Phép thử định lượng kháng sinh bằng phương pháp vi sinh vật

PHẦN 1:
PHÉP THỬ XÁC ĐỊNH
HOẠT LỰC THUỐC KHÁNG SINH BẰNG
PHƯƠNG PHÁP VI SINH VẬT


NGUYÊN TẮC
 Tại nơi kháng sinh k/tán ra m/tr định lượng,
chủng vi sinh vật bị ức chế phát triển, kết quả là
vịng vơ khuẩn được tạo thành

 Đường kính vịng vô khuẩn tỉ lệ thuận với logarit
của nồng độ kháng sinh.


NGUYÊN TẮC

Hình ảnh đĩa petri định lượng Erythromycin bằng phương pháp vi sinh


NGUYÊN TẮC
Nồng độ (IU/mL)

0,25

0,50

1,00

2,00

4,00

Logarit nồng độ

0,6021

0,3010

0

0,3010

0,6021

ĐK VVK (mm)

13,38

15,30

18,32

21,34

23,77

Đồ thị biểu diễn độ tuyến tính của Erythromycin


THIẾT BỊ

 02 Nồi hấp
 Tủ ấm
 Tủ sấy
 Máy lắc Vortex
 Buồng thổi khí sạch (BSC)
 Cân phân tích ±0,0001 g
 Cân kỹ thuật ±0,01 g
 Máy đo pH
 Máy/thước đo VVK (±0,1 mm)


THIẾT BỊ

Máy đo VVK Omnicon

Máy đo VVK Haloes Caliper

Thước kẹp điện tử Mitutoyo


DỤNG CỤ
 Đĩa petri đường kính 10,0cm
 Pipet định mức các loại, bình định mức
 Pipet có vạch 25ml
 Micropipet 100/200 µl
 Dụng cụ đục lỗ/ống trụ
 Đèn cồn
 Bàn tạo mặt phẳng, thước giọt nước

DỤNG CỤ
Ống trụ (Peni cylinder)
KT: ĐK trong: 6 mm; ĐK
ngoài: 8 mm; Cao: 10 mm    
Độ CX: + 0,1 mm

Thước kiểm tra mặt phẳng
Dụng cụ đặt ống trụ (Peni
cylinder dispenser)

Bàn tạo
mặt phẳng


ĐiỀU KiỆN ĐỊNH LƯỢNG
Xây dựng Protocol a/d cho từng loại KS, p/hợp với điều kiện của PTN
DANH MỤC KHÁNG SINH ĐL BẰNG PP VI SINH VẬT
1. Acetylspiramycin
2. Doxycyclin hydroclorid
3. Erythromycin base/Erythromycin stearat
4. Gentamycin sulfat
5. Kanamycin sulfat
6. Kitasamycin
7. Neomycin sulfat
8. Nystatin
9. Oxytetracyclin dihydrat
10. Polymycin B sulfat
11. Spiramycin
12. Streptomycin sulfat
13. Tetracyclin hydroclorid

14. Tobramycin
15. Vancomycin


PROTOCOL ĐỊNH LƯỢNG GENTAMYCIN SULFAT
Tài liệu tham khảo: BP 2019

1. Chủng: B. pumilus ATCC 14884
2. Môi trường: A, pH 7,9
Pepton 6,0 g; Casein thủy phân từ pancreatin 4,0 g; Cao thịt bò 1,5 g; Cao nấm
men 3,0 g; Glucose. H2O 1,0 g; Thạch 15,0 g; Nước cất 1000 ml
3. Dung môi ban đầu: Nước cất
4. Dung dịch gốc: 400 IU/ml
5. Dung dịch đệm pha loãng: pH 8,0
Dung dịch kali dihydrophosphat 1M

50,0 ml

Dung dịch natri hydroxyd 1M

46,8 ml

Nước cất vừa đủ

1000 ml

6. Nồng độ kháng sinh:
- Phương pháp ống trụ: 8 - 4 - 2 - 1 - 0,5 IU/ml
- Phương pháp đục lỗ: 1 - 0,5 - 0,25 - 0,125 - 0,0625 IU/ml
7. Thời gian khuyếch tán ở nhiệt độ phòng: 1 giờ

8. Nhiệt độ ủ: 35 – 39oC
9. Thời gian ủ: 16 – 18 h
10. Yêu cầu ĐL (đối với NL): ko dưới 590 IU/mg, tính theo chất khan


CHẤT CHUẨN
Chất chuẩn được dùng để thực hiện phép
thử bao gồm:
 chuẩn phịng thí nghiệm
chất chuẩn DĐVN hoặc tương đương
chuẩn cấp cao hơn (ARS, ICRS, USPRS,
EPRS)
Chú ý: Đơn vị của chất chuẩn (IU/µg hoạt lực)


MƠI TRƯỜNG
 Sử dụng mtr có sẵn hay mtr tự pha chế có
cơng thức ghi trong Protocol áp dụng cho
từng loại kháng sinh
 Hay sử dụng mtr có sẵn: mtr số 1 (công
thức theo DĐVN 5) hay mtr số 11 do Hi Media
(Ấn Độ); Merck (Đức); Sharlau (Tây Ban
Nha) sản xuất


CHỦNG VSV
 Chủng vi sinh vật không được cấy chuyển quá
5 lần từ chủng vi sinh vật gốc
 Hay sử dụng: chủng bào tử B. pumilus,
B. cereus, B. subtilis do dễ ni cấy, sản xuất, bảo

quản và tiêu chuẩn hóa
 Chủng thực thể (E. coli, S. cerevisiae,
S. aureus, S. Epidermidis...): sử dụng chủng 1
ngày tuổi để cho đường đáp ứng tốt nhất


SẢN XUẤT CHỦNG BÀO TỬ
-

CB bình Roux chứa mtr số 1 (DĐVN 5)

-

Cấy 2 ml chủng cấp 4 vào bề mặt mtr, ủ ở 37±1oC/10-14 ngày.
Thêm vài viên bi thủy tinh lên bề mặt mtr để vi khuẩn dễ dàng trải
đều trên bề mặt mtr

-

Nhuộm bằng PP nhuộm bào tử và soi dưới kính hiển vi (tỷ lệ bào
tử 70 - 80%)

-

Gặt bào tử bằng nước muối sinh lý. Để lắng ở 2-8oC/24h. Chắt
dịch màu vàng bên trên, thêm nước muối sinh lý, để lắng ở 2 8oC/24h. Tiếp tục rửa vài lần như trên đến khi thu được hỗn dịch
có màu trắng đục

-

Đun nóng HD bào tử ở 70-80oC/30’ để diệt dạng thực thể

-

Đếm SL VK trong HD bào tử bằng PP đĩa thạch. Điều chỉnh để thu
được HD chủng có nồng độ 108 CFU/ml. BQ ở 2-8oC

-

Khi sử dụng: pha lỗng 10 lần được HD chủng có nồng độ 10 7
CFU/ml. BQ ở 2-8oC


KHẢO SÁT NỒNG ĐỘ KS VÀ CHỦNG VSV
 CB 5-6 DD chuẩn KS. Các nồng độ liên tiếp lớn hơn nhau
gấp 2 lần
 CB mtr ĐL được cấy chủng VSV với tỉ lệ khác nhau, ví dụ:
0,5% - 1,0% - 1,5% (số ml dịch cấy/100 ml mtr)
 Tiến hành giống như phần ĐLKS
 Sau thời gian ủ, đo ĐK VVK
 Chọn đĩa có nồng độ chủng VSV thích hợp nhất, có vịng
vơ khuẩn sắc nét, có ĐK VVK từ 14-24mm
 Trên đĩa đã chọn, tính giá trị độ dốc b trên 3 nồng độ liên
tiếp bằng hàm slope trong Microsoft Excel (mảng x là ĐK
VVK đo được, mảng y là logarit nồng độ KS). Chọn 3 nồng
độ KS liên tiếp có độ dốc b nhỏ nhất.


KHÁO SÁT NỒNG ĐỘ KS VÀ CHỦNG VSV

TiẾN HÀNH ĐỊNH LƯỢNG
Chuẩn bị DD chuẩn và thử:
 Cân chính xác một lượng chất chuẩn, hồ tan
trong dung mơi ban đầu để thu được DD chuẩn
gốc. Pha loãng DD chuẩn gốc bằng DD đệm để thu
được các dung dịch chuẩn làm việc S3, S2, S1
 DD thử được chuẩn bị tương tự như DD chuẩn,
thu được dung dịch thử làm việc: U3, U2, U1


CHUẨN BỊ DD CHUẨN/THỬ: CÁCH 1
m ×1000 × C
NDdd goc

S gốc (IU/ml)

V3 ml

S tg (IU/ml)

V4 ml (S tg)

V5 ml

S3 (IU/ml)

25 ml (S3)

50 ml

S2 (IU/ml)

25 ml (S2)

50 ml

S1 (IU/ml)

m cân (g)
V2 ml (S gốc)

dung môi ban đầu

dung dịch đệm

V1 =

 VD: V1 = 40,25 thì:
+ 40 ml: SD buret class A loại 50ml (chia vạch 0,1ml)
+ 0,25 ml: SD pipet vạch loại 1 ml (chia vạch 0,01 ml)
 V2, V4: SD pipet chính xác
 V3, V5: bình định mức có dung tích 20 ml trở lên


CHUẨN BỊ DD CHUẨN/THỬ: CÁCH 1
Câu hỏi: Chất chuẩn quốc gia Streptomycin sulfat có hoạt
lực là 727 IU/mg (as is), lượng cân chuẩn là 0,0452g, tính thể
tích nước cất cần thêm vào để thu được dung dịch gốc có
nồng độ là 800 IU/ml

CHUẨN BỊ DD CHUẨN/THỬ: CÁCH 1
Câu hỏi: Chất chuẩn quốc gia Streptomycin sulfat có hoạt
lực là 727 IU/mg (as is), lượng cân chuẩn là 0,0452g, tính thể
tích nước cất cần thêm vào để thu được dung dịch gốc có
nồng độ là 800 IU/ml

 Ưu điểm: Pha được DD chuẩn/thử gốc có NĐ mong
muốn; Lượng cân giao động nhiều cũng ko bị a/hưởng;
hoạt lực giả định (HLGĐ) của thử ko thay đổi
 Được áp dụng khi thiết lập chất chuẩn PTN, chuẩn DĐVN
vì khi tập hợp kết quả, HLGĐ ở từng phép thử phải như
nhau


CHUẨN BỊ DD CHUẨN/THỬ: CÁCH 2
m cân (g)

V1 ml

S gốc (IU/ml)

V3 ml

S tg (IU/ml)

V4 ml (S tg)

V5 ml

S3 (IU/ml)

25 ml (S3)

50 ml

S2 (IU/ml)

25 ml (S2)

50 ml

S1 (IU/ml)

V2 ml (S gốc)

dung mơi ban đầu

dung dịch đệm

 V1, V3, V5: bình định mức có dung tích 20 ml trở lên
 V2, V4: SD pipet chính xác


CHUẨN BỊ DD CHUẨN/THỬ: CÁCH 2
Câu hỏi: Chất chuẩn Erythromycin có HL 893 IU/mg (as is), cân
0,0449 g chuẩn, pha vừa đủ BĐM 50 ml bằng MeOH. Tính nồng độ
DD chuẩn gốc
Viên nén Erythromycin 250 mg, KLTB viên: 0,4659g/viên. Cân

0,0750 g chế phẩm, pha vừa đủ BĐM 50ml bằng MeOH. Tính HLGĐ
của mẫu thử


CHUẨN BỊ DD CHUẨN/THỬ: CÁCH 2
Câu hỏi: Chất chuẩn Erythromycin có HL 893 IU/mg (as is), cân
0,0449 g chuẩn, pha vừa đủ BĐM 50 ml bằng MeOH. Tính nồng độ
DD chuẩn gốc
Viên nén Erythromycin 250 mg, KLTB viên: 0,4659g/viên. Cân
0,0750 g chế phẩm, pha vừa đủ BĐM 50ml bằng MeOH. Tính HLGĐ
của mẫu thử

Đáp án:
- Nồng độ DD chuẩn gốc: 801,9 IU/ml
- Nồng độ DD thử gốc: giả định là 801,9 IU/ml

 Ưu điểm: Pha DD chuẩn/thử gốc thuận tiện; đặc biệt cần thiết nếu
DM ban đầu là DM hữu cơ bay hơi
 Nhược điểm: Lượng cân giao động khiến HLGĐ thay đổi;
 Thường được áp dụng khi kiểm nghiệm thành phẩm (viên, kem,
dung dịch...)


TiẾN HÀNH: PP KHUYẾCH TÁN, MƠ HÌNH 3+3, 6 ĐĨA PETRI
TH 1: Nhỏ DD K/S ngẫu nhiên theo khối (mô hình HV Latin)
(a/d khi đo VVK bằng tay)
 Đặt 6 đĩa petri vô khuẩn lên bàn tạo mặt phẳng. K/tra lại độ
phẳng của bàn bằng thước có giọt nước. Mở nắp đĩa. Chuẩn bị
đĩa m/tr 1 lớp hoặc 2 lớp:
- Đổ 1 lớp: hút 22ml m/tr đã cấy chủng vào mỗi đĩa petri

- Đổ 2 lớp (mỗi đĩa petri): hút 12 ml m/tr ko cấy chủng, để
ở nhiệt độ phòng 15 – 20’ cho m/tr đông. Hút tiếp 10 ml
m/tr đã cấy chủng
Sau đó, để ở nhiệt độ phịng 15 – 20’ cho m/tr đông
 SD khoan thạch vô khuẩn bằng thép (ĐK trong 6 mm) để
khoan thạch, mỗi đĩa 6 lỗ thạch cách đều nhau, dùng kim vô
khuẩn để lấy thạch ra
 Nguyên tắc của thiết kế ngẫu nhiên theo khối (HV Latin): mỗi
nồng độ chỉ x/hiện 1 lần trong bất cứ 1 hàng hay 1 cột nào và
mỗi hàng hoặc mỗi cột đều phải có đủ S3, S2, S1, U3, U2, U1.


MƠ HÌNH HÌNH VNG LATIN
6 3 5 2 4 1  
3 5 2 4 1 6
5 2 4 1 6 3
2 4 1 6 3 5
4 1 6 3 5 2
1 6 3 5 2 4
6 3 5 4 1 2  
2 5 4 6 3 1
1 2 6 5 4 3
5 4 3 1 2 6
3 6 1 2 5 4
4 1 2 3 6 5

3
4
6
2

1
5
3
6
1
4
2
5

5
6
3
1
2
4
4
2
3
5
6
1

4
2
1
5
6
3
6
4

5
3
1
2

1
5
2
4
3
6
5
1
6
2
3
4

6
1
5
3
4
2
1
5
2
6
4
3

2  
3
4
6
5
1
2  
3
4
1
5
6

2
3
4
6
1
5
4
5
3
2
6
1

3
4
5

1
6
2
3
4
5
1
2
6

1
2
3
4
5
6
2
1
4
6
3
5

5
1
6
2
3
4
1

2
6
4
5
3

4
6
1
5
2
3
5
6
1
3
4
2

6  
5
2
3
4
1
6  
3
2
5
1

4

2
5
6
1
4
3
1
5
3
4
6
2

5
6
2
3
1
4
5
6
1
2
4
3

4
3

1
5
6
2
3
4
6
1
2
5

3
4
5
6
2
1
6
2
4
5
3
1

6
1
4
2
3
5

4
1
2
3
5
6

1
2
3
4
5
6
2
3
5
6
1
4

1
3
4
5
6
2

2
3
1

5
4
6

6
1
3
4
5
2

5
6
4
2
3
1

4
2
6
3
1
5

3
5
2
1
6

4

1  
4
5
6
2
3

2
3
4
5
6
1

3
4
2
6
1
5

6
1
5
3
4
2

5
6
1
2
3
4

4
5
6
1
2
3

1  
2
3
4
5
6

3
1
2
4
6
5

6
4

5
3
1
2

1
2
3
6
5
4

5
6
4
1
2
3

2
3
6
5
4
1

4
5
1
2

3
6

4
6
1
3
2
5

5
2
6
1
4
3

2
1
3
6
5
4

3
5
2
4
1
6

6  
4
5
2
3
1