Tài liệu Chương 2: CÁC KỸ THUẬT NỀN CỦA CNSH HIỆN ĐẠI (tiếp theo) doc

LOGO
Chương 2: CÁC KỸ THUẬT
NỀN CỦA CNSH HIỆN ĐẠI
(tiếp theo)
Nguyen Thi Viet Anh
www.themegallery.com
Nội dung
1. Các kỹ thuật chính dùng trong công nghệ DNA tái tổ hợp
1.2. Các enzym dùng trong công nghệ DNA tái tổ hợp
1.3. Các vector nhân dòng dùng trong công nghệ DNA tái tổ hợp
1.1. Khái niệm
1.4. Nhân dòng gen (gene cloning)
2. Các kỹ thuật chính sử dụng trong phân tích DNA
2.1. Kỹ thuật chiết tách DNA và RNA
2.2. Kỹ thuật tạo ngân hàng cDNA
2.3. Phương pháp PCR
2.4. Kỹ thuật xác định trình tự DNA
2.5. Kỹ thuật RFLP (dựa vào lai DNA/DNA)
2.6. Các kỹ thuật xác định tính đa hình DNA dựa trên PCR (AFLP, SSR)
1.5. Chọn lọc, tạo dòng và sự biểu hiện của gen
2.7. Genomic và proteomic
www.themegallery.com
 Ngân hàng bộ gen:
 Thư viện DNA từ bộ gen (lắc cơ học, RE);
 Khái niệm ngân hàng bộ gen (Bank of genomic DNA):
• Đoạn DNA được tách dòng (khác nhau do tế bào, bộ gen, RE,…);
• Bao gồm exon và intron;
• VD: ngân hàng bộ gen của vi khuẩn;
• tập hợp tất cả các trình tự DNA cấu thành bộ gen và đã được tách
dòng trong tế bào chủ;
• Đầu tiên DNA 300.000-400.000 bp gắn vào YAC hoặc BAC, cắt

đoạn nhỏ trung bình 30.000-40.000 bp gắn vào cosmid, cuối cùng
là các đoạn trung bình 4.000 bp gắn vào plasmid để giải kí tự chuỗi.

2. Các kỹ thuật chính sử
dụng trong phân tích DNA
www.themegallery.com
2. Các kỹ thuật chính sử
dụng trong phân tích DNA
Bước 1: Dùng enzyme cắt giới hạn
Bước 2: DNA bị cắt thành nhiều
đoạn khác nhau
Bước 3: đoạn DNA
được đưa vào vector
www.themegallery.com
Ngân hàng cDNA
 Bộ gen Eukaryotae (1,7% gen người-mã hoá protein);
 Tập hợp cDNA được tổng hợp nhờ kỹ thuật phiên mã ngược
mRNA tương ứng (cDNA=complementary DNA);
 Exon;
 Enzyme reverse transcriptase, DNA polymerase;…
 cDNA từ những đoạn gen đã được phiên mã ra mRNA (khác
biệt tuỳ vào tế bào của mô đã được biệt hoá và giai đoạn biệt
hoá) tổng hợp các ngân hàng cDNA trong từng loại tế bào,
từng loại mô của các cơ quan sẽ hình thành nên ngân hàng
cDNA của một cơ quan nào đó.
 VD: rễ lúa
www.themegallery.com
www.themegallery.com
www.themegallery.com
Kỹ thuật tạo

ngân hàng cDNA
 Kỹ thuật phiên mã ngược
tạo cDNA:
 Tách chiết và tinh sạch mRNA của
tế bào;
 Sử dụng kỹ thuật PCR: các đoạn
mồi (primer) đặc hiệu, các loại
nucleotide tự do, DNA
polymerase…
 mRNA tổng hợp nên cDNA;
 Enzyme RNase H để phân huỷ sợi
khuôn RNA;
 Tổng hợp sợi đơn cDNA thứ 2
www.themegallery.com
Kỹ thuật tạo
ngân hàng cDNA
 Kỹ thuật phiên mã ngược tạo cDNA: có 2 nhóm
phương pháp chủ yếu:
 Phiên mã ngược bằng phân huỷ hoàn toàn sợi khuôn mRNA
(cDNA có cấu trúc kẹp tóc-hairpin loop, S
1
nuclease cắt bỏ);
 Phiên mã ngược tạo cDNA theo kỹ thuật RACE (rapid
amplification of cDNA ends): kỹ thuật nhân nhanh đầu cuối
cDNA.
 Video cDNA libraries
www.themegallery.com
 Ưu điểm sử dụng ngân hàng cDNA:
 Các dòng c-DNA chứa trình tự mã hoá liên tục của
một gen;

 Những tế bào chuyên hoá sẽ tạo ra số lượng lớn của 1
loại protein;
 Dễ chiết tách; giảm nhẹ việc xác định đúng dòng
mong muốn từ ngân hàng gen.



Kỹ thuật tạo
ngân hàng cDNA
www.themegallery.com
Phương pháp PCR
 PCR = Polymerase chain reaction: phản
ứng polymerase dây chuyền:
 Khuếch đại một lượng lớn đoạn DNA trong điều
kiện in-vitro;
 Trong ống nghiệm plastic nhỏ (ependoff);
 Khác hẳn với sự tạo dòng các đoạn DNA bằng tế
bào vi khuẩn hay nấm men;



www.themegallery.com
Phương pháp PCR
 Nguyên tắc thực hiện:
 Sự khuếch đại nhờ vào chu trình nhiệt lập lại (~35 lần) gồm
các bước:
1. Đun nóng, biến tính (95
0
C);
2. Làm nguội, gắn mồi (37-65

0
C);
3. Ủ dài, tổng hợp (72
0
C).
 Sử dụng các đoạn mồi (primer) để bắt cặp bổ sung với đầu
đoạn mạch tương ứng;
 DNA polymerase chịu nhiệt (Taq polymerase, vi khuẩn
Thermophilus aquatus)


www.themegallery.com
Phương pháp PCR
www.themegallery.com
Phương pháp PCR
 Phản ứng PCR:
 Khuôn mẫu (DNA cần khuếch đại);
 Các đoạn mồi (primer ~18-25 Nucleotide);
 DNA polymerase chịu nhiệt (Taq polymerase);
 Các nucleotide tự do (dNTP);
 Dung dịch đệm thích hợp;
 Video phản ứng PCR


www.themegallery.com
Phương pháp PCR
 Lợi ích:
 Khuếch đại các trình tự nucleotide đặc hiệu
 Thời gian thực hiện cực nhanh;
 Đơn giản và ít tốn kém;

 Độ tinh sạch của mẫu không cần cao.
Giới hạn:
 Cần phải biết trình tự nucleotide (hoặc ít nhất là một
phần của đoạn cần khuếch đại).



www.themegallery.com
 Các dạng PCR mở rộng:
 RT-PCR (reverse transcripstase PCR): mRNA làm
khuôn mẫu chuyển thành cDNA cho sự khuếch đại
PCR;
 Real-Time PCR: PCR định lượng, có thể biết được số
lượng DNA khuếch đại trong quá trình khuếch đại;
 PCR-ELISA: kết hợp với miễn dịch trong chuẩn đoán.


Phương pháp PCR
www.themegallery.com
Kỹ thuật xác định trình
tự DNA
 DNA: một chuỗi xoắn kép:
 4 loại Nucleotide: A (Adenine), C
(Cytosine), G (Guanine), T
(Thymine);
 Xác định trình tự của DNA
(sequencing) là biết được trình tự
sắp xếp của 4 loại Nu trên chuỗi
DNA.

www.themegallery.com
 Phương pháp hoá học xác định trình tự
DNA của Maxam và Gilbert:
1. Đánh dấu đồng vị phóng xạ P
32
ở đầu 5’ của DNA;
2. Xử lí với hoá học làm biến đổi 1 hay 2 base
(dimethylsulphate làm biến đổi Guanine, hydrazine và
NaCl làm biến đổi Cytosine…);
3. Các Nucleotide biến đổi sẽ bị lấy ra khỏi chuỗi DNA;
4. 4 loại Nucleotide4 nhóm với 4 bản điện di  Tổng
hợp đầy đủ 4 bản điện di sẽ phản ánh đầy đủ trình tự
các nucleotide của đoạn DNA.


Kỹ thuật xác định trình
tự DNA
www.themegallery.com
 Phương pháp hoá học xác định trình tự
DNA của Maxam và Gilbert:

Kỹ thuật xác định trình
tự DNA
www.themegallery.com
 Phương pháp hoá học xác định trình tự DNA của
Maxam và Gilbert:

Kỹ thuật xác định trình

tự DNA
www.themegallery.com
 Hạn chế của phương pháp hoá học
xác định trình tự DNA của Maxam và
Gilbert:
 Khó thực hiện;
 Cần nhiều thông số tối ưu từ thí nghiệm;
 Xác định nồng độ giới hạn của các chất hoá học;




Kỹ thuật xác định trình
tự DNA
www.themegallery.com
Kỹ thuật xác định trình
tự DNA
 Phương pháp dideoxy
của F. Sanger:
1. Dideoxynucleotide: mất
nhóm OH tại vị trí carbon thứ
3 của đường deoxyribose
(nơi gắn dNTP kế
cận)dừng tổng hợp DNA;
2. 4 phản ứng với 4 loại ddNTP
(A, T, C, G)
3. Cũng có 4 bản điện di


www.themegallery.com

www.themegallery.com
 Các phương
pháp xác định
trình tự DNA
thế hệ mới:
 Dùng 4 màu
huỳnh quang khác
nhau để đánh dấu
4 loại dNTP



Kỹ thuật xác định trình
tự DNA
www.themegallery.com
Kỹ thuật xác định trình
tự DNA
Kỹ thuật giải trình tự 454
pyrosequencing
Kỹ thuật giải trình tự dựa trên sự
nối với chất hoá học 4 màu