PTTP_Chương 4_Các phương pháp sắc kí (đọc thêm)

CHƯƠNG 4: CÁC PHƯƠNG PHÁP SẮC KÍ (ĐỌC THÊM)

1


1. CÁC VẤN ĐỀ CHUNG CỦA PHƯƠNG PHÁP SẮC KÍ

1.1. Cơ sở của phương pháp sắc kí
1.2. Phân loại các phương pháp sắc kí
1.3. Lựa chọn phương pháp
1.4. Sắc kí đồ
1.5. Hiệu quả tách của cột

1.6. Phân tích định lượng bằng sắc kí

2


1.1. Cơ sở của phương pháp sắc kí
 Thí nghiệm của Mikhail Tsvett:

- Hòa tan các sắc tố thực vật trong ete dầu hỏa.
- Đưa hỗn hợp này lên cột đã nhồi CaCO3.

- Tiếp tục cho ete dầu hỏa tinh khiết đi qua cột.
- Sau một thời gian sắc nhât định, sắc tố thực vật đã tách thành
các dải riêng biệt.

3

 Cơ chế tách các hợp phần ra khỏi hỗn hợp:
- Ban đầu, các cấu tử chất tan phân bố ở pha tĩnh một cách bất
kì.
- Chất tan có ái lực với pha tĩnh tốt hơn  Thời gian ở lại pha
tĩnh lớn hơn  Di chuyển chậm hơn và ngược lại.
- Chất tan ở pha tĩnh  Không di chuyển.
- Chất tan ở pha động  Di chuyển theo các ái lực tương tác

khác nhau.
 Sau mỗi lần hấp thu và giải hấp  Chất tan di chuyển được

những quãng đường khác nhau
- Pha động tiếp tục qua cột  Chất tan tiếp tục di chuyển 

khoảng cách giữa các chất càng lớn  Tách ra khỏi nhau

4


 Định nghĩa: Sắc kí là q trình tách dựa trên sự phân chia
liên tục chất tan lên hai pha, một pha có khả năng hấp thu chất
tan gọi là pha tĩnh, một pha di chuyển qua pha tĩnh gọi là pha

động. Do ái lực khác nhau của pha tĩnh với từng hợp phần có
trong pha động, chất tan sẽ di chuyển với tốc độ khác nhau và
tách ra khỏi nhau.

5

Hệ số phân bố KD
 Cấu tử A phân bố giữa pha tĩnh và pha động, khi cân bằng
được thiết lập:
AM  AS
 Hằng số phân bố KD:

CS là tổng nồng độ chất tan trong pha tĩnh
CM là tổng nồng độ chất tan trong pha động

 Cân bằng phân bố: cân bằng động; cân bằng giữa pha lỏng –
lỏng, khí – lỏng hoặc rắn – lỏng.
 Giá trị KD lớn khi pha động là chất khí và giá trị KD nhỏ khi hai
pha ở trạng thái đông đặc (lỏng, rắn).

6


1.2. Phân loại các phương pháp sắc kí
Nguyên tắc: Phân loại theo bản chất của các pha
Pha tĩnh:
+ Sắc kí cột: pha tĩnh được nhồi trong một ống nhỏ và pha

động di chuyển qua pha tĩnh nhờ trọng lực và áp suất.
+ Sắc kí phẳng: pha tĩnh ở dạng phẳng trên một bản
phẳng hoặc giấy xenlulo; pha động di chuyển bằng hiện tượng
mao dẫn.
Pha động: Sắc kí lỏng và sắc kí khí.

7

Phân loại các phương pháp sắc kí trên cột
Phân loại chung

Phương pháp
cụ thể

Sắc kí lỏng (Pha Lỏng – Lỏng
động: chất lỏng)

Kiểu cân bằng

Chất lỏng cố định trên Phân bố giữa các
chất rắn
pha lỏng không trộn
lẫn

Lỏng – pha ghép

Chất hữu cơ liên kết hóa Phân bố chất lỏng
học với bề mặt chất rắn và bề mặt ghép

Lỏng – Rắn

Chất rắn

Hấp phụ

Trao đổi ion

Nhựa trao đổi ion

Trao đổi ion

Lỏng - gel

Chất lỏng trong kẽ hở Phân bố/Cỡ hạt
của chất rắn polyme

Sắc kí khí (Pha Khí – Lỏng
động: chất khí)
Khí – Rắn
Sắc kí lỏng siêu
tới
hạn
(Pha
động: chất lỏng
siêu tới hạn)

Pha tĩnh

Chất lỏng cố định trên Phân bố khí – lỏng
chất rắn
Chất rắn

Hấp phụ

Chất hữu cơ liên kết hóa Phân bố: chất lỏng
học với bề mặt chất rắn siêu tới hạn và bề
mặt ghép

8


1.2.1. Sắc kí lỏng: Pha động là pha lỏng
 Sắc kí phân bố:

- Sắc kí phân bố lỏng – lỏng:
Pha tĩnh là chất lỏng cố định trên một chất mang rắn trơ
hoặc tẩm trên một chất rắn xốp hoặc ghép trên chất rắn.

Sự tách dựa trên hệ số phân bố của chất tan trong hai pha
lỏng.

 Sắc kí phân bố li tâm (Centrifugal Partition Chromatography):
Pha tĩnh được giữ trong máy bằng lực li tâm.
Pha động được bơm qua pha tĩnh.

9


Mẫu phân tích

1. Pha tĩnh được làm đầy trong máy
(pha tĩnh nhẹ)
2. Bơm mẫu phân tích
Pha động
nặng hơn

3. Rửa giải bằng pha động nặng hơn
theo chế độ đẩy xuống

Pha động
nặng hơn

4. Các cấu tử được tách ra tùy theo ái
lực của chúng đối với mỗi một pha

C. Roullier et al. / J. Chromatogr. B 877 (2009) 2067–2073

10


- Sắc kí rây phân tử (Sắc kí loại cỡ):
Pha tĩnh là chất rắn xốp: chất tan có kích thước lớn bị rửa

giải trước; chất tan có kích thước nhỏ phân tán trên pha tĩnh và
tách ra sau.

Thứ tự rửa giải trên cột

11


1.2.1. Sắc kí lỏng:
 Sắc kí hấp phụ:

Pha tĩnh là chất hấp phụ rắn, phân cực (silica gel hoặc
nhôm oxit)  Hấp phụ pha thường.
Pha tĩnh có thể thay đổi để trở nên kém phân cực  Hấp

phụ pha đảo.

Sự hấp phụ của chất tan và pha tĩnh: hấp phụ vật lí hoặc
hấp phụ hóa học  Sự tách của các cấu tử dựa trên hệ số hấp
phụ.

12


1.2.1. Sắc kí lỏng:
 Sắc kí trao đổi ion:
Pha tĩnh là nhựa trao đổi ion: các polyme có chứa các
nhóm ion: chất có khả năng trao đổi cation gọi là cationit; chất có
khả năng trao đổi anion gọi là anionit

Lực liên kết giữa ion chất tan và pha tĩnh chủ yếu là liên
kết tĩnh điện, phụ thuộc vào điện tích của ion chất tan, pH của
dung dịch và bán kính hidrat hóa của các ion chất tan.

13


1.2.1. Sắc kí lỏng:
 Sắc kí ái lực:
Pha tĩnh là một chất mang rắn mà trên đó người ta cố định
một thành phần có ái lực đối với một chất tan của mẫu phân tích
(ái lực giưa enzym - cơ chất, hormon – recepteur, kháng nguyên

– kháng thể…)

Chất gây
nhiễu

Sự gắn vào của
thành phần cần
phân tích

Sự tinh chế

Sự tách
thành phần
cần phân tích
14


1.2.2. Sắc kí khí: Pha động là khí mang
 Sắc kí phân bố: Sắc kí khí – lỏng

Pha tĩnh là chất lỏng cố định trên một chất mang rắn trơ
hoặc tẩm trên một chất rắn xốp hoặc ghép trên chất rắn.
 Sắc kí hấp phụ: Sắc kí khí – rắn
Pha tĩnh là chất rắn xốp; dùng để phân tích hỗn hợp khí
hoặc lỏng có nhiệt độ sơi thấp.

15


1.3. Lựa chọn phương pháp
 Tính chất của chất phân tích:

Chất tan là chất khí; chất lỏng dễ bay hơi; chất lỏng ít bay
hơi; chất rắn; phân tử lượng lớn; chất hữu cơ; hợp chất ion; độ

phân cực…
 Mục đích phân tích:
Nhận dạng một thành phần trong một hỗn hợp; cần thiết
hay khơng sự liên kết sắc kí với một phương pháp phổ; kiểm tra
độ tinh khiết; tinh chất sản phẩm (sắc kí điều chế); theo dõi một
phản ứng hóa học để tối ưu hóa điều kiện; định lượng…
16


1.3. Sắc kí đồ
 Sắc kí đồ: Đường cong thể hiện sự biến đổi theo thời gian liên

quan đến nồng độ của chất tan ở đầu cột tùy theo thời gian rửa
giải.
 Sự rửa giải: Sự kéo chất tan qua pha tĩnh bằng pha động
 Phân tích sắc kí đồ: Cho phép phân tích:

Định tính: Dựa vào vị trí pic của phân tích
Định lượng: Dựa trên diện tích pic của chất phân tích

17


Mẫu phân
tích

Pha động

Cột sắc kí

Đầu dị

Sắc kí đồ

Thời gian

18


t0: thời gian bắt đầu đưa mẫu lên cột
Vm : thể tích chết của cột
tm : thời gian chết

VR: thể tích lưu của một chất
h

W1/2

VR = tR. F với F là tốc độ chảy của
pha động
tR : Thời gian lưu của một chất
V’R = VR – Vm thể tích lưu hiệu chỉnh

t (phút) t’ = t + t thời gian lưu hiệu chỉnh
R
R
m

W

W: độ rộng của pic
tm (Vm)

t’R (V’R)

W1/2: độ rộng pic ở nửa chiều cao
h: chiều cao của pic

tR (VR)

 Hệ số dung lượng k’:
Hay

1 < k’ < 10 đổi với
những chất tan khác
nhau trong một hỗn

hợp

19


1.4. Hiệu quả của cột
1.4.1. Đĩa lí thuyết

 Đĩa lí thuyết n: phần nhỏ của cột có thể đạt được khi đạt
được sự cân bằng phân bố chất tan.

n càng lớn, pic càng hẹp

20


1.4.2. Hệ số tách 
 : cho phép xác định chính xác mối liên hệ về vị trí của hai
pic liền kề.
: phụ thuộc vào hệ số phân bố của hai chất đó.

21


1.4.2. Độ phân giải và cách cải thiện độ phân giải
 Độ phân giải R: Mức độ tách của các cấu tử ra khỏi nhau

22


 Cách cải thiện độ:
- Dựa trên sự thay đổi cấu trúc của cột:
+ Tăng chiều dài cột.
+ Sử dụng chất nhồi có kích thước hạt nhỏ hơn, đồng đều hơn
+ Thay đổi pha tĩnh.
+ Giảm đường kính cột.

- Dựa trên thay đổi vận hành cột:
+ Tối ưu hóa tốc độ pha động.
+ Giảm lượng mẫu.
+ Giảm nhiệt độ cột.
+ Thay đổi thành phần pha động.
23

Hiệu quả của chiều dài cột đối với sự phân giải
24


1.5. Tối ưu hóa q trình sắc kí
 Tối ưu hóa: Chọn điều kiện tốt nhất để thực hiện tốt qui trình
sắc kí: tách thành cơng một hoặc nhiều cấu tử mong muốn trong
thời gian ngắn nhất.
 Độ phân giải và thời gian lưu: hai yếu tố quan trọng nhất

Sắc kí đồ của một q trình tách. Pha động là hỗn hợp của
nước/acetonitrin : a) 50/50 ; b) 55/45 ; c) 60/40 ; d) 65/35

25