Nghiên cứu chủng nấm mốc có hoạt lực amylase từ bùn ao nuôi tôm

ĐẠI HỌC HUẾ
TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC
KHOA SINH HỌC
------

NGHIÊN CỨU CHỦNG NẤM MỐC
CĨ HOẠT LỰC AMYLASE
TỪ BÙN AO NI TƠM

Giáo viên hướng dẫn:

Sinh viên thực hiện:

TS. PHẠM THỊ NGỌC LAN

HUỲNH NGỌC THÀNH

HUẾ, 2011


MỤC LỤC
MỞ ĐẦU ............................................................................................................... 1
I. SỰ Ô NHIỄM THỦY VỰC ............................................................................. 3
1. Khái niệm chung ........................................................................................... 3
2. Khả năng tự làm sạch các thủy vực ............................................................ 3
3. Một số chỉ tiêu đánh giá mức độ ô nhiễm nguồn nước [2] ........................ 5
II. VÀI NÉT VỀ TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU VÀ ỨNG DỤNG VI SINH
VẬT TRONG XỬ LÝ NƯỚC THẢI Ở VIỆT NAM VÀ TRÊN THẾ GIỚI . 8
1. Vài nét về tình hình nghiên cứu và ứng dụng vi sinh vật trong xử lý
nước thải trên thế giới ...................................................................................... 8
2. Vài nét về tình hình nghiên cứu và ứng dụng vi sinh vật trong xử lý

nước thải ở Việt Nam........................................................................................ 9
III. NẤM MỐC, HOẠT LỰC AMYLASE CỦA NẤM MỐC ....................... 10
1. Nấm mốc, đặc tính sinh học của nấm mốc (Molds, Moulds) .................. 10
2. Amylase của nấm mốc ................................................................................ 13
3. Ảnh hưởng của điều kiện mơi trường đến sự hình thành amylase và tích
lũy sinh khối của nấm mốc ............................................................................. 14
ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ..................................... 17
I. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHẠM VI NGHIÊN CỨU .............................................. 17
1. Đối tượng nghiên cứu ................................................................................. 17
2. Phạm vi và thời gian nghiên cứu ............................................................... 17
II. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ................................................................ 17
1. Phương pháp phân lập và đếm số lượng tế bào [3] ................................. 17
2. Xác định khả năng phân giải tinh bột của các chủng nấm mốc ............. 18
3. Xác định sinh khối của nấm mốc .............................................................. 20
4. Thăm dò ảnh hưởng của một số điều kiện ni cấy đến hoạt tính của
amylase và sự tích lũy sinh khối .................................................................... 20
5. Xác định ảnh hưởng của thời gian ủ enzyme đến sự thể hiện hoạt tính
phân giải tinh bột của amylase ...................................................................... 21


Khóa luận tốt nghiệp
6. Xác định hoạt tính cellulase và protease của nấm mốc ........................... 21
III. XỬ LÝ SỐ LIỆU ......................................................................................... 21
KẾT QUẢ VÀ BIỆN LUẬN.............................................................................. 22
I. PHÂN LẬP VÀ XÁC ĐỊNH SỐ LƯỢNG TẾ BÀO.................................... 22
II. KHẢ NĂNG PHÂN GIẢI TINH BỘT CỦA CÁC CHỦNG NẤM MỐC24
1. Đánh giá khả năng phân giải tinh bột của các chủng nấm mốc.................... 24
2. Tuyển chọn gián tiếp .................................................................................... 26
III. ẢNH HƯỞNG CỦA MỘT SỐ ĐIỀU KIỆN NI CẤY ĐẾN HOẠT
TÍNH AMYLASE VÀ SỰ TÍCH LŨY SINH KHỐI CỦA NẤM MỐC ....... 27

1. Ảnh hưởng của thời gian nuôi cấy ................................................................ 27
2. Ảnh hưởng của pH môi trường ..................................................................... 30
3. Ảnh hưởng của nguồn carbon ....................................................................... 33
4. Ảnh hưởng của nguồn nitrogen .................................................................... 35
IV. ẢNH HƯỞNG CỦA THỜI GIAN Ủ ENZYME ĐẾN SỰ THỂ HIỆN
HOẠT TÍNH CỦA AMYLASE ........................................................................ 38
V. XÁC ĐỊNH HOẠT TÍNH CELLULASE VÀ HOẠT TÍNH PROTEASE
CỦA NẤM MỐC ................................................................................................ 40
1. Hoạt tính cellulase của nấm mốc .................................................................. 40
2. Hoạt tính protease của nấm mốc ................................................................... 41
KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ ................................................................................ 43
I. KẾT LUẬN ..................................................................................................... 43
II. ĐỀ NGHỊ ....................................................................................................... 43
TÀI LIỆU THAM KHẢO ................................................................................. 44


Khóa luận tốt nghiệp

MỞ ĐẦU
Trong thực tiễn sản xuất và đời sống, nấm mốc là một trong những đối tượng
được sử dụng phổ biến. Nấm mốc thuộc nhóm vi sinh vật nhân thật, phân bố
rộng rãi trong tự nhiên như đất, rác, bùn… Chúng tham gia tích cực vào vịng
tuần hồn vật chất đặc biệt là q trình phân giải chất hữu cơ và hình thành chất
mùn.
Trong nơng nghiệp, nấm mốc được sử dụng làm thuốc trừ sâu sinh học, làm phân
bón… Trong cơng nghiệp, nấm mốc được ứng dụng để sản xuất enzyme, làm
thực phẩm (sản xuất nước chấm, tương, chao, acid hữu cơ…). Ngoài ra, một ứng
dụng quan trọng của nấm mốc là xử lý ô nhiễm môi trường. Người ta sử dụng
nấm mốc cùng với một số vi khuẩn, xạ khuẩn và các enzyme để tạo nên các chế
phẩm sinh học nhằm xử lý chất thải rắn, xử lý nước thải ao nuôi trồng thủy sản,

xử lý hầm cầu, xử lý mùi hôi… Đặc biệt, nấm mốc Aspergillus oryzae được xử
dụng nhiều trong các chế phẩm sinh học như chế phẩm BLUTech – K của công
ty Công nghệ sinh học và Môi trường Lam Thiên, chế phẩm BIO – EMS của
công ty Vi sinh Môi trường, chế phẩm men vi sinh Jumbo – A của công ty Môi
trường Thảo Nguyên Xanh… [30], [31], [32].
Hiện nay, vấn đề ô nhiễm thủy vực đang đặt ra nhiều thách thức cho các nhà
khoa học. Đối với các thủy vực nội địa, hiện tượng ô nhiễm là một trong những
vấn đề nghiêm trọng nhất, đặc biệt là các nước công nghiệp hóa và các nước
đang phát triển.
Hệ thống đầm phá Tam Giang – Cầu Hai ở tỉnh Thừa Thiên Huế là một thủy vực
nước lợ ven biển điển hình. Trong những năm gần đây, phong trào nuôi tôm phát
triển mạnh mẽ đã tạo việc làm và tăng thu nhập, từng bước cải thiện đời sống của
người dân nơi đây. Bên cạnh những mặt tích cực đó, do hoạt động mạnh về khai
thác và ni trồng thủy sản của ngư dân cịn mang nặng tính tự phát, chú trọng
lợi ích kinh tế mà ít quan tâm đến yếu tố mơi trường và cân bằng sinh thái. Chính
điều này dẫn đến chất lượng nước tại các vùng nuôi giảm sút rõ rệt, trở thành nơi
tiềm ẩn các loại dịch bệnh làm giảm năng suất ni, tăng rủi ro cho ngư dân. Bên
cạnh đó việc mở rộng nhanh chóng các ao ni trồng thủy sản đang gây ra nhiều
tác động tiêu cực đến môi trường. Nguyên nhân dẫn đến nước trong ao nuôi tôm
bị ô nhiễm là do thời gian thay nước không hợp lý, thức ăn dư thừa quá nhiều và
tôm chết do dịch bệnh… Những chất cặn bã này lâu ngày tích tụ lại, lắng đọng
vào môi trường không những làm ảnh hưởng đến mơi trường sinh thái mà cịn
làm giảm sản lượng thu hoạch tôm.

1


Khóa luận tốt nghiệp
Dựa trên cơ sở đó, chúng tơi chọn đề tài: “Nghiên cứu chủng nấm mốc có hoạt
lực amylase từ bùn ao nuôi tôm”, với hy vọng sẽ tuyển chọn được chủng nấm

mốc có hoạt lực amylase mạnh để xử lý sơ bộ nguồn tinh bột dư thừa trong các
ao ni tơm làm sạch nguồn nước, góp phần xử lý ô nhiễm môi trường ở các
thủy vực này.

2


Khóa luận tốt nghiệp

TỔNG QUAN TÀI LIỆU
I. SỰ Ơ NHIỄM THỦY VỰC
1. Khái niệm chung
Ô nhiễm thủy vực là sự thay đổi theo chiều hướng xấu đi các tính chất vật
lý – hóa học – sinh học của nước, với sự xuất hiện các chất lạ ở thể rắn, lỏng làm
cho nguồn nước trở nên độc hại với con người và sinh vật. Làm giảm độ đa dạng
sinh vật trong nước. Xét về tốc độ lan truyền và quy mô ảnh hưởng thì ơ nhiễm
nước là vấn đề đáng lo ngại hơn ô nhiễm đất.
Hiện tượng ô nhiễm thủy vực xảy ra khi các loại hóa chất độc hại, các loại
vi khuẩn gây bệnh, virus, ký sinh trùng phát sinh từ các nguồn thải khác nhau
như chất thải công nghiệp từ các nhà máy sản xuất, các loại rác thải bệnh viện,
các loại rác thải sinh hoạt bình thường của con người hay hóa chất, thuốc trừ sâu,
phân bón hữu cơ… sử dụng trong sản xuất nông nghiệp được đẩy ra các ao, hồ,
sông, suối, hoặc ngấm xuống nước dưới đất mà không qua xử lý hoặc với khối
lượng quá lớn vượt quá khả năng tự điều chỉnh, tự làm sạch của các loại ao, hồ,
sông, suối [26].
Hiến chương Châu Âu đã định nghĩa về ô nhiễm nước như sau: “Ô nhiễm
nước là sự biến đổi chung do con người đối với chất lượng nước làm ô nhiễm và
gây ra nguy hiểm cho con người, công nghiệp, nông nghiệp, nuôi cá, nghỉ ngơi
giải trí, đối với một số động vật ni và các lồi hoang dại” [2].
Việc nhận biết nước ô nhiễm có thể căn cứ vào các trạng thái hóa lý, sinh

học của nước. Ví dụ khi nước ơ nhiễm sẽ có mùi khó chịu, vị khơng bình thường,
màu không trong suốt, số lượng cá, tôm và các thủy sinh vật khác giảm hẳn, cỏ
dại phát triển mạnh, nhiều bùn hoặc có váng dầu mỡ trên mặt nước… [2].
2. Khả năng tự làm sạch các thủy vực
Đa số các dịng sơng, ao hồ cũng như biển ln bị làm bẩn nhiều hoặc ít
tùy mức độ bởi rác và nước thải nên khả năng tự làm sạch của các nguồn nước có
ý nghĩa cực kỳ quan trọng. Nhờ q trình này các chất bẩn thường xuyên được

3


Khóa luận tốt nghiệp
loại khỏi nước cho nên nếu khơng bị ơ nhiễm q nặng thì các đoạn sơng chỉ
cách chỗ đổ nước thải vài km là nước đã tương đối sạch [28].
Khả năng tự làm sạch của nguồn nước ln có sự tham gia tổng hợp của
nhiều nhân tố. Trước hết là các tác nhân vật lý, hóa học trong đó hiện tượng sa
lắng và oxy hóa giữ vai trò chủ đạo. Tiếp đến là các tác nhân sinh học, đây là
nhân tố chính giúp cho việc làm sạch nguồn nước được nhanh chóng. Các nhân
tố sinh học bao gồm động vật, thực vật và vi sinh vật, tuy nhiên, vi sinh vật mà
đặc biệt là vi khuẩn đóng vai trị chính. Trong điều kiện thuận lợi, chúng có khả
năng khống hóa nhiều chất hữu cơ và tham gia tích cực vào các vịng tuần hồn
vật chất trong tự nhiên, chuyển các hợp chất hữu khó phân giải có dưới dạng rắn
hoặc lỏng trong nước thành các hợp chất hữu cơ dễ phân giải hơn hay trong điều
kiện thuận lợi có thể chuyển thành CO2, H2O và các muối vơ cơ đơn giản. Nói
cách khác, trong điều kiện thích hợp, chúng có khả năng tái khống hóa một cách
trọn vẹn nhiều chất bẩn hữu cơ [28].
Trong các loại chất hữu cơ thì protein, đường, tinh bột được phân giải
nhanh, ngược lại, các chất như mỡ, sáp, cellulose phân giải chậm. Chính vì vậy
quần thể vi sinh vật cũng thay đổi tùy theo chế độ tự làm sạch của nguồn nước.
Theo tiến độ tự làm sạch không những nồng độ các chất bẩn giảm đi mà cả số

lượng và thành phần của vi khuẩn cũng giảm theo [28].
Khả năng tự làm sạch của các thủy vực là không giống nhau. Tại những
nơi có dịng chảy mạnh, các chất hữu cơ được chia đều và q trình trao đổi khí
với mơi trường trên cạn xảy ra mạnh nên sự tự làm sạch cũng diễn ra mạnh. Còn
ở các thủy vực thiếu sự chuyển động của nước thì có sự ứ đọng nước thải và trao
đổi khí yếu dẫn đến sự thiếu hụt oxygen, do đó khả năng tự làm sạch giảm mạnh.
Trong quá trình xâm nhập của nước thải vào biển, đa số các vi khuẩn kéo
theo bị chết rất nhanh và một khu hệ vi sinh vật mới của biển phát triển mạnh
chiếm ưu thế. Chính nhóm này mới là tác nhân có tác dụng khống hóa các chất
bẩn hữu cơ, nhưng quá trình này cần nhiều thời gian. Thêm vào đó, vi khuẩn biển
có hoạt tính trao đổi chất thường yếu hơn so với vi khuẩn nước ngọt tương

4


Khóa luận tốt nghiệp
đương. Theo Fair và Geyer (1961), tốc độ phân giải các chất bẩn phụ thuộc vào
nồng độ pha loãng của nước thải. Trong nước biển, ở những nồng độ cao, tốc độ
này sẽ cao còn ở nước ngọt tốc độ phân giải cao khi nồng độ thấp. Vì nước thải
được pha lỗng rất lớn khi đưa vào các thủy vực nên trong điều kiện tự nhiên lực
tự làm sạch tại các vùng nước ngọt là lớn hơn so với các vùng nước mặn [28].
Tuy nhiên, lực tự làm sạch tự nhiên chỉ xảy ra ở những địa điểm mà thành
phần và nồng độ các chất bẩn phù hợp với khả năng làm sạch của các thủy vực.
Thường thì các thủy vực bị nhiễm bẩn quá mức so với khả năng mà chúng có thể
phân hủy thì ngay cả ở những điều kiện thuận lợi nhất sự tự làm sạch cũng không
xảy ra hay xảy ra yếu.
Do nhu cầu về oxygen quá lớn mà trong thủy vực sẽ xuất hiện những vùng
yếm khí. Tại đó có q trình thối rữa và phản sulfate hóa tạo H2S, nên hầu như
toàn bộ sinh vật bậc cao bị chết, một quần thể sinh vật nghèo nàn được tạo thành
trong đó chủ yếu là vi sinh vật yếm khí, do đó chỉ phân giải được một phần rất

nhỏ chất bẩn hữu cơ.
Việc tự làm sạch cũng có thể bị phá vỡ do sự cung cấp trực tiếp các chất
độc hại mà trước hết do nước thải và rác thải của các nhà máy thủ công hay công
nghiệp đưa vào. Do chứa nhiều chất độc mà chủ yếu là kim loại nặng, acid, chất
hữu cơ độc hại… sẽ gây chết các vi sinh vật tham gia vào q trình khống hóa.
Chính vì điều đó mà tại các vùng bị nhiễm chất thải cơng nghiệp, khả năng tự
làm sạch giảm rõ rệt. Tình trạng này cũng gặp ở các thủy vực nằm gần vùng sản
xuất nơng nghiệp.
Như vậy, mỗi một thủy vực điều có khả năng tự làm sạch riêng và khả
năng này phụ thuộc nhiều vào các điều kiện tự nhiên cũng như mức độ nhiễm
bẩn của các thủy vực.
3. Một số chỉ tiêu đánh giá mức độ ô nhiễm nguồn nước [2]
Để đánh giá chất lượng nước cũng như mức độ gây ô nhiễm nguồn nước,
có thể dựa vào một số chỉ tiêu cơ bản và quy định giới hạn của từng chỉ tiêu đó
tn theo luật mơi trường của một quốc gia hoặc tiêu chuẩn quốc tế quy định cho
5


Khóa luận tốt nghiệp
từng loại nước sử dụng cho từng mục đích khác nhau. Theo yêu cầu về chất
lượng nước và các chất gây ơ nhiễm nguồn nước có thể đưa ra một số chỉ tiêu cơ
bản như sau:
- Màu sắc: màu sắc của nước là do hai nguyên nhân. Thứ nhất, các chất
hữu cơ và phần tiết của thực vật gọi là màu thực, màu này rất khó xử lý bằng các
phương pháp đơn giản; ví dụ các chất mùn humic làm nước có màu vàng, các
lồi thủy sinh, rong tảo làm nước có màu xanh. Thứ hai, các chất vơ cơ là những
hạt rắn có màu gây ra màu của nước, gọi là màu biểu kiến, màu này dễ xử lý hơn.
Ví dụ các hợp chất của Fe (III) khơng tan làm nước có màu đỏ.
- Độ đục: độ đục trong nước là do các hạt lơ lửng, các chất hữu cơ hoặc
do các động vật, thực vật sống trong nước gây nên. Đơn vị đo độ đục được định

nghĩa: 1 đơn vị độ đục bằng 1 mg SiO2/l nước. Độ đục càng lớn có nghĩa là độ ô
nhiễm của nước càng cao và cần được xử lý.
- Hàm lượng chất rắn: chất rắn có trong nước có thể là do:
• Các chất vơ cơ ở dạng hịa tan (các muối) hoặc các chất không tan như
đất đá ở dạng huyền phù.
• Các chất hữu cơ như các vi sinh vật, chất hữu cơ tổng hợp như phân
bón, chất thải công nghiệp…
Tổng chất rắn (TS) là thành phần vật lý đặc trưng quan trọng nhất của
nước. Nó bao gồm cả chất rắn lơ lửng, chất rắn nổi, chất keo và chất tan. Nó ảnh
hưởng đến chất lượng nước khi sử dụng cho sinh hoạt, cho sản xuất, cản trở hoặc
tiêu tốn thêm nhiều hóa chất trong q trình xử lý.
- Hàm lượng oxygen hòa tan trong nước (DO): là lượng oxygen từ
khơng khí có thể hịa tan vào nước trong điều kiện nhiệt độ, áp suất xác định.
Oxygen hịa tan trong nước sẽ tham gia vào q trình trao đổi chất, duy trì năng
lượng cho quá trình sinh trưởng, phát triển cho các sinh vật sống dưới nước.
- Nhu cầu oxygen sinh hóa (BOD): được định nghĩa là lượng oxygen
cần thiết cho vi sinh vật tiêu thụ trong q trình oxy hóa các chất hữu cơ trong
nước. Đơn vị tính là mg/l. Chỉ số BOD là chỉ tiêu quan trọng để đánh giá mức độ
ô nhiễm nước do các chất hữu cơ có thể bị các vi sinh vật phân hủy trong điều
6


Khóa luận tốt nghiệp
kiện hiếu khí. Chỉ số BOD càng cao càng chứng tỏ lượng chất hữu cơ có khả
năng phân hủy sinh học ô nhiễm trong nước càng lớn.
Trong thực tế, người ta không thể xác định lượng oxygen cần thiết để
phân hủy hoàn toàn chất hữu cơ mà thường xác định lượng oxygen cần thiết để
oxy hóa chất hữu cơ trong 5 ngày đầu khi ủ mẫu ở 20oC, ký hiệu là BOD5. Hoặc
có thể xác định lượng oxygen cần thiết trong 3 ngày đầu khi ủ mẫu ở 30oC, ký
hiệu là BOD3.

- Nhu cầu oxygen hóa hóa học (COD): là lượng oxygen cần thiết cho
quá trình oxy hóa các chất hữu cơ trong nước thành CO2 và H2O. Đơn vị được
tính là gam hoặc mg O2 theo đơn vị thể tích. COD biểu thị lượng chất hữu cơ có
thể oxy hóa bằng hóa học. Chỉ số COD có giá trị cao hơn BOD vì nó bao gồm cả
lượng chất hữu cơ khơng thể bị oxy hóa bằng vi sinh vật. Tỷ lệ giữa BOD và
COD xấp xỉ từ 0,5 đến 0,7. Việc xác định BOD đòi hỏi thời gian lâu hơn COD
nên trong thực tế có thể xác định COD để đánh giá mức độ ô nhiễm.
- Hàm lượng phosphorus (P): P có thể tồn tại trong nước dưới các dạng:
H2PO4-, HPO42-, PO43-, các polyphosphate như Na3(PO3)6 và phosphorus hữu cơ.
Đây là một trong những nguồn dinh dưỡng cho các thực vật thủy sinh, gây ô
nhiễm và góp phần thúc đẩy hiện tượng phú dưỡng trong các thủy vực.
- Hàm lượng nitrogen (N): hợp chất N trong nước tự nhiên là nguồn
dinh dưỡng cho các thực vật. Trong nước, N có thể tồn tại ở các dạng chính sau:
• Các hợp chất N hữu cơ dạng protein hay các sản phẩm phân giải protein.
• Ammonia và các muối ammonium như NH4Cl, NH4NO3…
• Các hợp chất dưới dạng nitrite (NO2-), nitrate (NO3-)…
Trong nước có thể xảy ra các q trình biến đổi oxy hóa:
Protein

NH3

Pseudomonas
Nitrosomonas
Nitrobacter
NO2NO3N2
Oxy hóa
Oxy hóa
Khử nitrate

Khi phân tích hàm lượng nitrogen trong nước thấy rằng:

7


Khóa luận tốt nghiệp
• Nếu nước chứa hầu hết N – amine chứng tỏ nước bị nhiễm bẩn N hữu
cơ.
• Nếu nước chứa chủ yếu N dạng NH3, NO2-, NO3- chứng tỏ ơ nhiễm N
hữu cơ đã được khống hóa.
• Nếu nước chứa chủ yếu N dạng NO2- là nước đã bị ơ nhiễm một thời
gian dài.
• Nếu nước chứa chủ yếu N dạng NO3- chứng tỏ quá trình oxy hóa đã kết
thúc. Tuy vậy, các nitrate chỉ bền ở điều kiện hiếu khí. Trong điều kiện yếm khí,
chúng nhanh chóng bị khử thành nitrogen tự do tách khỏi nước.
- Các chỉ tiêu vi sinh: trong nước tự nhiên còn chứa các loại vi trùng,
siêu vi trùng, rong tảo và các sinh vật đơn bào. Chúng xâm nhập vào nước từ môi
trường xung quanh hoặc sống và phát triển trong nước. Thực tế người ta thường
chỉ xét xem mẫu nước có bị ơ nhiễm bởi các vi trùng gây bệnh có trong phân
người và động vật. Có 3 nhóm vi sinh vật chỉ thị ơ nhiễm phân là:
• Nhóm Coliforms đặc trưng là Escherichia coli (E. coli).
• Nhóm Streptococcus đặc trưng là S. faecalis.
• Nhóm Clostridium đặc trưng là C. perfringens.

II. VÀI NÉT VỀ TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU VÀ ỨNG DỤNG VI
SINH VẬT TRONG XỬ LÝ NƯỚC THẢI Ở VIỆT NAM VÀ TRÊN
THẾ GIỚI
1. Vài nét về tình hình nghiên cứu và ứng dụng vi sinh vật trong xử lý nước
thải trên thế giới
Ở Úc, người ta đã xử lý nước thải công nghiệp và khu dân cư bằng bể sục
khí (lagoon) và kết hợp với phương pháp lọc qua đồng cỏ hoặc lọc qua đất nhờ

hệ vi sinh vật tồn tại trong đất và trong nước.
Ở Mỹ, hệ thống ao sinh học có thành phần vi sinh vật khá phong phú được
sử dụng để xử lý các nguồn nước thải công nghiệp…

8


Khóa luận tốt nghiệp
Kobayshi và cộng sự (1984) đã sử dụng một số lồi vi khuẩn lưu hình màu
tía để làm sạch nước thải.
Hutaikhe đã tách được nấm men phân giải tinh bột chịu được độ acid cao
để xử lý nước thải giàu tinh bột [8].
Hiện nay, việc tạo ra các chủng vi sinh vật có khả năng phân hủy chất hữu
cơ cao cũng như các chủng vi sinh vật có khả năng phân hủy các chất hữu cơ khó
phân giải bằng việc ứng dụng kỹ thuật chuyển gene hiện đại. Điển hình là tạo ra
được một loại vi khuẩn có khả năng tổng hợp được nhiều enzyme theo ba hướng:
tạo plasmid đa gene, tạo quần thể plasmid đơn gene hoặc tạo quần thể plasmid
đơn gene và đa gene, sau đó chuyển vào một loại vi khuẩn thích hợp [1].
2. Vài nét về tình hình nghiên cứu và ứng dụng vi sinh vật trong xử lý nước
thải ở Việt Nam
Ở Việt Nam, trong những năm gần đây đã có nhiều cơng trình nghiên cứu
đề cập đến việc điều tra, đánh giá mức độ ơ nhiễm nước để báo động tình hình và
định hướng giải quyết.
Trước hết phải kể đến cơng trình nghiên cứu của Viện Sinh học nhiệt đới Trung tâm Khoa học tự nhiên và Công nghệ Quốc gia (2003) về khảo sát khả
năng cạnh tranh và đối kháng của các vi sinh vật có trong chế phẩm BiO II với vi
khuẩn gây bệnh cho tơm. Ngồi ra, cịn có nghiên cứu về đặc điểm sinh học của
một số chủng thuộc chi Bacillus và chi Lactobacillus ứng dụng để xử lý môi
trường nuôi tôm, cá của Nguyễn Liêu Ba, Võ Thị Thứ, La Thị Nga, Trương Ba
Hùng, Nguyễn Minh Dương [16]. Bên cạnh đó, cịn có cơng trình tuyển chọn các
chủng nấm men biển sinh acid béo có ích làm thức ăn sống cho ấu trùng bánh xe

Brachionus plicatilis, sử dụng trong việc sản xuất thức ăn cho cá của Tống Kim
Thuần, Trần Thanh Thủy - Viện Công nghệ sinh học (2005) [24].
Ở Hà Nội, một số cơng trình nghiên cứu trong đó sử dụng các đối tượng
sinh học để xử lý ô nhiễm các nguồn nước thải đã được cơng bố và ứng dụng vào
thực tiễn. Cơng trình nổi bật nhất là nghiên cứu xử lý thành công nước thải chế
biến nông sản kết hợp với chăn nuôi có hàm lượng chất hữu cơ cao ở làng bún
9


Khóa luận tốt nghiệp
truyền thống thuộc xã Phú Đơ, Từ Liêm, Hà Nội của tác giả Trần Văn Nhị và
cộng sự [18]. Trong đó đã nghiên cứu vi khuẩn nitrate từ nước thải chế biến nông
sản thực phẩm ở một số vùng ngoại ô Hà Nội cũng như nghiên cứu kỹ thuật hiếu
khí hóa để xử lý nước thải với hàm lượng chất hữu cơ cao.
Bên cạnh đó, Trần Văn Nhị và cộng sự (Viện Công nghệ sinh học – Trung
tâm Khoa học tự nhiên và Công nghệ quốc gia) và Nguyễn Hoài Châu (Viện
Khoa học vật liệu) cũng đã nghiên cứu sử dụng biện pháp sinh học tổng hợp
trong xử lý nước thải chế biến nông, lâm và hải sản thực phẩm bằng cơng nghệ
thích hợp với các cơ sở sản xuất quy mơ vừa và nhỏ [21]. Ngồi ra, Nguyễn Văn
Năm (Viện Sinh thái và Tài nguyên sinh vật – Trung tâm Khoa học tự nhiên và
Công nghệ quốc gia) đã phân lập, tuyển chọn các chủng vi sinh vật có khả năng
phân hủy các hợp chất hữu cơ và ứng dụng trong xử lý cặn chế biến nông
sản…[15].
Riêng ở tỉnh Thừa Thiên Huế, Lại Thúy Hiền và cộng sự đã tiến hành
khảo nghiệm một số chế phẩm sinh học trong việc xử lý các hồ nuôi tôm bị ô
nhiễm tại phá Tam Giang [10]. Nguyễn Thị Thu Thủy, Võ Thị Mai Hương đã
phân lập, đánh giá khả năng phân giải chất hữu cơ và thăm dò hiệu quả nước bị ơ
nhiễm của các nhóm vi sinh vật ở một số nguồn nước thải và thu được kết quả rất
khả quan [25]. Đặng Thị Sơn (2004), Phạm Thị Huyền (2009) đã phân lập và
tuyển chọn được một số chủng vi sinh vật phân giải chất hữu cơ trong nước thải

sản xuất bún ở các hộ gia đình tại huyện Hương Trà và thành phố Huế [22], [11].
Đinh Thị Hà đã nghiên cứu và tuyển chọn được một số chủng xạ khuẩn phân giải
cellulose, tinh bột trong nước ao nuôi tôm ở huyện Phú Vang và thu được kết quả
khả quan [9].

III. NẤM MỐC, HOẠT LỰC AMYLASE CỦA NẤM MỐC
1. Nấm mốc, đặc tính sinh học của nấm mốc (Molds, Moulds)
Nấm mốc là nhóm nấm khơng phải là nấm men và cũng khơng phải là các
nấm có mũ nấm (quả thể có kích thước lớn) như nấm rơm, nấm gỗ… [5].

10


Khóa luận tốt nghiệp
Nấm mốc hay cịn gọi là nấm sợi phân bố rộng rãi trong khơng khí, nước,
rác, bùn… đặc biệt có nhiều trong đất. Đây là nhóm vi sinh vật có cấu tạo dạng
khuẩn ti. Màu sắc của nấm mốc được xác định bởi các bào tử do nó sinh ra như
xanh, trắng, vàng, đen, nâu. Chúng phát triển rất nhanh trên nhiều nguồn cơ chất
hữu cơ khi gặp khí hậu nóng ẩm, gây hư hỏng lương thực và thực phẩm. Trên
nhiều vật liệu vơ cơ do dính bụi bẩn (như các thấu kính ở ống nhịm, máy ảnh…)
nấm mốc vẫn có thể phát triển, sinh acid và làm mờ các vật liệu này [7].
Ngồi ra, có rất nhiều nấm mốc ký sinh trên cơ thể người và động vật,
thực vật gây ra các bệnh nấm khá nguy hiểm [14], nhiều loại có thể sinh ra các
độc tố gây ung thư và nhiều bệnh tật khác (như hắc lào, nấm kẻ chân, nấm phổi,
nấm tóc…). Mặt khác, nấm mốc tham gia tích cực vào các vịng tuần hồn vật
chất trong tự nhiên. Chúng có khả năng phân giải mạnh mẽ các hợp chất hữu cơ
phức tạp như chitin, pectin, cellulose, protein, lipid… [5].
Nấm mốc có rất nhiều tác dụng như sử dụng trong công nghiệp chế biến
thực phẩm (làm tương, nước chấm, sản xuất citric acid…), trong công nghiệp
enzyme (sản xuất amylase, cellulase, protease, peptinase…), tổng hợp các loại

acid hữu cơ (lactic acid, malic acid, gluconic acid …), sản xuất thuốc trừ sâu sinh
học [20]. Ngoài ra, một số nấm mốc cịn có khả năng tích lũy vitamin, β –
carotene, các chất sinh trưởng (auxin, gibberellin, rosolic acid…), các alkaloid có
giá trị chữa bệnh cao (amanitin, muscarin, phaloidin…).
Đặc biệt, trong công nghiệp dược phẩm, nhờ khả năng sinh kháng sinh mà
nấm mốc được sử dụng để sản xuất nhiều loại dược phẩm quan trọng (penicillin,
griseofulvin, variotin, cephalosporin…). Nấm mốc cịn được sử dụng như các tác
nhân hóa học để chuyển hóa một cách tinh vi và chính xác từng gốc hợp chất xác
định trong phân tử các chất thuộc loại steroid. Nhờ vậy mà trên thế giới càng
xuất hiện nhiều loại dược phẩm quý giá.
Nấm mốc có dạng sợi phân nhánh hoặc không phân nhánh, cấu tạo đơn
bào hoặc đa bào. Sợi nấm thường là một ống hình trụ dài, có đường kính khác
nhau, trung bình khoảng 3 -10 µm, đặc biệt giá nang bào tử của lồi nấm tiếp hợp

11


Khóa luận tốt nghiệp
Phycomyces blankesneanus, đường kính tới 1 mm [20]. Chiều dài của một sợi
nấm có thể lên tới vài chục cm. Toàn bộ sợi nấm và các nhánh phát triển từ một
bào tử nấm gọi là hệ sợi nấm [13].
Sợi nấm phát triển từ ống nảy sợi mọc ra từ bào tử, ống nảy sợi mọc ra từ
đoạn sợi nấm non khơng có sự phân hóa đặc biệt. Sợi nấm có vách ngăn, sự tăng
trưởng của sợi nấm xảy ra ở phần ngọn của sợi nấm. Sự tăng trưởng ở ngọn thể
hiện ở cấu tạo phần ngọn sợi nấm: chất nguyên sinh ở phần ngọn có nhiều nhân,
ti thể, RNA, enzyme, các amino acid, protein, ngược lại chất dự trữ glycogen
giảm dần từ các đoạn sợi nấm ở phía sau đến ngọn sợi nấm. Phần ngọn sợi nấm
dài khảng 100 µm, phân cách với đoạn dưới bằng một không bào lớn [13].
Khi bào tử nấm gặp điều kiện thuận lợi sẽ nảy mầm thành hệ sợi nấm
(khuẩn ty thể) và được gọi là khuẩn lạc. Khuẩn ty thể phân biệt hai loại khuẩn ty

là khuẩn ty cơ chất (cắm sâu vào mơi trường) và khuẩn ty khí sinh (phát triển tự
do trong khơng khí) [13]. Mỗi đoạn khuẩn ty khi rơi vào trong mơi trường thích
hợp sẽ phát triển nhanh chóng thành một khuẩn ty thể mới.
Trong các điều kiện khác nhau, hệ sợi nấm có thể biến hóa theo nhiều
cách khác nhau để thích nghi với điều kiện sống như: hình thành rể giả, sợi bị,
sợi áp, sợi hút, sợi nấm bẫy mồi, thể đệm, hạch nấm, bó sợi nấm…
Nấm mốc khơng có sắc tố quang hợp, do đó khơng có khả năng quang
hợp như các loại cây xanh. Chúng sống nhờ khả năng hấp thụ các loại thức ăn có
sẵn qua bề mặt của khuẩn ty, đó là các cơ thể ký sinh hoặc hoại sinh [5], [20].
Nấm mốc có thể sinh sản theo nhiều hình thức khác nhau:
• Sinh sản dinh dưỡng: bằng hạch nấm hoặc bằng khuẩn ty. Từ một đoạn
khuẩn ty riêng lẻ có thể phát triển thành một khuẩn ty thể. Một số nấm mốc có
thể hình thành bào tử màng dày (chalamydospore) hay còn gọi là bào tử áo, khi
gặp điều kiện thuận lợi bào tử áo sẽ nảy mầm và phát triển thành khuẩn ty mới
[20].
• Sinh sản vơ tính: bằng cách hình thành bào tử trần hay bào tử kín. Hình
dạng bào tử có thể trịn hay ơ van có nhiều màu sắc khác nhau tùy theo từng lồi.
12


Khóa luận tốt nghiệp
• Sinh sản hữu tính: tương tự như ở thực vật bậc cao, sinh sản hữu tính
của nấm mốc cũng bao gồm các quá trình: chất giao (plasmogamy), nhân giao
(caryogamy) và phân bào giảm nhiễm (meiosis). Cơ quan sinh sản hữu tính ở
nấm mốc về nguyên tắc cũng là các túi giao tử để tạo nên giao tử.
2. Amylase của nấm mốc
Amylase là tên gọi của nhóm enzyme thủy phân tinh bột, bao gồm nhiều
loại khác nhau về đặc tính phân giải tinh bột. Nhiều loại vi sinh vật có khả năng
sản sinh ra enzyme amylase. Amylase của nấm mốc trội hơn hạt nảy mầm ở chỗ
có cả glucoamylase.

Glucoamylase (amyloglucosidase): có khả năng thủy phân tinh bột thành
những dextrin có trọng lượng phân tử thấp, liên tục tách lớp glucose và cuối cùng
tạo thành glucose mà không cần một amylase nào khác tham gia. Enzyme này có
khả năng phân hủy tinh bột, glycogen, polysaccharide đồng loại ở các mối liên
kết α – 1,4 glucoside và α – 1,6 glucoside. Nó có giá trị đặc biệt trong sản xuất
rượu, chuyển những dextrin có phân tử lượng cao khơng lên men thành những
hợp chất lên men được và do đó nâng cao được hiệu suất lên men rượu từ các
nguyên liệu là tinh bột [19], [23].
α - amylase (1,4 glucan – glucanhydrolase): có khả năng thủy phân các
liên kết α – 1,4 glucoside ở bất kỳ vị trí nào trong phân tử tinh bột, glycogen và
các polysaccharide. Dưới tác dụng của α – amylase tinh bột có thể chuyển hóa
thành maltose, glucose và các dextrin có trọng lượng phân tử thấp. Nhưng kết
quả này không phải đạt được dễ dàng mà thông thường α – amylase chỉ thủy
phân tinh bột chủ yếu thành dextrin có trọng lượng phân tử thấp, maltose và một
ít glucose. Do vậy, α – amylase có tác dụng làm giảm độ nhớt của hồ tinh bột.
Độ pH tối thích cho hoạt động của α – amylase nấm mốc là khoảng 4,5 –
4,7. Nhưng trong dung dịch đường hóa nó thích hợp vùng pH 5 – 5,5, ở pH 2,5
enzyme này mất hoạt tính sau 30 phút [23].

13


Khóa luận tốt nghiệp
3. Ảnh hưởng của điều kiện mơi trường đến sự hình thành amylase và tích
lũy sinh khối của nấm mốc
Sinh trưởng và phát triển của nấm mốc cùng với q trình sinh tổng hợp
nói chung và sinh tổng hợp amylase nói riêng liên quan chặc chẽ đến các điều
kiện mơi trường bên ngồi, mỗi lồi thích ứng với từng điều kiện khác nhau. Các
điều kiện này bao gồm hàng loạt các yếu tố khác nhau, tác động qua lại với nhau
và tác động lên sự sinh trưởng phát triển của nấm mốc, trong đó quan trọng nhất

là điều kiện mơi trường ni cấy.
• Ảnh hưởng của thời gian nuôi cấy: sự sinh tổng hợp enzyme phụ thuộc
nhiều vào thời gian, do đó trong q trình ni cấy nấm mốc để có hoạt lực
enzyme mạnh cần xác định thời gian ni cấy thích hợp. Ở một số nấm mốc, quá
trình sinh tổng hợp amylase tiến hành song song với quá trình sinh trưởng. Trong
trường hợp này, sinh tổng hợp amylase kết thúc ở cuối pha logarithm đồng thời
với sự ngừng sinh trưởng và bắt đầu pha ổn định tiếp theo. Mặt khác, ở một số
nấm mốc, sự tích lũy amylase cực đại xảy ra sau khi quần thể tế bào đạt cực đại
sinh trưởng. Trong trường hợp này, khi nấm mốc sinh trưởng hầu như khơng tích
lũy amylase trong canh trường mà chỉ sau khi kết thúc pha sinh trưởng mới xảy
ra sự tổng hợp amylase mạnh mẽ. Sự tổng hợp amylase sẽ đạt cực đại tại một
thời điểm nhất định ở pha cân bằng, sau đó hoạt độ amylase sẽ giảm [27].
• Ảnh hưởng của nhiệt độ ni cấy: nhiệt độ có ảnh hưởng rất lớn đến sự
sinh trưởng phát triển và khả năng sinh tổng hợp amylase của nấm mốc. Qua
nhiều kết quả nghiên cứu cho thấy nhiệt độ thích hợp cho sự phát triển của nấm
mốc là 30 – 35 oC. Nếu nhiệt độ quá cao hay quá thấp sẽ kìm hãm sự sinh trưởng
phát triển từ đó ảnh hưởng đến hoạt tính amylase của các chủng nấm mốc. Theo
nghiên cứu của Đặng Thị Sơn (2004) khi xem xét ảnh hưởng của nhiệt độ đến sự
tích lũy sinh khối của các chủng nấm mốc phân lập từ nước thải sản xuất bún cho
thấy, nhiệt độ tối thích để ni cấy nấm mốc là 35 oC [22].
• Ảnh hưởng của pH: pH mơi trường có ảnh hưởng rõ rệt đến sự sinh
trưởng phát triển cũng như quá trình sinh tổng hợp amylase của nấm mốc. pH tối

14


Khóa luận tốt nghiệp
thích cho hoạt động của α – amylase nấm mốc khoảng 4,5 – 4,8. Nhìn chung,
nấm mốc thường sinh trưởng phát triển ở vùng pH acid yếu, tuy nhiên chúng
cũng có thể tồn tại ở vùng pH rộng hơn (2 – 10) và mỗi loại nấm mốc có khoảng

pH tối thích riêng [29]. Điều này cịn phụ thuộc vào môi trường mà chúng phân
bố. Theo Fenikaxova, Ermoshina (1969), α – amylase của nấm mốc bền vững đối
với acid hơn so với α – amylase của vi khuẩn. Ở pH 3,6 và nhiệt độ 0 oC, hoạt
lực của α – amylase nấm mốc hầu như không giảm, trong khi đó α – amylase của
vi khuẩn bị bất hoạt hoàn toàn. Theo Sproler Uhling, α – amylase của nấm mốc
bền vững ở vùng pH 5,3 – 8 còn α – amylase của vi khuẩn bền vững ở vùng pH
5,0 – 10,0 [27].
• Ảnh hưởng của thành phần mơi trường: thành phần mơi trường có ảnh
hưởng rất lớn đến sự sinh trưởng phát triển và khả năng sinh tổng hợp amylase
của nấm mốc. Để đạt được sinh khối cực đại cần lựa chọn thành phần mơi trường
cho thích hợp, đồng thời xem xét tỷ lệ tương ứng giữa các thành phần.
+ Nguồn carbon: amylase là một enzyme cảm ứng điển hình, do đó mơi
trường nấm mốc sinh amylase phải có các chất cảm ứng như tinh bột, dextrin,
maltose, đây là nguồn carbon tốt hơn để thu amylase cao. Nhiều nghiên cứu của
Magaxanic (1964) cho thấy, glucose là nguồn carbon dễ đồng hóa đối với đa số
vi sinh vật dị dưỡng, nhưng lại là chất kìm hãm sinh tổng hợp nhiều enzyme, hệ
enzyme [27]. Theo số liệu của Tonomura (1961) thì isomaltose và panose (các
oligosaccharide có chứa liên kết α – 1,6) là những chất cảm ứng tổng hợp α –
amylase của Aspergillus oryzae, tiếp đến là maltose và tinh bột.
+ Nguồn nitrogen: nguồn nitrogen dùng để nuôi cấy nấm mốc có thể là
các hợp chất hữu cơ hoặc muối vơ cơ có chứa nitrogen. Đối với nấm mốc sản
sinh amylase, khi chế tạo môi trường nuôi cấy người ta thường dùng NaNO3 và
NH4NO3, đây là nguồn dinh dưỡng nitrogen có hiệu quả hơn so với các muối
ammonium khác (KNO3, Mg(NO3)2, (NH4)2SO4, (NH4)3PO4) [27]. Theo
Fenikxova, Dvatxatova (1960) khi nuôi chủng A. oryzae 3, 9, 15 trên môi trường
bột ngô chúng tạo α – amylase khi có mặt (NH4)2HPO4 và NH4NO3, cịn chủng
A. oryzae 153 lại tổng hợp mạnh mẽ amylase khi có mặt (NH4)2SO4, trong khi đó
15

Khóa luận tốt nghiệp
A. awamori sinh trưởng tốt và tạo nhiều amylase trên mơi trường Czapeck có
chứa NaNO3 hoặc NH4NO3 [27]. Theo Phạm Thị Huyền (2009) khi tìm hiểu ảnh
hưởng của nguồn nitrogen lên sự tích lũy sinh khối và sinh tổng hợp amylase của
nấm mốc trong nước thải giàu tinh bột cho thấy hai chủng nấm mốc M12 và M23
sinh trưởng phát triển thích hợp nhất trong mơi trưởng có urea [11].

16


Khóa luận tốt nghiệp
Phần 2

ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
I. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHẠM VI NGHIÊN CỨU
1. Đối tượng nghiên cứu
Các chủng nấm mốc có khả năng phân giải tinh bột phân lập từ bùn ao
nuôi tôm tại đầm Sam – Chuồn thuộc huyện Phú Vang, tỉnh Thừa Thiên Huế.
2. Phạm vi và thời gian nghiên cứu
- Phạm vi nghiên cứu: Ao nuôi tôm ở đầm Sam – Chuồn, huyện Phú
Vang, tỉnh Thừa Thiên Huế.
- Địa điểm thu mẫu: thị trấn Thuận An, xã Phú An, xã Phú Mỹ.
- Thời gian nghiên cứu: Từ tháng 2/2011 đến tháng 5/2011.

II. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
1. Phương pháp phân lập và đếm số lượng tế bào [3]
Sử dụng phương pháp Koch để phân lập nấm mốc phân giải tinh bột trên
môi trường Czapeck với nguồn carbon là tinh bột (g, ml/l):
Tinh bột

20

KH2PO4

1

NaNO3

3

FeSO4

0,01

MgSO4

0,5

KCl

0,5

Agar – agar

20

Nước

1000

pH

6,0

Môi trường sau khi pha chế được phân vào bình tam giác và khử trùng ở 1
atm trong 30 phút. Sau khi khử trùng, phân phối môi trường vào các hộp Petri
trong điều kiện vơ trùng.
• Tiến hành phân lập
Cân 1g mẫu đất bùn cho vào ống nghiệm chứa 9 ml nước vơ trùng và lắc
đều ta có độ pha loãng mẫu là 10-1. Hút ra 1 ml mẫu ở độ pha loãng này cho vào
ống nghiệm chứa 9 ml nước vơ trùng, lắc đều ta có độ pha loãng 10-2, tiếp tục

17


Khóa luận tốt nghiệp
pha lỗng cho đến nồng độ cần thiết. Dùng pipette loại 1 ml vô trùng hút mẫu ở
các độ pha lỗng thích hợp nhỏ một giọt lên bề mặt thạch đĩa chứa sẵn môi
trường phân lập tương ứng, dùng que gạt dàn đều giọt dịch mẫu trên bề mặt
thạch. Mỗi nồng độ pha loãng cấy trên 3 hộp Petri, sau đó bao gói cẩn thận, ni
cấy trong tủ ấm ở nhiệt độ 30 oC cho bào tử nấm mốc phát triển thành khuẩn lạc.
Sau 3 ngày, chọn những khuẩn lạc mọc riêng rẽ, cấy chuyền sang ống thạch
nghiêng chứa cùng một môi trường phân lập để giữ giống trong điều kiện lạnh 4
C sau khi ống giống đã mọc tốt.

o

• Đếm số lượng tế bào vi sinh vật
Xác định số lượng tế bào vi sinh vật trong 1g mẫu bằng phương pháp xác
định gián tiếp thông qua đếm số lượng khuẩn lạc mọc trên môi trường thạch đĩa.

Số lượng vi sinh vật trong 1g mẫu khô tuyệt đối được tính bằng cơng thức:
CFU / g = M.a.10n/W
Trong đó:
CFU: đơn vị hình thành khuẩn lạc (colonie forming unit)
W

: trọng lượng khô tuyệt đối của 1 g mẫu phân lập

a

: số giọt pipette của 1 ml mẫu

M

: số lượng khuẩn lạc trung bình / hộp petri

( Để tăng độ chính xác, giá trị M thường lấy trung bình cộng của 3, 5 hoặc
7 hộp Petri của cùng một độ pha loãng).
2. Xác định khả năng phân giải tinh bột của các chủng nấm mốc
• Phương pháp xác định trực tiếp
+ Ngun tắc: trên mơi trường chứa cơ chất thích hợp (tinh bột), nấm mốc
sẽ tiết ra enzyme amylase ngoại bào phân hủy cơ chất để sinh trưởng và làm cho
môi trường trong hơn khi nhuộm màu bằng thuốc thử Lugol. Độ lớn của khoảng
môi trường trong suốt và vệt cấy phản ánh khả năng phân giải cơ chất của nấm
mốc.
+ Phương pháp tiến hành:

18

Khóa luận tốt nghiệp
Từ ống giống thuần khiết tiến hành cấy vạch từng chủng nấm mốc riêng rẽ
lên các đĩa Petri chứa môi trường Czapeck với nguồn carbon là tinh bột rồi ni
ở thời gian và nhiệt độ thích hợp. Sau đó nhuộm bằng thuốc thử Lugol rồi đo
kích thước khuẩn lạc (d) và kích thước vạch phân giải (D) để tính hiệu số vạch
phân giải (D – d). Hiệu số vạch phân giải càng lớn thì hoạt tính của amylase càng
mạnh [4].
Cơng thức thuốc thử Lugol
KI

2g

I2

1g

H2 O

300 ml

• Xác định hoạt tính enzyme amylase bằng phương pháp khuếch tán trên
thạch (tuyển chọn gián tiếp)
+ Nguyên tắc: ezyme amylase tác động lên cơ chất tinh bột trong môi
trường thạch, tinh bột bị phân hủy. Độ đục của môi trường bị giảm và trở nên
trong suốt. Độ lớn của vòng phân giải phản ánh hoạt lực của enzyme.
+ Phương pháp tiến hành:
Các ống thạch nghiêng chứa giống được chuyển vào môi trường dịch thể.
Tiến hành ni lắc 120 vịng/phút trong thời gian 4 ngày rồi tiến hành chiết dịch
enzyme.
Chuẩn bị môi trường agar – cơ chất:

Agar : 2%
Tinh bột: 1%
Khử trùng và đổ đầy vào các hộp Petri để tạo giếng. Sau khi thạch đông,
dùng khoan nút chai khoan các lỗ nhỏ trên thạch và cho vào mỗi lỗ khoan một
lượng thích hợp dịch enzyme amylase. Sau khi làm lạnh (4 – 6 oC) khoảng 3 – 5
giờ, giữ mẫu trong tủ ấm 40 oC trong 36 giờ. Sau đó tiến hành nhuộm bằng thuốc
thử Lugol và đo kích thước vịng phân giải cơ chất. Hoạt tính enzyme amylase
được biểu diễn bằng mm đường kính vịng thủy phân [4].

19


Khóa luận tốt nghiệp
3. Xác định sinh khối của nấm mốc
Để xác định sinh khối của nấm mốc, chúng tôi dùng phương pháp cân trực
tiếp (độ chính xác cân là 0,001 g).
Phương pháp tiến hành: Sau khi thu được sinh khối nấm mốc bằng cách
lọc tĩnh và rửa qua giấy lọc, chúng tơi đem giấy lọc có nấm mốc sấy khơ đến
khối lượng khơng đổi. Sau đó cân khối lượng giấy lọc có nấm mốc và khối lượng
giấy lọc khơng chúng tôi xác định được khối lượng của chủng nấm mốc (sinh
khối) thu được.
4. Thăm dò ảnh hưởng của một số điều kiện ni cấy đến hoạt tính của
amylase và sự tích lũy sinh khối
Ảnh hưởng của thời gian: Để thăm dị ảnh hưởng của thời gian đến hoạt
tính của amylase và sự tích lũy sinh khối, tiến hành ni cấy lắc (120 vòng/phút)
các chủng nấm mốc đã được tuyển chọn trong môi trường dịch thể Czapeck sau
24, 48, 72, 96, 120 giờ. Sau đó thu dịch lọc, xác định hoạt tính amylase bằng
phương pháp khuếch tán trên thạch và xác định sinh khối nấm mốc theo phương
pháp cân.
Ảnh hưởng của pH mơi trường: Để thăm dị ảnh hưởng của pH mơi

trường đến hoạt tính của amylase và sự tích lũy sinh khối, tiến hành ni cấy lắc
(120 vịng/phút) các chủng nấm mốc trong mơi trường dịch thể Czapeck có độ
pH: 5,0; 5,5; 6,0; 6,5; 7,0 (pha trong đệm Briton và Robinson). Sau đó thu dịch
lọc, xác định hoạt tính amylase bằng phương pháp khuếch tán trên thạch và xác
định sinh khối nấm mốc theo phương pháp cân.
Ảnh hưởng của nguồn carbon: Để thăm dò ảnh hưởng của nguồn dinh
dưỡng carbon đến hoạt tính amylase và sự tích lũy sinh khối, tiến hành ni cấy
lắc (120 vịng/phút) chủng nấm mốc trong môi trường dịch thể Czapeck với các
nguồn carbon là: tinh bột, saccharose, glucose, rỉ đường, CMC (carboxyl methyl
cellulose). Sau đó thu dịch lọc, xác định hoạt tính amylase bằng phương pháp
khuếch tán trên thạch và xác định sinh khối nấm mốc theo phương pháp cân.

20


Khóa luận tốt nghiệp
Ảnh hưởng của nguồn nitrogen: Để thăm dị ảnh hưởng của nguồn dinh
dưỡng nitrogen đến hoạt tính của amylase và sự tích lũy sinh khối, tiến hành ni
cấy lắc (120 vịng/phút) các chủng nấm mốc trong mơi trường dịch thể Czapeck
với các nguồn nitrogen là: NH4Cl, KNO3, NaNO3, urea, gelatine. Sau đó thu dịch
lọc, xác định hoạt tính amylase bằng phương pháp khuếch tán trên thạch và xác
định sinh khối nấm mốc theo phương pháp cân.
5. Xác định ảnh hưởng của thời gian ủ enzyme đến sự thể hiện hoạt tính
phân giải tinh bột của amylase
Để xác định ảnh hưởng của thời gian ủ enzyme đến sự thể hiện hoạt tính
phân giải tinh bột của amylase, tiến hành ni cấy lắc (120 vịng/phút) các chủng
nấm mốc trong môi trường Czapeck dịch thể với điều kiện tối ưu. Sau đó thu
dịch lọc, xác định hoạt tính amylase bằng phương pháp khuếch tán trên thạch với
các khoảng thời gian ủ enzyme: 24 giờ, 36 giờ, 48 giờ, 60 giờ, 72 giờ.
6. Xác định hoạt tính cellulase và protease của nấm mốc

Để xác định hoạt tính cellulase của nấm mốc, tiến hành ni cấy lắc (120
vịng/phút) các chủng nấm mốc trong mơi trường Czapeck dịch thể với nguồn
carbon thích hợp nhất cho sinh trưởng và phát triển của nấm mốc. Sau đó thu
dịch lọc, xác định hoạt tính cellulase bằng phương pháp khuếch tán trên thạch
với cơ chất là CMC, dùng thuốc thử Lugol.
Tương tự, để xác định hoạt tính protease của nấm mốc, tiến hành ni cấy lắc
(120 vịng/phút) các chủng nấm mốc trong môi trường Czapeck dịch thể với
nguồn nitrogen thích hợp nhất cho sinh trưởng và phát triển của nấm mốc. Sau
đó thu dịch lọc, xác định hoạt tính protease bằng phương pháp khuếch tán trên
thạch với cơ chất là gelatine, dùng thuốc thử Fraziae.

III. XỬ LÝ SỐ LIỆU
Số liệu thu được được xử lý bằng chương trình thống kê trong phần mềm
Microsoft Excel 2003.

21


Khóa luận tốt nghiệp
Phần 3

KẾT QUẢ VÀ BIỆN LUẬN
I. PHÂN LẬP VÀ XÁC ĐỊNH SỐ LƯỢNG TẾ BÀO
Chúng tôi đã tiến hành 4 đợt thu mẫu tại các ao nuôi tôm tại 3 địa điểm là
xã Phú An, xã Phú Mỹ và thị trấn Thuận An thuộc huyện Phú Vang, tỉnh Thừa
Thiên Huế. Từ 9 mẫu bùn thu được, chúng tôi tiến hành phân lập trên môi trường
Czapeck thạch đĩa được 53 chủng nấm mốc có khả năng phân giải tinh bột, với
ký hiệu là MA1, MA2, MA3,…, MA53. Qua phân lập, quan sát các khuẩn lạc
nấm mốc mọc trên môi trường thạch đĩa, chúng tôi nhận thấy các khuẩn lạc nấm
mốc này có các đặc điểm sau:

• Đa số khuẩn lạc có dạng tỏa trịn, màu vàng nhạt ở giữa có màu trắng,
kích thước khoảng 7 – 8 mm.
• Một số khuẩn lạc có dạng trịn, chóp gồ cao, màu trắng hoặc màu xanh,
kích thước khoảng 6 – 7 mm.
• Ngồi ra, cịn có một số khuẩn lạc có màu trắng, tỏa trịn, kích thước
nhỏ khoảng 2 – 3 mm và một số khuẩn lạc có kích thước khá lớn màu xanh, mọc
loang.
Các chủng nấm mốc được cấy chuyền sang các ống thạch nghiêng và lưu
giữ ở nhiệt độ 4 oC để tiến hành các thí nghiệm tiếp theo.
Bằng phương pháp phân lập trên môi trường Czapeck thay nguồn
saccharose bằng tinh bột và nuôi ở 30 oC trong 3 ngày chúng tôi xác định được
số lượng nấm mốc phân giải tinh bột trong bùn ao nuôi tôm (bảng 3.1).
Qua bảng 3.1 chúng tôi nhận thấy, số lượng nấm mốc ở các mẫu bùn thu ở
các địa điểm khác nhau và trong những khoảng thời gian khác nhau có sự chênh
lệch khá rõ rệt, dao động trong khoảng 0,54 x 106 – 12,65 x 106 CFU/g.
Nhìn chung trong ba địa điểm thu mẫu, số lượng nấm mốc ở các mẫu bùn
dao động không nhiều ngoại trừ mẫu PA1 (ao đất) ở Phú An có số lượng nấm
22