Nghiên cứu xây dựng quy trình công nghệ thu nhận isoflavone từ một số nguồn thực vật và ứng dụng sản xuất thực phẩm chức năng

ĐẠI HỌC ĐÀ NẴNG
TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA


TRẦN THỊ NGỌC THƯ

NGHIÊN CỨU XÂY DỰNG QUY TRÌNH CƠNG NGHỆ
THU NHẬN ISOFLAVONE TỪ MỘT SỐ NGUỒN THỰC VẬT
VÀ ỨNG DỤNG SẢN XUẤT THỰC PHẨM CHỨC NĂNG

LUẬN ÁN TIẾN SỸ KỸ THUẬT

Đà Nẵng, 2022


ĐẠI HỌC ĐÀ NẴNG
TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA


TRẦN THỊ NGỌC THƯ

NGHIÊN CỨU XÂY DỰNG QUY TRÌNH CƠNG NGHỆ
THU NHẬN ISOFLAVONE TỪ MỘT SỐ NGUỒN THỰC VẬT
VÀ ỨNG DỤNG SẢN XUẤT THỰC PHẨM CHỨC NĂNG
Chuyên ngành : Công nghệ thực phẩm
Mã số

: 9 54 01 01

CÁN BỘ HƯỚNG DẪN KHOA HỌC:
Hướng dẫn 1: PGS.TS. TRƯƠNG THỊ MINH HẠNH

Hướng dẫn 2: TS. BÙI XUÂN VỮNG

Đà Nẵng, 2022


i

LỜI CAM ĐOAN
Tơi xin cam đoan đây là cơng trình nghiên cứu của bản thân. Các kết quả
nghiên cứu trong luận án này là trung thực và chưa được công bố trong bất kì cơng
trình khoa học nào khác.
Tác giả thực hiện Luận án


ii

LỜI CẢM ƠN
Trước tiên, cho phép tôi được bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến PGS.TS.
Trương Thị Minh Hạnh – Đại học Bách khoa – Đại học Đà Nẵng, TS. Bùi
Xuân Vững – Đại học Sư phạm Đà Nẵng – Đại học Đà Nẵng đã nhận hướng dẫn,
định hướng nội dung khoa học và giúp đỡ tôi đầy trách nhiệm trong suốt q trình
hồn thành luận án.
Xin được bày tỏ lòng cảm ơn chân thành đến Ban giám đốc Đại học Đà Nẵng,
Ban giám hiệu các trường Đại học Bách khoa, Đại học Sư phạm, Đại học Sư
phạm Kỹ thuật cùng các phòng Ban, Khoa và đồng nghiệp của các Trường đã tạo
mọi điều kiện thuận lợi giúp tôi hoàn thành nội dung nghiên cứu.
Xin được bày tỏ sự mến mộ và lịng tri ân đến: Bộ mơn Cơng nghiệp Dược –
Đại học Dược Hà Nội; Phịng thí nghiệm hoạt tính sinh học – Viện Cơng nghệ
Sinh học – Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam; Trung tâm nghiên
cứu và ứng dụng đậu nành Vinasoy (VSAC); Quỹ đổi mới sáng tạo Vingroup

(VINIF) và GS.TS. Pau Loke Show – Đại học Nottingham – Malaysia đã đồng
hành hỗ trợ phương pháp nghiên cứu chuyên sâu có liên quan đến nội dung trong
luận án, cũng như tài trợ một phần kinh phí trong tiến trình thực nghiệm.
Xin trân trọng cảm ơn các GS, PGS, TS là chủ tịch, phản biện và ủy viên hội
đồng đã dành nhiều thời gian quý báu để đọc, nhận xét và tham gia hội đồng chấm
luận án này.
Cuối cùng, xin được tri ân thân thiết đến gia đình, bạn bè đã ln quan tâm,
động viên, khích lệ và hỗ trợ đầy hiệu quả giúp tơi trong suốt tiến trình hồn thành
luận án.
Nghiên cứu sinh


iii

MỤC LỤC
Trang
LỜI CAM ĐOAN ....................................................................................................... i
LỜI CẢM ƠN ............................................................................................................ii
MỤC LỤC ................................................................................................................ iii
DANH MỤC CÁC BẢNG BIỂU ...........................................................................vii
DANH MỤC CÁC HÌNH ......................................................................................... x
MỘT SỐ CHỮ VIẾT TẮT .................................................................................... xiv
MỞ ĐẦU .................................................................................................................... 1
1. Lý do chọn đề tài ................................................................................................ 1
2. Mục tiêu nghiên cứu ........................................................................................... 2
3. Nội dung nghiên cứu........................................................................................... 3
4. Phương pháp nghiên cứu .................................................................................... 3
5. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài ............................................................ 5
6. Bố cục của luận án .............................................................................................. 5
CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN ..................................................................................... 7

1.1. Giới thiệu về isoflavone ....................................................................................... 7
1.1.1. Cấu trúc hóa học của isoflavone ................................................................... 7
1.1.2. Công dụng của isoflavone trong sản xuất thực phẩm bảo vệ sức khỏe ........ 8
1.2. Một số nguồn thực vật giàu isoflavone .............................................................. 12
1.2.1. Đậu nành (Glycine max (L) Merrill) .......................................................... 12
1.2.2. Sắn dây (Pueraria benth thomsonii Benth) ................................................ 12
1.2.3. Đậu xanh (Vigna radiata L. Wilczek) ......................................................... 13
1.2.4. Bã đậu nành ................................................................................................ 13
1.2.5. Cỏ ba lá đỏ (Trifolium pratense L) ............................................................. 14
1.3. Cơ sở về công nghệ thu nhận isoflavone ........................................................... 14
1.3.1. Xử lý nguyên liệu ....................................................................................... 15
1.3.2. Trích ly ........................................................................................................ 15


iv
1.3.3. Thủy phân glycoside ................................................................................... 17
1.3.4. Tinh sạch ..................................................................................................... 17
1.3.5. Hồn thiện sản phẩm .................................................................................. 18
1.4. Tình hình nghiên cứu trong và ngồi nước về cơng nghệ thu nhận và ứng dụng
sản xuất thực phẩm bảo vệ sức khỏe bổ sung isoflavone ......................................... 18
1.4.1. Tình hình nghiên cứu trên thế giới ............................................................. 18
1.4.2. Tình hình nghiên cứu trong nước ............................................................... 22
CHƯƠNG 2. NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU .............. 25
2.1. Nguyên liệu, hóa chất và thiết bị ........................................................................ 25
2.1.1. Nguyên liệu ................................................................................................. 25
2.1.2. Hóa chất, chế phẩm sinh học và nhựa macroporous .................................. 26
2.1.3. Thiết bị sử dụng chính ................................................................................ 28
2.2. Nội dung nghiên cứu và bố trí thí nghiệm ......................................................... 28
2.2.1. Đánh giá hàm lượng isoflavone và và một số thành phần hóa học của một
số nguồn thực vật .................................................................................................. 30

2.2.2. Khảo sát các phương pháp trích ly isoflavone từ hạt và bã đậu nành ........ 30
2.2.3. Khảo sát một số phương pháp tinh chế và nâng cao hoạt tính cao
isoflavone tinh chế ................................................................................................ 31
2.2.4. Kiểm tra hoạt tính sinh học và tính an tồn thực phẩm của cao isoflavone
(TN7) .................................................................................................................... 32
2.2.5. Đề xuất quy trình cơng nghệ thu nhận isoflavone từ hạt và bã đậu nành ... 32
2.2.6. Ứng dụng cao isoflavone để sản xuất thực phẩm bảo vệ sức khỏe ............ 32
2.2.7. Đề xuất giải pháp tận thu phụ phẩm bột đậu nành sau trích ly isoflavone . 34
2.3. Phương pháp nghiên cứu .................................................................................... 34
2.3.1. Phương pháp phân tích các chỉ tiêu ............................................................ 34
2.3.2. Phương pháp toán học ................................................................................ 37
2.3.3. Phương pháp đánh giá cảm quan ................................................................ 41
2.3.4. Phương pháp xử lý số liệu .......................................................................... 41


v
CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ......................................................... 42
3.1. Đánh giá hàm lượng isoflavone và thành phần hóa học từ một số nguyên liệu
thực vật ...................................................................................................................... 42
3.1.1. Hàm lượng isoflavone................................................................................. 42
3.1.2. Thành phần hóa học của nguyên liệu ......................................................... 45
3.2. Ảnh hưởng của một số phương pháp trích ly đến hiệu quả thu nhận isoflavone
từ hạt đậu nành .......................................................................................................... 47
3.2.1. Phương pháp chiết khuấy............................................................................ 47
3.2.2. Phương pháp dùng sóng siêu âm ................................................................ 52
3.2.3. So sánh hiệu quả thu nhận isoflavone từ 2 phương pháp trích ly ............... 55
3.3. Tối ưu hóa điều kiện trích ly isoflavone từ hạt và bã đậu nành bằng phương
pháp chiết khuấy ....................................................................................................... 57
3.3.1. Hạt đậu nành ............................................................................................... 57
3.3.2. Bã đậu nành ................................................................................................ 61

3.4. Ảnh hưởng của phương pháp tinh chế cao isoflavone thô thu nhận từ hạt và bã
đậu nành .................................................................................................................... 64
3.4.1. Tinh chế cao isoflavone thô thu nhận từ hạt đậu nành bằng phương pháp
trích ly lỏng-rắn .................................................................................................... 64
3.4.2. Khảo sát một số loại nhựa macroporous dùng tinh chế isoflavone từ hạt
đậu nành ................................................................................................................ 66
3.4.3. Nghiên cứu tinh chế isoflavone từ cao thô thu nhận từ hạt đậu nành bằng
nhựa macroporous D101 ....................................................................................... 69
3.4.4. Nâng cao hàm lượng aglycone trong cao isoflavone tinh chế bằng chế
phẩm enzyme cellulase ......................................................................................... 76
3.4.5. Nghiên cứu tinh chế isoflavone thu nhận từ bã đậu nành bằng nhựa
macroporous D101 ................................................................................................ 81
3.5. Kiểm tra hoạt tính sinh học và tính an toàn thực phẩm của cao isoflavone ...... 85
3.5.1. Kiểm tra hoạt tính sinh học của cao isoflavone .......................................... 86


vi
3.5.2. Kiểm tra tính an tồn thực phẩm của cao isoflavone.................................. 93
3.6. Đề xuất quy trình thu nhận isoflavone từ hạt và bã đậu nành ............................ 97
3.7. Ứng dụng cao isoflavone trong sản xuất thực phẩm bảo vệ sức khỏe ............... 99
3.7.1. Thử nghiệm sản xuất sữa chua đậu nành nước cốt dừa bổ sung isoflavone
thu nhận từ đậu nành ............................................................................................. 99
3.7.2. Thử nghiệm sản xuất nectar chanh dây bổ sung cao isoflavone tinh chế từ
bã đậu nành ......................................................................................................... 115
3.8. Đề xuất giải pháp tận thu phụ phẩm bột đậu nành sau trích ly isoflavone ...... 130
3.8.1. Chỉ tiêu chất lượng phụ phẩm của phụ phẩm bột đậu nành ..................... 130
3.8.2. Đề xuất quy trình cơng nghệ chế biến các sản phẩm thực phẩm từ phụ
phẩm bột đậu nành sau trích ly ........................................................................... 131
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ .............................................................................. 134
DANH MỤC CÁC CƠNG TRÌNH ĐÃ CƠNG BỐ ........................................... 138

TÀI LIỆU THAM KHẢO .................................................................................... 140


vii

DANH MỤC CÁC BẢNG BIỂU
Số hiệu

Tên bảng

bảng

Trang

2.1

Đặc tính vật lý của các loại nhựa macroporous

27

2.2

Các thiết bị sử dụng trong nghiên cứu

28

2.3

Mức quy hoạch thực nghiệm của các yếu tố

37

3.1

Thành phần và hàm lượng nhóm isoflavone đậu nành hạt

42

3.2

Thành phần và hàm lượng nhóm isoflavone củ sắn dây

44

3.3

Thành phần và hàm lượng nhóm isoflavone bã đậu nành

45

3.4

Thành phần hóa học của các loại nguyên liệu trong nghiên cứu

45

3.5

Hàm lượng của 6 hợp chất isoflavone ở các mẫu phân tích

47

3.6

3.7

3.8
3.9
3.10

3.11
3.12
3.13

3.14

Hiệu quả qt gốc tự do DPPH• của các dịch trích ly ứng với
mỗi phương pháp
Kết quả thực nghiệm hàm lượng thu nhận isoflavone từ hạt đậu
nành theo mơ hình thí nghiệm TYT 23
Kết quả phân tích phương sai hàm lượng isoflavone tổng trích
ly từ hạt đậu nành (Minitab 18)
Bảng quy hoạch theo hướng gradient từ hạt đậu nành
Kết quả thực nghiệm theo mơ hình thí nghiệm TYT23 của hàm
lượng isoflavone từ bã đậu nành
Kết quả phân tích phương sai hàm lượng isoflavone trích ly ở
bã đậu nành (Minitab 18)
Bảng quy hoạch theo hướng gradient từ bã đậu nành
Các thông số đẳng nhiệt hấp phụ Langmuir và Freundlich của
isoflavone thu nhận từ hạt đậu nành

Các đại lượng hấp phụ trên cột mở D101 isoflavone hạt đậu
nành

56

58

58
60
61

62
63
70

73


viii
Số hiệu

Tên bảng

bảng
3.15
3.16
3.17

3.18

3.19

Các đại lượng giải hấp phụ trên cột nhồi D101 của isoflavone
thu nhận từ hạt đậu nành
Thành phần cao isoflavone tinh chế và thô từ hạt đậu nành
Các thông số đẳng nhiệt hấp phụ Langmuir và Freundlich của
isoflavone từ bã đậu nành
Các đại lượng hấp phụ của sắc kí cột mở D101 (isoflavone bã
đậu nành)
Các đại lượng giải hấp phụ trên cột mở D101 của isoflavone
thu nhận bã đậu nành

Trang

74
74
82

83

84

3.20

Thành phần cao isoflavone tinh chế và cao thô từ bã đậu nành

85

3.21

Tỉ lệ tế bào tăng sinh dưới tác động của các mẫu nghiên cứu

86

3.22

Khối lượng chuột trước và sau thử nghiệm

88

3.23

Khối lượng tử cung chuột ở các lơ thí nghiệm

88

3.24

Hiệu quả bảo vệ tế bào HepG2 của các mẫu nghiên cứu

91

3.25
3.26
3.27

Khả năng ức chế quá trình peroxy hóa lipid của các mẫu
nghiên cứu trên dịch đồng thể gan
Giá trị IC50 % của các mẫu
So sánh các chỉ tiêu hóa học của cao isoflavone thơ và tinh từ

hạt và bã đậu nành

92
93
94

3.28

Đặc tính cảm quan của các loại mẫu cao isoflavone

95

3.29

Chỉ tiêu vi sinh vật của các mẫu bột cao isoflavone

95

3.30

Khối lượng của chuột ở các lô thử nghiệm độc tính cấp

96

3.31
3.32

Ảnh hưởng của liều lượng nước cốt dừa bổ sung lên các chỉ
tiêu hóa lý của các mẫu sữa chua
Phân tích cảm quan các mẫu sữa chua đậu nành-nước cốt dừa

101
103


ix
Số hiệu

Tên bảng

bảng
3.33
3.34
3.35

3.36

3.37

3.38

Một số chỉ tiêu hóa lý của các mẫu sữa chua đậu nành-nước
cốt dừa
Hàm lượng isoflavone của sản phẩm mẫu sữa chua
Ảnh hưởng của thời gian bảo quản đến các chỉ tiêu hóa lý và
số lượng chủng VSV khởi động của sữa chua
Chất lượng cảm quan sữa chua đậu nành-dừa bổ sung
isoflavone theo thời gian bảo quản
Các chỉ tiêu hóa lý chất lượng sữa chua đậu nành nước cốt dừa
bổ sung isoflavone

Chỉ tiêu vi sinh vật của sản phẩm sữa chua đậu nành-nước cốt
dừa bổ sung isoflavone

Trang

105
105
107

109

110

110

3.39

Kí hiệu các mẫu bổ sung GG-NaC

119

3.40

So sánh các chỉ tiêu giữa các mẫu nectar chanh dây

122

3.41

3.42

3.43

3.44
3.45
3.46
3.47

Thành phần các isoflavone trong nectar chanh dây bổ sung
isoflavone
Ảnh hưởng của thời gian bảo quản đến các chỉ tiêu hóa lý của
nectar chanh dây bổ sung isoflavone
Ảnh hưởng thời gian bảo quản đến các đặc tính cảm quan
nectar chanh dây
Các chỉ tiêu hóa lý chất lượng nectar chanh dây giàu
isoflavone
Chỉ tiêu vi sinh vật của nectar chanh dây bổ sung isoflavone
Thành phần hóa học của bột đậu nành trước và sau khi trích ly
isoflavone
Thành phần các acid béo trong các mẫu dầu trích ly

123

124

125

125
126
130

131


x

DANH MỤC CÁC HÌNH
Số hiệu

Tên hình

hình
1.1
1.2
1.3

Cơng thức cấu tạo của các hợp chất isoflavone trong đậu
nành
Sơ đồ chuyển hóa giữa các hợp chất isoflavone
Cơng thức cấu tạo và cấu hình khơng gian của 17-estradiol

Trang

7
8
9

và S-equol
1.4

1.5

Quy trình tổng qt sản xuất chế phẩm isoflavone thương
mại
Yếu tố ảnh hưởng đến hiệu quả trích ly (phương pháp truyền
thống)

14

15

2.1

Nguyên liệu giàu isoflavone dùng trong nghiên cứu

25

2.2

Các loại nhựa macroporous sử dụng

27

2.3

Sơ đồ tóm tắt nội dung nghiên cứu và bố trí thí nghiệm

29

3.1

Sắc ký đồ HPLC isoflavone đậu nành

42

3.2

Sắc ký đồ HPLC isoflavone đậu xanh

43

3.3

Sắc ký đồ HPLC isoflavone của củ sắn dây

44

3.4

Sắc ký đồ HPLC isoflavone bã đậu nành

45

3.5

3.6

3.7

3.8

Ảnh hưởng của nồng độ ethanol đến khả năng thu nhận
isoflavone
Ảnh hưởng của tỉ lệ dung môi/nguyên liệu đến khả năng thu
nhận isoflavone
Ảnh hưởng của nhiệt độ trích ly đến khả năng thu nhận
isoflavone
Ảnh hưởng của thời gian trích ly đến khả năng thu nhận
isoflavone

48

49

50

51


xi
Số hiệu

Tên hình

hình
3.9

3.10

3.11

3.12

3.13

3.14

Ảnh hưởng của điều kiện siêu âm đến hàm lượng glycoside
của các mẫu phân tích
Ảnh hưởng của mức NLSA và thời gian siêu âm đến hàm
lượng aglycone của các mẫu phân tích
Ảnh hưởng của mức NLSA và thời gian siêu âm đến hàm
lượng isoflavone tổng của các mẫu phân tích
So sánh hiệu quả giữa các phương pháp trích ly đến hàm
lượng isoflavone
Phương trình hồi quy của isoflavone từ hạt đậu nành trên
mặt phẳng khơng gian 3 chiều.
Phương trình hồi quy của isoflavone từ bã đậu nành trên mặt
phẳng không gian 3 chiều

Trang

52

53

54

55

59

62

3.15

Hàm lượng isoflavone trong các mẫu cao phân đoạn

64

3.16

Hiệu suất thu hồi isoflavone trong cao trích ly phân đoạn

65

3.17

Sắc kí đồ HPLC của các dịch cân bằng và rửa giải D101

66

3.19

3.20

3.21

3.22

3.23

3.24

Đồ thị biểu diễn đại lượng giải hấp của các loại nhựa đối với
các isoflavone từ đậu nành.
Đường đẳng nhiệt hấp phụ Langmuir và Freundlich của
isoflavone hạt đậu nành trên nhựa D101
Ảnh hưởng của nồng độ ethanol đến khả năng giải hấp
isoflavone từ cao thô hạt đậu nành.
Đường cong hấp phụ trên sắc kí cột D101 của isoflavone từ
hạt đậu nành
Đường cong giải hấp phụ trên sắc kí cột D101 của
isoflavone từ hạt đậu nành
Các dịch và cao khô hạt đậu nành trước và sau tinh chế

68

69

71

72

73
75


xii
Số hiệu

Tên hình

hình
3.25

Ảnh hưởng của nồng độ enzyme đến hiệu quả chuyển hóa
glycoside

Trang

76

3.26

Ảnh hưởng của nồng độ cơ chất đến hiệu quả thủy phân

78

3.27

Sắc kí đồ HPLC mẫu dịch trước và sau thủy phân

79

3.28

Ảnh hưởng của thời gian thủy phân đến hiệu suất thủy phân

80

3.29

Tổng hợp kết quả tinh chế isoflavone từ hạt đậu nành

81

3.30

3.31

3.32

Đường đẳng nhiệt hấp phụ Langmuir và Freundlich trên
nhựa D101 của isoflavone từ bã đậu nành
Đường cong hấp phụ trên sắc kí cột D101 của isoflavone từ
bã đậu nành
Đường cong giải hấp phụ trên sắc kí cột D101 của
isoflavone từ bã đậu nành

82

83

84

3.33

Hình ảnh tử cung của chuột ở các lơ thí nghiệm

88

3.34

Hình ảnh nỗn trứng của chuột ở các lơ thí nghiệm

89

3.35

3.36

3.37

Tác động của các mẫu nghiên cứu đến sự phát triển của nang
trứng
Tác động của các mẫu nghiên cứu đến sự sản sinh estradiol
trong huyết thanh chuột
Khả năng bao vây gốc tự do DPPH• của các mẫu cao

89

90

93

isoflavone
3.38

Các mẫu cao isoflavone sấy thăng hoa từ hạt và bã đậu nành

95

3.39

Quy trình thu nhận isoflavone từ hạt và bã đậu nành

97

3.40

Hình ảnh các mẫu sữa chua đậu nành nước cốt dừa

103

3.41

Sắc ký đồ HPLC isoflavone của sữa chua SoCY và mẫu đối
chứng

105


xiii
Số hiệu

Tên hình

hình
3.42

3.43

3.44

Số lượng vi khuẩn lactic trong mẫu sữa chua theo thời gian
bảo quản.
Điểm thị hiếu các chỉ tiêu cảm quan sữa chua nước cốt dừa
bổ sung isoflavone và các mẫu đối chứng
Quy trình cơng nghệ chế biến sữa chua đậu nành nước cốt
dừa bổ sung isoflavone

Trang

108

111

113

3.45

Độ lắng của các mẫu nectar chanh dây

116

3.46

Các mẫu nectar chanh dây bổ sung gellan gum

117

3.47

Độ nhớt của các mẫu nectar chanh dây

118

3.48
3.49
3.50

3.51

3.52

3.53

3.54

Ảnh hưởng của liều lượng GG-NaC đến chỉ số độ lắng các
mẫu nectar chanh dây theo thời gian bảo quản
Các mẫu nectar chanh dây bổ sung GG- NaC
Ảnh hưởng của liều lượng GG-NaC đến độ nhớt biểu kiến
của các mẫu nectar chanh dây theo thời gian bảo quản
Điểm thị hiếu các chỉ tiêu cảm quan của nectar chanh dây bổ
sung isoflavone và mẫu đối chứng
Quy trình cơng nghệ chế biến nectar chanh dây bổ sung
isoflavone
Quy trình cơng nghệ chế biến sản phẩm thực phẩm từ phụ
phẩm bột đậu nành
Phụ phẩm bột đậu nành trước và sau khi trích ly chất béo và

sản phẩm dầu đậu nành so với bột đậu nành nguyên liệu

120
120
121

127

128

132

132


xiv

MỘT SỐ CHỮ VIẾT TẮT
Chữ viết tắt bằng tiếng Việt
DM

: Dung môi

DM/NL

: Tỉ lệ Dung môi/Nguyên liệu

HL

: Hàm lượng

NL

: Nguyên liệu

NLSA

: Năng lượng siêu âm

TN

: Thí nghiệm

TYT23

: Quy hoạch thực nghiệm toàn phần 2 mức 3 yếu tố

VSV

: Vi sinh vật

Chữ viết tắt bằng tiếng Anh
ANOVA

: Analysis of Variance

AOAC

: Association of Official Analytical Chemists

ATPS

: Aqueous Two-Phase Extraction

BALB/c

: Bagg Albino/c mice

BV

: Bed-Volume

ACN

: Acetonitril

CH2Cl2

: Dichloromethane

CMC

: Carboxymethyl Cellulose

D

: Daidzin

De

: Daidzein

DMEM

: Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium

DMSO

: Dimethyl sulfoxide (CH3)2SO

DPPH

: 2,2-Diphenyl-2-picrylhydrazyl

EFSA

: European Food Safety Authority

ER

: Estrogen Receptor

EtOAC

: Ethyl Acetate


xv
EtOH

: Ethanol

FRAP

: Ferric Reducing Antioxidant Power

G

: Genistin

Ge

: Genistein

GG

: Gellan gum

Gle

: Glycitein

Gly

: Glycitin

HPLC

: High-Performance Liquid Chromatography

HRT

: Hormone Replacement Therapy

LDL

: Low density lipoprotein cholesterol

LOD

: Limit of Detector

LOQ

: Limit of Quantitation

MBMA

: Model Based Meta-Analysis

MCF-7

: Michigan Cancer Foundation-7

MDA

: Malondialdehyde

MeOH

: Methanol

NaC

: Natri Citrate (Na3C6H5O7)

PTFE

: Polytetrafluoroethylene

R2

: Regression Sum of Squares

RNI

: Recommended Nutrition Intakes

RSD

: Relative Standard Deviation

SD

: Standard Deviation


xvi
SDVB

: Polystyrene-Divinylbenzene

TLC

: Thin Layer Chromatography

TPTZ

: 2,4,6-Tripyridyl-s-triazine

UV

: Ultraviolet

VCD

: 4-Vinylcyclohexene Diepoxide

WHC

: Water Holding Capacity


1

MỞ ĐẦU
1. Lý do chọn đề tài
Nhiều quốc gia châu Á có tín ngưỡng đạo Phật như Trung Quốc, Nhật Bản,
Hàn Quốc từ bao đời nay sử dụng phổ biến dịng thực phẩm có nguồn gốc từ các
loại hạt họ đậu, đặc biệt là từ đậu nành [1][2]. Do đó, thực phẩm có xuất xứ thuần

thực vật này đã và sẽ là tâm điểm cho nhiều đề tài nghiên cứu chun sâu nhằm
khai thác những lợi ích cịn ẩn chứa nhiều tiềm năng chưa được biết đến. Ngày nay,
với sự tiến bộ của khoa học công nghệ, giá trị cốt lõi của các sản phẩm được sản
xuất từ đậu nành đã được khẳng định. Đây không chỉ là nguồn cung cấp hàm lượng
protein thực vật cùng với các khoáng chất cần thiết, mà nó cịn bổ sung nhiều kiến
thức mới cho nhân loại trong việc tìm nguồn và phương thức bổ sung các hoạt chất
mang hoạt tính sinh học mà đậu nành là đại diện tiêu biểu. Phát hiện này đã khơi
mào cho việc tìm kiếm nguồn isoflavone thực vật và sự ra đời dòng sản phẩm bảo
vệ sức khỏe có bổ sung hoạt chất này.
Isoflavone là các hợp chất chuyển hóa thứ cấp, được phân bố nhiều trong các
cây họ đậu Leguminosae như đậu nành, đậu trắng, củ sắn dây, cỏ linh lăng, cỏ ba lá
đỏ, đậu xanh và một lượng nhỏ isoflavone cũng được chứa trong các sản phẩm thực
vật khác như ở quả hạch [3][4]. Với cấu trúc hóa học gần với estrogen-nội tiết tố nữ
có vai trò quan trọng đối với phụ nữ tiền mãn kinh, isoflavone giúp chống lại các
triệu chứng như loãng xương, trầm cảm, ngăn ngừa các bệnh tim mạch, ung thư vú,
v.v…mà không gây tác dụng phụ như các loại hormone tổng hợp. Vì vậy isoflavone
được sử dụng phổ biến trên thế giới và trong nước dưới dạng các sản phẩm thực
phẩm chức năng, dược phẩm, mỹ phẩm, nước giải khát và đồ uống [3][5]. Ngành
công nghiệp thu nhận isoflavone hiện nay đã và đang ứng dụng nhiều phương pháp
trích ly, tinh chế nhằm đạt được hiệu quả thu nhận isoflavone cao nhất đồng thời
đảm bảo sự phát triển bền vững [6]. Isoflavone được chia thành 4 nhóm chính, trong
đó nhóm aglycone khơng chứa gốc đường, có hoạt tính sinh học cao nên cũng là
một phần cần quan tâm trong nghiên cứu tinh chế [7].
Tại Việt Nam, nguồn đậu nành hạt nói riêng và phong phú các loại thực vật


2

họ đậu và có sản lượng lớn. Theo báo cáo của Tổng cục Thống kê (GSO), sản lượng
đậu nành trung bình đạt 150 ngàn tấn/năm [8]. Do đó, những nghiên cứu theo định

hướng nêu trên có cơ sở để phát triển thành công và bền vững.
Mặc dù các nguồn nguyên liệu giàu isoflavone như đậu nành, củ sắn dây là
loại thực vật sẵn có ở nước ta, nhưng các nghiên cứu trong nước về thu nhận và sản
xuất thực phẩm chức năng giàu isoflavone cịn khá mới mẻ. Các cơng trình cơng bố
trong nước về isoflavone cịn ít, chủ yếu nghiên cứu về thành phần các hợp chất
isoflavone và trích ly isoflavone từ hạt đậu nành nảy mầm, củ sắn dây và các
phương pháp trích ly, tinh chế [9][10]. Bên cạnh đó, một lượng lớn các phế liệu
trong ngành chế biến các sản phẩm từ đậu nành hiện nay, cụ thể là bã đậu nành chỉ
dùng trong chăn nuôi gia súc hay làm phân bón, trong khi chúng vẫn cịn chứa một
lượng các chất dinh dưỡng đáng kể như protein, hàm lượng xơ, glucid v.v…và đặc
biệt là chứa isoflavone [11]. Ngoài ra, những nghiên cứu về thực phẩm bảo vệ sức
khỏe có bổ sung isoflavone ở Việt Nam chỉ mới dừng ở mức nghiên cứu cơ bản. Do
đó, các sản phẩm thực phẩm chức năng bổ sung isoflavone hiện nay trên thị trường
Việt Nam hầu hết đều là nhập ngoại giá thành cao, chưa có nhiều dịng sản phẩm
thực phẩm chức năng.
Do đó “Nghiên cứu xây dựng quy trình cơng nghệ thu nhận isoflavone từ
một số nguồn thực vật và ứng dụng sản xuất thực phẩm chức năng” nhằm mục đích
góp phần làm phong phú thêm định hướng nghiên cứu ứng dụng, tạo ra những sản
phẩm thực phẩm bảo vệ sức khỏe trên nguồn nguyên liệu sẵn có trong nước. Các
sản phẩm này với chất lượng đảm bảo sẽ tạo được sự cạnh tranh bền vững, đồng
thời giúp cho phụ nữ - chiếm tỉ lệ gần 50% của nhân loại sẽ trẻ hơn, đẹp hơn và
khỏe mạnh hơn.

2. Mục tiêu nghiên cứu
Mục tiêu tổng quát của luận án là xây dựng quy trình cơng nghệ thu nhận
isoflavone và quy trình sản xuất thực phẩm bảo vệ sức khỏe bổ sung isoflavone, góp
phần tạo ra các sản phẩm bảo vệ sức khỏe từ nguồn nguyên liệu dồi dào trong nước.
Từ đó, luận án đặt ra các mục tiêu cụ thể như sau:

3

1) Xây dựng quy trình cơng nghệ thu nhận isoflavone từ nguồn nguyên liệu
thực vật giàu isoflavone sẵn có tại khu vực miền Trung − Tây Nguyên, gồm có các
quá trình: trích ly, tinh chế và nâng cao hàm lượng hoạt tính sinh học cao isoflavone
2) Kiểm tra hoạt tính sinh học và an toàn thực phẩm của cao isoflavone
3) Ứng dụng sản xuất thực phẩm bảo vệ sức khỏe bổ sung isoflavone

3. Nội dung nghiên cứu
Nhiệm vụ nghiên cứu của đề tài nhằm giải quyết các nội dung sau đây:
- Đánh giá thành phần và hàm lượng isoflavone trong một số nguyên liệu thực
vật sẵn có tại khu vực miền Trung − Tây Nguyên
- Khảo sát một số phương pháp trích ly isoflavone từ hạt và bã đậu nành
- Khảo sát một số phương pháp tinh chế và nâng cao hoạt tính cao isoflavone.
- Kiểm tra hoạt tính sinh học và an toàn thực phẩm của cao isoflavone
- Đề xuất quy trình cơng nghệ thu nhận isoflavone từ hạt và bã đậu nành
- Ứng dụng cao isoflavone trong sản xuất thực phẩm bảo vệ sức khỏe
- Đề xuất giải pháp tận thu phụ phẩm bột đậu nành sau khi trích ly isoflavone

4. Phương pháp nghiên cứu
4.1. Phương pháp nghiên cứu lý thuyết
Thu thập, tổng hợp các tài liệu, sách báo, các cơng trình nghiên cứu khoa học
trong nước và ngoài nước về các vấn đề liên quan đến đặc tính và các phương pháp
xác định hoạt tính sinh học của isoflavone, phương pháp trích ly, tinh chế
isoflavone từ thực vật và các quy định đánh giá thực phẩm chức năng.

4.2. Phương pháp nghiên cứu thực nghiệm
- Các phương pháp trích ly isoflavone từ thực vật: với dung mơi sử dụng là
ethanol, sử dụng 2 phương pháp trích ly bằng chiết khuấy, sóng siêu âm. Hiệu quả
trích ly được đánh giá qua hàm lượng isoflavone trên hàm lượng chất khô của mẫu

ban đầu.
- Các phương pháp tinh chế isoflavone từ cao trích ly isoflavone thơ: phương
pháp trích ly lỏng-rắn, phương pháp sắc kí cột nhồi với nhựa hấp phụ macroporous.
Hiệu quả tinh chế được đánh giá qua hàm lượng isoflavone trong cao tinh chế và
hiệu suất thu hồi.


4

- Phương pháp khảo sát nâng cao hàm lượng aglycone: khảo sát điều kiện
thủy phân glycoside dựa vào nồng độ enzyme, hàm lượng isoflavone ban đầu, thời
gian thủy phân. Hiệu quả thủy phân được đánh giá qua hiệu suất thủy phân
isoflavone và hiệu suất gia tăng aglycone.
- Các phương pháp khảo sát tính an tồn thực phẩm và hoạt tính sinh học
của isoflavone tinh chế: khảo sát tính an tồn thực phẩm của isoflavone tinh chế
(hàm lượng kim loại nặng, độc tính cấp), các phương pháp khảo sát hoạt tính sinh
học của isoflavone tinh chế (hoạt tính estrogen, khả năng kháng oxi hóa thơng qua
khả năng bắt gốc tự do DPPH, v.v…).
- Các phương pháp sản xuất sản phẩm thực phẩm bảo vệ sức khỏe: Nghị
định chính phủ số 15/2018/NĐ-CP ngày 02/02/2018 của Chính phủ Quy định chi
tiết thi hành một số điều của Luật an tồn thực phẩm, Thơng tư số 43/2014/TT-BYT
ngày 24/11/2014 của Bộ Y tế Quy định về quản lý thực phẩm chức năng đã lựa
chọn ứng dụng sản xuất thực phẩm bảo vệ sức khỏe thuộc nhóm thực phẩm chức
năng. Khảo sát tỉ lệ bổ sung theo giới hạn cho phép, đề xuất quy trình cơng nghệ sản
xuất từ 1 đến 2 sản phẩm thực phẩm bảo vệ sức khỏe bổ sung isoflavone.
- Các phương pháp phân tích thành phần hóa học của ngun liệu: Xác định
độ ẩm, hàm lượng tinh bột, hàm lượng protein, hàm lượng tro tổng, hàm lượng chất
béo thô, hàm lượng xơ thơ, hàm lượng đường tổng, hàm lượng protein hịa tan, hàm
lượng polyphenol tổng.
- Các phương pháp phân tích các đặc tính hóa lý của sản phẩm thực phẩm.

- Phương pháp phân tích hàm lượng isoflavone bằng phương pháp sắc ký
lỏng hiệu năng cao HPLC ở các mẫu thí nghiệm.
- Các phương pháp xử lý số liệu: sử dụng các thuật toán quy hoạch thực
nghiệm trực giao cấp 1 và tối ưu hóa bằng phương pháp leo dốc Box-Wilson. Các
thí nghiệm đều được thực hiện ít nhất 3 lần, các số liệu đều được xử lý bằng phương
pháp phân tích phương sai ANOVA, so sánh sự khác nhau có nghĩa với trị số P ở
mức P  0,05. Phần xử lý số liệu được thực hiện trên phần mềm Minitab 18.


5

5. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài
5.1. Ý nghĩa khoa học của đề tài
Luận án đã sử dụng quy hoạch thực nghiệm toàn phần 23 và mơ hình thực
nghiệm leo dốc Box-Wilson để tìm điều kiện trích ly isoflavone tối ưu từ hạt và bã
đậu nành.
Luận án đã nghiên cứu cụ thể sự hấp phụ và giải hấp phụ các hợp chất
isoflavone từ cao trích ly hạt và bã đậu nành theo mơ hình hấp phụ đẳng nhiệt
Langmuir và Freundlich và trên mơ hình sắc kí cột đối với nhựa hấp phụ D101, là
cơ sở để xây dựng quy trình tinh chế quy mơ lớn.
Cao isoflavon thô và tinh chế thu nhận từ hạt và bã đậu nành đã được thử
nghiệm hoạt tính nội tiết tố và hoạt tính chống oxi hóa bằng các mơ hình in vitro,
in vivo khẳng định được các hoạt tính sinh học của isoflavone.
5.2. Ý nghĩa thực tiễn của đề tài
Luận án tập trung nghiên cứu nguồn nguyên liệu địa phương sẵn có, giá
thành thấp và tận dụng được nguồn phế liệu trong sản xuất sữa đậu nành, đậu phụ
để trích ly isoflavone-hoạt chất có giá trị sinh học cao.
Luận án xây dựng được quy trình thu nhận isoflavone từ hạt và bã đậu nành
với một số công đoạn được cải tiến: trích ly bằng chiết khuấy, tinh chế bằng nhựa
macroporous D101 và nâng cao hàm lượng aglycone bằng chế phẩm enzyme

Celluclast1.5L. Quy trình thu nhận isoflavone dễ vận hành, chi phí thấp, an tồn và
giảm thiểu ơ nhiễm mơi trường thông qua việc sử dụng dung môi ethanol và nước.
Hai sản phẩm thực phẩm bảo vệ sức khỏe bổ sung giàu isoflavone từ cao
isoflavone là sữa chua đậu nành nước cốt dừa và nectar chanh dây đã được đánh giá
đảm bảo các tiêu chuẩn trong nước.

6. Bố cục của luận án
Luận án gồm 137 trang, trong đó có 50 Bảng biểu, 62 Hình ảnh, được trình
bày theo các chương mục chính sau:
Mở đầu
Chương 1: TỔNG QUAN


6

Chương 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
Chương 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ
TÀI LIỆU THAM KHẢO
PHỤ LỤC


7

CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN
1.1. Giới thiệu về isoflavone
1.1.1. Cấu trúc hóa học của isoflavone
Isoflavone có cấu trúc cơ bản gồm 2 vòng benzene (A và B) nối với nhau bởi
một cầu ba carbon tạo thành dị vòng pyran (C). Trong cấu trúc của isoflavone, vòng
benzene B được nối ở vị trí thứ 3 thay vì vị trí số 2 của dị vòng C như các flavonoid

khác [3][12][7].

Nguồn: Rostagno M.A và cộng sự [7]
Hình 1.1: Cơng thức cấu tạo của các hợp chất isoflavone trong đậu nành
Các công thức cấu tạo phổ biến của isoflavone ở một số nguồn thực vật được
trình bày ở hình 1.1. Các gốc R1, R2, R3 như [-H], [-OCH3], [-C6O5H11] tạo nên các
hợp chất khác nhau của isoflavone. Trong đó, aglycone là dạng đơn giản, khơng liên
kết với phân tử đường, chiếm hàm lượng thấp. Trái lại dạng glycoside (dạng
aglycone liên kết với glucose bằng các liên kết -1,4-glycoside) hoặc dạng Cglycoside (puerarin) cùng các dạng este của glycoside là malonyl và acetyl
glycoside chiếm lượng lớn trong thực vật.
Các hợp chất isoflavone có khả năng hấp thụ ánh sáng tử ngoại ở bước
sóng max từ 250-270nm do có vịng phenol. Đặc điểm này được ứng dụng để phân
tích định tính, định lượng bằng phương pháp sắc kí lỏng hiệu năng cao (HPLC) vì
các hợp chất isoflavone khơng màu rất khó phát hiện [13].
Về độ ổn định, isoflavone dễ bị thối hóa bởi nhiệt độ và tia UV nên cần
được bảo quản trong bóng tối, nhiệt độ thấp [13][14]. Khi thực hiện q trình trích