Nghiên cứu thành phần hóa học và hoạt tính sinh học của loài hải sâm stichopus chloronotus 273734

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA HÀ NỘI

*****************

LÊ THỊ VIÊN

NGHIÊN CỨU THÀNH PHẦN HÓA HỌC VÀ
HOẠT TÍNH SINH HỌC CỦA LỒI HẢI SÂM
STICHOPUS CHLORONOTUS

LUẬN VĂN THẠC SĨ KỸ THUẬT
CHUYÊN NGÀNH: CÔNG NGHỆ SINH HỌC

NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC
1. PGS. TS. Lê Thanh Hà
2. TS. Nguyễn Hoài Nam

Hà Nội - 2014


LỜI CẢM ƠN
Luận văn này được thực hiện tại phòng Dược liệu biển, Viện Hóa sinh biển,
Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam, trong khuôn khổ Đề tài nghiên
cứu cơ bản định hướng ứng dụng: “Nghiên cứu quy trình phân lập các hoạt chất có
tác dụng diệt tế bào ung thư, kháng viêm và kháng khuẩn từ một số loài thuộc lớp
Sao biển (Asteroidea), Hải sâm (Holothuroidea), Cầu gai (Echinoidea) thuộc ngành
Da gai (Echinodermata) ở biển Việt Nam”.
Đầu tiên, với tấm lịng biết ơn sâu sắc, tơi xin gửi lời cảm ơn chân thành tới
PGS. TS. Lê Thanh Hà, Trường Đại học Bách Khoa Hà Nội và TS. Nguyễn Hồi
Nam, Viện Hóa sinh biển, những người đã tận tình hướng dẫn, hết lịng chỉ bảo và

giúp đỡ tơi hồn thành luận văn này.
Tơi xin chân thành cảm ơn Ban lãnh đạo Viện Hóa sinh biển và tập thể các
cán bộ phòng Dược liệu biển đã tạo điều kiện, giúp đỡ tơi trong suốt q trình thực
hiện luận văn.
Cuối cùng, tôi cũng xin gửi lời cảm ơn tới gia đình, người thân và bạn bè đã
ln ln ủng hộ, giúp đỡ, động viên tôi trong suốt thời gian học tập, cơng tác để
hồn thành luận văn này.
Hà Nội, tháng 04 năm 2014
Lê Thị Viên


LỜI CAM ĐOAN
Tôi xin cam đoan luận văn là công trình nghiên cứu khoa học của riêng tơi,
dưới sự hỗ trợ kinh phí của Đề tài nghiên cứu cơ bản định hướng ứng dụng:
“Nghiên cứu quy trình phân lập các hoạt chất có tác dụng diệt tế bào ung thư,
kháng viêm và kháng khuẩn từ một số loài thuộc lớp Sao biển (Asteroidea), Hải sâm
(Holothuroidea), Cầu gai (Echinoidea) thuộc ngành Da gai (Echinodermata) ở biển
Việt Nam”. Các kết quả, số liệu nghiên cứu trong luận văn hoàn toàn trung thực và
chưa được cơng bố trong bất kỳ các cơng trình nghiên cứu nào khác.

Hà Nội, tháng 04 năm 2014
Lê Thị Viên


MỤC LỤC
DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT.........................................................................
DANH MỤC CÁC BẢNG ..........................................................................................
DANH MỤC CÁC HÌNH VÀ SƠ ĐỒ .......................................................................
LỜI MỞ ĐẦU ............................................................................................................1
CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN .....................................................................................3

1.1. Giới thiệu vài nét chung về hải sâm .................................................................3
1.1.1. Đặc điểm sinh vật và phân loại ..................................................................3
1.1.2. Giá trị dinh dưỡng và ứng dụng trong y học cổ truyền của hải sâm ..........5
1.1.3. Thành phần hóa học và hoạt tính sinh học của hải sâm .............................7
1.2. Tình hình nghiên cứu về thành phần hóa học và hoạt tính sinh học của lồi
hải sâm Stichopus chloronotus ..............................................................................10
1.2.1. Thành phần hóa học ..............................................................................10
1.2.2. Hoạt tính sinh học .................................................................................13
CHƯƠNG 2. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ...................17
2.1. Đối tượng ........................................................................................................17
2.2. Phương pháp nghiên cứu ................................................................................17
2.2.1. Phương pháp phân lập các hợp chất .........................................................17
2.2.1.1. Sắc ký lớp mỏng (TLC) .....................................................................17
2.2.1.2. Sắc ký lớp mỏng điều chế (PTLC) ....................................................17
2.2.1.3. Sắc ký cột (CC) ..................................................................................17
2.2.2. Phương pháp xác định cấu trúc các hợp chất đã được phân lập .............18
2.2.2.1. Phổ khối lượng phân giải cao (HRMS) .............................................18
2.2.2.2. Phổ cộng hưởng từ hạt nhân (NMR) .................................................18
2.2.3. Phương pháp thử hoạt tính sinh học .........................................................19
2.2.3.1. Phương pháp nuôi cấy tế bào in vitro ................................................19
2.2.3.2. Phép thử sinh học xác định tính độc tế bào .......................................20
2.2.3.3. Phương pháp xử lí số liệu ..................................................................21


CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN ............................................................22
3.1. Kết quả phân lập các hợp chất ........................................................................22
3.2. Xác định cấu trúc hóa học các hợp chất .........................................................23
3.2.1. Hợp chất 1: Stichloroside F (chất mới) ....................................................23
3.2.2. Hợp chất 2: Stichoposide D......................................................................32
3.2.3. Hợp chất 3: Stichloroside A2 ...................................................................40

3.3. Đánh giá hoạt tính gây độc tế bào của các hợp chất .......................................46
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ................................................................................48
I. KẾT LUẬN ........................................................................................................48
II. KIẾN NGHỊ ......................................................................................................48
TÀI LIỆU THAM KHẢO ......................................................................................49
I. TIẾNG VIỆT ......................................................................................................49
II. TIẾNG ANH .....................................................................................................49


DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT

STT

Chữ viết tắt

Tên đầy đủ

1

CC

Column Chromatography

2

COSY

Correlation Spectroscopy

3

DEPT

Distortionless Enhancement by Polarisation Transfer

4

DMSO

Dimethyl Sunphoxit

5

DPPH

1,1-Diphenyl-2- picrylhydrazyl

6

GAE

Gallic Acid Equivalent

7

HEPES

Hydroxy Ethyl Piperazin Ethan Sulphonic

8

HMBC

Heteronuclear Multiple Bond Connectivity

9

HRMS

High Resolution Mass Spectrometry

10

HSQC

Heteronuclear Single Quantum Coherence

11

IC

Inhibitory Concentration

12

MPLC

Medium Pressure Liquid Chromatography

13

MTT

(3 - [ 4,5- dimethylthiazol -2-yl ] ) -2,5 - diphenyl
tetrazolium bromide

14

NMR

Nuclear Magnetic Resonance

15

PBS

Phosphate Buffer Saline

16

PTLC

Preparative Thin Layer Chromatography

17

TLC

Thin Layer Chromatography

DANH MỤC CÁC BẢNG

Bảng 1.1. Ảnh hưởng của các dịch chiết Stichopus chloronotus tới phản ứng co thắt
bụng ở chuột ..............................................................................................................14
Bảng 3.1. Số liệu phổ NMR của hợp chất 1..............................................................27
Bảng 3.2. Số liệu phổ NMR của hợp chất 2..............................................................34
Bảng 3.3. Số liệu phổ NMR của hợp chất 3..............................................................41
Bảng 3.4. Kết quả đánh giá hoạt tính gây độc tế bào của các hợp chất ....................47


DANH MỤC CÁC HÌNH VÀ SƠ ĐỒ
Hình 1.1. Hải sâm Stichopus chloronotus................................................................... 4
Hình 1.2. Cấu trúc hóa học của stichlorosides A1, B1, C1, A2, B2, C2 ...................... 12
Hình 1.3. Cấu trúc hóa học của SCG-1, SCG-2, SCG-3 .......................................... 13
Sơ đồ 1. Sơ đồ phân lập các hợp chất từ loài hải sâm Stichopus chloronotus .......... 23
Hình 3.1. Phổ khối lượng phân giải cao của 1 .......................................................... 24
Hình 3.2. Cấu trúc hóa học của 1 .............................................................................. 24
Hình 3.3. Phổ 1H-NMR của 1 ................................................................................... 25
Hình 3.4. Phổ 13C-NMR của 1 .................................................................................. 26
Hình 3.5. Phổ HSQC của 1 ....................................................................................... 28
Hình 3.6. Phổ HMBC của 1 ...................................................................................... 29
Hình 3.7. Phổ COSY của 1 ....................................................................................... 30
Hình 3.8. Các tương tác COSY (▬) và HMBC chính (→) của 1 ............................ 30
Hình 3.9. Phổ ROESY của 1 ..................................................................................... 31
Hình 3.10. Các tương tác ROESY chính của 1 ......................................................... 32
Hình 3.11. Phổ 1H-NMR của 2 ................................................................................. 33
Hình 3.12. Cấu trúc hóa học của 2 ............................................................................ 33
Hình 3.13. Phổ 13C-NMR của 2 ................................................................................ 36
Hình 3.14. Phổ DEPT của 2 ...................................................................................... 36

Hình 3.15. Phổ HSQC của 2 ..................................................................................... 37
Hình 3.16. Phổ HMBC của 2 .................................................................................... 38
Hình 3.17. Phổ COSY của 2 ..................................................................................... 38
Hình 3.18. Các tương tác COSY (▬) và HMBC (→) chính của 2 .......................... 39
Hình 3.19. Phổ 1H-NMR của 3 ................................................................................. 40
Hình 3.20. Cấu trúc hóa học của 3 ............................................................................ 41
Hình 3.21. Phổ 13C-NMR của 3 ................................................................................ 43
Hình 3.22. Phổ DEPT của 3 ...................................................................................... 44
Hình 3.23. Phổ HSQC của 3 ..................................................................................... 44


Hình 3.24. Phổ HMBC của 3 .................................................................................... 45
Hình 3.25. Phổ COSY của 3 ..................................................................................... 45
Hình 3.26. Các tương tác COSY (▬) và HMBC (→) chính của 3 .......................... 46


Luận văn thạc sĩ

Công nghệ sinh học

LỜI MỞ ĐẦU
Biển và Đại dương chiếm tới 70% diện tích bề mặt trái đất, là nơi sinh sống
của 34 trong 36 ngành sinh vật trên trái đất với hơn 300000 loài động thực vật đã
được biết đến. Ngày nay, một trong những nguồn lợi vô cùng to lớn đang được các
nước trên thế giới chú trọng nghiên cứu, phát hiện, khai thác và sử dụng từ sinh vật
biển là các hợp chất tự nhiên có hoạt tính sinh học. Các hợp chất đó khơng những
có giá trị dinh dưỡng cao mà cịn là nguồn dược liệu tự nhiên quý giá mà thiên
nhiên ban tặng cho con người.
Ở Việt Nam, lĩnh vực nghiên cứu khai thác các hợp chất có hoạt tính hóa
sinh học của nguồn dược liệu từ sinh vật biển cũng còn khá khiêm tốn, mới chỉ

được quan tâm nhiều trong những năm gần đây. Trong khi đất nước ta có vị trí địa
lý vơ cùng thuận lợi với bờ biển dài hơn 3260km và vùng thềm lục địa rộng khoảng
1 triệu km2 hứa hẹn tiềm năng to lớn về nguồn tài nguyên thiên nhiên với hệ sinh
vật biển vô cùng đa dạng, phong phú cả về số lượng và thành phần các loài động,
thực vật. Điều kiện sống khắc nghiệt ở biển là môi trường thuận lợi cho các sinh vật
biển tổng hợp các hợp chất hữu cơ có cấu trúc khác biệt với các hợp chất có nguồn
gốc thực vật.
Trong số các loài sinh vật biển, hải sâm đã và đang nhận được sự quan tâm
của các nhà khoa học trên thế giới bởi sự dồi dào về nguồn nguyên liệu, tính đa
dạng về thành phần hóa học và hoạt tính sinh học. Theo kinh nghiệm của y học cổ
truyền hải sâm được xem như loại thuốc bổ thận tráng dương, tư âm dưỡng huyết,
ích tinh nhuận táo, chữa lị, chữa viêm phế quản, thần kinh suy nhược... Các cơng
trình khoa học đã cơng bố cho thấy thành phần hóa học chính của các lồi hải sâm
là hợp chất tritecpen saponin dạng khung holostan. Đây là một lớp chất có cấu trúc
hóa học rất đặc trưng và có nhiều tác dụng dược lý như diệt tế bào ung thư, kháng vi
sinh vật, kháng viêm… Tuy nhiên đến nay cũng chỉ có rất ít thơng tin khoa học về
chúng. Y học hiện đại chưa có nhiều nghiên cứu sâu về mặt hóa học cũng như hoạt
tính sinh học các lồi hải sâm. Vì vậy, việc nghiên cứu, khảo sát thành phần hóa học
và tác dụng dược lý của hải sâm khơng những làm sáng tỏ các kinh nghiệm sử dụng
Lê Thị Viên

1

2012B


Luận văn thạc sĩ

Công nghệ sinh học

hải sâm làm dược liệu trong dân gian mà cịn giúp tìm ra các phương thuốc chữa
bệnh từ loài sinh vật biển này.
Trên cơ sở đó, tơi đã tiến hành đề tài: “Nghiên cứu thành phần hóa học và
hoạt tính sinh học của lồi hải sâm Stichopus chloronotus”.
Mục tiêu của đề tài:
Nghiên cứu nhằm tìm kiếm các hợp chất có hoạt tính sinh học góp phần làm
sáng tỏ tác dụng dược lý của nguồn dược liệu quý, đồng thời góp phần cho việc sử
dụng hợp lý, hiệu quả và bảo tồn nguồn nguyên liệu biển quý giá của đất nước.
Nội dung của đề tài:
1. Phân lập một số hợp chất từ loài hải sâm Stichopus chloronotus
2. Xác định cấu trúc hóa học của các hợp chất đã phân lập được
3. Đánh giá hoạt tính sinh học của các hợp chất đã phân lập được

Lê Thị Viên

2

2012B


Luận văn thạc sĩ

Công nghệ sinh học

CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN
1.1. Giới thiệu vài nét chung về hải sâm
1.1.1. Đặc điểm sinh vật và phân loại
Hải sâm là loài động vật không xương sống, ngành da gai (Echinodermata),
lớp Holothuroidea [6, 56, 64]. Tên Holothuroidea được đưa ra bởi các nhà triết học
Hy Lạp. Tên khoa học là "Cucumis marimus" có nghĩa là "Dưa chuột biển" được

đặt ra bởi Pliny (một nhà phân loại khơng xương sống) [56]. Nó được chia thành ba
lớp con cụ thể là Dendrochirotacea, Aspidochirotacea và Apodacea. Sáu bộ dưới
các lớp con được đặt tên là Aspidochirotida, Apodida, Dactylochirotida,
Dendrochirotida, Elasipodida và Molpadiida [17, 47, 56]. Nhìn vào các xúc tu
miệng là cách phổ biến nhất để tách các lớp con của hải sâm. Ví dụ, dưa chuột biển
thuộc phân lớp Dendrochirotacea thường có 8-30 xúc tu miệng trong khi những lồi
thuộc Aspidochirotacea có thể có 10-30 xúc tu miệng giống như tấm chắn. Bên
cạnh đó, các thành viên của Apodacea có thể chứa đến 25 gai hoặc xúc tu miệng
đơn [17]. Hải sâm sống như những quần thể dưới đáy biển sâu và sử dụng những
xúc tu của chúng cho mục đích ăn [17, 18, 21]. Thức ăn chính của hải sâm là xác
động vật chết, thực vật nhỏ, mùn bã.
Chiều dài của hải sâm thường từ 10-30cm; tuy nhiên một số loài nhỏ chỉ dài
3mm và lớn nhất đạt khoảng 1m cũng đã được ghi nhận. Hải sâm khơng giống lắm
với các lồi Da gai khác, cơ thể của chúng được bao bọc bởi vỏ mềm hình trụ. Hải
sâm khơng tựa trên mặt miệng của nó mà tựa trên mặt sườn. Những hàng chân nhỏ
của chúng được sắp xếp ở lườn thấp hơn của cơ thể và được sử dụng cho sự vận
động. Hải sâm trườn tới phía trước bằng cách làm phồng lên hoặc xẹp xuống cơ thể
của chúng [1].
Hải sâm là một thành phần quan trọng của hệ sinh thái biển. Chúng có mặt ở
hầu hết các đại dương trên toàn thế giới, thường sống gần rạn san hô, bãi đá ngầm
hoặc cỏ dại biển [56]. Tổng số lượng các loài dưa chuột biển hiện nay đang tồn tại
là khoảng 1250 loài, tuy nhiên gần đây, một số loài mới cũng đã được nghiên cứu từ
Ấn Độ-Thái Bình Dương, nơi được biết đến như là một trung tâm đa dạng sinh học
Lê Thị Viên

3

2012B

Luận văn thạc sĩ

Công nghệ sinh học

phong phú của Holothuroidea. Bên cạnh đó cịn một số lượng lớn các lồi dưa chuột
biển sống ở vùng nước nông chưa được xác định một cách hệ thống [10].
Ở vùng biển Việt Nam đã thống kê được khoảng 80 loài hải sâm khác nhau,
trong đó Holothuria và Stichopus là các chi có số lượng loài nhiều. Đối tượng
nghiên cứu trong luận văn này là loài hải sâm Stichopus chloronotus thuộc họ
Stichopodidae, bộ Aspidochirotida. Lồi này rất dễ nhận dạng vì cơ thể có dạng
hình bốn cạnh kéo dài với hai đầu thon lại, chiều dài trung bình khoảng 250mm, các
cạnh là những hàng kép của nhiều gai thịt lớn hình nón. Chân ống ở mặt bụng được
xếp thành 3 băng dọc, băng giữa rộng hơn 2 băng bên. Khi sống toàn thân chúng có
màu xanh đen hoặc tím thẫm, mẫu ngâm cồn có màu vàng đất. Vách thân dày và
cứng, nhưng khi chết sẽ bị rữa ra từng mảnh dọc. Miệng mang 20 xúc tu màu xám,
cuống xúc tu màu hơi trắng. Ở Việt Nam, hải sâm Stichopus chloronotus phân bố
chủ yếu tại các vùng biển Đà Nẵng, Quảng Nam, Phú Yên, Khánh Hịa, Ninh
Thuận, Bình Thuận, Hồng Sa, Trường Sa, Cơn Đảo, Phú Quốc, Thổ Chu [2]. Trên
thế giới, Stichopus chloronotus thường được tìm thấy dưới đáy biển ở khu vực Thái
Bình Dương, Ấn Độ-Thái Bình Dương và Đại Tây Dương [19].

Hình 1.1. Hải sâm Stichopus chloronotus
Hải sâm Stichopus chloronotus sinh sản theo cả hai hình thức sinh sản vơ
tính và sinh sản hữu tính. Sinh sản vơ tính được thực hiện thơng qua q trình phân
Lê Thị Viên

4

2012B

Luận văn thạc sĩ

Công nghệ sinh học

hạch ngang, thường xảy ra trong mùa đơng [68]. Cịn vào mùa hè, chúng thường
sinh sản hữu tính bằng hình thức đẻ trứng [22].
1.1.2. Giá trị dinh dưỡng và ứng dụng trong y học cổ truyền của hải sâm
Hải sâm (Dưa chuột biển) thường được gọi là trepang, beche-de-mer, hoặc
gamat, từ lâu đã được sử dụng trong các hệ thống thực phẩm và y học dân gian của
cộng đồng châu Á và Trung Đông [75].
Về mặt giá trị dinh dưỡng, hải sâm là loại thuốc bổ lý tưởng với một hàm
lượng lớn các chất dinh dưỡng có giá trị cao như vitamin A, vitamin B1 (thiamine),
vitamin B2 (riboflavin), vitamin B3 (niacin) và khoáng chất, đặc biệt là canxi,
magie, sắt và kẽm [12, 56].
Thành phần của hải sâm tươi có thể khác nhau nhiều, tùy thuộc vào loài, thay
đổi theo mùa và chế độ ăn. Theo các thông tin đã được báo cáo trong các tài liệu
cho thấy độ ẩm, protein, chất béo, tro và carbohydrate của hải sâm tươi thay đổi
tương ứng từ 82.0-92.6, 2.5-13.8, 0.1-0.9, 1.5-4.3 và 0.2-2.0 % [40].
Hải sâm có chứa một hàm lượng lớn các axit amin có giá trị; glycin là thành
phần chính (chiếm khoảng 5.57-12.5g/100g trọng lượng ướt) ở hầu hết các loài
được xác định. Axit glutamic (4.69-7.31g/100g trọng lượng ướt), axit aspartic
(3.48-5.06g/100g trọng lượng ướt), alanine (2.95-5.77g/100g trọng lượng ướt) và
arginine (2.71-4.95g/100g trọng lượng ướt) là các thành phần chiếm tỷ lệ lớn hơn so
với các thành phần khác. Một tính năng quan trọng của thành phần axit amin hải
sâm là tỷ lệ lysine/arginine thấp cùng với hàm lượng cao của axit amin thiết yếu do
sự hiện diện của một lượng đáng kể threonine, tyrosine và phenyl alanine. Tổng số
các axit amin thành phần chiếm khoảng 33.32-54.13g/100g trọng lượng ướt [74].
Theo kinh nghiệm của y học cổ truyền, hải sâm có tính ơn, vị ngọt đậm, quy
vào các kinh tâm, tỳ, phế, có tác dụng bổ thận tráng dương, dưỡng tinh huyết, bổ

não, ích trí, ninh tâm, trấn kinh, trừ toan, tiêu viêm, cầm máu, giảm đau, nhuận táo;
công dụng chữa suy nhược thần kinh và thể lực, chữa liệt dương, thiếu máu, táo
bón, ho lao, ho ra máu, tiểu đường. Gần đây, hải sâm còn được dùng trong trường
hợp huyết áp cao, động mạch xơ cứng, bệnh mạch vành tim, xuất huyết dưới da,
ung thư, tổn thương trong trị xạ ung thư…
Lê Thị Viên

5

2012B


Luận văn thạc sĩ

Công nghệ sinh học

Dưới đây là một số bài thuốc có dùng hải sâm đã được các sách đề cập
nhiều:
-

Cháo hải sâm long nhãn: Gạo 100g, hải sâm 30g, long nhãn 20g, đường
phèn 30g, nước 2000ml. Dùng bổ dưỡng, chống suy nhược, ăn ngủ kém.

-

Canh hải sâm câu kỷ: Hải sâm 300g, câu kỷ 20g, nấm đông cơ 30g, đậu Hịa
Lan 50g, hành trắng 20g, dầu ăn 50g, đường trắng 30g. Xào xong cho 1 lít
nước nấu thêm 40 phút rồi mới bỏ câu kỷ vào. Tác dụng bổ thận, tráng
dương.

-

Canh hải sâm quy bản: Hải sâm 60g, quy bản (chích dịn) 15g, bạch cập 15g,
gia vị. Cơng dụng chữa khí âm bất túc, gầy ốm, tức ngực, ngắn hơi, ho nhiều,
ăn uống kém, đổ mồ hôi trộm, viêm khí quản, ho lao, ho ra máu.

-

Hải sâm, Khởi tử: Hải sâm 150g, hành 500g, mỡ gà 30g, nước súp thịt 250g,
rượu vang chát 30g, khởi tử 15g, nước tương 6g, dầu thực vật 30g, gia vị vừa
đủ. Cơng dụng: Bổ thận, dưỡng huyết, nhuận tràng; thích hợp bổ dưỡng cả
bốn mùa.

-

Hải sâm cần tây: Hải sâm 200g, cần tây 100g, câu kỷ 15g, hành 10g, gừng
4g, dầu 50g, muối 5g, nước canh gà 300g. Ðảo gừng, hành cho thơm rồi cho
hải sâm, cần, câu kỷ, đổ canh gà trộn đều, nấu 25 phút.

-

Canh hải sâm đường phèn: Hải sâm 20g, đường phèn vừa ngọt. Ninh nhừ hải
sâm rồi cho đường phèn ninh tiếp, dùng nóng ngày một lần. Chữa bệnh huyết
áp cao, bệnh mạch vành, xơ cứng mạch máu.

-

Hải sâm với tôm: Hải sâm 150g, tôm khô 20g, măng khô 50g, rượu vang chát
10g, hành 10g, dầu vừng 5g, dầu thực vật khác 15g; Muối, bột ngọt, mỗi thứ
3g; Ðường 8g. Cơng dụng bổ thận khí, mạnh tình dục; là món bổ dưỡng cho

lớp trung niên, lão niên suy nhược.
Ngồi ra có thể thay đổi cách nấu hải sâm với thịt gà, thịt chó, trứng gà,

xương gà, trứng chim bồ câu, chim cút, thịt xương heo, thận hoặc thịt dê, đậu phụ
với tôm nõn, dăm bông, chân giị lợn hun khói, cá... Thường dùng cho nam giới
thận hư, liệt dương, di tinh, tiểu đêm nhiều lần, nữ giới âm lạnh, chân tay lạnh.

Lê Thị Viên

6

2012B


Luận văn thạc sĩ

Cơng nghệ sinh học

1.1.3. Thành phần hóa học và hoạt tính sinh học của hải sâm
Trong 3-4 thập kỷ qua nhiều nỗ lực đã được dành cho việc cơ lập các hợp
chất mới có hoạt tính sinh học từ các nguồn hải sản. Nhiều hợp chất tự nhiên trong
số đó là mối quan tâm lớn cho tiềm năng phát triển thuốc cũng như một trong
những hướng đi mới là các sản phẩm thương mại ứng dụng cho nhiều ngành công
nghiệp khác nhau, đặc biệt là dược phẩm, hóa chất nơng nghiệp, thực phẩm chức
năng [70]. Hải sâm là một trong những động vật biển tiềm năng với giá trị thực
phẩm và giá trị chữa bệnh cao. Các đặc tính chữa bệnh của các lồi động vật được
gán cho sự hiện diện của các thành phần chức năng với nhiều hoạt tính sinh học hứa
hẹn.
Hải sâm đã được công nhận là một loại thuốc bổ cho hiệu quả chống tăng
huyết áp, hen suyễn, thấp khớp, vết thương và vết bỏng, bệnh liệt dương và táo bón

[12, 73, 74, 75]. Một số hoạt tính sinh học và dược học độc đáo như chống nghẽn
mạch [65], chống ung thư [57], chống đông máu [13, 50], chống tăng huyết áp [26],
chống viêm [14-16], kháng khuẩn [8, 28], chống oxy hóa [4], chống huyết khối [48,
51], kháng u [67, 81] và chữa lành vết thương [60] đã được gán cho các hợp chất
hóa học được chiết xuất từ các lồi hải sâm khác nhau. Những lợi ích chữa bệnh và
chức năng y tế của hải sâm có thể là do sự hiện diện của một lượng đáng kể các hợp
chất hoạt tính sinh học, đặc biệt là các glycosides triterpene (saponin) [5, 31, 34,
42], glycosaminoglycan [50, 51], sunfatchondroitin [71], polysaccharides sulfate
[49], sterol [25], phenolics [38], peptide [54], cerberosides [61] và lectin [43-45].
Một số lượng lớn protein có chất lượng tốt trong dưa chuột biển được liên
kết với các hiệu ứng có lợi của nó lên mức triglycerid huyết thanh [63]. Protein dưa
chuột biển, đặc biệt là protein sản xuất từ thành cơ thể, rất giàu glycine, axit
glutamic và arginine. Glycine có thể kích thích sản xuất và phát hành của
Interleukin 2 (IL2) và tế bào kháng thể lympho B và do đó góp phần nâng cao thực
bào. Glycine và axit glutamic là những thành phần cần thiết cho các tế bào để sinh
tổng hợp glutathione, cái mà có thể kích thích sự hoạt động và phát triển của các tế
bào Natural Killer (NK). Arginine có thể tăng cường miễn dịch tế bào bằng cách
thúc đẩy kích hoạt và phát triển của các tế bào lympho T. Do đó, các thành phần
Lê Thị Viên

7

2012B


Luận văn thạc sĩ

Công nghệ sinh học

axit amin dưa chuột biển có chức năng đáng chú ý trong điều hịa miễn dịch [53].

Một tỷ lệ lớn (khoảng 70%) protein thành cơ thể dưa chuột biển bao gồm collagen.
Collagen được công nhận là một thành phần có giá trị trong các mô liên kết, do sự
hữu dụng và phân phối đặc trưng của nó [54, 59]. Nó có thể được tiếp tục chuyển
đổi thành gelatin bằng cách đun sôi, để hoạt động như một chất hoạt tính sinh học
chức năng [80].
Có một loạt các chất hoạt tính sinh học và chất đối kháng khác trong dưa
chuột biển, chẳng hạn như glycosides triterpene, enzyme, amyloses, các axit béo,
cytotoxins… với tiềm năng giúp tăng cường hệ miễn dịch, chống lại khối u và cục
máu đông, bảo vệ các mô thần kinh, giảm đau và chống thực vật biểu sinh cũng như
góp phần kích thích miễn dịch, chống ung thư và chống đơng máu [30, 78].
Sản phẩm từ dưa chuột biển và dưa chuột biển đang trở nên có sẵn trong các
kệ của các cửa hàng thực phẩm do tác dụng phục hồi sức khỏe của nó, đặc biệt là
chức năng chữa lành vết thương (để phục hồi tốc độ của vết loét, vết cắt và vết
thương trên da, cũng như nội bộ cho các vết loét và các bệnh khác có liên quan đến
sự hư hỏng bên trong). Người ta tin rằng việc sử dụng trực tiếp của hải sâm có thể
làm giảm thời gian phục hồi vết thương, giúp hình thành mơ mới và sự tái tạo trong
cơ thể con người cũng giống như khả năng của hải sâm có thể nhanh chóng tái tạo
mơ cơ thể của chính mình khi bị hư hỏng [41, 76].
Theo Fredalina và cộng sự [23], các axit béo của dưa chuột biển là những
thành phần quan trọng, chịu trách nhiệm sửa chữa mơ và đặc tính chữa lành vết
thương của động vật biển này. Một vài axit béo trong số đó là axit myristic (C14:0),
palmitic

(C16:0),

stearic

(C18:0),

linoleic

(C18:2),

arachidic

(C20:0),

eicosapentaenoic (C20:5, EPA) và axit docosahexaenoic (C22:6, DHA) của các
phân đoạn chất béo được chiết từ dưa chuột biển (Stichopus chloronotus) sử dụng
methanol, ethanol, đệm muối phosphate (PBS) và nước cất. Các dịch chiết PBS cho
thấy mức độ tương đối cao của EPA (25.69%) so với 7.84% trong nước cất, 18.89%
trong ethanol và chỉ có 5.83% trong chiết xuất methanol. Thật ngạc nhiên, DHA có
mặt với số lượng lớn hơn (57.55%) trong chiết xuất nước, so với chỉ 1.20-3.63% ở
những dịch chiết khác trong khi nó khơng được phát hiện trong dịch chiết ethanol.
Lê Thị Viên

8

2012B


Luận văn thạc sĩ

Công nghệ sinh học

Điều thú vị là, C16:0 được chiết xuất hiệu quả trong ethanol (20.18%) và methanol
(20.82%), trong khi 12.55% trong PBS và chỉ 2.20% trong dịch chiết nước. Sau đó,
axit oleic (C18:1) chỉ được xác định trong PBS (21.98%) và dịch chiết nước
(7.50%) [23]. EPA được biết đến là hợp chất hoạt động chính trong dầu cá, chức
năng chính của nó là ức chế prostaglandin và thuộc tính chống nghẽn mạch. Bên

cạnh đó, EPA cũng đóng một vai trị tiềm năng trong cơ chế đơng máu [23, 24, 39].
Trái ngược với dầu thực vật - chủ yếu là có axit béo với số cacbon chẵn, một
lượng đáng kể axit béo có số cacbon lẻ như C15:0, C17:0, C19:0, C21:0 và C23:1
cũng đã được tìm thấy trong thành phần axit béo dưa chuột biển [74]. Thông
thường, axit palmitic (C16:0), axit eicosenoic (C20:1 n-9) và axit arachidonic
(C20:4 n-6) là những thành phần chiếm ưu thế trong số các axit béo bão hịa, axit
béo khơng bão hịa đơn và axit béo khơng bão hịa đa, tương ứng trong gần như tất
cả các loài hải sâm được xác định [74]. Trong số các axit béo khơng bão hịa đa của
dưa chuột biển, axit arachidonic (AA, C20:4 n-6) được phát hiện là thành phần
chính trong hầu hết các lồi với số lượng tương đối cao hơn báo cáo đối với các lồi
nhiệt đới [20, 62]. Lợi ích chữa bệnh của AA là tiền thân của eicosanoids và là
thành phần chính của các phospholipid màng tế bào được cơng nhận. Nó được biết
đến với vai trò tiềm năng tăng trưởng và q trình đơng máu dẫn đến chữa lành vết
thương [24, 39]. Báo cáo này cũng chỉ ra hải sâm được sử dụng trong thời gian dài
như một phương thuốc truyền thống chữa bỏng và các vết cắt ở châu Á [23]. Sự
hiện diện của số lượng đáng kể axit eicosapentaenoic (EPA) và axit
decosahexaenoic (DHA) trong một số loài, đặc biệt là trong dưa chuột biển nhiệt
đới và cận nhiệt đới [9, 62] là phương thuốc quan trọng như hai axit béo chuỗi dài
có liên quan đến giảm tỷ lệ mắc động mạch vành bệnh tim và ung thư [27, 58].
Một nhóm các chất chức năng cụ thể là mucopolysaccharides và chondroitins
cũng đã được xác định trong dưa chuột biển. Những người bị viêm khớp và các rối
loạn mô liên kết thường khơng có các hợp chất này. Như vậy, chondroitin sulfate có
nguồn gốc từ dưa chuột biển có thể được khai thác như một nguồn dinh dưỡng giúp
giảm đau và viêm khớp [29]. Vì lý do này mà sử dụng khoảng 3g/ngày hải sâm khô

Lê Thị Viên

9

2012B

Luận văn thạc sĩ

Công nghệ sinh học

được y học chứng minh là có hiệu quả trong việc làm giảm đau khớp đến một mức
độ đáng kể [12].
Một lớp chất khác là saponins, thường được biết đến là holothurins, từ dưa
chuột biển. Đặc điểm cấu trúc của các hợp chất này là khá giống với những thành
phần hoạt tính sinh học từ linh chi, nhân sâm và các thảo dược bổ nổi tiếng khác
trong y học [12]. Chúng đã thể hiện một phổ rộng các hiệu ứng sinh học như tan
huyết, ngăn phân bào, chống ung thư và kháng u hoạt động [11, 33, 65, 66, 69].
1.2. Tình hình nghiên cứu về thành phần hóa học và hoạt tính sinh học của
lồi hải sâm Stichopus chloronotus
1.2.1. Thành phần hóa học
Thành phần hóa học của lồi hải sâm Stichopus chlorontus được nghiên cứu
từ những năm 1980 khi các thành phần axit béo [23], glycosphingolipid [77] và
triterpene oligoglycoside (saponin) [35, 36] của nó được báo cáo là có hoạt tính
kháng nấm [36], kháng u, gây độc tế bào [52], chống đông máu, chống oxi hóa,
chống nghẽn mạch và chống ung thư [23, 77]. Tuy nhiên ở nước ta chưa có cơng
trình khoa học nào cơng bố về thành phần hóa học và hoạt tính sinh học của lồi
này. Trên thế giới hiện cũng có rất ít các cơng trình cơng bố về lồi hải sâm
Stichopus chlorontus.
Năm 1981, các nhà khoa học Nhật Bản thuộc trường Đại học Khoa học
Dược, Đại học Kyushu đã phân lập được 6 hợp chất là stichlorosides A1, B1, C1, A2,
B2, C2 từ loài hải sâm Stichopus chloronotus Nhật Bản [36]. Cả 6 hợp chất đều có
dạng triterpene-oligoglycosides và các hợp chất stichlorosides A2, B2, C2 là các dẫn
xuất dehydro của stichlorosides A1, B1, C1.

Lê Thị Viên

10

2012B


Luận văn thạc sĩ

Công nghệ sinh học
O

O

23
25

H OR2

O

O

7

H

OR1
CH2OR1
O

OCH3
H
R 1O
OR1

CH2

OR1

O
OCH3
R 1O

H
OR1

CH2OR1
O
O
H
R 1O
OR1

H

O

O

O

CH2OR1
O
O
H
R 1O
OR1

OR1
H

O

OR1

Stichloroside A1: R1= H, R2=Ac
Stichloroside A2: R1= H, R2=Ac, ∆25

O

O

23
25

H OR2

O

O
CH2OR1

O
OCH3
H
R 1O
OR1

CH2OR1
O
OCH3
H
R 1O
OR1

CH2OR1
O
O
H
R 1O
OR1

O
R 1O

O

O

O

7

H

OR1
H
O

CH2OR1
O
OR1
H
OR1

H
OR1
Stichloroside B1: R1= H, R2=Ac, ∆7
,
Stichloroside B2: R1= H, R2=Ac, ∆7 25

Lê Thị Viên

11

2012B


Luận văn thạc sĩ

Công nghệ sinh học
O

O

23

H OR2

OR1
CH2OR1
O
OCH3
H
R1O
OR1

CH2OR1
O
O
H
R1O
OR1

O

O

25

7

H
H

O

O

CH3
O
OR1

CH2OR1
O
OCH3
H
R1O
OR1

O
R1O

O

O

H
OR1

H
OR1

Stichloroside C1: R1= H, R2=Ac, ∆7
,
Stichloroside C2: R1= H, R2=Ac, ∆7 25

Hình 1.2. Cấu trúc hóa học của stichlorosides A1, B1, C1, A2, B2, C2
Năm 2003, nhóm các tác giả này tiếp tục phân lập được 3 hợp chất mới là
SCG-1, SCG-2, SCG-3 từ dịch chiết chloroform-methanol của loài hải sâm
Stichopus chloronotus. Dựa trên các dữ kiện hằng số vật lý và phổ, cấu trúc của 3
phân tử ganglioside này đã được xác định là 1-O-[(N-glycolyl-α-D-neuraminosyl)(2→6)-β-D-glucopyranosyl]-ceramide (SCG-1); 1-O-[8-O-sulfo(major)-(N-acetylα-D-neuraminosyl)-(2→6)-β-D-glucopyranosyl]-ceramide (SCG-2); và 1-O-[α-Lfucopyranosyl-(1→11)-(N-glycolyl-α-D-neuraminosyl)-(2→6)-β-Dglucopyranosyl]-ceramide (SCG-3). Các nửa creamide được hợp thành bởi chuỗi
dài không đồng nhất và các đơn vị axit béo. SCG-3 là phân tử ganglioside đầu tiên
có chứa một fucopyranose trong phân nửa sialosyl trisaccharide [77].

Lê Thị Viên

12

2012B


Luận văn thạc sĩ

Cơng nghệ sinh học

Hình 1.3. Cấu trúc hóa học của SCG-1, SCG-2, SCG-3
1.2.2. Hoạt tính sinh học
Năm 2001, các nhà khoa học thuộc trường Đại học Kebangsaan – Malaysia
đã nghiên cứu hiệu quả chống cảm giác đau của các dịch chiết từ loài hải sâm
Stichopus chloronotus Brant [55]. Các phân đoạn dịch chiết sử dụng nước, đệm
phosphate, etanol và methanol được đánh giá trên chuột qua phản ứng co thắt bụng.
Kết quả được thể hiện trong bảng 1.1.

Lê Thị Viên

13

2012B


Luận văn thạc sĩ

Công nghệ sinh học

Bảng 1.1. Ảnh hưởng của các dịch chiết Stichopus chloronotus tới
phản ứng co thắt bụng ở chuột
Mẫu

N

% Ức chế

Đối chứng âm

9

30

Đối chứng dương

9

34.39

10 mg/kg

9

36.07

30 mg/kg

7

50.53

50 mg/kg

10

65.20

10 mg/kg

9

46.47

30 mg/kg

10

58.68

50 mg/kg

8

63.62

10 mg/kg

9

41.45

30 mg/kg

9

45.80

50 mg/kg

9

56.67

10 mg/kg

9

51.67

30 mg/kg

9

50.69

50 mg/kg

7

52.57

Dịch nước

Dịch chiết PBS

Dịch chiết methanol

Dịch chiết ethanol

Kết quả là với liều lượng mẫu phản ứng 50 mg/kg sử dụng dịch chiết nước
cho hiệu quả ức chế 65.20%. Kết quả cũng chỉ ra rằng có sự tăng dần trong phần
trăm ức chế của phản ứng co thắt bụng khi sử dụng dịch chiết nước điều trị ở nồng
độ 10, 30, 50 mg/kg từ 36.07, 50.53 và 65.20 %. So với đối chứng âm sử dụng muối
Lê Thị Viên

14

2012B


Luận văn thạc sĩ

Cơng nghệ sinh học

thường có một sự tăng lên đáng kể về phần trăm ức chế. Tuy nhiên, nghiên cứu so
sánh với đối chứng dương (morphine sulphate 34.39%) khơng có sự khác biệt đáng
kể nào ở nồng độ 10 mg/kg và 30 mg/kg. Điều trị sử dụng dịch chiết đệm phosphate
cũng cho thấy sự tăng lên trong phần trăm ức chế từ 46.47% ở nồng độ 10 mg/kg
lên 63.62% ở nồng độ 50 mg/kg. Như vậy, các kết quả cho thấy tất cả các dịch chiết
của Stichopus chloronotus đều có hiệu quả chống cảm giác đau phụ thuộc nồng độ
như đánh giá bởi sự kiểm tra co thắt bụng ở chuột.
Năm 2009, Althunibat và cộng sự [4] đã kiểm tra tác động của dịch nước và
dịch chiết hữu cơ từ ba loài dưa chuột biển Holothuria leucospilota, Holothuria
scabra, Stichopus chloronotus trên sự phát triển của hai tế bào ung thư người: A549
(tế bào ung thư phổi) và C33A (tế bào ung thư cổ tử cung) sử dụng MTT khảo
nghiệm. Trong các dịch chiết thử nghiệm, chỉ dịch chiết có nguồn gốc từ Stichopus
chloronotus ức chế sự phát triển và chống lại các dòng tế bào ung thư thử nghiệm.
Dịch nước từ Stichopus chloronotus gây độc với các tế bào C33A (IC50=10.0
µg/ml) cao hơn so với A549, trong khi dịch chiết nước từ Holothuria leucospilota
và Holothuria scabra cho thấy khơng có tác động gì đáng chú ý đến sự tăng trưởng
của các tế bào ung thư trong giới hạn nồng độ sử dụng. Mặt khác, các dịch chiết
hữu cơ từ dưa chuột biển ức chế sự phát triển của các dòng tế bào A549 và C33A ở
mức độ khác nhau. Dịch chiết hữu cơ từ loài Holothuria scabra cho hiệu quả ức chế
sự phát triển của A549 và C33A lớn hơn cả với giá trị IC50 tương ứng là 15.5 µg/ml
và 3.0 µg/ml. Hơn nữa, dịch chiết hữu cơ từ Stichopus chloronotus cho thấy khả
năng gây độc cao hơn với các tế bào C33A (IC50=6.0 µg/ml) nhưng lại ít chống lại
các tế bào A549 (IC50=21.0 µg/ml). Chức năng ức chế sự phát triển của các tế bào

ung thư và chống ung thư của dịch chiết từ dưa chuột biển có thể được gán cho sự
hiện diện của một lượng đáng kể tổng số các phenol và các flavonid, có giá trị như
chất chống oxy hóa hữu hiệu bảo vệ khỏi sự oxy hóa do stress và các bệnh thối hóa
bao gồm một số bệnh ung thư [4].
Tương tự như vậy, các thuộc tính kháng sinh và chống oxy hóa in vitro của
dịch chiết hữu cơ và dịch nước từ các loài hải sâm Holothuria leucospilota,
Holothuria scabra và Stichopus chloronotus đã được Althunibat và cộng sự nghiên
Lê Thị Viên

15

2012B


Luận văn thạc sĩ

Công nghệ sinh học

cứu [4]. Kết quả cho thấy dịch nước của Holothuria leucospilota có hàm lượng
phenolic tổng số cao nhất (9.70mg GAE/g dịch chiết), trong khi dịch chiết hữu cơ
của Holothuria scabra chứa ít nhất (1.53mg GAE/g dịch chiết). Dịch nước từ
Stichopus chloronotus thu dọn gốc tự do DPPH (IC50=2.13 mg/ml) có hiệu quả hơn
dịch nước từ Holothuria scabra (IC50=50 mg/ml). Các dịch nước từ cả ba lồi này
cịn thể hiện hoạt tính chống oxy hóa cao (77.46 %, 64.03 % và 80.58 %, tương
ứng) về sự peroxy hóa axit linoleic.
Năm 2012, các nhà khoa học Hàn Quốc thuộc trường Đại học y khoa DongA đã nghiên cứu tác động của stichoposide C (STC) lên các tế bào ung thư đại trực
tràng và bạch cầu. Nghiên cứu đã chỉ ra rằng STC ức chế sự tăng sinh của tế bào
bạch cầu HL- 60 bằng cách gây ra hiện tượng apoptosis. Tương tự với các dòng tế
bào bạch cầu (THP-1, K562 và NB4) và tế bào ung thư đại trực tràng khác (CT-26,
HT- 29 và SNU-C4), quá trình apoptosis của stichoposide C cũng được quan sát

thấy mặc dù hiệu quả apoptosis ở mỗi dòng tế bào là khác nhau. Nghiên cứu cịn
cho thấy STC có khả năng ức chế sự phát triển khối u của các tế bào ung thư ở mơ
hình khối u ghép ngoại lai HL-60 và khối u dưới da CT-26 trên chuột. Sau 21 ngày,
kích thước các khối u trên chuột được điều trị với STC nhỏ hơn 70% hoặc 60% các
khối u ở chuột trước khi điều trị [79].
Sau đó, nhóm các nhà khoa học này tiếp tục nghiên cứu hoạt tính kháng u và
ức chế sự tăng sinh của tế bào bạch cầu người của stichoposide D (STD). STD gây
ra hiện tượng apoptosis trong tế bào bạch cầu của con người phụ thuộc nồng độ và
thời gian. Tuy nhiên, trong các tế bào K562 và HL-60, stichoposide D gây ra hiện
tượng apoptosis yếu hơn stichoposide C. Stichoposide C gây chết tế bào cao gấp 2-5
lần đã được quan sát thấy với giá trị IC50 ở các tế bào K562, HL-60 lần lượt là
0.5µM và 0.3µM; trong khi đó, IC50 của stichoposide D tương ứng là 1µM và
1.5µM [52].

Lê Thị Viên

16

2012B