Tiềm năng sinh Alginate lyase của các chủng vi khuẩn phân lập ở vùng biển Việt Nam

TAP CHI SINH HOC 2019, 41(2se1&2se2): 273–279
DOI: 10.15625/0866-7160/v41n2se1&2se2.14135

POTENTAL PRODUCE ALGINATE LYASE BY BACTERIA STRAINS
ISOLATED FROM COASTAL REGIONS IN VIETNAM
Nguyen Thi Thuan*, Tran Nguyen Ha Vy, Vo Thi Dieu Trang, Cao Thi Thuy Hang,
Vo Mai Nhu Hieu, Nguyen Ngoc Linh, Nguyen Dinh Thuat, Tran Thi Thanh Van
Nha Trang Institute of Technology Research and Application, VAST, Vietnam
Received 6 August 2019, accepted 29 September 2019

ABSTRACT
The ability to produce the alginate lyase enzyme of marine bacteria strains was screened by
alginate agar plate stained with gram’s iodine. Among 197 strains of bacteria isolated from
sponges, soft corals and seaweeds, 56% of strains showed alginate - cleavage activity on alginate
from Sargassum mcclurei. Total of eleven active bacterial strains were selected to identify the
characteristic of subspecies. The sequence comparision of 16S rRNA gene showed that nine
strains belong to the genus Bacillus and two strains belong to the genus Fictibacillus.
Keywords: Bacillus, alginate, alginate lyase, gram’s iodine, marine bacteria.

Citation: Nguyen Thi Thuan, Tran Nguyen Ha Vy, Vo Thi Dieu Trang, Cao Thi Thuy Hang, Vo Mai Nhu Hieu,
Nguyen Ngoc Linh, Nguyen Dinh Thuat, Tran Thi Thanh Van, 2019. Potental produce alginate lyase by bacteria
strains isolated from coastal regions in Vietnam. Tap chi Sinh hoc, 41(2se1&2se2): 273–279.
/>*

Corresponding author email:

©2019 Vietnam Academy of Science and Technology (VAST)

273

TAP CHI SINH HOC 2019, 41(2se1&2se2): 273–279
DOI: 10.15625/0866-7160/v41n2se1&2se2.14135

TIỀM NĂNG SINH ALGINATE LYASE CỦA CÁC CHỦNG VI KHUẨN
PHÂN LẬP Ở VÙNG BIỂN VIỆT NAM
Nguyễn Thị Thuận*, Trần Nguyễn Hà Vy, Võ Thị Diệu Trang, Cao Thị Thúy Hằng,
Võ Mai Nhƣ Hiếu, Nguyễn Ngọc Linh, Nguyễn Đình Thuất, Trần Thị Thanh Vân
Viện Nghiên cứu và Ứng dụng công nghệ Nha Trang, Viện Hàn lâm Khoa học
và Công nghệ Việt Nam
Ngày nhận bài 6-8-2019, ngày chấp nhận 29-9-2019

TÓM TẮT
Khả năng sinh enzyme alginate lyase của các chủng vi khuẩn biển được sàng lọc bằng phương
pháp đĩa thạch alginate nhuộm bởi gram’s iodine. Trong số 197 chủng vi khuẩn phân lập từ bọt
biển, san hô mềm và rong biển, 56% chủng thể hiện hoạt tính phân cắt alginate từ rong
Sargassum mcclurei. 11 chủng vi khuẩn có hoạt tính cao nhất được chọn lọc để xác định đặc
trưng phân lồi. Kết quả so sánh trình tự gen 16S rRNA cho thấy có 9 chủng vi khuẩn biển thuộc
chi Bacillus và 2 chủng vi khuẩn biển thuộc chi Fictibacillus.
Từ khóa: Bacillus, alginate, alginate lyase, gram’s iodine, vi khuẩn biển.

*Địa chỉ liên hệ email:
MỞ ĐẦU
Alginate là polysaccharide chủ yếu được
chiết xuất từ rong nâu (chiếm đến 40% khối
lượng rong khô), được cấu tạo từ β-Dmannuronate (M) và α-L- guluronate (G). Các
gốc uronate này sắp xếp thành các block khác
nhau: poly β-D- mannuronate (poly M), poly
α-L- guluronate G (poly G) và heteropolymer
(polyMG) (Lee et al., 2013). Alginate đặc biệt
thu hút sự quan tâm của các nhà nghiên cứu

trong các lĩnh vực thực phẩm, hóa học, y
dược, nơng nghiệp bởi trữ lượng lớn (hơn
30.000 tấn/năm) (Hay et al., 2013) và các hoạt
tính sinh học đa dạng của polymer cũng như
oligosaccharide như chống oxy hóa, kích thích
tăng trưởng, kháng viêm,… (Falkeborg et al.,
2014; Salachna et al., 2018; Zhou et al.,
2015). Tuy nhiên, việc ứng dụng alginate
trong y học còn nhiều hạn chế do khối lượng
phân tử lớn và độ nhớt cao. Do đó, nhiều nhà
khoa học đã tập trung nghiên cứu điều chế
alginate trọng lượng phân tử thấp với mục
đích tăng khả năng ứng dụng trong lĩnh vực y
274

dược, nghiên cứu cấu trúc cũng như làm tăng
hoạt tính sinh học của chúng (Chen et al.,
2017; Zhu et al., 2016).
Alginate oligosaccharide được điều chế
bằng các phương pháp vật lý, hóa học hoặc
enzyme. Trong đó phương pháp enzyme được
ưu tiên sử dụng do tính đặc hiệu và hiệu suất
cao, thân thiện với môi trường. Alginate lyase
được phân lập từ các nguồn khác nhau như vi
khuẩn biển, động vật biển và một số loại đã
được xác định đặc tính xúc tác (Chen et al.,
2018). Dựa trên tính đặc hiệu cơ chất alginate
lyase được chia thành hai loại chính: enzyme
đặc hiệu block G (polyG lyase EC 4.2.2.11)
và enzyme đặc hiệu block M (polyM lyase EC

4.2.2.3) (Yagi et al., 2016). Hiện nay alginate
lyase thương mại có giá thành cao và tính đặc
hiệu chỉ trên block G (Manns et al., 2016).
Theo các nghiên cứu đã được cơng bố,
alginate từ rong nâu Việt Nam có cấu trúc
phức tạp bao gồm block M, block G và một
lượng nhỏ block MG (Thien et al., 2017). Tuy


Tiềm năng sinh alginate lyase của vi khuẩn

nhiên, việc nghiên cứu enzyme chuyển hóa
alginate từ rong nâu Việt Nam vẫn cịn ít
(Huỳnh Hồng Như Khánh nnk., 2011). Do
đó việc tìm kiếm alginate lyase mới có hoạt
tính cao trên cơ chất alginate từ rong biển Việt
Nam là vấn đề cần thiết phải nghiên cứu.
Trong nghiên cứu này chúng tơi tìm kiếm
nguồn sinh alginate lyase mới từ vi khuẩn
biển, xác định đặc trưng phân lồi của các
chủng có hoạt tính cao.
VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN
CỨU
197 chủng vi khuẩn biển được phân lập từ
các nguồn khác nhau trong vùng biển Quảng
Trị, Quảng Nam, Quảng Ngãi, Nha Trang vào
tháng 12 năm 2017. Trong đó có 129 chủng
được phân lập từ bọt biển, 48 chủng được
phân lập từ san hô mềm và 19 chủng được
phân lập từ rong biển.

Sàng lọc hoạt tính alginate lyase của vi sinh
vật biển bằng phƣơng pháp đĩa thạch
Các chủng vi khuẩn sau khi phân lập trên
môi trường MB (glucose 1 g/l; pepton 5 g/l;
yeast extract 1 g/l; KH2PO4 0,2 g/l;
MgSO4.7H2O 0,05 g/l; agar 18 g/l, nước biển
500ml, mước máy 500ml; pH= 7,0–7,5) được
cấy trên đĩa thạch chứa 0,5% alginate chiết từ
rong Sargassum mcclurei. Các mẫu thí
nghiệm được ủ ở 30oC trong 24 giờ. Sau đó,
tiến hành loại bỏ sinh khối vi khuẩn và đĩa
thạch được nhuộm bởi gram’s iodine. Chủng
vi khuẩn được xác định là có hoạt tính
alginate lyase khi vùng nuôi cấy chúng không
bị nhuộm màu bởi thuốc nhuộm mà tạo ra
vùng trong suốt (Sawant et al., 2015).
Xác định đặc trƣng phân lồi
Các chủng vi khuẩn có hoạt tính cao được
định danh bằng phương pháp so sánh trình tự
gen 16S rRNA. Sử dụng cặp mồi 533F:
5’GTGCCAGCAGCCGCGGTAA3’
và
1496R: 5’GGTTACCTTGTTACGACTT3’
(Rosete-Enríquez & Romero-López, 2017) để
nhân gen mã hóa đoạn 16S rRNA của vi
khuẩn phân lập được. Sản phẩm của phản ứng
PCR được kiểm tra bằng điện di trên gel
agarose 2%, tinh sạch bằng bộ QIA quick
PCR Purification Kit (Qiagen). Trình tự

nucleotide của gen 16S rRNA tinh sạch được
giải bằng phương pháp Sanger trên hệ thống
máy ABI 3130XL (313001R, Thermo Fisher
Scientific, USA) tại Phịng xét nghiệm Cơng
ty TNHH DV và TM Nam Khoa (thành phố
Hồ Chí Minh). Các trình tự được xử lí bằng
các chương trình BLAST/NCBI và tiến hành
so sánh trình tự gen của các chủng nghiên
cứu với một số chủng khác từ Ngân hàng
gen
thế
giới
(NCBI)
( />KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
Hoạt tính alginate lyase của vi sinh vật biển
Đến nay nhiều loại enzyme alginate lyase
từ vi sinh vật biển, rong biển và động vật thân
mềm biển đã được phân lập và xác định đặc
tính. Trong nghiên cứu này chúng tôi tập
trung nghiên cứu khả năng sinh alginate lyase
từ vi khuẩn biển. Việc sử dụng vi sinh vật có
khả năng sinh enzyme biến đổi polysaccharide
có nhiều ưu điểm như: Vi sinh vật phát triển
nhanh trong môi trường nuôi cấy chứa các
thành phần dinh dưỡng khác nhau, sản xuất
enzyme với số lượng và điều kiện ổn định, dễ
dàng thao tác và có thể sử dụng lâu dài nếu
được bảo quản tốt. So với phương pháp hóa
học thì việc sử dụng alginate lyase để điều
chế alginate trọng lượng phân tử thấp có giá

thành đắt hơn nhưng với tính chất xúc tác đặc
hiệu của enzyme, điều kiện xúc tác nhẹ nhàng
sẽ giúp phản ứng được kiểm soát và tạo ra
những sản phẩm có tính ứng dụng cao trong
lĩnh vực dược phẩm, y học.
Kết quả trong nghiên cứu này cho thấy, có
hơn 56% chủng vi khuẩn sàng lọc có khả năng
phân cắt alginate từ rong S. mcclurei. Trong
đó, tỷ lệ chủng vi khuẩn phân lập từ rong biển
có tiềm năng sinh alginate cao nhất (hình 1).
Kết quả này tương tự với công bố trong những
năm gần đây về hoạt tính alginate lyase từ vi
khuẩn biển sống cộng sinh trên rong (Dong et
al., 2012; Wang et al., 2017). Dong và cộng
sự đã sàng lọc hoạt tính alginate lyase của 65
chủng vi khuẩn phân lập từ rong nâu thuộc chi
Laminaria, trong đó 21 chủng (32,3%) có
hoạt hoạt tính cao (Dong et al., 2012). Wang
et al. (2017) đã phân lập được 12 chủng vi
khuẩn sinh alginate lyase từ bề mặt rong nâu.
275


Nguyen Thi Luan et al.

a)

b)

Hình 1. Khả năng sinh alginate lyase của các chủng vi khuẩn biển: a) Tỷ lệ chủng vi khuẩn có

khả năng sinh alginate lyase; b) Đĩa thạch alginate nhuộm bởi gram’s iodine, vùng trong suốt
thể hiện hoạt tính alginate lyase
Dựa trên kết quả sàng lọc này, chúng tôi
đã chọn được 11 chủng vi khuẩn biển thể

STT
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11

276

hiện hoạt tính phân cắt alginate mạnh nhất
(bảng 1).

Bảng 1. Hoạt tính alginate lyase của của chủng vi khuẩn biển tuyển chọn
Kí hiệu
Hoạt tính alginate
Nguồn phân lập
Địa điểm thu mẫu
chủng
lyase (mm)

Bọt biển
Cồn Cỏ, Quảng Trị
AlgSm1
21
17 o16711’N; 107 o33806’E
Bọt biển
Cồn Cỏ, Quảng Trị
AlgSm2
12
17 o16711’N; 107 o33806’E
Bọt biển
Cồn Cỏ, Quảng Trị
AlgSm3
32
17 o16711’N; 107 o33806’E
Bọt biển
Cồn Cỏ, Quảng Trị
AlgSm4
17
17 o16711’N; 107 o33806’E
San hô mềm
Cồn Cỏ, Quảng Trị
AlgSm5
27
17 o16711’N; 107 o33806’E
Bọt biển
Cồn Cỏ, Quảng Trị
AlgSm6
12
17 o16711’N; 107 o33806’E

Cù Lao Chàm, Quảng Nam
AlgSm7
San hô mềm
23
15o90300’N; 105o3972’E
Bọt biển
Lý Sơn, Quảng Ngãi
AlgSm8
21
15o36800’N; 109o11382’E
Bọt biển
Lý Sơn, Quảng Ngãi
AlgSm9
28
15o36800’N; 109o11382’E
Bãi Tre, Nha Trang
AlgSm10
San hơ mềm
22
12 o60670’N; 109 o33278’E
Bọt biển
Hịn Ngoại, Nha Trang
AlgSm11
20
12o00581’N; 109o32079’E


Tiềm năng sinh alginate lyase của vi khuẩn

Trong hầu hết các nghiên cứu alginate

lyase từ vi khuẩn biển, rong biển được chọn
làm nguồn phân lập vi khuẩn (Dong et al.,
2012). Trong nghiên cứu này của chúng tôi,
các chủng vi khuẩn có khả năng phân giải
alginate cao lại được phân lập từ bọt biển và
san hơ mềm. Do đó có thể thấy rằng các loài
vi khuẩn biển cộng sinh với bọt biển và san
hô mềm đã giúp các sinh vật này phân giải

STT

alginate thành nguồn carbon cho sự sinh
trưởng và phát triển của chúng. Như vậy,
ngồi rong biển chúng tơi đã mở rộng thêm
nguồn phân lập vi sinh vật biển từ các
nguồn bọt biển và san hơ mềm nhằm tìm
kiếm các chủng vi khuẩn tiềm năng sinh
alginate lyase.
Xác định đặc trƣng phân loài

Bảng 2. Kết quả định danh của các chủng vi khuẩn biển tuyển chọn
Đặc điểm
Chủng
Mã số trên
hình thái
Chủng tương đồng
phân lập
GenBank
khuẩn lạc

Độ tương
đồng (%)

1

AlgSm1

Bacillus velezensisi

CP021011.1

99

2

AlgSm2

Bacillus aquimaris

KJ575042.1

99

3

AlgSm3

Bacillus indicus

MG651110.1

100

4

AlgSm4

Bacillus aryabhattai

NR 115953.1

100

5

AlgSm5

Fictibacillus macauensis

MH169269.1

100

6

AlgSm6

Bacillus megaterium

CP009920.1

100

7

AlgSm7

Fictibacillus macauensis

MH169330.1

99

8

AlgSm8

Bacillus filamentosus

CP026635.1

99

9

AlgSm9

Bacillus cereus

NR 074540.1

100

10

AlgSm10

Bacillus aryabhattai

NR 115953.1

100

11

AlgSm11

Bacillus velezensis

CP011686.1

100

Các chủng vi khuẩn tuyển chọn được nuôi
trên môi trường phân lập MB, sau 24 h quan
sát hình thái khuẩn lạc (bảng 2). Khuẩn lạc
thuần được nhân sinh khối để tách chiết DNA
tổng số và tiến hành PCR nhân bản đoạn 16S
rRNA. Sản phẩm PCR sạch với kích thước

1.500kb được giải trình tự, phân tích và so
sánh với các trình tự các gen có trong ngân
hàng GenBank qua cơng cụ Blast. Các chủng
vi khuẩn này có độ tương đồng cao từ 99 –
100% so với một số chủng trong ngân hàng
GenBank (bảng 2). Kết quả định danh trong
277


Nguyen Thi Luan et al.

bảng 2 cho thấy, 11 chủng vi khuẩn có tiềm
năng sinh alginate lyase đều có độ tương đồng
cao với các chủng đã công bố trên Genbank
và hầu hết thuộc chi Bacillus, 2 chủng vi
khuẩn thuộc chi Fictibacillus. Khả năng sinh
alginate lyase của vi khuẩn biển thuộc chi
Bacillus cũng đã được công bố bởi Wang và
cộng sự (Wang et al., 2017). Tuy nhiên, trong
hầu hết các nghiên cứu alginate lyase từ vi
khuẩn biển, rong biển được chọn làm nguồn
phân lập vi khuẩn thì các chủng vi khuẩn có
hoạt tính alginate lyase đa dạng, thuộc các chi
Psychrobacter,
Winogradskyella,
Psedoalteromonas,
Psychromonas
và
Polaribacte (Dong et al., 2012). Trong nghiên
cứu này của chúng tôi, các chủng vi khuẩn

phân lập từ (bọt biển và san hô mềm) có khả
năng phân giải alginate chủ yếu thuộc chi
Bacillus. Do đó có thể thấy rằng các lồi vi
khuẩn thuộc chi Bacillus cộng sinh chặt chẽ
với bọt biển và san hô mềm giúp các sinh vật
này phân giải alginate thành nguồn carbon
cho sự sống của mình.
KẾT LUẬN
Trong nghiên cứu này, chúng tôi đã sàng
lọc được các chủng vi khuẩn biển có khả năng
sinh alginate lyase trong đó có 9 chủng vi
khuẩn đã được định danh tên khoa học thuộc
chi Bacillus, 2 chủng vi khuẩn thuộc chi
Fictibacillus. Kết quả này sẽ cung cấp những
chủng vi khuẩn biển tiềm năng để tiếp tục
nghiên cứu tách chiết, tinh sạch alginate lyase.
Enzyme có nguồn gốc từ các chủng vi khuẩn
này hứa hẹn có khả năng bẻ mạch alginate
chiết xuất từ rong Việt Nam nhằm điều chế ra
những sản phẩm mới có tính ứng dụng cao.
Lời cảm ơn: Tập thể tác giả xin cảm ơn tài trợ
kinh phí của Hợp phần nhánh số 3, thuộc dự
án
VAST.ĐA47.12/16-19
của
Viện
NC&UDCN Nha Trang, Viện HLKH&CN
Việt Nam và Nhiệm vụ KHCN cấp cơ sở năm
2019,
Phịng

Hóa
PTTKCN,
Viện
NC&UDCNNT.
TÀI LIỆU THAM KHẢO
Chen, J., Hu, Y., Zhang, L., Wang, Y., Wang,
S., Zhang, Y., Guo H., Ji D., Wang, Y.,
2017. Alginate oligosaccharide DP5
exhibits antitumor effects in osteosarcoma
278

patients following surgery. Frontiers in
Pharmacology, 8: 623. />10.3389/fphar.2017.00623
Chen, P., Zhu, Y., Men, Y., Zeng, Y., Sun, Y.,
2018. Purification and characterization of
a novel alginate lyase from the marine
bacterium Bacillus sp. Alg07. Marine
Drugs,
16(3):
86.
/>10.3390/md16030086
Dong, S., Yang, J., Zhang, X. Y., Shi, M.,
Song, X. Y., Chen, X. L., Zhang, Y. Z.,
2012. Cultivable alginate lyase-excreting
bacteria associated with the arctic brown
alga Laminaria. Marine Drugs, 10(11):
2481–2491.
/>md10112481
Falkeborg, M., Cheong, L. Z., Gianfico, C.,
Sztukiel, K. M., Kristensen, K., Glasius,

M., Xu X., Guo, Z., 2014. Alginate
oligosaccharides: Enzymatic preparation
and antioxidant property evaluation. Food
Chemistry, 164: 185–194. />10.1016/j.foodchem.2014.05.053
Hay, I. D., Rehman, Z. U., Moradali, M. F.,
Wang, Y., Rehm, B. H. A., 2013.
Microbial
alginate
production,
modification
and
its
applications.
Microbial Biotechnology, 6(6): 637–650.
/>Lee, K. Y., Mooney J. D., 2013. Alginate :
properties and biomedical applications.
Prog Polym Sci., 37(1): 106–126.
/>11.06.003
Manns, D., Nyffenegger, C., Saake, B.,
Meyer, A. S., 2016. Impact of different
alginate lyases on combined cellulaselyase saccharification of brown seaweed.
RSC Advances,
6:
45392–45401.
/>Rosete-Enríquez, M., Romero-López, A. A.,
2017. Klebsiella Bacteria Isolated from
the Genital Chamber of Phyllophaga
obsoleta. Southwestern Entomologist,
42(4):
1003–1014.

/>10.3958/059.042.0419


Tiềm năng sinh alginate lyase của vi khuẩn

Salachna, P., Grzeszczuk, M., Meller, E.,
Soból, M., 2018. Oligo-Alginate with low
molecular mass improves growth and
physiological
activity
of
eucomis
autumnalis
under
salinity
stress.
Molecules, 23(4): 812. />10.3390/molecules23040812
Sawant, S. S., Salunke, B. K., Kim, B. S.,
2015. A rapid, sensitive, simple plate
assay for detection of microbial alginate
lyase activity. Enzyme and Microbial
Technology, 77: 8–13. />10.1016/j.enzmictec.2015.05.003
Thien, T. V., Kinh, C. D., Hoa, T. T., Khieu,
D. Q., 2017. Characterization of alginate
prepared from brown seaweeds in Thua
Thien - Hue province, Vietnam. Asean
Journal on Science and Technology for
Development,
25(2):
427–433.

/>Wang, M., Chen, L., Zhang, Z., Wang, X.,
Qin, S., Yan, P., 2017. Screening of

alginate lyase-excreting microorganisms
from the surface of brown algae. AMB
Express, 7(1): 74. />s13568-017-0361-x
Yagi, H., Fujise, A., Itabashi, N., Ohshiro, T.,
2016. Purification and characterization of
a novel alginate lyase from the marine
bacterium Cobetia sp. NAP1 isolated from
brown algae. Bioscience, Biotechnology
and Biochemistry, 80(12): 2338–2346.
/>32154
Zhou, R., Shi, X., Gao, Y., Cai, N., Jiang, Z.,
Xu, X. (2015). Anti-inflammatory activity
of guluronate oligosaccharides obtained
by oxidative degradation from alginate in
lipopolysaccharide-activated
murine
macrophage RAW 264.7 cells. Journal of
Agricultural and Food Chemistry,
63(1):160–168. />jf503548a

279