KHẢ NĂNG KHÁNG OXY HÓA VÀ ỨC CHẾ ENZYME TYROSINASE CỦA CÂY DỨA (Ananas comosus).

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ

NGUYỄN THỊ THU HẬU

KHẢ NĂNG KHÁNG OXY HÓA VÀ ỨC CHẾ
ENZYME TYROSINASE CỦA CÂY DỨA
(Ananas comosus)
LUẬN ÁN TIẾN SĨ
CHUYÊN NGÀNH: CÔNG NGHỆ SINH HỌC
MÃ NGÀNH: 7420201

NĂM 2022


BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ

NGUYỄN THỊ THU HẬU
MÃ SỐ NCS: 0917003

KHẢ NĂNG KHÁNG OXY HÓA VÀ ỨC CHẾ
ENZYME TYROSINASE CỦA CÂY DỨA
(Ananas comosus)
LUẬN ÁN TIẾN SĨ
CHUYÊN NGÀNH: CÔNG NGHỆ SINH HỌC
MÃ NGÀNH: 7420201

NGƯỜI HƯỚNG DẪN
PGS.TS. TRẦN NHÂN DŨNG
PGS.TS. HUỲNH VĂN BÁ

NĂM 2022


Luận án

Trường Đại học Cần Thơ

LỜI CẢM ƠN
Trong thời gian học tập, nghiên cứu tại Viện Nghiên cứu và Phát triển
Công nghệ Sinh học - Trường Đại học Cần Thơ em đã nhận được sự hướng dẫn,
động viên, giúp đỡ của thầy cơ, gia đình, bạn bè cả về vật chất lẫn tinh thần. Em
xin gửi lời cảm ơn và ghi nhận những sự hỗ trợ, những lời động viên vơ cùng q
báu để em có được thành quả như ngày hôm nay.
Em xin chân thành cảm ơn Ban lãnh đạo Viện Nghiên cứu và Phát triển
Công nghệ Sinh học và tất cả thầy, cơ trong và ngồi Viện đã tận tình truyền đạt
và giúp đỡ em về chun mơn cũng như những khó khăn khác trong suốt q
trình theo học Nghiên cứu sinh tại Trường Đại học Cần Thơ.
Em xin gửi lời cảm ơn sâu sắc đến PGS. TS. Trần Nhân Dũng, PGS. TS.
Huỳnh Văn Bá, PGS. TS. Nguyễn Minh Chơn và TS. Nguyễn Đức Độ là những
người thầy đã truyền đạt cho em rất nhiều những kiến thức thực tế về nghiên cứu
Khoa học đồng thời các thầy cũng giúp đỡ em tháo gỡ những khó khăn trong
suốt quá trình nghiên cứu Luận án.
Xin cảm ơn Ban giám hiệu trường Đại học Kiên Giang, quý thầy cô giáo,
các bạn đồng nghiệp đã tạo điều kiện tốt nhất về thời gian, tinh thần giúp em
hoàn thành Luận án này.
Cuối cùng, con xin dành những lời cảm ơn sâu sắc nhất đến bố mẹ và các
em. Con cảm ơn bố mẹ đã luôn bên con, che chở, động viên con khi con mệt mỏi
và gục ngã. Con nhớ lắm câu nói của bố: “Thời bố mẹ ngày xưa khổ lắm khơng
có điều kiện đi học, các con bây giờ có điều kiện phải cố gắng…”. Cảm ơn gia

đình đã ln tin tưởng và ủng hộ con trên con đường mà con lựa chọn.
Một lần nữa con xin chân thành cảm ơn và xin chúc tất cả những người mà
con yêu thương luôn luôn vui vẻ, hạnh phúc và thành công.
Kiên Giang, ngày 02 tháng 04 năm 2022

Chuyên ngành Công nghệ sinh
học

i

Viện NC&PT Công nghệ sinh hoc


Luận án

Trường Đại học Cần Thơ

TÓM TẮT
Dứa là loại cây ăn quả có giá trị dinh dưỡng cao thuộc họ Bromeliaceae có
nguồn gốc từ Paraguay được trồng phổ biến ở nhiều vùng sinh thái khác nhau ở
Việt Nam. Mục tiêu của luận án là khảo sát khả năng kháng oxy hóa và ức chế
tyrosinase của cao chiết từ các bộ phận của cây dứa (lá, thân, thịt quả và vỏ
quả) ở Hòn Đất và Tắc Cậu thuộc tỉnh Kiên Giang. Luận án sử dụng phương
pháp định danh loài bằng phương pháp phân tích đặc điểm hình thái đồng thời
có kiểm định lại bằng phương pháp giải trình tự, trích ly cao bằng phương pháp
ngâm dầm kết hợp với đánh sóng siêu âm, khảo sát khả năng kháng oxy hóa in
vitro của các mẫu cao chiết được thực hiện thông qua ba phương pháp gồm:
phương pháp trung hòa gốc tự do DPPH (1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl);
phương pháp khử ion Fe3+ và phương pháp khử ion Cu2+, phương pháp khảo sát
ức chế hoạt động enzyme tyrosinase in vitro, phương pháp sắc ký cột silica gel

để tách cao phân đoạn vỏ dứa Tắc Cậu. Sử dụng phương pháp nuôi cấy tế bào
động vật, khảo sát sự ức chế hình thành melanin trên dịng tế bào hắc tố B16F10
và phân tích phổ GC-MS của cao phân đoạn có hoạt tính kháng oxy hóa và ức
chế tyrosinase mạnh. Kết quả nghiên cứu cho thấy, vùng sinh thái Tắc Cậu, Kiên
Giang và dung mơi methanol là thích hợp phục vụ nghiên cứu của luận án. Dựa
vào đặc điểm hình thái và trình tự gen ITS cho thấy dứa thuộc chi Ananas với tên
khoa học là (Ananas comosus (L.) Merr.). Kết quả định lượng cho thấy hàm
lượng polyphenol tổng cao nhất trong mẫu chiết xuất methanol lá còn hàm lượng
flavonoid tổng cao nhất trong mẫu methanol vỏ dứa. Kết quả kháng oxy hóa từ
ba phương pháp thử hoạt tính kháng oxy hóa khác nhau cho thấy kết khơng
giống nhau. Khả năng trung hòa DPPH của cao chiết methanol lá mạnh nhất so
với các mẫu còn lại, cao chiết lá- methanol có giá trị IC50 (nồng độ ức chế 50%)
là: 31,27 ± 3,91µg/mL, hoạt tính khử ion Fe3+, khử ion Cu2+ mạnh nhất là
chiết xuất vỏ-methanol với chỉ số IC50 lần lượt là: 97,72 ± 0,42; 220,95 ± 8,2.
Khảo sát hoạt tính ức chế tyrosinase in vitro cho thấy, chiết xuất vỏ-methanol có
hoạt tính mạnh nhất so với các chiết xuất thơ cịn lại nên chọn để trích ly cao
phân đoạn. Khảo sát hoạt tính kháng oxy hóa và ức chế tyrosinase của các cao
phân đoạn thu được cho thấy F1 có hoạt tính cao nhất. Hoạt tính kháng oxy hóa
của F1 qua hoạt tính khử DPPH, Cu2+ với giá trị IC50 lần lượt là: 14,52 ± 0,44;
18,78 ± 2,55 µg/mL và hoạt tính ức chế tyrosinase in vitro với giá trị IC50 là:
84,98 ± 5,06 µg/mL đồng thời trong in vivo (trên dòng tế bào sắc tố B16F10) ở
nồng độ 25 µg/mL đã ức chế sự sản sinh melanin 50,79%. Kết quả phân tích sắc
ký khí ghép khối phổ (GC-MS) của F1 có sự hiện diện của succinic acid, ferulic
acid, p-coumaric acid, cinnamic acid, 2-ethylhexyl benzoatelà những hợp chất
có khả năng kháng oxy hóa và ức chế tyrosinase mạnh. Kết quả nghiên cứu đã
cho thấy vỏ quả dứa là nguồn giàu hợp chất thứ cấp có hoạt tính kháng oxy hóa
và ức chế tyrosinase.
Từ khóa: Dứa, GC-MS, kháng oxy hóa, Tắc Cậu, tyrosinase

Chuyên ngành Công nghệ sinh

học

ii

Viện NC&PT Công nghệ sinh hoc


Luận án

Trường Đại học Cần Thơ

ABSTRACT
Pineapple is a fruit with high nutritional value belonging to the
Bromeliaceae family originating from Paraguay and cultivated grown in many
different ecological regions in Vietnam. The purpose of the thesis is Investigation
of antioxidant and tyrosinase inhibitory ability of extracts from parts of
Pineapple tree (leaves, stems, flesh and peel) in Hon Dat and Tac Cau in Kien
Giang province. The thesis uses the method of species identification by
morphological characterization at the same time with re-verification by
sequencing method, extraction by soaking method combined with ultrasonic
wave, investigation of the in vitro antioxidant capacity of the extracts was
carried out through three methods including: method to neutralize free radicals
DPPH (1,1-diphenyl-2- picrylhydrazyl); Fe3+ deionization activity method; Cu2+
deionization activity method; method to investigate the inhibition of tyrosinase
enzyme activity in vitro, silica gel column chromatography method to separate
high fractions of Tac Cau pineapple peel. Next, using the cell culture method and
investigating the inhibition of melanin formation on the melanoma cell line
B16F10 and the GC-MS spectral analysis method of the high fraction with strong
antioxidant activity and strong tyrosinase inhibitor. Research results show that,
Tac Cau, Kien Giang eco-regions and methanol solvent are suitable for the

research of the thesis. Based on the morphological characteristics and ITS gene
proved that Pineapple is Ananas genus with the scientific name (Ananas comosus
(L.) Merr). The quantitative results showed that, the highest total polyphenol
content in the high leaf methanol sample was also the highest total flavonoid
content in the pineapple peel methanol sample. Antioxidant results from three
different antioxidant activity assays showed dissimilar results. The ability to
neutralize DPPH of leaf methanol extract was strongest compared to other
samples, leaf-methanol extract had IC50 value (50% inhibitory concentration)
was: 31.27 ± 3.91 µg/mL, the most powerful Fe3+ deionization activity, the
strongest Cu2+ deionization activity is methanol-peel with IC50 value of 97.72 ±
0.42 respectively; 220.95 ± 8.2. Investigating the inhibitory activity of tyrosinase
in vitro showed that the shell-methanol extract has the strongest activity
compared to the remaining crude extracts, so it is recommended to prepare the
fractionation by silica gel column chromatography. Investigation of antioxidant
and tyrosinase inhibitory activities of the obtained fractions showed that had the
highest activity among the fractions. Antioxidant activity of F1 through reducing
activity of DPPH, Cu2+ with IC50 value is 14.52 ± 0.44 respectively; 18.78 ±
2.55 µg / mL and in vitro tyrosinase inhibitory activity with an IC50 value of:
84.98 ± 5.06 µg/mL simultaneously in vivo (on a B16F10 pigment cell line) at
concentration 25 µg/mL inhibited melanin production by 50.79%. Results of gas
chromatographic analysis of mass spectrometry (GC-MS) of F 1 in the presence of
Succinic acid, Ferulic acid, p-coumaric acid, Cinnamic acid, Benzoic acid, 2ethylhexyl are compounds with resistance oxidizes and inhibits tyrosinase
strongly. The results of the study showed that peel Pineapple is a rich source of
secondary compounds with antioxidant and tyrosinase inhibitory activity.
Keyword: Ananas comosus, antioxidant, GC-MS, Tac Cau, tyrosinase.
Chuyên ngành Công nghệ sinh
học

5

Viện NC&PT Công nghệ sinh hoc


LỜI CAM ĐOAN


MỤC LỤC

LỜI CẢM ƠN........................................................................................................ i
TÓM TẮT............................................................................................................. ii
ABSTRACT......................................................................................................... iii
LỜI CAM ĐOAN................................................................................................ iv
MỤC LỤC............................................................................................................. v
DANH SÁCH BẢNG.......................................................................................... ix
DANH SÁCH HÌNH............................................................................................ xi
DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT........................................................................... xii
CHƯƠNG 1: GIỚI THIỆU................................................................................... 1
1.1 Đặt vấn đề............................................................................................... 1
1.2 Mục tiêu luận án..................................................................................... 2
1.3 Nội dung nghiên cứu............................................................................... 2
1.4 Đối tượng và phạm vi nghiên cứu........................................................... 3
1.4.1 Đối tượng nghiên cứu...................................................................... 3
1.4.2 Phạm vi nghiên cứu......................................................................... 3
1.5 Ý nghĩa của nghiên cứu.......................................................................... 3
1.5.1 Ý nghĩa khoa học............................................................................. 3
1.5.2 Ý nghĩa thực tiễn............................................................................. 3
1.6 Tính mới của luận án.............................................................................. 3

CHƯƠNG 2: TỔNG QUAN TÀI LIỆU................................................................ 5
2.1 Tổng quan về cây dứa (Ananas comosus)............................................... 5

2.1.1 Nguồn gốc....................................................................................... 5
2.1.2 Phân Loại........................................................................................ 5
2.1.3 Đặc điểm sinh học của cây dứa....................................................... 6
2.1.4 Phân bố............................................................................................ 7
2.1.5 Công dụng....................................................................................... 8


Luận án

Trường Đại học Cần Thơ

2.2 Các nghiên cứu trong và ngoài nước....................................................... 9
2.2.1 Những nghiên cứu ngoài nước........................................................ 9
2.2.2 Những nghiên cứu trong nước....................................................... 14
2.3 Tổng quan về các hợp chất thứ cấp thực vật......................................... 16
2.3.1 Nhóm polyphenol.......................................................................... 19
2.3.2 Terpene và các dẫn xuất của terpene.............................................. 22
2.3.3 Saponin.......................................................................................... 23
2.3.4 Nhóm alkaloid............................................................................... 23
2.4 Tổng quan về kháng oxy hóa, chất kháng oxy hóa và cơ chế...............24
2.4.1 Khái quát về quá trình oxy hóa tế bào........................................... 24
2.4.2 Khái qt về gốc tự do................................................................... 25
2.4.3 Tác hại của gốc tự do đối với cơ thể.............................................. 26
2.4.4 Chất kháng oxy hóa....................................................................... 26
2.4.5 Cơ chế hoạt động của các chất kháng oxy hóa tự nhiên................ 27
2.5 Tổng quan về tyrosinase, cơ chế hoạt động và chất ức chế tyrosinase 33
2.5.1 Tổng quan về enzyme tyrosinase................................................... 33
2.5.2 Cơ chế hoạt động của tyrosinase................................................... 36
2.5.3 Các yếu tố ảnh hưởng đến hoạt động của tyrosinase.....................37
2.5.4 Các chất ức chế Tyrosinase............................................................ 38

2.5.5 Cơ chế ức chế enzyme tyrosinase.................................................. 39
2.5.6 Tiềm năng sử dụng các chất ức chế tyrosinase.............................. 40
2.6 Tổng quan về melanocyte, cơ chế hoạt động và chất ức chế.................41
2.6.1 Tế bào hắc tố................................................................................. 41
2.6.2 Cơ chế hoạt động của melanocyte................................................. 42
2.7 Tổng quan về các phương pháp định danh thực vật.............................. 45
2.7.1 Nhận diện và định danh thực vật bằng đặc điểm hình thái............45
2.7.2 Nhận diện và định danh thực vật bằng di truyền phân tử...............45
2.8 Phương pháp chiết xuất và phân tách các hợp chất từ thực vật.............46
2.8.1 Phương pháp chiết xuất rắn-lỏng................................................... 46
Chuyên ngành Công nghệ sinh
học

vi

Viện NC&PT Công nghệ sinh hoc


Luận án

Trường Đại học Cần Thơ

2.8.2 Phương pháp chiết xuất hỗ trợ sóng siêu âm.................................46
2.8.3 Phương pháp sắc ký cột silica gel.................................................. 47
2.9 Tổng quan về các phương pháp định lượng, kháng oxy hóa, ức chế

enzyme tyrosinase (in vitro), phân tich khối phổ GC-MS...................................48
2.9.1 Các phương pháp định lượng hợp chất thứ cấp thực vật................48
2.9.2 Các phương pháp xác định hoạt tính kháng oxy hóa.....................49

CHƯƠNG 3: PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU................................................. 53
3.1 Phương tiện nghiên cứu........................................................................ 53
3.1.1 Thời gian và địa điểm.................................................................... 53
3.1.2 Nguyên vật liệu............................................................................. 53
3.1.3 Dụng cụ và thiết bị........................................................................ 53
3.1.4 Hóa chất........................................................................................ 54
3.2 Phương pháp nghiên cứu....................................................................... 54
3.2.1 Nội dung 1: Khảo sát chọn vùng nguyên liệu và dung mơi trích ly

cao chiết.

54

3.2.2 Nội dung 2: Đánh giá khả năng kháng oxy hóa và ức chế tyrosinase

của cao methanol dứa Tắc Cậu............................................................................ 63
3.2.3 Nội dung 3: Đánh giá khả năng kháng oxy hóa và ức chế tyrosinase

của cao phân đoạn dứa........................................................................................ 71
3.2.4 Nội dung 4: Khảo sát khả năng ức chế sự sản sinh melanin trên

dòng tế bào hắc tố B16F10 của cao phân đoạn F1....................................................................... 78
3.2.5 Nội dung 5: Phân tích phổ GC-MS của cao phân đoạn F1 vỏ dứa .79

3.3 Phương pháp xử lý số liệu..................................................................... 80
CHƯƠNG 4: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN....................................................... 81
4.1 Kết quả khảo sát chọn nguồn nguyên liệu............................................. 81
4.1.1 Kết quả kháng oxy hóa cao chiết ethanol dứa ở hai vùng sinh thái

Hòn Đất và Tắc Cậu............................................................................................ 81

4.1.2 Kết quả kháng oxy hóa cao chiết ethanol/methanol dứa vùng Tắc

Cậu, Kiên Giang.................................................................................................. 86
4.1.3 Kết quả giải trình tự gen cây dứa Tắc Cậu.................................... 91

Chuyên ngành Công nghệ sinh
học

vii

Viện NC&PT Công nghệ sinh hoc


Luận án

Trường Đại học Cần Thơ

4.2 Kết quả khả năng kháng oxy hóa và ức chế tyrosinase của cao methanol

dứa Tắc Cậu........................................................................................................ 93
4.2.1 Kết quả định lượng polyphenol tổng và flavonoid trong cao

methanol dứa ....................................................................................................... 93
4.2.2 Kết quả kháng oxy hóa của cao methanol dứa Tắc Cậu................ 97
4.2.3 Mối quan hệ giữa hàm lượng polyphenol tổng, flavonoid tổng với

khả năng kháng oxy hóa của cây dứa Tắc Cậu.................................................. 100
4.2.4 Kết quả ức chế tyrosinase của cao methanol dứa vùng Tắc Cậu .100
4.3 Kết quả kháng oxy hóa và ức chế tyrosinase của cao phân đoạn vỏ dứa.103
4.3.1 Kết quả sắc ký tách phân đoạn cao chiết methanol vỏ dứa..........103

4.3.2 Kết quả định lượng polyphenol tổng và flavonoid tổng trong cao
phân đoạn vỏ dứa.............................................................................................. 105
4.3.3 Kết quả kháng oxy hóa và ức chế tyrosinase của cao phân đoạn vỏ dứa

.............................................................................................................................106
4.3.4 Mối quan hệ giữa hàm lượng polyphenol tổng, flavonoid tổng với

khả năng kháng oxy hóa và ức chế tyrosinase của cao phân đoạn vỏ dứa.........110
4.4 Kết quả ức chế sự sản sinh melanin trên dòng tế bào sắc tố B16F10 của

cao phân đoạn F1 vỏ dứa................................................................................... 111
4.5 Kết quả phân tích phổ khối GC-MS mẫu cao phân đoạn F1 vỏ dứa.......114

CHƯƠNG 5: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT........................................................ 118
5.1 Kết luận............................................................................................... 118
5.2 Đề nghị............................................................................................... 118

TÀI LIỆU THAM KHẢO................................................................................. 120
DANH MỤC CÁC CÔNG TRÌNH ĐÃ CƠNG BỐ.......................................... 131
PHỤ LỤC A..............................................................................................................
PHỤ LỤC B: KẾT QUẢ THỬ TẾ BÀO B16F10 ...................................................
PHỤ LỤC C: XỬ LÝ THỐNG KÊ ..........................................................................
PHỤ LỤC D: GIẢI GC-MS .....................................................................................

Chuyên ngành Công nghệ sinh
học

10

Viện NC&PT Công nghệ sinh hoc

DANH SÁCH BẢNG
Bảng 2.1: Những hợp chất thực vật có hoạt tính kháng oxy hóa và ức chế
tyrosinase từ cây dứa................................................................................... 10
Bảng 2.3: Chức năng của một số hợp chất thực vật............................................. 18
Bảng 2.4: Danh sách các gốc tự do (ROS).......................................................... 25
Bảng 2.5: Cơ chế hoạt động của các chất kháng oxy hóa.................................... 28
Bảng 2.6: Các dung mơi có độ phân cực tăng dần theo hằng số điện môi và độ
nhớt của dung mơi....................................................................................... 48
Bảng 3.1: Bố trí thí nghiệm trích ly cao chiết lá, thân, thịt và vỏ dứa ở Hòn Đất
và Tắc Cậu trong ethanol............................................................................. 57
Bảng 3.2: Bố trí thí nghiệm điều chế cao chiết cao thơ lá, thân, thịt và vỏ dứa ở
vùng sinh thái, dung môi khác nhau............................................................ 60
Bảng 3.3: Thành phần phản ứng PCR................................................................ 62
Bảng 3.4: Sơ đồ bơm cao chiết, tyrosinase và L-Dopa trong thí nghiệm đánh giá
hoạt tính khử tyrosinase của cao chiết từ dứa.............................................. 70
Bảng 3.5: Tỷ lệ các dung môi sử dụng trong sắc ký cột silica gel vỏ dứa..........72
Bảng 4.1: Kết qủa thu mẫu, xử lý và trích ly cao chiết từ dứa tại Hòn Đất và Tắc
Cậu trong dung mơi ethanol........................................................................ 81
Bảng 4.2: Kết quả hoạt tính kháng oxy hóa của cao ethanol dứa thu tại vùng sinh
thái Hịn Đất và Tắc Cậu bằng phương pháp khử DPPH............................. 84
Bảng 4.3: Kết qủa thu mẫu, xử lý và trích ly cao chiết từ dứa tại Tắc Cậu trong
dung môi ethanol/methaol........................................................................... 87
Bảng 4.4: Hoạt tính kháng oxy hóa của cao ethanol và methanol dứa vùng sinh
thái Tắc Cậu, Kiên Giang............................................................................ 88
Bảng 4.5: Hàm lượng polyphenol tổng, flavonoid tổng của lá, thân, thịt quả và vỏ
dứa Tắc Cậu................................................................................................ 93
Bảng 4.6: Hoạt tính kháng oxy hóa của cao chiết methanol dứa.........................97
Bảng 4.7: Khả năng ức chế tyrosinase của các cao methanol dứa Tắc Cậu.......101

Bảng 4.8: Kết quả điều chế cao phân đoạn........................................................ 103
Bảng 4.9: Kết quả định lượng polyphenol tổng, flavonoid tổng của cao phân đoạn vỏ
dứa............................................................................................................. 105
Bảng 4.10: Hoạt tính kháng oxy hóa của cao phân đoạn vỏ dứa.......................107


Bảng 4.11: Khả năng ức chế tyrosinase của các cao phân đoạn vỏ dứa.............109
Bảng 4.12: Mối quan hệ giữa hoạt tính khử DPPH, khử Cu2+ và ức chế
tyrosinase.................................................................................................. 111
Bảng 4.13: Phần trăm ức chế sinh melanin của mẫu F1 so với đối chứng.........112
Bảng 4.14: Kết quả giải phổ GC-MS của cao phân đoạn F1 vỏ dứa..................114


Luận án

Trường Đại học Cần Thơ

DANH SÁCH HÌNH
Hình 1.1: Sơ đồ tóm tắt các nội dung nghiên cứu luận án....................................4
Hình 2.1: Cây dứa Ananas comosus..................................................................... 5
Hình 2.2: Sơ đồ phân loại các hợp chất thứ cấp thực vật.................................... 17
Hình 2.3: Công thức cấu tạo các hợp chất phenol phổ biến................................ 19
Hình 2.4: Cấu trúc cơ bản của flavonoid............................................................ 20
Hình 2.5: Cấu trúc cơ bản của terpene............................................................... 22
Hình 2.6: Cấu trúc của một số alkaloid phổ biến................................................ 24
Hình 2.7: Sơ đồ các cơ chế kháng oxy hóa của các hợp chất phenol..................29
Hình 2.8: Ức chế gốc tự do bởi flavonoid.......................................................... 30
Hình 2.9: Cơ chế hoạt động kháng gốc tự do của Vitamin C.............................. 31
Hình 2.10: Cấu trúc trung tâm hoạt động của enzyme tyrosinase.......................34
Hình 2.11: Trình tự các amino acid trong protein tạo nên hắc tố ở người...........35

Hình 2.12: Sơ đồ biểu diễn con đường sinh tổng hợp Melanin..........................36
Hình 2.13: Sự phân bố của tế bào hắc tố............................................................ 42
Hình 2.14: Sản xuất và phân bố tế bào hắc tố ở thượng bì.................................43
Hình 2.15: Cơ chế hoạt động của melanocyte tạo melanin................................. 44
Hình 2.16: Phản ứng khử DPPH (gốc tự do R⚫ = H⚫)....................................... 49
Hình 3.1: Mẫu lá ở đỉnh (a), thân (b), thịt quả (c) và vỏ (d) của dứa (Ananas
comosus (L.) Merr.)....................................................................................... 55
Hình 3.2: Đo độ ẩm nguyên liệu........................................................................ 56
Hình 3.3: Mẫu dứa thu tại Hòn Đất và Tắc Cậu trích ly trong ethanol...............56
Hình 4.1: Kết quả BLAST trình tự ITS của mẫu dứa theo dữ liệu từ NCBI........92
Hình 4.2: Các phân đoạn cao chiết thu nhận qua sắc ký trên silica gel từ cao
chiết methanol vỏ khô quả dứa.................................................................. 106
Hình 4.3: Tế bào B16F10 dưới tác dụng của cao phân đoạn F 1 vỏ dứa và đối
chứng......................................................................................................... 112
Hình 5.1: Sơ đồ tóm tắt tồn Luận án............................................................... 119

Chun ngành Cơng nghệ sinh
học

xi

Viện NC&PT Công nghệ sinh hoc


Luận án

Trường Đại học Cần Thơ

DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT
Ký hiệu

Nội dung viết tắt

CPĐ

Cao phân đoạn sắc ký cột silica gel

CT

Cao thơ

CTAB

Cetyl trimethyl ammonium bromide

DMSO

Dimethyl sulfoxide

DNA

Acid Deoxyribonucleotide

DPPH

α, α-diphenyl-β-picrylhydrazyl

E

Ethanol

EB

Extraction buffer

EU

Eumelanin

HĐ

Hịn Đất

MSH

Melanocyte – stimulating hormone

GC-MS

Gas chromatography - Mass spectrometry (Sắc ký lỏng ghép
khối phổ)

HCTCTV

Hợp chất thứ cấp thực vật

KOH

Kháng oxy hóa

IC50

Half maximal inhibitory concentration (Nồng độ ức chế 50%)

L_EHĐ

Cao ethanol lá vùng sinh thái Hòn Đất

L_ETC

Cao ethanol lá vùng sinh thái Tắc Cậu

L_MHĐ

Cao methanol lá vùng sinh thái Hòn Đất

L_MTC

Cao methanol lá vùng sinh thái Tắc Cậu

L_EtOH

Cao lá_ethanol

L_MeOH

Cao lá_methanol

M

Methanol

MatK

MaturaseK

MBC

Minimun bactericidal concentration

MIC

Minimum inhibitory concentration

OD

Optical density (Mật độ quang)

Chuyên ngành Công nghệ sinh
học

xii

Viện NC&PT Công nghệ sinh hoc


Luận án

Trường Đại học Cần Thơ

Ký hiệu

Nội dung viết tắt

PU

Pheomelanin

PCR

Polymerase chain reaction (Phản ứng chuỗi polymerase)

ROS

Reactive oxigen species (Oxi phản ứng)

RNS

Reactive nitrogen species (Nitơ phản ứng)

T_EtOH

Cao thân_ethanol

T_MeOH

Cao thân_methanol

T_EHĐ

Cao ethanol thân vùng sinh thái Hòn Đất

T_ETC

Cao ethanol thân vùng sinh thái Tắc Cậu

T_MHĐ

Cao methanol thân vùng sinh thái Hòn Đất

T_MTC

Cao methanol thân vùng sinh thái Tắc Cậu

TQ_EtOH

Cao thịt quả_ethanol

TQ_MeOH

Cao thịt quả_methanol

TQ_EHĐ

Cao ethanol thịt quả vùng sinh thái Hòn Đất

TQ_ETC

Cao ethanol thịt quả vùng sinh thái Tắc Cậu

TQ_MHĐ

Cao methanol thịt quả vùng sinh thái Hòn Đất

TQ_MTC

Cao methanol thịt quả vùng sinh thái Tắc Cậu

TC

Tắc Cậu

TE

Tris-EDTA

TFC

Total flavonoid content (Hàm lượng flavonoid tổng)

TGLX

Tứ Giác Long Xuyên

TSH

Tây Sông Hậu

TPC

Total polyphenol content (Hàm lượng polyphenol tổng)

UV

Tia cực tím, tia tử ngoại

UVA

Ultraviolet Aging

UVB

Ultraviolet Burning

UVR

Ultraviolet Radiation

V_EtOH

Cao vỏ quả_ethanol

V_MeOH

Cao vỏ quả_methanol

Chuyên ngành Công nghệ sinh
học

xiii

Viện NC&PT Công nghệ sinh hoc


Luận án

Trường Đại học Cần Thơ

Ký hiệu

Nội dung viết tắt

V_EHĐ

Cao ethanol vỏ vùng sinh thái Hòn Đất

V_ETC

Cao ethanol vỏ quả vùng sinh thái Tắc Cậu

V_MHĐ

Cao methanol vỏ vùng sinh thái Hòn Đất

V_MTC

Cao methanol vỏ vùng sinh thái Tắc Cậu

VT

Vỏ dứa sử dụng phương pháp trích ly mẫu khi mẫu cịn tươi

VK

Vỏ dứa sử dụng phương pháp trích ly mẫu khi mẫu đã sấy khô

Chuyên ngành Công nghệ sinh
học

xiv

Viện NC&PT Công nghệ sinh hoc


Luận án

Trường Đại học Cần Thơ

CHƯƠNG 1: GIỚI THIỆU
1.1 Đặt vấn đề

Dứa (Ananas comosus (L.) Merr.) thuộc họ bromeliaceae có nguồn gốc
từ Paraguay là loại trái cây có giá trị dinh dưỡng cao đứng thứ ba trên thế giới
chỉ đứng sau chuối và cây có múi (cam quýt) (Vrianty et al., 2019). Thịt qủa
dứa có các hợp chất có hoạt tính sinh học cao như: mangan, vitamin A, B, (B1,
B6, folates), C và các loại acid hữu cơ đặc biệt là malic acid, citric acid, folic
acid, βcarotene, enzyme bromelain (Ramsden & Riley, 2014).
Trong cơ thể của sinh vật (kể cả con người) luôn sản sinh ra các gốc tự
do, các gốc tự do này dễ phản ứng với các gốc khác gần kề dẫn đến sự sản
sinh các gốc tự do mới là nguyên nhân dẫn tới sự phá huỷ các bào quan và cấu

trúc bên trong tế bào (đột biến). Đột biến là nguyên nhân dẫn đến sự thoái hóa
tế bào làm xuất hiện các bệnh hiểm nghèo (Ghasemzadeh, 2012; Vrianty et al.,
2019). Các hợp chất kháng oxy hoá là những hợp chất làm chậm hoặc ngăn
chặn được sự phát triển của các gốc tự do bảo vệ tế bào và cơ thể. Hệ thống
kháng oxy hóa xảy ra trong cơ thể con người có thể làm sạch các gốc tự do,
giữ cân bằng giữa q trình oxy hóa và kháng oxy hóa. Đồng thời, những bất
lợi của sự thối hóa tế bào có thể được ngăn ngừa bằng cách bổ sung các chất
kháng oxy hóa từ thực phẩm và dược liệu (Ghasemzadeh, 2012; Ha & Thu,
2009; Vrianty et al., 2019).
Tyrosinase là enzyme chính trong con đường sinh tổng hợp melanin, là
phức hợp các hạt sắc tố trong da, tóc, niêm mạc võng mạc, melanin bao quanh
sợ trục thần kinh. Nám da là hiện tượng gia tăng hàm lượng của melanin để
bảo vệ da, giúp da chống lại tia cực tím (Bonesi et al., 2019; F. Kong et al.,
2000; Pires et al., 2021). Vì thế, cấu trúc của tyrosinase và các chất ức chế
tyrosinase được nghiên cứu với mục tiêu sàng lọc và tuyển chọn nguồn
nguyên liệu trong ngành dược liệu và mỹ phẩm (Lai et al., 2018; Yuan et al.,
2020). Những hoạt chất ức chế tyrosinase được tổng hợp bằng phương pháp
hóa học chưa thật sự an tồn và hiệu quả. Chính vì thế, vấn đề tìm kiếm các
hợp chất ức chế tyrosinase từ thiên nhiên được nghiên cứu ở phạm vi sinh hóa
để bước đầu chọn lọc nguyên liệu để ứng dụng vào lĩnh vực y học, công
nghiệp thực phẩm, xử lý môi trường và mỹ phẩm (Lai et al., 2018; Yuan et al.,
2020).
Trên thế giới đã có nhiều nghiên cứu về khả năng kháng oxy hóa của cao
chiết trích ly từ thịt quả, lá, vỏ quả dứa nhưng vẫn chưa có đánh giá tổng thể
Chuyên ngành Công nghệ sinh
học

17

Viện NC&PT Công nghệ sinh hoc

Luận án

Trường Đại học Cần Thơ

so sánh về khả năng kháng oxy hóa về cao chiết được trích ly từ nguyên liệu là
lá,

Chuyên ngành Công nghệ sinh
học

18

Viện NC&PT Công nghệ sinh hoc


thân, thịt quả và vỏ dứa. Đồng thời, có rất ít nghiên cứu về khả năng ức chế
hoạt động tyrosinase của các loại cao chiết từ dứa.
Nhiều năm gần đây những nghiên cứu về ức chế tyrosinase từ các hợp
chất thiên nhiên được nhiều nhà khoa học trên thế giới nghiên cứu. Việt Nam
đã có nhiều nghiên cứu về khả năng ức chế tyrosinase của một số cao chiết củ
cải trắng, cây huỳnh anh, vi tảo, nấm rơm, mít dai, hoa hịe, lá tía tơ (Hưng,
2014; L. Q. Loan et al., 2018; Mai & Mai, 2018; Phú, 2019; Trúc et al., 2020),
… nhưng chưa có nghiên cứu về ức chế tyrosinase của cao chiết cây dứa.
Ngoài ra, hàm lượng các hợp chất thiên nhiên, hoạt tính kháng oxy hóa
và ức chế tyrosinase phụ thuộc nhiều vào các hợp chất khác nhau có trong tế
bào từng loại cây, từng vùng sinh thái (đối với cây cùng loài), từng độ tuổi của
cây (đối với cây cùng loài và cùng vùng sinh thái) thậm chí trên cùng một cây
ở các bộ phận khác nhau thì hàm lượng và hoạt tính sinh học cũng không

giống nhau.
Mục tiêu của luận án là nghiên cứu về “Khả năng kháng oxy hóa và ức
chế enzyme tyrosinase của cây dứa (Ananas comosus (L.) Merr.)”.
1.2 Mục tiêu luận án

Đánh giá khả năng kháng oxy hóa và ức chế enzyme tyrosinase của cao
chiết từ dứa (Ananas comosus (L.) Merr.) với mục tiêu khảo sát nguồn nguyên
liệu tiềm năng từ cây dứa.
1.3 Nội dung nghiên cứu

Nội dung 1: Khảo sát chọn vùng nguyên liệu và dung môi chiết xuất cao
và định danh loài dứa vùng Tắc Cậu.
Nội dung 2: Khảo sát khả năng kháng oxy hóa (hoạt tính khử DPPH,
hoạt tính khử ion Fe3+ thành ion Fe2+, hoạt tính khử ion Cu2+ thành ion Cu+) và
khả năng ức chế tyrosinase của cao methanol dứa Tắc Cậu.
Nội dung 3: Sắc ký tách phân đoạn cao chiết methanol vỏ dứa và khảo
sát khả năng kháng oxy hóa và ức chế tyrosinase của cao phân đoạn có hoạt
tính cao.
Nội dung 4: Khảo sát khả năng ức chế sự sản sinh melanin của cao phân
đoạn có hoạt tính cao từ cao chiết methanol F1 vỏ dứa trên dòng tế bào
B16F10.
Nội dung 5: Khảo sát các hợp chất trong cao phân đoạn F1 methanol vỏ
dứa có khả năng kháng oxy hóa và ức chế tyrosinase thơng qua phân tích phổ


GC-MS.


1.4 Đối tượng và phạm vi nghiên cứu
1.4.1 Đối tượng nghiên cứu

Đề tài nghiên cứu trên đối tượng cây dứa (lá, thân, thịt quả và vỏ quả) thu
hái tại Tắc Cậu (vùng sinh thái Tây Sông Hậu) của tỉnh Kiên Giang.
1.4.2 Phạm vi nghiên cứu

Đề tài tập trung nghiên cứu về khả năng kháng oxy hóa (được tiến hành
bằng 3 phương pháp khử DPPH, khử ion Fe3+, khử ion Cu2+) và khả năng ức
chế hoạt tính của enzyme tyrosinase của cao chiết từ lá, thân, thịt quả và vỏ
cây dứa. Các nghiên cứu được thực hiện từ tháng 5/2018 đến tháng 1/2021 tại
Viên nghiên cứu và Phát triển Công nghệ sinh học, Trường Đại học Cần Thơ
và Trung
tâm Quản lý thực hành thí nghiệm, Trường Đại học Kiên Giang.
1.5 Ý nghĩa của nghiên cứu
1.5.1 Ý nghĩa khoa học

Luận án cung cấp thơng tin khoa học hữu ích về khả năng kháng oxy hóa
và ức chế tyrosinase của cao chiết từ cây dứa với mục tiêu sử dụng nguyên
liệu từ cây dứa cung cấp trong các ngành y dược học và hóa mỹ phẩm.
1.5.2 Ý nghĩa thực tiễn

Kết quả nghiên cứu cho thấy tiềm năng sử dụng phụ phế phẩm trong
công nghiệp chế biến dứa, điều chế cao chiết từ vỏ dứa sử dụng nguồn nguyên
liệu trong y dược học giúp giảm thiểu ô nhiễm môi trường đồng thời sẽ làm
tăng giá trị sản phẩm của dứa trong ngành nông nghiệp canh tác dứa.
1.6 Tính mới của luận án

Luận án đã xác định lá, thân, thịt quả và vỏ dứa có hoạt tính kháng oxy
hóa và ức chế hoạt động của tyrosinase. Cao chiết methanol vỏ dứa có hoạt
tính kháng oxy hóa và ức chế hoạt động của enzyme tyrosinase cao. Kết quả
nghiên cứu của luận án cung cấp thông tin cho ngành y dược và hóa mỹ phẩm.

Kết quả ức chế sự sản sinh melanin trên dòng tế bào hắc tố B16F10 của
cao phân đoạn F1 tách từ cao methanol vỏ dứa mở ra hướng ứng dụng mới của
phụ phế phẩm quả dứa trong y dược học (phòng và trị các bệnh có liên quan
đến việc hình thành hắc tố melanin như Alzheimer, Parkinson, tàn nhang, nám
da và những bệnh liên quan đến dòng tế bào u hắc tố).


Hình 1.1: Sơ đồ tóm tắt các nội dung nghiên cứu luận án


CHƯƠNG 2: TỔNG QUAN TÀI LIỆU
2.1 Tổng quan về cây dứa (Ananas comosus)
2.1.1 Nguồn gốc

Dứa cịn có tên khác như: thơm, khóm hay trái huyền nương. Dứa có tên
khoa học (Ananas comosus (L.) Merr.) thuộc họ Bromeliaceae chi Ananas,
trong chi này có 6 lồi, trong đó lồi Ananas comosus là có giá trị kinh tế cao
nhất. Dứa là một loại quả nhiệt đới có nguồn gốc từ Paraguay và được trồng
phổ biến ở miền Nam Brasil, miền Bắc Argentina và rất nhiều nơi khác trên
thế giới (Ogawa et al., 2018).
Dứa có tên tiếng anh gọi là Pineapple. Các nhà thám hiểm Tây Ban Nha
thấy hình dáng ngồi của quả dứa giống chóp quả Thơng nên đặt tên là “Pine”.
Người Anh thêm chữ “apple” để nói rõ hơn về tính ngọt dịu của quả dứa (Li et
al., 2014; Ogawa et al., 2018). Dứa là loại trái cây trồng phổ biến ở rất nhiều
nước trên thế giới, là loại trái cây ưa chuộng đứng thứ ba trên thế giới, sau
chuối và cây có múi (Ivanova et al., 2019; Ogawa et al., 2018). Ở Việt Nam,
dứa được trồng nhiều ở Phú Thọ, Ninh Bình, Lâm Đồng, Long An, Hậu
Giang, Kiên Giang, Cần Thơ.
2.1.2 Phân Loại

Giới: Thực vật (Plantae)
Ngành: Thực vật có hoa (Angiospermae)
Lớp: Một lá mầm (Monocots)
Nhánh: Thài lài (Commelinids)
Bộ: Hòa thảo (Poales)
Họ: Dứa (Bromeliaceae)
Phân họ: Bromelioideae
Chi: Dứa (Ananas)
Lồi: A. Comosus
Hình 2.1: Cây dứa Ananas comosus

Tên khoa học: Ananas comosus (L.) Merr. Tên tiếng việt: dứa
Dứa thuộc họ Bromeliaceae, có khoảng 2.794 lồi, trong đó có 56 lồi có
ngưỡng thích nghi rộng về không gian sống như từ dạng sống trên mặt đất đến
dạng thân leo, từ dạng ưa bóng râm đến nơi có nhiều ánh sáng, từ vùng khí
hậu


nhiệt đới nóng ẩm, đến vùng cận nhiệt đới có khí hậu lạnh và khơ (Dey &
Chaudhuri, 2016; Ivanova et al., 2019). Ở Việt Nam dứa có ba nhóm phổ biến:
Nhóm Queen
Dứa thuộc nhóm Queen được trồng phổ biến ở Đồng Bằng Sơng Cửu
Long vì nó thích nghi với các điều kiện khí hậu đất đai có pH thấp, thuộc vùng
phèn và chống chịu hạn tốt. Lá đầy gai và ngắn hơn nhóm Cayenne. Trọng
lượng trái trung bình 1 - 1,2 kg, khi chín cả vỏ và thịt quả có màu vàng, các
giống tiêu biểu gồm: Golden Queen, Egyptian, Abachi, Balck Riplay, Green
Riplay, Ruby, Singapore, Canning và Pernambuco (Hải, 2017).
Nhóm Cayenne
Giống tiêu biểu là Smooth Cayenne (Cayenne Lissa). Nhóm này có năng
suất cao. Lá gần như khơng gai, chỉ có một ít gai ở chóp lá. Quả to trung bình

2 - 2,5 kg, dạng hình trụ, mắc dẹp và cạn, thích hợp làm nguyên liệu cho chế
biến và xuất khẩu. Vỏ trái khi chín có màu vàng nhạt đến vàng. Tuy nhiên,
giống này chỉ phát triển tốt trên đất có pH trung tính và có sự đầu tư thâm canh
cao (Hải, 2017).
Nhóm Spanish (Tây Ban Nha)
Dứa thuộc nhóm Spanish (dứa ta), có thể trồng ở mọi miền đất nước kể
cả vùng đất khô cằn, đất phèn chua, ... Lá dứa có màu xanh nhạt. Quả có hình
trụ, mắt to, hố sâu, vỏ dày. Quả chín có màu vàng cam, thịt vàng nhạt có nhiều
xơ, nhiều nước, có vị chua (Hải, 2017).
2.1.3 Đặc điểm sinh học của cây dứa

Dứa là loài cây thảo lâu năm: sau thu hoạch quả các mầm nách ở thân có
thể sử dụng làm cây giống cho vụ tiếp theo. Cây dứa trưởng thành cao 1,0 1,2 m bụi như nón trái thơng, có đường kính khoảng từ 1,3 - 1,5 m, có đáy bẹt,
tán cây xoè rộng. Theo Hồ Đình Hải, (2017), cấu tạo của dứa gồm có các
thành phần sau:
Thân: Có hình chùy, dài 25 - 50 cm, rộng 2,5 - 3,5 cm, lá ngắn. Thân
được cấu tạo bởi 2 phần trung trụ và vỏ.
Lá: Xếp thành hình hoa thị, lá non ở trong, lá già ở ngồi, hình máng rất
cứng, có gai. Lá có một lớp sáp bao bọc có tác dụng giảm thốt hơi nước.
Rễ: Bất định đặc trưng bởi các lớp đơn tử diệp, rễ có thể lan rộng xuống
đất tối đa 85 cm, số rễ sinh ra được quyết định bởi trọng lượng chồi.


Hoa và quả: Hoa dứa lưỡng tính, dạng hoa kép, thường có 50 - 200 hoa
đơn hợp lại, dạng hình xoắn ốc. Dứa thụ phấn chéo khi khác giống. Sau khi
thụ phấn chéo tất cả các bộ phận của hoa đều hình thành trái, dạng trái phức
do 100
- 200 trái nhỏ hợp lại (Ivanova et al., 2019). Dứa thích hợp với nhiệt đới ơn
hịa với nhiệt độ rừ 16 – 32oC và có nắng nhẹ.
Dứa có bộ nhiễm sắc thể là 2n = 54 (Chen et al., 2019; Xie et al., 2018).

Ở tất cả các lồi Ananas comosus thì nhiễm sắc thể đều nhỏ và hình cầu. Các
giống dứa đang trồng hiện nay được chia làm 3 nhóm: Cayene, Queen,
Spanish, nước ta trồng phổ biến dứa Queen.
2.1.4 Phân bố

Dứa thích hợp với điều kiện nhiệt độ và độ ẩm cao, sợ rét và sương
muối. Trong điều kiện thích hợp có thể sinh trưởng quanh năm. Dứa là cây ăn
quả nhiệt đới thích nhiệt độ cao 28 – 32oC, ưa ánh sáng tán xạ hơn ánh sáng
trực xạ. Lượng mưa thích hợp nhất cho dứa là 1000 – 1500 mm.
Ở Việt Nam, dứa phân bố từ Bắc đến Nam, diện tích trồng cả nước hiện
khoảng gần 50.000 ha với sản lượng khoảng 500.000 tấn/năm trong đó 90% là
phía Nam. Các tỉnh trồng dứa nhiều ở miền Nam là Kiên Giang, Tiền Giang,
Cà Mau, Cần Thơ và Long An. Miền Bắc dứa được trồng nhiều ở Thanh Hóa,
Ninh Bình, Tun Giang và Phú Thọ. Miền Trung dứa trồng nhiều ở Nghệ An,
Quảng Nam và Bình Định (Hải, 2017).
Dứa là loại cây khơng kén đất, vùng gò, đồi, đất dốc, những loại đất
nghèo dinh dưỡng có thể trồng dứa. Dứa được trồng nhiều trong cả nước, ở
ĐBSCL trên đất phèn, dứa là cây tiên phong mở đường cho các loại hoa màu
và các loại cây khác như mía, chuối, cam, đậu.
Cù lao Tắc Cậu (thuộc vùng sinh thái Tây sông Hậu) nằm dọc theo hai
bên bờ sông Cái Lớn và Cái Bé thuộc các huyện Châu Thành, Gò Quao của
tỉnh Kiên Giang với thổ nhưỡng (đậm phù sa do các con sông bồi đắp) và địa
thế đặc trưng đã hình thành vùng trồng dứa (cịn gọi là Khóm, thơm) cho chất
lượng ngon ngọt nức tiếng suốt 70 năm qua. Đất có hàm lượng độ phì tương
đối cao và cân đối, ít có những hạn chế về mặt hóa học đất đối với sinh trưởng
của cây trồng, sa cấu mịn với thành phần cơ giới chủ yếu là đất sét, khả năng
đáp ứng với phân bón tốt, có mức thuần thục cao. Cù lao Tắc Cậu là vùng
nước lợ đất phèn và mặn nhưng dứa nơi đây lại cho vị ngọt thanh. Nét đặc