ dung
môi n-hexane: acetone (3:1) ..................................................................... 37
3.2. Đánh giá tác dụng kháng khuẩn của α-mangostin lên S. mutans trên
biofilm ......................................................................................................... 44

3.2.1. -mangostin ức chế sự sinh acid của vi khuẩn
S. mutans trên
biofilm… .................................................................................................. 44
3.2.1.1. Ức chế sự giảm pH của môi trường ............................................. 44
3.2.1.2. -mangostin ức chế hoạt tính enzyme liên quan đến quá trình sinh
và chống chịu acid F-ATPase và PTS ....................................................... 45
3.2.2. Đánh giá tác dụng ức chế sự hiǹ h thành biofilm của vi khuẩ n
S .
mutans ...................................................................................................... 48
3.2.2.1. -mangostin ức chế sự sinhtổng hợp EPS ngoại bào ................... 48
3.2.2.2. -mangostin làm thay đổi cấu trúc biofilm của S. mutans............ 49
3.2.2.3. -mangostin ức chế hoạt tính các enzyme GTF liên quan đ ến sự
hình thành biofilm của vi khuẩn S. mutans ............................................... 51
3.3. Khả năng giết vi khuẩn trên biofilm của α-mangostin ...................... 52
3.4. Khả năng tích lũy của α-mangostin trên biofilm ............................... 53
3.4.1. Bước đầ u đánh giá tác du ̣ng chống sâu răng của dung dịch nước súc
miệng có chứa α-mangostin ...................................................................... 54
3.4.1.1. Khả năng ức chế sự sinh acid ...................................................... 54
3.4.1.2. Khả năng ức chế sự hình thành biofilm (mảng bám răng)............ 55
Chƣơng 4. KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ .......................................................... 57
TÀI LIỆU THAM KHẢO.............................................................................. 58
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN

download by :

PHỤ LỤC........................................................................................................ 67

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN

download by :

DANH MỤC CÁC BẢNG SỬ DỤNG TRONG LUẬN VĂN
Trang
Bảng 1. Cơng thức hóa học một số xanthone có trong vỏ quả măng cụt

21

Bảng 2.Độ sạch của chế phẩ m α-mangostin so với chấ t chuẩ n

40

Bảng 3. Độ sống sót của S. mutans trên biofilm được xử lý với -mangostin53
Bảng 4. Khả năng tích lũy của α-mangostin trên biofilm của vi khuẩ n S.
mutans53
Bảng 5. Khả năng ức chế sự sinh a cid của S. mutans trên biofilm của các dung
dịch nước súc miệng 55
Bảng 6. Ảnh hưởng của NSM chứa α-mangostin lên sự tić h lũy sinh khố i
biofilm của vi khuẩ n S. mutans56

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN

download by :

DANH MỤC CÁC HÌNH SỬ DỤNG TRONG LUẬN VĂN
Trang
Hình 1.1.Cấu trúc của răng

4

Hình 1.2. Ba giai đoạn chính hình thành mảng bám răng

6

Hình 1.3. Vi khuẩn Streptococcus mutans

8

Hình 1.4. Quả măng cụt (Garcinia mangostana L.)
Hình 1.5. Quá trình hình thành xanthone trong thực vật

20
22

Hình 2.1. Mơ hình ta ̣o biofilm S. mutans trên bề mă ̣t điã hydroxyapatite 31
Hình 3.1. Sắc ký đồ phân đoạn chiết vỏ quả măng cụt trong ethanol và n-hexane
sử dụng phương pháp sắc ký lớp mỏng
36
Hình 3.2. Sắc ký đồ phân đoạn n-hexane sử dụng phương pháp sắc ký lớp mỏng
37
Hình 3.3. Sắc ký cột silica gel phân đoạn chiết n-hexane của vỏ quả măng cụt
với hệ dung môi rửa chiết n-hexane: acetone theo tỉ lệ (3:1)
38
Hình 3.4.A. Sắc ký đồ α-mangostin tinh sa ̣ch từ v ỏ quả măng cụt với hệ dung
môi Hexane: acetone (3:1 v/v)
38
Hình 3.4.B. Sắc ký đồ α-mangostin tinh sa ̣ch từ vỏ quả măng cụt với hệ dung
môi TEAF (5:3:1:1 v/v)

38
Hình 3.5. Phổ HPLC của chất tinh sạch (A) so với chấ t chuẩ n (B) sau khi qua
cột sắc ký silica gel đo trên máy LC-MSD-Trap-SL
39
Hình 3.6. Phổ Proton (A) và 13C (B) của chất -mangostin đo trên máy NMR
Bruker, Avance 500
42
Hình 3.7. Cấu trúc hóa học của -mangostin (C24H26O6)

43

Hình 3.8. Sơ đồ qui trình tinh sạch -mangostin từ vỏ quả măng cụt 43
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN

download by :

Hình 3.9. -mangostin ức chế sự sinh acid của vi khuẩn S. mutanstrên bioflm
45
Hình 3.10. Ảnh hưởng của -mangostin lên hoạt độ F-ATPase và PTS củaS.
mutans trên biofilm
46
Hình 3.11. Ảnh hưởng của -mangostin lên sinh khố i biofilm của vi kh̉ n S.
mutans
49
Hình 3.12. -mangostin 150 µM làm thay đổi cấu trúc biofilm của S. mutans
50
Hình 3.13. -mangostin 150µM ảnh hưởng đế n hoa ̣t độ GTF củaS. mutans
51
Hình 3.14. Chế phẩ m nước súc miê ̣ng chứa α-mangostin từ vỏ quả măng cu ̣t

54

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN

download by :

Luận văn Thạc sỹ Khoa học

Nguyễn Vũ Anh

MỞ ĐẦU
Sâu răng là một trong những bệnh răng miệng phổ biến nhất hiện nay và
đang có xu hướng ngày một tăng lên ở các nước đang phát triển. Tổ chức Y tế
thế giới đã c ảnh báo về mức độ phổ bi ến của bê ̣nh này ch ỉ sau các bệnh tim
mạch và ung thư [5]. Theo số liệu mới nhất (2015) của Hội Răng Hàm Mặt Việt
Nam, thực tế có tới hơn 90% dân số Việt Nam đang đối mặt với các vấn đề về
răng miệng, trong đó phổ biến nhất là sâu răng dẫn đến mất răng [59], [60]. Đây
là tỷ lệ thuộc hàng cao nhất thế giới. Ngay cả ở những nước phát triển như Hoa
Kỳ, tỷ lệ sâu răng hiện nay vẫn còn tới 84% ở lứa tuổi thanh niên. Đi kèm với
sâu răng là các bệnh về răng miệng. Trong những năm qua, chi phí cho việc
chăm sóc, sửa chữa răng ta ̣i Viê ̣t Nam đã lên t ới nhiều tỷ đồng. Bệnh sâu răng là
do vi khuẩn trên mảng bám răng gây ra. Những vi khuẩn trên mảng bám răng sử
dụng carbonhydrate để lên men t ạo acid, trong đó chủ yế u là lactic . Môi trường
acid sẽ phá v ỡ sự cân b ằng của hệ vi khuẩn đường miệng, tạo điều kiện thích
hợp cho những vi khuẩn có khả năng chịu được pH thấp tiếp tục sinh acid. Khi
lượng acid đủ lớn sẽ hịa tan các chất khống có trong men răng dẫn đến làm
mòn men răng, tạo thành các hố trên răng và gây ra sâu răng [38].
Sử dụng chất kháng khuẩn trong các sản phẩm vệ sinh răng miệng là một
trong những biện pháp phịng chống sâu răng có hiệu quả nhất hiện nay. Trong

số các chất kháng khuẩn đã được sử dụng vào mục đích này, fluor là chất có
tiềm năng hơn cả. Đây là chất có cơ chế tác động hai mặt. Một mặt chất này có
tác dụng kháng vi khuẩn sâu răng mạnh, mặt khác nó lại có vai trị giúp tái tạo
lại men răng và vì vậy có tác dụng làm bền răng. Chính vì thế, fluor vẫn được sử
dụng rộng rãi và cho đến nay chưa có một chất kháng khuẩn nào có thể thay thế
được [43].

1

download by :

Luận văn Thạc sỹ Khoa học

Nguyễn Vũ Anh

Tuy nhiên, việc xuất hiện hiện tượng bệnh nhiễm fluor (fluorosis) do sử
dụng lâu dài các sản phẩm vệ sinh răng miệng có chứa fluor đã khiến cho các
nhà nghiên cứu và các công ty sản xuất các sản phẩm vệ sinh răng miệng phải
tìm kiếm thêm những hợp chất mới để có thể thay thế fluor hay kết hợp với
fluor, nhưng ở nồng độ thấp hơn mà vẫn có hiệu quả chống sâu răng cao. Hàng
loạt các chất kháng khuẩn mới bao gồm những chất tổng hợp và tự nhiên như
các acid yếu, dẫn xuất của các acid béo, triclosan, muối kim loại và cả những
chất có nguồn gốc từ thực vật đã được nghiên cứu và thử nghiệm. Việc tìm kiếm
và sử dụng những chất kháng khuẩn tự nhiên, đặc biệt là các chất có nguồn gốc
thực vật (phytochemicals) đang rất được quan tâm. Hướng nghiên cứu này còn
được gọi là cuộc cách mạng xanh trong y học (green medicine) [9], [19], [43].
Trong lĩnh vực bảo vệ răng miệng, đây cũng là hướng nghiên cứu có nhiều triển
vọng do tin
́ h hiê ̣u quả và an toàn cao của các chấ t này .

Những kết quả điều tra trước đây của chúng tơi cho thấy vỏ quả măng cụt
(Garcinia mangostanaL.) có chứa một số polyphenol thuộc nhóm chất
xanthone, trong đó có α-mangostin, có khả năng ức chế sự sinh trưởng, sự sinh
acid, sự hô hấp và diệt vi khuẩn gây sâu răng S. mutans mạnh. Ngoài ra, vỏ quả
măng cu ̣t cũng là nguồ n nguyên liê ̣u khá phong phú và rẻ tiề n để tách chiế t các
chấ t xanthone vì th ế, Garcinia mangostanaL. sẽ là đối tượng tiềm năng để tinh
sạch, nghiên cứu và ứng dụng các chất kháng vi khuẩn sâu răng mới (anticaries
agents).Với mong muố n có mô ̣t nghiên cứu đầ y đủ về cơ chế tác du ̣ng kháng vi
khuẩ n sâu răng của α-mangostin từ vỏ quả măng cụt và ứng dụng chúng trong
viê ̣c sản xuấ t mô ̣t loa ̣i sản phẩ m vê ̣ sinh răng miê ̣ng mới

, chúng tôi tiến hành

thực hiê ̣n đề tài “Nghiên cứu ảnh hưởng của α-mangostin từ vỏ quả măng cụt
(Garcinia mangostana L.) lên vi khuẩ n Streptococcu s mutans trên biofilm và
đinh
̣ hướng ứng dụng ” nhằ m mu ̣c đić h đưa ra được qui trình tách chiết αmangostin hiê ̣u quả , đơn giản đồ ng thời kh ẳng định được tác dụng kháng khuẩn
2

download by :

Luận văn Thạc sỹ Khoa học

Nguyễn Vũ Anh

sâu răng của chấ t này trênđối tượng vi khuẩnS. mutans trên biofilmvà bước đầu
tạo đươ ̣c chế phẩm nước súc miệng mới có tác du ̣ng phòng ch ống bệnh sâu răng.
Đề tài khoá luận tập trung nghiên cứu các nội dung chính sau:
i.

Xây dựng qui trình tách chiế t α-mangostinđơn giản , đạt hiệu suất cao.

ii.

Nghiên cứu tác dụng của α-mangostinlên vi khuẩn S. mutans trên biofilm
thông qua việc nghiên cứu ảnh hưởng của chấ t này lênquá trì nh sinh acid
và tạo biofilm c ủa vi khuẩ n cũng như các enzyme liên quan đế n các quá
trình này.

iii.

Nghiên cứu khả năng tích lũy của α-mangostin trên biofilm

iv.

Tạo dung dịch nước súc miệng có chứa xanthone cùng một số chất hoạt
động khác và đánh giá khả năng chống sâu răng của chế phẩm thu được
trên mơ hình biofilm nhân tạo cóso sánh tác dụng với chế phẩm nước súc
miệng thương mại thông qua các chỉ tiêu: i) Ảnh hưởng của chúng lên quá
trình sinh acid của vi khuẩn; ii) Khả năng hạn chế sự tạo mảng bám răng
(dental plaque).

3

download by :

Luận văn Thạc sỹ Khoa học

Nguyễn Vũ Anh

Chƣơng 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1. Bệnh sâu răng và vi khuẩn Streptococus mutans
1.1.1. Bệnh học sâu răng
Bệnhsâu răng thực chất là sự tiêu hủy cấu trúc vơi hóa hữu cơ (tinh thể
canxi) của men răng và ngà răng, tạo nên lỗ hổng trên bề mặt răng, do vi khuẩn
gây ra. Ban đầu chỉ là sự tạo thành các lỗ trên bề mặt răng, giai đoạn này khơng
gây ra triệu chứng, có thể kéo dài vài tháng thậm chí vài năm. Nếu khơng phát
hiện và điều trị kịp thời thì “sâu răng” sẽ ăn sâu vào tủy, phá hủy tủy, gây chết
tủy. Từ bệnh sâu răng và viên tủy có thể phát sinh ra các biến chứng như viên
quanh cuống răng, rụng răng, viêm xương, viêm hạch v.v... nhiều trường hợp
gây ra tử vong.

Hình 1.1. Cấu trúc của răng
1.1.1.1 Nguyên nhân gây sâu răng
Thương tổn sâu răng là kết quả của sự phân huỷ khoáng (mineral
dissolution) ở tổ chức cứng của răng [4],[6]. Sâu răng xảy ra do nhiều nguyên
nhân nhưng có 3 yếu tố chủ yếu cùng tác động để gây sâu răng:
4

download by :

Luận văn Thạc sỹ Khoa học

Nguyễn Vũ Anh

 Vi khuẩn trong hốc miệng.
 Chất bột, đường, dính vào răng bị lên men do vi khuẩn tạo thành acid.

 Acid phá huỷ men răng, tạo điều kiện để hình thành lỗ sâu răng [2].
1.1.1.2. Mảng bám răng (dental plaque)
Mảng bám răng, được xem là mô ̣t biofilm sinh ho ̣c điể n hiǹ h , chính là
một quần thể các vi sinh vật đa dạng về chủng loại tồn tại trên bề mặt răng
[27],[43]. Đó là một lưới polymer sinh học chứa các vi sinh vật và nước bọt.
Thuật ngữ biofilm mô tả quần thể các vi sinh vật bám vào bề mặt giá thể. Sử
dụng các phương pháp nghiên cứu sinh học phân tử trong đó có kỹ thuật PCR
(polymerase chain reaction) đã phát hiện tới hơn 500 loài vi khuẩn khác nhau
có mặt trong mảng bám răng [22]. Nhìn chung biofilm có các tính chất sau:
i.

Bảo vệ cơ thể vi sinh vật khỏi hệ thống phịng thủ của chính vật chủ hay
của vi sinh vật kẻ thù.

ii.

Chống lại sự mất nước.

iii.

Chống lại các chất kháng khuẩn thông qua việc tạo kiểu hình mới có tốc
độ sinh trưởng giảm, hạn chế sự tiếp xúc và có khả năng bất hoạt hay
trung hoà các chất kháng khuẩn.

iv.

Nồng độ các chất dinh dưỡng trong biofilm tăng cao hơn so với môi
trường xung quanh.
Chính vì những đặc điểm này mà các vi sinh vật sống trên biofilm thường

có khả năng chống chịu cao với các chất kháng khuẩn so với các tế bào sống tự
do trong môi trường nuôi cấy (độ chống chịu có thể cao hơn tới khoảng 1000
lần) [57]. Sự hình thành biofilm bao gồm ba giai đoạn chính. Giai đoạn mở đầu:
vi khuẩn bắt đầu bám vào bề mặt răng. Các mối tương tác đặc hiệu và không đặc
hiệu giữa bề mặt răng và tế bào xuất hiện dẫn đến sự tạo liên kết và sự xâm
chiếm dần dần. Giai đoạn bùng nởtăng trưởng: hình thành biofilm đồng thời với
sự sinh tổng hợp polymer ngoại bào. Giai đoạn mất đi các tế bào trên mảng bám
5

download by :

Luận văn Thạc sỹ Khoa học

Nguyễn Vũ Anh

răngvào nước bọt: thúc đẩy sự xâm nhập của các cơ thể vi sinh vật mới vào các
vị trí vừa được giải phóng trên mảng bám răng [43].

A. Vi khuẩn được vận B.Các liên kết không thuận C.Sự đồng gắn kết của các cơ
chuyển đến bề mặt của răng nghịch hình thành do mối thể vi khuẩn vào các tế bào đã
và bám vào răng nhờ các lực tương tác phân tử hoá lập thể định cư trước. Sự bùng nổ
tĩnh điện yếu.

giữa tế bào vi khuẩn và các tăng trưởng để hình thành
biofilm đồng thời với sự sinh
receptor trên bề mặt răng.
tổng hợp polymer ngoại bào.

Hình 1.2. Ba giai đoạn chính hình thành mảng bám răng [43]

1.1.1.3. Cơ chế gây sâu răng
Bệnh sâu răng được khởi đầu bằng sự hình thành mảng bám răng (dental
plaque). Hydrat cacbon trong thức ăn được chuyển hố thành glucose. Glucose
sau đó được polymer hố thành dextran bởi enzyme dextranase và
glucosyltransferase. Dextran có tính dính bám nên tạo điều kiện để các vi khuẩn
khác và các mảnh thức ăn bám thêm vào. Sự dính bám cịn được gia tăng bởi
những protein trên bề mặt vi khuẩn đang sinh sống tại đó và các polysaccharide
do chúng chuyển hố tạo ra như là các glucan [38],[43]. Việc hình thành nhiều
lớp vi khuẩn cộng với thức ăn còn tạo ra mơi trường cho cả các vi khuẩn kỵ khí
sinh sống. Q trình tiêu thụ đường thơng qua con đường glycolysis với sự sinh
acid bởi vi khuẩn làm cho pH trong mảng bám rănggiảm xuống thấp, thậm chí
6

download by :

Luận văn Thạc sỹ Khoa học

Nguyễn Vũ Anh

dưới 4,0. Ở điều kiện pH thấp này, lớp men răng bị bào mòn và dẫn đến sâu
răng.
Các vi khuẩn tham gia chủ yếu vào q trình này là các Streptococcus
mutans. Ngồi ra cịn có S. sobrinus và một số chủng lactobacillus[38]. Acid do
chúng sinh ra cịn tấn cơng cả phần lợi gây ra một số bệnh như viêm nướu răng
(gingivitis), viêm quanh răng (periodontal diseases)... Vì vậy có thể nói, bệnh
sâu răng chủ yếu là do vi khuẩn gây ra và kiểm soát vi khuẩn trên mảng bám là
biện pháp hữu hiệu để phòng chống sâu răng.
1.1.1.4.Vi khuẩn Streptococcus mutans

Streptococcus là các vi khuẩn Gram (+), gồm một lượng lớn các loài,
phân bố rất rộng rãi trong tự nhiên. Một số là các nhân tố gây ra những bệnh
nguy hiểm như viêm phổi (pneumonia), sốt phát ban (scarlet fever), viêm màng
não (meningitis)… Sử dụng kỹ thuật phân tích trình tự ADN mã hoá cho ARN
ribosome 16S, sơ đồ phả hệ của streptococci đã được xây dựng [43]. Trong sơ
đồ đó, ngồi thành viên của hai nhóm Pyrogenic và Bovis cùng với
Streptococcus pneumoniae (nhóm mitis),Streptococcus thermophilus (nhóm
salivarius),Streptococcus suis,Streptococcus acidominimus, là các streptococci
khơng sinh sống trong miệng động vật, còn lại đều là streptococci xoang miệng
(oral streptococci). Ở xoang miệng của người chỉ thấy hai thành viên của nhóm
mutans là Streptococcus mutans và Streptococcus sobrinus [43].
Streptococcus mutans lần đầu tiên được Clark mô tả năm 1924 sau khi
phân lập được nó từ vùng răng bị tổn thương. Tuy vậy phải đến thập niên 60, khi
các nhà khoa học tập trung nghiên cứu bệnh sâu răng từ giai đoạn sớm, vi khuẩn
này mới được chú ý đến nhiều. Cũng từ đó, rất nhiều dịng mang những đặc tính
hố sinh tương tự nhau nhưng hồn tồn phân biệt bởi chỉ thị kháng nguyên đã
được phân lập. Tổng cộng có 7 kiểu chỉ thị kháng nguyên đã được mô tả là a, b,
c, d, e, và f[43]. Những nghiên cứu về sau trên protein, cấu trúc màng, ADN
7

download by :

Luận văn Thạc sỹ Khoa học

Nguyễn Vũ Anh

tổng số cũng khẳng định có rất nhiều các biến thể ở những vi khuẩn vốn vẫn
được coi là S. mutans. Dựa trên tất cả các nghiên cứu, S. mutans được chia nhỏ
thành rất nhiều dưới lồi riêng biệt. Từ đó, đã ra đời cụm từ "mutans

streptococci" và tên gọi S. mutans không cịn thực sự chính xác về mặt phân
loại, tuy nhiên, nó vẫn cịn được dùng như một thói quen để gọi tên dòng
Streptococcus xoang miệng phổ biến nhất ở người [43].

Hình 1.3. Vi khuẩn Streptococcus mutans
S. mutans được phát hiện ở tất cả các mảng bám răng và có tỉ lệ rất cao ở
những vùng răng sâu. Các nghiên cứu khác nhau [38], [43] cũng đã chỉ ra đây
chính là nguyên nhân hàng đầu dẫn đến bệnh sâu răng. Sở dĩ như vậy là vì S.
mutans có những đặc điểm đặc biệt, đó là: i) có khả năng chuyển hố được
nhiều loại hydrat cacbon khác nhau, ii) chuyển hoá đường bằng con đường lên
men sinh ra rất nhiều acid lactic, iii) chống chịu được pH rất thấp của môi
trường, iv) có khả năng sinh polysaccharide ngoại bào

(EPS) mạnh.Do vậy, vi

khuẩn này thường được sử dụng như là đối tượng điển hình cho các nghiên cứu
về sâu răng.

8

download by :

Luận văn Thạc sỹ Khoa học

Nguyễn Vũ Anh

1.1.2. Tình hình bệnh sâu răng trên thế giới và Việt Nam
Từ những năm 1940 cho đến những năm 1960, tình hình sâu răng ở các
nước cơng nghiệp hố rất nghiêm trọng. Trung bình mỗi trẻ em 12 tuổi có tới 810 răng sâu hoặc răng đã bị mất do sâu. Chỉ số DMFT ( Decayed Mising, Filling

Teeths, phản ánh số răng sâu, số răng mất do sâu hoặc số răng đã trám) ở tuổi 12
của Na Uy năm 1940 cao tới mức 12,0 [2]. Tới những năm 1980, chỉ số DMFT
ở tuổi 12 của các nước công nghiệp đã giảm xuống đáng kể (nằm trong khoảng
từ 2-4) và chỉ còn từ 1 - 2 vào năm 1993. Tuy vậy, tại thời điểm 1997, chỉ số
DMFT ở lứa tuổi trung niên (35 – 44 tuổi) tại các nước cơng nghiệp phát triển
vẫn cịn ở mức rất cao. Ví dụ như Canada, Nhật Bản, Úc và Bắc Âu là 13,9, Hoa
Kỳ là 9,0 - 13,9. Theo những thơng báo gần đây, tình trạng sâu răng tuổi thanh
niên của Hoa Kỳ vẫn còn ở mức cao. Cụ thể là 84% thanh niên lứa tuổi 17 có
răng sâu và trung bình mỗi người có 11 mặt răng bị phá huỷ do sâu. Người từ 40
tuổi trở lên có trung bình 30 mặt răng bị sâu và 41% người từ 65 tuổi trở lên
khơng cịn răng.
Ở các nước đang phát triển như Thailand, Uganda, Zaire... chỉ số DMFT
tuổi 12 cuối những năm 1960 chỉ từ 1,0 đến 3,0, nhưng lại tăng lên mức 3,0 - 5,0
và thậm chí cao hơn vào những năm 1970-1980. Nhìn chung, tình trạng sâu răng
có xu hướng tăng lên ở các nước này. Tới 1997, chỉ số DMFT ở lứa tuổi 12 lớn
hơn 4,4 còn gặp ở nhiều nước như Ba Lan (châu Âu), Philipin (châu Á), và
Trung Mỹ. Còn ở lứa tuổi trung niên, mức độ sâu răng cũng rất cao, trung bình
mỗi người có trên 13,9 răng sâu [5].
Ở Việt Nam, các kết quả điều tra răng miệng năm 1991 của Võ Thế
Quang cho thấy sâu răng ở Việt Nam tăng dần theo tuổi, cả về tỉ lệ sâu răng và
chỉ số DMFT. Trần Văn Trường và cs [5] công bố tỉ lệ sâu răng ở Việt Nam sau
điều tra sức khoẻ răng miệng toàn quốc lần thứ 2 năm 2001 là 84,9% ở lứa tuổi
6 - 7; 56,6% ở lứa tuổi 12 và 67,6% ở lứa tuổi 15. Ở người lớn, tỉ lệ này là
9

download by :

Luận văn Thạc sỹ Khoa học

Nguyễn Vũ Anh

75,2% ở lứa tuổi 18 - 34 và 89,7% ở lứa tuổi trên 45. Kèm theo đó, tỉ lệ bệnh
viêm quanh răng cũng rất cao ở cả trẻ em và người lớn. Tỉ lệ người có răng khoẻ
mạnh chỉ đạt mức dưới 10%. Theo số liệu mới nhất (2015) của Hội Răng Hàm
Mặt Việt Nam, thực tế có tới hơn 90% dân số Việt Nam đang đối mặt với các
vấn đề về răng miệng, trong đó phổ biến nhất là sâu răng dẫn đến mất răng [59],
[60].
Đứng trước tình hình đó, ngay từ năm 1908, liên đoàn Nha khoa Quốc tế
(FDI) đã rất quan tâm đến vấn đề dự phòng sâu răng, tuyên bố ủng hộ nguyên
tắc phòng bệnh hơn chữa bệnh, và từ đó liên tục nghiên cứu, tìm kiếm các biện
pháp phòng bệnh sâu răng. Các khuyến cáo về dự phòng sâu răng ln được đưa
ra nhằm duy trì thành tựu ở các nước công nghiệp phát triển và ngăn chặn gia
tăng bệnh răng miệng ở các nước đang phát triển. WHO đã đưa ra mục tiêu cho
toàn cầu năm 2010 là chỉ số DMFT phải dưới1. Tại Việt Nam, mục tiêu phấn
đấu đến năm 2010 ở độ tuổi 5-6 có 50% trẻ em không bị sâu răng, ở độ tuổi 18
có 85% người giữ được tồn bộ răng, ở tuổi từ 35-44 tuổi giảm 50% số người
khơng cịn răng và trên 65 tuổi giảm 25% số người khơng cịn răng.
1.1.3. Các biện pháp ngăn ngừa sâu răng
Việc loại bỏ bằng cơ học có thể ngăn chặn hồn tồn sự tạo mảng bám
răng [43].Điều này sẽ có hiệu quả hơn nếu kết hợp với việc giảm bớt thói quen
ăn các sản phẩm có đường. Tuy vậy, việc thay đổi thói quen ăn uống và duy trì
vệ sinh răng miệng tốt rất khó thực hiện. Vì vậy hàng loạt các biện pháp khác
nhau nhằm ngăn chặn sâu răng đã được nghiên cứu và ứng dụng.
1.1.3.1. Sử dụng chất kháng khuẩn
Việc sử dụng chất kháng khuẩn để kiểm soát mảng bám răng đã được
thực hiện trong nhiều năm qua, chủ yếu là những chất chống tạo mảng bám. Sử
dụng nước súc miệng là cách rất có hiệu quả để đưa các chất kháng khuẩn như là
các bisbiguanides, enzyme, muối kim loại, tinh dầu... tiếp xúc với các vi khuẩn
10

download by :

Luận văn Thạc sỹ Khoa học

Nguyễn Vũ Anh

trong mảng bám răng [43]. Khi hấp phụ vào mảng bám răng, các chất này sẽ
xâm nhập dần vào bên trong mảng bám, ức chế sự phát triển hoặc quá trình trao
đổi chất của vi khuẩn, làm giảm sự gắn kết của vi khuẩn với bề mặt răng vì vậy
ngăn ngừa sự tạo mảng bám, hạn chế q trình tích tụ hay liên kết bắc cầu vì vậy
ngăn chặn sự xâm nhập của vi khuẩn. Các đặc tính quan trọng nhất của chất
kháng khuẩn là ngăn ngừa sự gắn kết, sự xâm nhiễm của vi khuẩn và tác động
đến quá trình trao đổi chất của chúng. Các chất kháng khuẩn thường không tác
động lớn đến các q trình sinh học, khơng làm tổn thương lớp màng nhày ở
miệng và ít độc. Vì thế, có thể nói sử dụng chất kháng khuẩn là biện pháp hữu
hiệu nhất hiện nay để kiểm soát sâu răng. Scheie [53] đã phân loại 6 nhóm chất
kháng khuẩn chính là:
1. Cation : các ion tích điện dương có khả năng làm thay đổi chức năng của
màng, sự gắn kết và sử dụng glucose của vi khuẩn.
2. Anion : các ion tích điện âm có khả năng làm thay đổi chức năng của
màng tế bào hay quá trình trao đổi chất trong quá trình đường phân và sử
dụng glucose.
3. Các tác nhân khơng phải ion: các ion khơng tích điện có khả năng ức
chế các enzyme trên màng tế bào, dẫn đến làm giảm sử dụng glucose.
4. Enzyme: một số enzyme có khả năng ngăn chặn sự gắn kết của vi khuẩn
hay làm tăng hoạt tính lysozyme.
5. Các đƣờng đa (polyol): có khả năng làm thay đổi q trình đường phân
hoá của vi khuẩn.

6. Các chất khác: bao gồm các dịch chiết thực vật, các tác nhân tạo phức
càng cua, các acid béo, các tác nhân gây tổn thương oxi hoá (oxidativedamaging agents). Cơ chế tác động của các chất này rất phức tạp và vẫn
còn đang được nghiên cứu.

11

download by :

Luận văn Thạc sỹ Khoa học

Nguyễn Vũ Anh

1.1.3.2. Sử dụng chất thay thế đường
Do thói quen sử dụng đường trong cuộc sống hàng ngày nên vi khuẩn trên
mảng bám răng có điều kiện lên men, sinh acid và kết quả là làm mịn men răng,
gây sâu răng. Vì vậy, người ta đã nghĩ đến việc sử dụng những chất làm ngọt mà
vi khuẩn không thể tiêu thụ được để thay thế đường. Những chất này không gây
ra sự sinh acid nên không gây sâu răng.
Các loại đường nhân tạo này có khả năng kháng khuẩn nhất định thơng
qua việc ức chế sự phát triển của vi khuẩn. Các đường như manitol, sorbitol
không ngọt như sucrose nên được dùng trong công nghiệp chế biến thực phẩm.
Các đường này không bị vi khuẩn tiêu thụ. Tuy nhiên, việc sử dụng thường
xuyên các loại đường này sẽ dẫn đến sự hình thành các chủng vi khuẩn có khả
năng đồng hố chúng, đặc biệt là các loài S. mutans. Cơ chế tác động của xylitol
lên vi khuẩn S. mutans cũng đã được tìm hiểu. Khi xylitol đi vào tế bào S.
mutans sẽ can thiệp vào quá trình lên men đường của vi khuẩn bằng cáchtiêu thụ
PEP và NAD+ trong q trình phosphoryl hố, đồng thời ức chế cạnh tranh với
enzyme phosphofructokinase nhờ chất trao đổi trung gian xylitol-5-phosphate
[43].Chính điều này làm giảm q trình sinh acid của tế bào, giảm mật độ S.

mutans nên giảm sâu răng ở những người sử dụng xylitol. Nhìn chung, việc sử
dụng các chất thay thế đường có tác dụng khá hiệu quả vì chúng làm mất đi hay
hạn chế tối đa cơ hội phát triển của các vi khuẩn có khả năng sinh và chịu acid.
1.1.3.3. Liệu pháp thay thế (replacement therapy)
Việc sử dụng các vi khuẩn đối kháng để kiểm soát sâu răng đã được sử
dụng từ nhiều năm nay [43].Lợi ích của liệu pháp này là có tác dụng bảo vệ răng
lâu dài và ít tốn kém. Tuy nhiên, liệu pháp này chưa được thử nghiệm nhiều ở
người vì tính an tồn của các chủng vi khuẩn đối với người sử dụng chưa được
nghiên cứu kỹ. Liệu pháp này có hai hướng chính là :
i.

Hướng tiền nhiễm: Cấy vào mảng bám răng những vi khuẩn có lợi hay
không gây hại trước khi các chủng không mong muốn xâm nhập và định
12

download by :

Luận văn Thạc sỹ Khoa học

Nguyễn Vũ Anh

cư trên mảng bám. Những vi khuẩn tiền nhiễm sẽ loại bỏ những tác nhân
gây bệnh không mong muốn. Các chủng đột biến của streptococci đã bị
làm mất khả năng tạo glucosyltransferase (GTF), hoặc polysaccharide nội
bào, hoặc khơng có lactate dehydrogenase là những đối tượng thường
được sử dụng trong liệu pháp này.
ii.

Hướng thay thế các cơ thể tiền nhiễm có mặt trong mảng bám răng:

Cách này có ưu điểm là khơng phải xử lý loại bỏ những chủng không
mong muốn trước khi gây nhiễm mới. Ví dụ, S. salivarius thay thế cho S.
mutans trên mảng bám răng của chuột đã làm giảm tỉ lệ sâu răng vì nó
thay thế chủng S. mutans có khả năng sinh acid mạnh.

1.1.3.4. Vacxin
Các nghiên cứu cho thấy có thể tạo được các đáp ứng miễn dịch chống lại
vi khuẩn sâu răng. Vì các đột biến của streptococci là tác nhân chính gây sâu
răng nên người ta nghĩ đến khả năng tạo ra các vacxin bằng việc sử dụng chính
các vi khuẩn này (vacxin) hay các phân tử của các vi khuẩn này (sub-unit
vacxin) để gây miễn dịch [43]. Trên thực tế, hướng nghiên cứu này đã xuất hiện
ở Anh từ hơn 20 năm trước đây. Mặc dù đã thu được một số kết quả khả quan
như làm giảm mật độ tế bào streptococci, giảm tỉ lệ sâu răng, nhưng lại xuất
hiện các phản ứng phụ cũng như xuất hiện các tổn thương mô.
Các nhà nghiên cứu Mỹ lại sử dụng S. sobrinus trên mảng bám răng chuột
để tạo vacxin. Các vacxin sản xuất theo hướng này nhằm mục đích chống lại
enzyme glucosyltransferase, nhờ đó làm giảm khả năng tạo mảng bám răng.
Hướng nghiên cứu này tỏ ra rất có hiệu quả ở chuột nhưng lại khơng có hiệu quả
ở các lồi linh trưởng. Vì vậy người ta nghi ngờ khả năng ứng dụng của nó cho
người.
1.1.3.5. Kiểm soát sự hình thành biofilm
S. mutans được xác định là tác nhân gây sâu răng chính tồn tại trên mảng
bám răng với 2 đặc tính gây bệnh quan trọng là: i) khả năng sinh acid cao; và ii)
13

download by :

Luận văn Thạc sỹ Khoa học

Nguyễn Vũ Anh

khả năng sinh biofilm mạnh do nó có khả năng sản xuất các EPS, bộ khung
chính của biofilm [38]. Trong đó, khả năng sinh EPS của S. mutans gần đây
được xem là nhân tố gây bệnh quan trọng cần được quan tâm nghiên cứu [36],
[37]. Như vậy, có thể nói rằng kiểm sốt sâu răng là kiểm sốt các đặc tính gây
bệnh của vi khuẩ n , hay nói một cách khác là tìm kiếm các chất kháng khuẩn có
khả năng ức chế sự sinh acid (anti-acidogeneic agents) và ức chế sự tạo biofilm
(anti-biofilm agents) của vi khuẩ n .
Các nghiên cứu hiện nay tập trung nhiều vào việc làm giảm khả năng biểu
hiện của các yếu tố gây bệnh của S. mutans mà khơng nhất thiết phải diệt vi
khuẩn đích này. Làm mất khả năng gây bệnh của vi khuẩn nhưng không đe dọa
sự tồn tại của chúng có thể sẽ làm giảm khả năng kháng thuốc và tránh được sự
xáo trộn lớn trong quần thể vi khuẩn cư ngụ. Ví dụ, các chiến lược kiểm sốt sự
tạo biofilm thơng qua việc ức chế sự hình thành EPS trên bề mặt có thể là biện
pháp thay thế (hay kết hợp) hữu hiệu [37]. Lý do là vì các EPS có thể đóng vai
trị như là một chất hấp thụ phản ứng, vì vậy sẽ làm giảm sự xâm nhập của chất
kháng khuẩn với các tế bào trên biofilm [54]. Như vậy, các chất có khả năng làm
giảm EPS có thể làm tăng tính hiệu quả của chất kháng khuẩn với các tế bào
biofilm. Nhìn chung, các chất kháng khuẩn mới nên có một hay nhiều đặc tính
sau: (1) ức chế sự gắn kết của các glucosyltransferase (GTF) vào bề mặt film;
(2) ức chế sự sinh tổng hợp các EPS trên bề mặt; (3) ảnh hưởng đến cấu trúc
của lưới EPS; (4) ức chế sự dính kết và xâm chiếm của vi khuẩn; (5) làm mất
khả năng sinh acid và các cơ chế thích nghi acid; (6) làm giảm khả năng sinh
trưởng của các vi khuẩn gây bệnh xoang miệng; (7) làm thay đổi hệ sinh thái và
hóa sinh của biofilm [21], [37].
Các chất kháng khuẩn tự nhiên, đặc biệt là các chất kháng khuẩn từ thực
vật (phytochemicals) có thể là những chất thay thế an toàn và hiệu quả. Thực vật
là nguồn cung cấp các chất kháng khuẩn sâu răng mới vì chúng rất giàu các chất
thứ cấp và rất nhiều trong số chúng là những chất kháng khuẩn mạnh [1],[7],

14

download by :