LÊN MEN LACTIC TỪ NƯỚC ÉP DƯA HẤU - LỢI KHUẨN Lactobacillus plantarum

TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM HÀ NỘI
KHOA SINH HỌC
BỘ MÔN CƠNG NGHỆ SINH HỌC – VI SINH
----------

ĐỀ CƯƠNG KHĨA LUẬN TỐT NGHIỆP
Chuyên ngành: Vi sinh học
Đề tài: Nghiên cứu lên men lactic nước ép dưa hấu bằng
lợi khuẩn Lactobacillus plantarum

Người hướng dẫn khoa học

: TS. Phan Duệ Thanh

Người thực hiện

: Hoàng Thu Thủy

Hà Nội - 2021


MỤC LỤC
Y

Mục lục
YI.

LÍ DO CHỌN ĐỀ TÀ

II. MỤC TIÊU NGHIÊN CỨU:..........................................................................1
III.

NỘI DUNG NGHIÊN CỨU:.......................................................................2

IV.

VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU:.....................................2

1. Vật liệu:.......................................................................................................2
2. Hóa chất và các nguyên vật liệu khác:........................................................2
3. Thiết bị và dụng cụ:.....................................................................................2
4. Môi trường:.................................................................................................2
5. Phương pháp nghiên cứu:...........................................................................2
V. KẾ HOẠCH THỰC HIỆN ĐỀ TÀI..................................................................5
V. DỰ KIẾN KẾT QUẢ ĐẠT ĐƯỢC:...............................................................6
VII. TÀI LIỆU THAM KHẢO:............................................................................8


I.

LÍ DO CHỌN ĐỀ TÀI:
Nước ép dưa hấu hấu (Citrullus lanatus) - được coi là thức uống lành

mạnh rất giàu lycopene, khoáng chất và vitamin. Sử dụng nước dưa hấu thường
xuyên có thể làm tăng nồng độ lycopene và beta-carotene trong máu. Các nghiên
cứu cho thấy rằng những chất chống oxy hóa mạnh này có thể có tác dụng bảo
vệ chống lại các bệnh tim mạch và một số bệnh ung thư, chẳng hạn như ung thư
tuyến tiền liệt, bàng quang và cổ tử cung. Giá trị chất dinh dưỡng của nước dưa
hấu có thể được tăng lên bằng cách bổ sung thêm hoặc lên men nhờ các lợi
khuẩn (probiotics).
Probiotic là nhóm những vi khuẩn có lợi cho sức khỏe, điển hình như

nhóm vi khuẩn lactic thuộc chi Bifidobacterium và Lactobacillus có trong hệ vi
sinh vật đường ruột. Probiotic mang rất nhiều lợi ích khác nhau như kiểm sốt vi
khuẩn có hại, trợ giúp đắc lực cho hệ miễn dịch của ruột… Với các cơng dụng
trên, hiện nay, probiotic có thể được sử dụng dưới dạng dược phẩm, hoặc thực
phẩm lên men hay bổ sung probiotic như sữa chua, sữa bột,.... Tuy nhiên, việc
sử dụng các sản phẩm từ sữa bị hạn chế ở một số người do khơng có khả năng
dung nạp lactose. Nước trái cây có nguồn dinh dưỡng phong phú như đường,
khoáng chất, vitamin, được xem là một môi trường phù hợp cho sinh trưởng của
probiotic. Cho đến nay, đã có một số nghiên cứu lên men lactic để tạo đồ uống
giàu probiotic trên các loại dịch quả như nước cam ép (Nguyễn Thị Thu Nga,
2011); nước cà chua (Hồ Bích Phương, 2011); thanh long ruột trắng (Nguyễn
Thị Quỳnh Mai và cs, 2020). Nghiên cứu bổ sung probitic vào dịch chanh leo
lên men có độ cồn thấp được tiến hành bởi tác giả Huỳnh Phan Phương Trang
(2018). Một số sản phẩm nước trái cây bổ sung probiotic đã được thương mại
hoá như Biola (Phần Lan), Goodbely (Mỹ),...
Với mong muốn tạo được sản phẩm có lợi cho sức khoẻ người tiêu dùng
từ nguồn hoa quả dồi dào, sẵn có, tơi chọn đề tài nghiên cứu với tiêu đề
“Nghiên cứu lên men lactic tạo đồ uống giàu probiotic từ nước ép dưa hấu
(Citrullus lanatus) bằng lợi khuẩn Lactobacillus plantarum”.
1


II.

MỤC TIÊU NGHIÊN CỨU:
Tạo được đồ uống lên men lactic chứa lợi khuẩn Lactobacillus plantarum

từ nước dưa hấu.
III.

NỘI DUNG NGHIÊN CỨU:
- Đánh giá một số thành phần dinh dưỡng của dịch ép dưa hấu.
- Nghiên cứu khả năng sinh trưởng và lên men tạo acid lactic của chủng vi
khuẩn Lactobacillus plantarum trong môi trường dịch ép dưa hấu.
- Đánh giá cảm quan sản phẩm đồ uống lên men lactic chứa lợi khuẩn
Lactobacillus plantarum từ nước dưa hấu.

IV.

VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU:
1. Vật liệu:
- Dưa hấu ruột đỏ mua tại các chợ đầu mối.
- Chủng vi khuẩn Latobacillus plantarum - Viện Vi sinh và Công nghệ Sinh
học – Đại học Quốc Gia Hà Nội
2. Hóa chất và các nguyên vật liệu khác:
Hóa chất: glucose; cao thịt; cao nấm men; pepton; Tween 80; K2HPO4;

CH3COONa; Triamoniumcitrat; MgSO4; MnSO4; NaCl.
3. Thiết bị và dụng cụ:
Các thiết bị: Tủ cấy (ClassII Biohazard Safety Cabinet – Esco, Mỹ); Tủ
ấm, tủ sấy (Binder, Đức); Nồi khử trùng (SA – 300VF, Nhật); Máy vortex (MS1
Minishaker IKA, Đức); Máy ly tâm falcon 50mL (Themo – Mỹ).
Các dụng cụ: Micropipette, các loại đầu tip, giếng đo quang phổ 96,
găng, bình tam giác, ống nghiệm, ống falcon, ống Eppendorf, cốc thủy tinh, que
trang, ống đong, phễu thủy tinh.

2


4. Mơi trường:

- Mơi trường hoạt hố giống sử dụng môi trường de Mann, Rogosa and
Sharp (MRS) lỏng hoặc đặc, có thành phần gồm (g/L): glucose 20,0;
cao thịt 10,0; cao nấm men 5,0; pepton 10,0; Tween 80 1,0; K2HPO4
2,0; CH3COONa 5,0; Triamoniumcitrat 2,0; MgSO4 0,58; MnSO4 0,28.
- Môi trường Luria_Bertani (LB) có thành phần gồm (g/L): cao nấm
men 5,0; pepton 10,0; NaCl 10,0.
5. Phương pháp nghiên cứu:
5.1.

Đánh giá ảnh hưởng của một số điều kiện môi trường đến khả
năng lên men của L. plantarum trong dịch ép dưa hấu

5.1.1. Ảnh hưởng của pH ban đầu
Chủng vi khuẩn L.plantarum sau khi được hoạt hố trong mơi trường MRS
lỏng ở 30°C. Sau 48 giờ hút lấy 1mL dịch giống và xác định mật độ quang ở
bước sóng 610nm. Bổ sung cùng lượng giống tương đương 106 TB/mL vào bình
tam giác 250mL chứa 100mL nước ép dưa hấu đã được thanh trùng Pasteur ở
80°C trong thời gian 10 phút với pH ban đầu 5,0,; 5,5; 6,0 và 6,5. Bình lên men
được ni tĩnh ở 30°C, trong thời gian 48 giờ. Thí nghiệm được lặp lại 3 lần.
5.1.2. Ảnh hưởng của nồng độ chất khơ hồ tan
Chủng vi khuẩn L.plantarum sau khi được hoạt hố trong mơi trường MRS
lỏng ở 30°C. Sau 48 giờ hút lấy 1mL dịch giống và xác định mật độ quang ở
bước sóng 610nm. Bổ sung cùng lượng giống tương đương 106 TB/mL vào bình
tam giác 250mL chứa 100mL nước ép dưa hấu đã được thanh trùng Pasteur ở
80°C trong thời gian 10 phút với hàm lượng chất khơ hồ tan 12, 14, 16, 18°Bx,
giá trị pH ban đầu chỉnh theo kết quả chọn từ thí nghiệm trước. Bình lên men
được nuôi tĩnh ở 30°C, trong thời gian 48 giờ. Thí nghiệm được lặp lại 3 lần.
5.1.3. Ảnh hưởng của thời gian lên men
Chủng vi khuẩn L. plantarum sau khi được hoạt hố trong mơi trường
MRS lỏng ở 30°C. Sau 48 giờ hút lấy 1mL dịch giống và xác định mật độ quang

3


ở bước sóng 610nm. Bổ sung cùng lượng giống tương đương 10 6 TB/mL vào
bình tam giác 250mL chứa 100mL nước ép dưa hấu đã được thanh trùng Pasteur
ở 80°C trong thời gian 10 phút với kết hợp với thông số về pH và hàm lượng
chất khơ hồ tan chọn được từ kết quả các thí nghiệm trước. Bình lên men được
nuôi tĩnh ở 30°C, với thời gian lên men 12 giờ, 24 giờ, 36 giờ, 48 giờ, 60 giờ, và
72 giờ. Thí nghiệm được lặp lại 3 lần.
Các nghiệm thức được theo dõi đánh giá thông qua mật độ vi khuẩn sau
lên men, nồng dộ chất tan, pH, acid tổng số và điểm cảm quan thị hiếu về vị.
5.2.

Các phương pháp phân tích

5.2.1. Xác định pH
Sử dụng máy đo pH để bàn để xác định giá trị pH của dịch ép dưa hấu,
trước và sau quá trình lên men..
5.2.2. Xác định hàm lượng chất khơ hồ tan
Sử dụng máy đo độ Brix cầm tay Total meter LH – T32 để xác định hàm
hàm lượng chất khơ hịa tan (tự bù nhiệt về 20°C) trong dịch ép dưa hấu..
5.2.3. Xác định hàm lượng đường tổng số (Masuko et al., 2005)
Nguyên tắc: Các loại đường đơn, oligosaccarit và các dẫn xuất của chúng
có mang những nhóm có tính khử hoặc khơng mang nhóm có tính khử đều bắt
màu vàng cam khi gặp phenol và H2SO4 đặc. Phản ứng này rất nhạy, tạo màu sắc
bền, cho phép xác định một lượng nhỏ đường và cơ chất trong một hỗn hợp.
Các bước tiến hành:
Pha lỗng các dung dịch thí nghiệm đến nồng độ phù hợp để có thể phân
tích. Bổ sung 50 µL các mẫu dịch cần phân tích vào các giếng của đĩa 96 giếng,
sau đó tiếp tục bổ sung 150 µL H2SO4 đặc và nhanh chóng bổ sung 30 µL

phenol 5% vào từng giếng. Đĩa 96 giếng sau đó được đun nóng cách thủy 90 oC
trong 5 phút rồi làm nguội về nhiệt độ phịng trong 5 phút, lau khơ rồi đo ở bước
sóng A490.
Pha các dung dịch đường D – Glucose với các nồng độ (µmol/mL): 0,5 - 1
- 2 - 3. Với cách làm như trên, xây dựng đuờng chuẩn D – Glucose đo ở bước
4


sóng A490 (y = ax + b, R 2 – hệ số tương quan), x là hàm lượng đường D –
Glucose, y là giá trị A490 tương ứng, a và b là các giá trị tìm được từ kết quả thí
nghiệm.
Từ đường chuẩn và các giá trị đo được của mẫu, tính ra hàm lượng đường
tổng số.
5.2.4. Xác định hàm lượng acid tổng số
Định lượng hàm lượng acid lactic theo phương pháp chuẩn độ xác định
hàm lượng acid tổng số (Tiêu chuẩn quốc gia TCVN, 2007).
Nguyên tắc:
Chuẩn độ trực tiếp các acid có trong mẫu bằng dung dịch natri hydroxit
(NaOH) với chỉ thị phenolphtalein và xác định hàm lượng acid có trong mẫu
thơng qua phương pháp xác định độ Therner.
Chuẩn bị dung dịch chuẩn độ
Cân chính xác 0,4g NaOH cho vào bình định mức 100mL, bổ sung thêm
nước cất cho đến khi đạt 100mL. Sau đó, pha lỗng phenolphtalein trong cồn
60° để thu được dung dịch phenolphtalein 1%.
Phân tích mẫu thí nghiệm
Sau 72 giờ ni cấy tĩnh, dịch ni cấy vi khuẩn Lactobacillus platarum
được li tâm 13000 vòng/phút trong 5 phút ở 4°C và thu dịch nổi. Hút 5 - 10mL
dịch nổi vào bình tam giác sạch (100mL), thêm 20mL nước cất trung tính và 3
giọt dung dịch phenolphtalein 0,1% lắc đều cho đến khi dung dịch trong, rồi
chuẩn độ bằng natri hydroxit 0,1N đến khi dung dịch có màu hồng nhạt bền

trong 30 giây.
Tính kết quả
Độ acid chung (X) tính bằng độ Therner (°Th), độ acid chung (X) là số
mL NaOH 0,1N trung hịa lượng acid tự do có trong 100 mL (tính bằng °Th).
Hàm lượng acid tổng số (X) của mẫu tính bằng g/100mL theo cơng thức: X =
Trong đó:
V - thể tích natri hydroxit 0,1N, mL;
5


V1 - thể tích mẫu hút để chuẩn độ, mL;
K - hệ số để tính ra loại acid tương ứng (độ chuẩn theo chất cần xác
định):
Với acid lactic K bằng 0,009
5.3.

Phương pháp vi sinh

5.3.1. Phương pháp giữ giống (Nguyễn Lân Dũng, 2010)
Phương pháp cấy truyền định kỳ: Vi khuẩn Lactobacillus plantarum cấy
định kì lên thạch đặc. Cấy truyền định kì trên môi trường mới cứ 2 tháng 1 lần.
Phương pháp lạnh đông bằng 15% glycerol: Nuôi chủng Lactobacillus
plantarum trên môi trường 15% glycerol. Cấy truyền định kì trên mơi trường
mới cứ 2 tháng 1 lần.
5.3.2. Phương pháp hoạt hóa giống
Vi khuẩn Lactobacillus plantarum (L. platarum) được hoạt hóa trên mơi
trường MRS lỏng. Lấy một vòng que cấy giống bảo quản, cấy vào bình tam giác
100mL chứa 25mL mơi trường MRS lỏng, vô trùng rồi nuôi tĩnh trong 48 giờ
với điều kiện nhiệt độ ở 30°C.
5.3.3. Phương pháp xác định mật độ tế bào

Mật độ tế bào được xác định theo hai phương pháp: Đếm số lượng tế bào
khuẩn lạc trên môi trường MRS rắn kết hợp với xác định giá trị OD (optical
density – mật độ quang) ở bước sóng 610nm để xây dựng mối tương quan giữa
mật độ tế bào và giá trị OD610.

 Xác định mật độ tế bào sống bằng phương pháp đếm khuẩn lạc
Xác định mật độ tế bào vi khuẩn bằng phương pháp đếm số lượng khuẩn
lạc xuất hiện trên môi trường MRS vô trùng.
Hút 1mL dịch lên men, pha loãng theo phương pháp tới hạn 10-1 - 10-6.
Lấy 0,1mL dịch mẫu ở các độ pha lỗng phù hợp đưa lên đĩa Petri chứa
mơi trường MRS đặc vô trùng và trang đều. Các hộp lồng Petri được giữ ở nhiệt
độ 30oC trong 24 giờ. Mỗi độ pha loãng được cấy lặp lại trên 3 hộp lồng. Số

6


lượng khuẩn lạc xuất hiện trên mỗi hộp lồng được xác định. Số lượng tế bào vi
khuẩn L. plantarum trong 1mL dịch lên men được xác định theo công thức sau:
N = A : V : Df
Trong đó, N là số lượng khuẩn lạc trên 1mL dịch mẫu;
A là số lượng khuẩn lạc trung bình đếm được trên một đĩa Petri
ở độ pha lỗng nhất định;
V là thể tích dịch mẫu cấy trên một đĩa Petri;
Df: là độ pha loãng mẫu (10-n)

 Xác định giá trị OD tương ứng ở bước sóng 610nm
Xác định sự tương quan giữa số lượng tế bào L. plantarum và giá trị OD ở
bước sóng 610nm bằng máy đo quang phổ UV với mỗi độ pha loãng. Đồ thị
đường chuẩn với y = ax + b thể hiện mối tương quan giữa số lượng tế bào/ml và
giá trị OD610 được xây dựng nhờ phần mềm Microsoft Excel.

5.4.

Phương pháp cảm quan

Sản phẩm nước dưa hấu lên men lactic nhờ chủng L. platarum được đánh
giá cảm quan. Phương pháp đánh giá cảm quan được sử dụng theo TCVN
7041:2009 , đối tượng cảm quan là nhóm 20 – 30 người. Đánh giá cảm quan
của người dùng theo thang điểm dựa vào các tiêu chí sau:
Đối với 4 tiêu chí cảm quan : Màu sắc, mùi, vị và trạng thái. Chấm theo
thang điểm từ 0 - 5 theo mức độ đạt cho từng tiêu chí của sản phẩm:
 Điểm 0: Sản phẩm bị hỏng, không dùng được
 Điểm 1: Sản phẩm có màu sắc và mùi vị khơng phù hợp.
 Điểm 2: Sản phẩm đạt loại trung bình, màu sắc không đẹp, mùi
không thơm.
 Điểm 3: Sản phẩm đạt loại khá, có mùi thơm, màu sắc chưa đẹp.
 Điểm 4: Sản phẩm khá tốt, có mùi thơm, màu sắc đẹp, vị khá.
 Điểm 5: sản phẩm rất tốt, có mùi thơm, màu sắc đẹp, vị ngon
miệng.
7


Các phiếu điểm sẽ được tập hợp lại để xử lý thống kê cho từng tiêu chí.
Tiêu chí
Điểm

Màu sắc

Mùi

Vị

Trạng thái

V. KẾ HOẠCH THỰC HIỆN ĐỀ TÀI
ST

Thời

T

gian

Tiến độ
Nội dung
nghiên cứu

khảo tài liệu liên

11/2021

thành phần dinh
dưỡng của nước
dưa hấu.

3

- Thu thập được
các tài liệu, báo cáo

liên quan đến đề tài.

quan đến đề tài.
- Thành thạo các
- Tìm hiểu và làm
phương
pháp Đã hồn
3-5/2021 quen với các
nghiên cứu vi sinh thành.
phương
pháp
và hóa sinh trong
nghiên cứu.
- Viết đề cương phịng thí nghiệm.
- Hồn thành đề
sơ bộ.
cương.
Một số kết quả về
Đánh giá một số

2

thực
hiện

- Thu thập, tham

1

Dự kiến kết quả

12/2021

các giá trị dinh
dưỡng của dịch ép
dưa

hấu

(Đường

tổng

số,

Protein,

Đã hồn
thành.

hàm lượng chất khơ

hồ tan, pH)
Nghiên cứu ảnh Xác định được giá Đang
hưởng của một số trị

pH ban đầu, thực

yếu tố môi trường hàm lượng chất khô hiện
(pH ban đầu, hàm hoà tan và thời gian
lượng chất tan, lên men phù hợp
8

của

chủng

thời gian ) đến plantarum

L.
trong

khả năng lên men dịch ép dưa hấu
lactic dịch ép dưa thông qua đánh giá
hấu của chủng vi về mật độ tế bào,
khuẩn

pH, acid tổng số,

Lactobacillus

nồng độ chất tan

plantarum

của dịch sau lên
men.

Thu nhận ý kiến

4

1/2022

đánh

giá

cảm

quan

và

điều

chỉnh tỉ lệ phù
hợp theo kết quả
cảm quan.
- Viết và hoàn
thiện luận văn tốt

5

1/2022

nghiệp.
- Bảo vệ khóa

Thống kê được các
ý kiến cảm quan, Chưa

điều chỉnh tỉ lệ để thực
phù hợp với thị hiếu hiện
người dùng.

Hồn thành khóa
luận

Chưa
thực
hiện

luận.
V.

DỰ KIẾN KẾT QUẢ ĐẠT ĐƯỢC:

- Tạo được đồ uống lên men lactic dịch ép dưa hâu bằng vi khuẩn
Lactobacillus pllantarum có cảm quan tốt.

9


VI.

TÀI LIỆU THAM KHẢO:

Tài liệu tiếng Việt
[1]. Bộ Y Tế - Viện Dinh Dưỡng. Bảng thành phần thực phẩm Việt Nam, NXB Y
học, 219.
[2]. Huỳnh Ngọc Thanh Tâm, Nguyễn Lê Hồng Diệp và Phan Thị Thu Sương,

2019. Phân lập và tuyển chọn dịng vi khuẩn lactobacillus có tiềm năng
probiotic từ cây mơn ngọt (colocasia esculenta (l.) Schott), Tạp chí Khoa học
Trường Đại học Cần Thơ, 15-23.
[3]. Đoàn Anh Dũng, Nguyễn Cơng Hà, Lý Nguyễn Bìnhvà Lê Nguyễn Đoan
Duy, 2015. Nghiên cứu sử dụng vi khuẩn probiotic Lactobacillus plantarum
trong chế biến sữa chua, Tạp chí Khoa học Trường Đại học Cần Thơ, 14-20.
[4]. Đồng Thị Hoàng Anh, Nguyễn Quang Huy, Nguyễn Quỳnh Uyển, 2017.
Khảo sát một số đặc điểm của bacteriocin ở chủng vi khuẩn Lactobacillus
plantarum UL487 phân lập từ mẫu chao của Huế, Tạp chí Khoa học ĐHQGHN:
Khoa học Tự nhiên và Công nghệ, Tập 33, Số 1S, 1-6.
[5]. Huỳnh Phan Phương Trang, 2018. Thử nghiệm nước chanh dây độ cồn thấp
bổ sung probiotic từ vi khuẩn Lactobacillus plantarum LY-78, Tạp chí Khoa học
cơng nghệ và Thực phẩm 16 (1), 56-66.
[6]. Phạm Thị Nga, 2011. Nghiên cứu sản xuất sản phẩm probioticnước cà rốt
từ vi khuẩn Lactobacillus plantarum, Luận văn thạc sĩ, Đại học Đà Nẵng.
Tài liệu tiếng nước ngoài
[7]. MR Fazeli, N Amirmozafari, R Golbooi nejad, H Jamalifar, 2007.
Antagonistic Action of Watermelon Juice Probioticated Using Different Strains
of Lactobacilli against Salmonella typhimurium, Iranian J Publ Health, Vol. 36,
No.4, 2007, pp.70-73.
[8]. Zahra sadat alavi, Seyed HadiRazavi, Rezvan pourahmad. Comparative of
fermentation in red and yellow watermelon juice by lactic acid bacteria.

10


[9]. Julia Szutowska, 2019. Functional properties of lactic acid bacteria in
fermented fruit and vegetable juices: a systematic literature review, European
Food Research and Technology.
[10].

11