Công Nghệ Di Truyền Chuyển gen ở vi khuẩn

CÔNG NGHỆ DI TRUYỀN 2

TÔN BẢO LINH


7/2013


Giới thiệu môn học
Mục tiêu môn học
-Cung cấp cho sinh viên ngành Công nghệ Sinh
học kiến thức về phương pháp tạo DNA tái tổ hợp;
- Giới thiệu các phương pháp chuyển DNA tái tổ
hợp vào tế bào vi khuẩn, nấm men, thực vật, động
vật; ứng dụng kỹ thuật tái tổ hợp DNA trong sản
xuất công nghiệp.
Nội dung đánh giá: bài tập nhóm (10%), thi thực
hành (20%), kiểm tra - đánh giá cuối kì (70%).


Tài liệu tham khảo

• Glick B. and Pasternak J. J., 2007. Công nghệ sinh học phân tửNguyên lý và ứng dụng DNA tái tổ hợp. NXB Khoa học và kỹ thuật
Hà Nội.
Phần I.2 Các hệ thống sinh học dùng trong CNSH phân tử
Phần I.6 Thao tác biểu hiện gen ở các sinh vật nhân sơ
Phần I.7 Sản xuất protein dị chủng trong các tế bào nhân chuẩn
Phần III.17 Cải biến gen thực vật: phương pháp luận
Phần III.19 Động vật chuyển gen

• OLD R.W. and Primrose S.B., 1994. Principles of Gene Manipulation.

Blackwell Science.
• Madigan M.T., Martinko J. M., Parker J., 2003. Brock Biology of
Microorganisms (10th ed). Prentice Hall Pearson Education
International.


Giới thiệu môn học
Tạo vi sinh vật BĐG và biểu
hiện gen ở sinh vật nhân sơ
Sản xuất protein dị chủng
trong các tế bào nhân chuẩn
Cải biến gen thực vật
Động vật chuyển gen

Ni tế bào
Tạo dịng gen
Tạo sinh vật
biến đổi gen


Giới thiệu môn học

Công nghệ di truyền (genetic engineering) hay biến đổi di
truyền (genetic transformation) là sự biến đổi bộ gen của
một sinh vật bằng cách bổ sung vào bộ gen một hay vài
gen. Gen được đưa vào được gọi là “gen chuyển”
(transgene); sinh vật nhận gene chuyển vào bộ gen một
cách bền vững được gọi là sinh vật biến đổi gen
(transgenic organism hay transformed organism).
CNDT được sử dụng trong các ứng dụng thực tế (cải tạo

giống cây trồng, vật nuôi hay tạo các sinh vật biến đổi gen),
đồng thời cũng là công cụ hữu hiệu cho nghiên cứu cơ bản
(nghiên cứu chức năng của gen, tạo đột biến)


NGUYÊN TẮC BIẾN ĐỔI DI TRUYỀN

Quá trình biến đổi di truyền
gồm 2 bước cơ bản: (1) chuyển
DNA ngoại lai vào một tế bào
tạo tế bào biến đổi gen,
(2) nhận sinh vật biến đổi gen
từ một tế bào biến đổi.
Sự xác nhập (integration) gen
vào bộ gen tế bào nhận có thể
có định hướng hay ngẫu nhiên.


CÁC HÌNH THỨC CHUYỂN GEN

Tiếp hợp (conjugation): phổ biến ở vi khuẩn, sự truyền thông tin di
truyền thông qua sự tiếp xúc trực tiếp giữa 2 tế bào.
Chuyển nạp (transduction): là quá trình DNA được chuyển từ vi
khuẩn này sang vi khuẩn khác bởi virus. Quá trình này bao gồm việc
chuyển DNA ngoại lai vào tế bào bằng vector của virus. Gen ngoại lai
được xác nhập bền vững vào bộ gen tế bào chủ.
Chuyển nhiễm (transfection): quá trình chuyển nucleic acid (hay
protein) tự do vào tế bào. Thường dùng để nói đến chuyển gen ở
sinh vật nhân chuẩn.

Biến nạp (Transformation): thường được dùng để mơ tả q trình
chuyển vật liệu di truyền mới vào tế bào vi khuẩn, tế bào động vật và
thực vật.


CÁC PHƯƠNG PHÁP
CHUYỂN
GENCHUYỂN GEN
CÁC HÌNH
THỨC

1

3

2

4


CÁC PHƯƠNG PHÁP CHUYỂN GEN
PP GIÁN TIẾP
•Thực khuẩn thể
•Virus
•Vi khuẩn kí sinh

•
•
•
•

•

PP TRỰC TIẾP
Hóa học
Điện biến nạp
(electroporation)
Vi tiêm (microinjection)
Bắn gen (biolistics)
Silicon carbide


Phương pháp chuyển gen sử dụng PEG (Polyethylene glycol)

Tế bào trần lục mô (mesophyll
protoplasts) ở Arabidopsis. Lá
Arabidopsis được phân giải
bằng cellulase và macerozyme
(cellulase,
Hemicellulase,
Pectinase) trong 3 giờ ở nhiệt
độ phòng.

Sự biểu hiện gen tín hiệu
(reporter gene) GUS (A) và
GFP (B) ở tế bào trần lục mô
của cây Arabidopsis


Phương pháp bắn gen (Biolistics)

Đối tượng áp dụng: mô, tế bào, bào quan .
Mục tiêu biểu hiện gen: phôi côn trùng và cá, tế bào động –
thực vật, phấn hoa, tảo, nấm sợi, mô thực vật - động vật, ti thể
và lục lạp.
Trạng thái mẫu sử dụng: in situ, in vitro, in vivo, và ex vivo.


Hệ thống biolistics (Biorad PSD – 1000/He)


Các bộ phận của buồng bắn gen (Biorad PSD – 1000/He)


Quá trình bắn vi đạn (Biorad PSD-1000/He)


Thành phần của rupture disk với nắp đậy (bên trái) và thành
phần của microcarrier (bên phải) (Biorad PSD – 1000/He)


Các thơng số cảnh hưởng đến q trình chuyển gen sử
dụng hệ thống PDS-1000/He


Các điều kiện ưu tiên khảo sát nhằm tối ưu hóa các dạng
hệ thống sinh học khi sử dụng hệ thống PDS-1000/He


Phương pháp dùng xung điện (Electroporation)

Đối tượng áp dụng:
vi khuẩn, nấm men và
protoplast thực vật

MicroPulser Electroporator

Cuvette bằng thủy tinh/nhựa
với 2 điện cực bằng nhơm. Thể
tích cuvette khoảng 400 µL


MicroPulser gồm module tạo xung điện, buồng tạo shock và cuvette


Các yếu tố ảnh hưởng đến hiệu quả chuyển gen bằng
xung điện

1. Sự tăng trưởng của tế bào
- Vi khuẩn: giữa giai đoạn tăng trưởng (mid-log)
- S. cerevisiae: tăng dần từ giai đoạn đầu đến cuối giai đoạn tăng
trưởng
- Hiệu quả biến nạp tỉ lệ thuận với nồng độ DNA (10 pg /ml – 7,5
μg/ml)
2. DNA: dạng cấu trúc, nồng độ
- Plasmid dạng siêu xoắn cho hiệu quả chuyển gen cao nhất ở vi
khuẩn.
- Ở Candida, Pichia và Tetrahymena DNA dạng thẳng cho hiệu
quả chuyển gen cao hơn dạng plasmid siêu xoắn tích hợp
(supercoiled integrating plasmids).

Các yếu tố ảnh hưởng đến hiệu quả chuyển gen bằng
xung điện

3. Môi trường điện biến nạp:
Tế bào phải được tách ra khỏi mơi trường ni và được rửa ít
nhất 3 lần với nước hoặc các dung dịch không chứa ion như
glycerol, sucrose, glucose, sorbitol hay polyethylene glycol.


Phương pháp vi tiêm (Microinjection)

Đây là một kỹ thuật cho hiệu quả
cao nhưng rất tốn nhiều công
sức. Ứng dụng chủ yếu trong
chuyển DNA vào nhân noãn, hợp
tử và các tế bào phôi sớm.

System diagram.
(1) Inverted microscope
(2) Joystick Hydraulic Micromanipulator
(3) Microinjector
(4) Floating table
(5) Remote-control Hydraulic Microdrive
(6) Auxiliary light-weight manipulator
(7) Microneedle holder
(8) A zoom lens for the video camera .


TẠO VI SINH VẬT BIẾN ĐỔI GEN VÀ BIỂU HIỆN GEN Ở

SINH VẬT NHÂN SƠ


CÁC KHÁI NIỆM CƠ BẢN
•Khả nạp (Competence). Tế bào có thể tiếp nhận một phân tử DNA và

bị biến đổi được gọi là có tính khả nạp (competent). Tính chất này qui
định bởi di truyền qui và chỉ một số chủng nhất định có tính khả nạp.

•Tế bào khả nạp nhân tạo (artificial competent cell). Có thể tạo tế
bào E. coli khả nạp (cho hiệu quả chuyển gen thấp) với nồng độ cao

của ion Ca2+ và bảo quản lạnh tế bào. Các tế bào E. coli khả nạp này
có thể tiếp thu DNA sợi đôi nên việc chuyển gen bằng DNA plasmid
khá hiệu quả.


CÁC PHƯƠNG PHÁP TẠO VI SINH VẬT BIẾN ĐỔI GEN

Phương pháp tiếp hợp
(conjugation)

Phương pháp điện biến nạp
(Electroporation)
Phương pháp hóa biến nạp