Công nghệ di truyền Chuyển gen ở nấm men

CÔNG NGHỆ DI TRUYỀN 2
Chuyển gen ở nấm men

Tháng 2/2015


HẠN CHẾ CỦA HÊ THỐNG CHUYỂN GEN SINH VẬT
TIỀN NHÂN

Protein được tổng hợp từ vi khuẩn thường không bền hoặc
không có hoạt tính sinh học, do
• (1) sự xoắn cuộn protein khác nhau (thể vùi, inclusion
body), tạo cầu nối disulfide khơng chính xác
• (2) ở tế bào nhân sơ khơng có các biến đổi sau dịch mã
qua đó các nhóm hóa học chức năng khơng được gắn vào
vị trí amino acid đặc hiệu
• (3) khơng tổng hợp được protein gồm nhiều tiểu đơn vị
E. coli chưa từng được sử dụng trong lên men công nghiệp
như các vi khuẩn Gram +, vd. Bacillus (amylase, protease),
actinomycetes (kháng sinh) hay coryneforms (amino acid,
steroid). Tuy nhiên, việc tạo dòng ở các vi khuẩn này không
hiệu quả như ở E. coli.


Quá trình phiên mã, dịch mã


Sự hình thành mRNA chức năng ở tế bào nhân chuẩn


Q trình glycosyl hóa ở nấm men

• Các glycans ở nấm thường chỉ
gồm mannose (S. pombe
galactose)
• S. cerevisiae là một trường hợp
ngoại lệ tạo nhiều phản ứng
mannose hóa, khơng diễn ra ở tất
cả protein.
• Sự glycosyl hóa ở nấm men có
thể ảnh hưởng đến đặc tính của
sản phẩm protein như hoạt tính
hay gắn kết
• Liên kết α-1,3-Man ở cuối chuỗi
mang tính miễn dịch với vật thể
lạ ở động vật có vú.


Các hệ thống biểu hiện gen phổ biến ở eukaryote

• Để khắc phục những nhược điểm nói trên, hệ thống biểu hiện
nhân chuẩn sử dụng nấm men, côn trùng, và tế bào động vật có
vú đã được phát triển.
• Protein tái tổ hợp từ tế bào nhân chuẩn có tính ổn định và
hoạt tính sinh học phù hợp cho các nghiên cứu hóa sinh, lý
sinh và cấu trúc, vd. các protein tái tổ hợp dùng trong y học
• Yeast
• Nấm men (yeast)
• Tế bào cơn trùng (insect cells)
• Tế bào động vật có vú (và cả hybridomas)
• Động vật có vú (mammals): chuột, cừu

• Thực vật
• Tế bào thực vật/ bào quan (organs)
• Bào quan thực vật: lục lạp (chloroplasts)


ƯU ĐIỂM CỦA HỆ THỐNG BIỂU HIỆN NẤM MEN

2 chủng nấm men thường được sử dụng là
Saccharomyces cerevisiae và Pichia pastoris.


SINH HỌC NẤM MEN

• Sinh vật nhân chuẩn, đơn bào, ng kớnh khong 5 àm,
cú 16 nhim sc th (n).
ã Bộ gen S. cerevisiae gồm khoảng 1,2 x 107 cặp base, nhỏ
hơn bộ gen người 200 lần.
• Nấm men có thể phát triển dễ dàng trong môi trường nuôi
cấy, thời gian phân chia khoảng 2 giờ  bộ gen có kích
thước nhỏ, sinh sản nhanh (giống vi khuẩn).
• Nấm men sinh sản bằng cách này chồi hay phân chia trực
tiếp (fission), hoặc có thể phát triển ở dạng sợi khuẩn ty
(mycelium).


Tế bào nấm men

Nguồn: www.bbc.co.uk

CÁC PHƯƠNG PHÁP CHUYỂN GEN Ở NẤM MEN

• 1978 Hinnen và cs. lần đầu tiên chuyển

gen trên nấm men. Spheroplast S. cerevisiae
(nấm men khơng có thành tế bào) được hịa
cùng polyethylen glycol (PEG) với DNA và
CaCl2, sau đó được tái tạo thành tế bào trong
môi trường ổn định chứa 3% agar.

• Kỹ thuật dùng xung điện (electroporation)
hiện nay thay thế cách dùng spheroplast nấm
men vì dễ thực hiện và nhanh hơn. Các tế
bào được biến đổi có thể được chọn lọc trên
bề mặt môi trường rắn.


CÁC PHƯƠNG PHÁP CHUYỂN GEN Ở NẤM MEN
Các phương pháp chuyển gene
• Sử dụng spheroplast
• Lithium acetate (LiAc), PEG
• Xung điện
• Sốc nhiệt
• Biolistics
• Dùng hạt thủy tinh (glass bead method)
Chọn lọc tế bào biến đổi
• Dựa vào đột biến khuyết dưỡng (auxotrophic mutations)
Chủng mang một đột biến ở 1 trong các gen (ura3, leu2, trp1,
his3) tương đương với các gen (URA3, LEU2, TRP1, HIS3) có
trong vector.

• Các marker chọn lọc: kháng G418, cyclohexamide,
formaldehyde, Cu2+


Tế bào Sacchromyces
cerevisiae ở các pha
khác nhau trong chu
kì tế bào.
Thanh ngang = 0,5 mm

(a) Yeast cells at stationary phase, (b) yeast cells at logarithmic phase, (c) spheroplasts obtained
by enzymatic treatment of cells, (d) nuclei (arrows) isolated from spheroplasts by osmotic shock
for centrifugation onto a silicon chip (shown in e) according to Step 6A. In all images, scale bar =
0.5 mm. This figure demonstrates Saccharomyces cerevisiae cells. In the case of Saccharomyces
pombe, the initial cell differs in shape and is more 'rod-shaped'; however, the spheroplasts and
isolated nuclei look very similar to S. cerevisiae when visualized using the light microscope.


CÁC VECTOR CHUYỂN GEN CHÍNH Ở NẤM MEN

Bốn loại vector biểu hiện chính ở S. cerevisiae:
 vector dạng episome nấm men (YEp, yeast episomal
plasmid),
 Vector mang trình tự ARS (YRp, yeast replicating
plasmid),
 vector cài nhập (YIp, yeast integration plasmid ),
 Vector mang trình tự tâm động (Ycp, yeast
centromere plasmid)
và các nhiễm sắc thể nấm men nhân tạo (YAC).

VECTOR E. COLI - NẤM MEN

Điểm khởi đầu tái
bản ở nấm men


CÁC VECTOR NẤM MEN

Các tế bào bị biến đổi có thể được chọn lọc dựa vào đột biến
khuyết dưỡng (auxotrophy) và đặc điểm của đoạn gen chèn vào
(gen qui định tính nhạy cảm với nhiệt độ, temperature-sensitive
gene).


MARKER CHỌN LỌC

Các marker được sử dụng ở nấm men bao gồm URA3,
HIS3, LEU2, TRP1 và LYS2 và bổ sung cho các chủng
nấm men đột biến khuyết dưỡng bao gồm ura3-52,
his3-D1, leu2-D1, trp1-D1 and lys2-201.
Các thể đột biến khuyết dưỡng ở nấm men đã được chọn
bởi tỉ lệ hồi tính thấp của chúng.
Ngoài ra, các gen marker URA3, HIS3, LEU2 và TRP1
của nấm men có thể bổ trợ cho các đột biến khuyết
dưỡng chuyên biệt ở E .coli.


YEp plasmid

Có 2 dạng vector thường được sử dụng để xây dựng plasmid
chuyển gen ở nấm men
• YEp (Yeast episomal plasmid)
• YCp (Yeast centromeric plasmid)
Cả hai loại vector này đều mang trình tự hỗ trợ tái bản độc lập
của nấm men (yếu tố ARS). Sự hiện diện của chúng càng làm
tăng tần số biến nạp.
YCp mang tâm động của NST – trình tự này quan trọng cho
sự phối hợp giữa plasmid và thoi vô sắc của tế bào. Lượng
bản sao plasmid ở mỗi tế bào giới hạn từ 1 - 2


YEp plasmid

YEp được phát triển từ episom plasmid 2 µm của nấm men
FLP: mã hóa cho recombinase
REP 1&2: mã hóa protein tham gia tái bản plasmid
D: vị trí phát huy sự tái bản plasmid


Vector YEp

• Các vector YEp (Yeast episomal plasmid) tái bản tự do với sự
hiện diện của một đoạn plasmid nấm men 2 µm đóng vai trị
như vị trí khởi đầu tỏi bn (2 àm ori).
ã Trỡnh t 2 àm ori giúp YEp vector có tần số chuyển gen cao
và lượng bản sao cao (25 – 100 copies/cell).
• Hầu hết YEp plasmid khơng bền vững, lượng tế bào mất
trung bình thấp nhất 10-2 nhiều hơn sau mỗi thế hệ. Ngay cả
khi ở điều kiện tăng trưởng chọn lọc, chỉ từ 60 – 95% tế bào

cịn mang YEp plasmid.
• Số lượng bản sao/tế bào: ~ 10 – 40 copy. Tuy nhiên, plasmid
không phân phối đều trong tế bào.


Vector YRp

• Mang trình tự tái bản tự
động (ARS,
Autonomously
Replicating Sequence)
từ nhiễm sắc thể nấm
men.
• Có thể tái bản độc lập
với NST nấm men.
• Dạng vector này khơng
bền và có thể bị mất
trong quá trình này chồi
của nấm men.

zon
aws.com


YCp plasmid

Mang một phần trình tự ARS
và trình tự tâm động của NST
(quan trọng cho sự phối hợp giữa
plasmid và thoi vô sắc của tế bào).

Lượng bản sao plasmid ở mỗi
tế bào giới hạn từ 1 - 2
YCp tồn tại ổn định mà không cần xác nhập DNA
như YIp vector, là sự lựa chọn lí tưởng cho vector tạo
dịng gen, xây dựng thư viện gen nấm men, và khảo
sát chức năng gen được thay đổi in vivo..


YIp (Yeast integrating plasmid)

• YIp thiếu trình tự ARS nhưng mang trình tự cho phép
kết hợp (intergrate) vào NST với tần suất cao
(homologous recombination, tái tổ hợp tương đồng).
• Sự kết hợp trình tự DNA vào NST nấm men làm chúng
có thể phát triển trong mơi trường giàu dinh dưỡng và
đạt đến mật độ cao mà không mất đi gen mong muốn

• Vì thế ở hệ thống này, sự biểu hiện protein cao phụ
thuộc vào lựa chọn promoter hơn là lượng bản sao
plasmid.


YIp (Yeast integrating plasmid)
YIp xác nhập với DNA bộ
gen bởi tái tổ hợp đồng
nhất.
Sự kết hợp ở dạng 1 bản
sao. Sự kết hợp nhiều bản
sao cũng xảy ra.

Do đó
vector này thích hợp để
xây dựng các chủng bền
vững và gia tăng biểu hiện
của các gen chuyên biệt.


YAC (Yeast artificial chromosome)

• Các hệ thống tạo dịng YAC dựa trên plasmid mạch
thẳng của nấm men, nổi bậc là YLp, chứa các trình
tự DNA có chức năng như telomeres (TEL) in vivo,
cũng như mang các đoạn ARS và CEN
• YAC vector có thể mang đoạn DNA lớn (lên đến 2
Mb), nhưng hiệu quả chuyển gen rất thấp.
Các thành phần chủ yếu của YAC:
• Centromeres (CEN), telomeres (TEL) và trình tự tái
bản độc lập (ARS) .
• Marker: ampr , TRP1 và URA3
• Vị trí nhận biết cắt giới hạn (như là EcoRI và
BamHI)


CÁC VECTOR NẤM MEN – YAC (Yeast artificial chromosome)