Tài liệu GIẢI TRÌNH TỰ GEN doc

GI I TRÌNH T GENẢ Ự
Các phơng pháp giải trình tự gen

Có 2 phơng pháp chính:

Phơng pháp hoá học Maxam Gilbert: đây là
phơng pháp đợc sử dụng đầu tiên để xác định
trình tự gen nhng hiện nay không còn đựơc sử
dụng phổ biến nữa.

Phơng pháp Enzyme Sanger
1. Ph¬ng ph¸p ho¸ häc Maxam - Gilbert
Walter Gilbert
Nguyên lý

Sử dụng các chất hoá học cắt đứt sợi DNA tại 1 loại
nucleotide đặc hiệu

Phân tử DNA kép đợc đánh dấu P
32
tại đầu 5

Tách rời 2 sợi đơn bằng nhiệt

Xử lý hoá học sao cho chỉ có 1 loại nucleotide bị phá
huỷ -> hàng loạt đoạn DNA có kích thớc khác nhau
đợc tạo thành (sử dụng các chất hoá học khác nhau
phá huỷ 4 loại nucleotide bằng 4 phản ứng riêng
biệt)

Tiến hành điện di các đoạn DNA thu đựơc trên gel

polyacrylamide, chỉ quan sát đựơc đoạn có gắn P
32
.

Đoạn DNA ngắn nhất có đánh dấu phóng xạ sẽ chạy
nhanh nhất dới tác dụng của điện trờng.

Căn cứ vào vị trí các vạch quan sát đợc trên gel mà
xác định trình tự các nucleotide.
5’-
Treat with
chemicals that
specifically
cleave at a
certain base.
4 tubes
G-rxn
A>G
-rxn
T>C
-rxn
C-rxn
5’-
5’-
5’-
C
The reaction is done such that each
strand is cleaved only once
C T A G
ddNTP Reaction Mix

3’
G
C
A
T
T
C
C
A
T
A
G
G
5’
MAXAM-GILBERT CHEMICAL
SEQUENCING
Labeled strand (P32)
C
C
Sequence is read directly
autoradiograph of
dried sequencing gel
Phá huỷ các nucleotide
Trong phơng pháp này sử dụng 5 phản ứng cơ bản:

Dimethylsulfate ở pH 8.0 sẽ làm thay đổi Guanine
(G).

Piperidine formate ở pH 2.0 sẽ phá vỡ cầu nối
glycoside giữa deoxyribose với purine (G,A)

Hydrazine: mở các vòng pyrimidine (C , T)

Hydrazine khi có mặt1.5M NaCl chỉ có tác dụng đối
với C

1.2N NaOH ở 90
0
C sẽ phá huỷ A mạnh và C kém.
KÕt qu¶:
Dimethylsulfate at pH 8.0 > G
Piperidine formate at pH 2.0 > G and A
Hydrazine > C and T
Hydrazine in 1.5 M NaCl > C
1.2 N NaOH at 90
o
C > A and C
5’
GACGTACTTA
3’


G G+A T+C C A>C
G G+A T+C C A>C
1.2 N
NaOH at
90
o
C
A>C

Hydrazine
T+C
Piperidine
formate
pH 2
G+A
Dimethyl
sulfate pH
8
G
Hydrazine in
1.5 M NaCl
C
X
X
X
X
X
X
5’ to 3’
Nhîc ®iÓm

Ho¸ chÊt ®éc

CÇn mét lîng lín chÊt phãng x¹

ThiÕu sù tù ®éng

§«i khi kÕt qu¶ thu ®ù¬c trªn gel kh«ng chÝnh
x¸c

2. Ph¬ng ph¸p enzyme Sanger
Fred Sanger
Nguyên lý

Sử dụng dideoxynucleotide không có nhóm
OH ở vị trí 3 trong phản ứng tổng hợp DNA
=> phơng pháp dideoxy

Phân tử DNA kép đợc đánh dấu P
32
tại đầu 5


Sợi đôi DNA bị biến tính thành hai sợi đơn và
đựơc lai với mồi (dài vài chục nu, liện kết
đựơc với 1 trong 2 mạch đơn)

Tiến hành đồng thời 4 phản ứng riêng lẽ với 4
loại dideoxynucleotide khác nhau -> các
sợi đơn DNA đợc tổng hợp có độ dài ngắn
khác nhau

Diện di 4 sản phẩm cùng lúc trên gel
polyacrylamide

Đọc kết quả.
Dideoxy-Nucleotides
O
(P)-(P)-(P)-
H

Base
dNTP ddNTP
O
(P)-(P)-(P)-
H
H
Base
If a ddNTP is added
to a growing DNA
chain, the sequence
is terminated,
because another
base can not be
added
OH
ống phản
ống phản


ứng A
ứng A
ống phản
ống phản


ứng C
ứng C
ống phản
ống phản

ứng G
ứng G
ống phản
ống phản


ứng T
ứng T
ddATP
dCTP
dTTP
dGTP
dATP
ddCTP
dCTP
dTTP
dGTP
dATP
ddGTP
dCTP
dTTP
dGTP
dATP
ddTTP
dCTP
dTTP
dGTP
dATP
C T A G

ddNTP Reaction Mix
SANGER DIDEOXY SEQUENCING
Phóng xạ tự ghi sợi AND đơn tổng
hợp trong mỗi ống phản ứng.
Đoạn ADN cần giải trình tự
Đoạn ADN cần giải trình tự
3 CCTATGGAATGC-
3 CCTATGGAATGC-
5
5


.
.
*
*
*
*
*
*
*
*
*
*
*
*
*
*
*
*

*
*
*
*
ống phản ứng A
ống phản ứng A
ống phản ứng C
ống phản ứng C
*
*
*
*
ống phản ứng G
ống phản ứng G
ống phản ứng T
ống phản ứng T
Mồi Sequencing
Mồi Sequencing
Phơng pháp dideoxy cải tiến

Phơng pháp dideoxy có thể đợc cải tiến để
thực hiện các phản ứng trong cùng một ống
nghiệm.

Lúc này, các ddNTP sẽ đợc đánh dấu bằng
các phân tử phát huỳnh quang màu khác
nhau
Ưu điểm của phơng pháp cải tiến

Tạo điều kiện thuận lợi cho việc tự động hoá.

Giảm giá thành phản ứng

Tăng tốc độ phản ứng
=> Nhiều trung tâm giải trình tự gen đã sử dụng
phơng pháp này và họ có thể đọc đợc
hàng triệu bp mỗi ngày.