xác định chỉ tiêu sinh hóa và khả năng kháng thuốc kháng sinh của vi khuẩn phân lập từ huyết tương tôm càng xanh (macrobrachium rosenbergii) bị đục cơ nuôi ở thành phố cần thơ

TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ
KHOA THỦY SẢN







PHẠM MINH TRÚC






XÁC ĐỊNH CHỈ TIÊU SINH HÓA
VÀ KHẢ NĂNG KHÁNG THUỐC KHÁNG SINH
CỦA VI KHUẨN PHÂN LẬP TỪ HUYẾT TƯƠNG
TÔM CÀNG XANH (Macrobrachium rosenbergii)
BỊ ĐỤC CƠ NUÔI Ở THÀNH PHỐ CẦN THƠ







LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC

CHUYÊN NGÀNH BỆNH HỌC THỦY SẢN







2009
PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version


i
LỜI CẢM TẠ
Cảm ơn tạo hóa cho con làm con của cha mẹ. Cảm ơn cha mẹ đã sinh ra con, luôn
luôn bên cạnh con làm chỗ dựa tinh thần vững chắc để con có thể tự tin bước qua
mọi khó khăn trong cuộc sống.
Xin gởi lời cám ơn chân thành đến cô Đặng Thị Hoàng Oanh, cô Nguyễn Thị Thu
Hằng đã tận tình hướng dẫn và tạo mọi điều kiện thuận lợi giúp tôi hoàn thành tốt
đề tài .
Cám ơn cô Đặng Thụy Mai Thy, chị Nguyễn Hà Giang, chị Nguyễn Thị Thúy
Liễu cùng quý thầy cô, anh chị trong bộ môn thủy sinh học và bệnh thủy sản đã
tận tâm nhiệt tình giúp đỡ tôi trong suốt quá trình thực hiện đề tài.
Cảm ơn những người bạn thân cùng tập thể lớp Bệnh học thủy sản 31 luôn ủng hộ
tôi, chia sẻ và giúp đỡ tôi trong suốt thời gian qua.
Cuối cùng, một lần nữa tôi xin cảm ơn tất cả.
Chân thành cảm ơn!
PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version

ii
TÓM TẮT

Đề tài được thực hiện nhằm xác định chỉ tiêu sinh hóa và khả năng kháng thuốc
kháng sinh của vi khuẩn phân lập từ huyết tương tôm càng xanh bị bệnh đục cơ
nuôi ở thành phố Cần Thơ. Vi khuẩn trong đề tài là những chủng vi khuẩn phân
lập từ mẫu huyết tương tôm càng xanh bị bệnh đục cơ được phục hồi từ tủ -80
O
C
của bộ môn Sinh học và Bệnh thủy sản – Khoa thủy sản – ĐHCT. Sau khi kiểm tra
đặc tính sinh lý và một vài chỉ tiêu sinh hóa cơ bản cùng với kết quả test kit API
20E đã định danh được 3 nhóm vi khuẩn: Aeromonas gồm 12 chủng trong đó có
một chủng là Aeromonas hydrophila; Enterobacter 3 chủng và Pantoea 1 chủng.
Kết quả kiểm tra kháng sinh đồ của 16 chủng vi khuẩn với 8 loại kháng sinh
thường dùng trong nuôi trồng thủy sản nhìn chung rất nhạy cảm với kháng sinh.
Cả 3 nhóm vi khuẩn đều nhạy với Streptomycin, Colistin, Norfloxacin, Flofenicol,
Doxycycline và Ciprofloxacin. Tuy nhiên, khả năng mẫn cảm của vi khuẩn đối với
colistin không cao; oxolinic acid cũng khá nhạy chỉ duy nhất có một chủng kháng.
Riêng amoxyciclin kháng hầu như hoàn toàn chiếm 93,75%.
PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version


iii

MỤC LỤC

Trang
PHẦN 1
GIỚI THIỆU 1
PHẦN 2

TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2
2.1 Tình hình dịch bệnh trong nuôi trồng thủy sản 2
2.2 Một số bệnh trên tôm càng xanh 2
2.2.1 Bệnh do virus 2
2.2.2 Bệnh do vi khuẩn 3
2.2.3 Bệnh do sinh vật bám 4
2.2.4 Bệnh do dinh dưỡng và môi trường 4
2.3 Sơ lược về bệnh đục cơ 5
2.3.1 Dấu hiệu bệnh lý 5
2.3.2 Tác nhân 5
2.3.3 Phân bố và lan truyền 6
2.3.4 Các biện pháp phòng bệnh đục cơ do vi khuẩn 7
2.4 Sơ lược về vi khuẩn gây bệnh trên tôm 7
2.4.1 Đặc điểm vi khuẩn Aeromonas 7
2.4.2 Đặc điểm vi khuẩn Vibrio 7
2.4.3 Đặc điểm vi khuẩn Pseudomonas 8
2.4.4 Đặc điểm cầu khuẩn Lactococcus garvieae 8
2.5 Các nghiên cứu về sự kháng thuốc của vi khuẩn gây bệnh trên động
vật thủy sản 8
PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version


iv
PHẦN 3
VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 11
3.1 Thời gian và địa điểm nghiên cứu 11
3.2 Nội dung 11
3.3 Vật liệu nghiên cứu 11
3.3.1 Dụng cụ 11
3.3.2 Hóa chất và môi trường 11

3.3.3 Đối tượng nghiên cứu 12
3.4 Phương pháp nghiên cứu 13
3.4.1 Phương pháp xác định chỉ tiêu sinh hóa 13
3.4.2 Phương pháp lập kháng sinh đồ 14
PHẦN 4
KẾT QUẢ THẢO LUẬN 16
4.1 Kết quả định danh vi khuẩn 17
4.2 Kết quả kháng sinh đồ 22
PHẦN 5
KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT 26
5.1 Kết luận 26
5.2 Đề xuất 26
TÀI LIỆU THAM KHẢO 27
PHỤ LỤC 31

PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version


v
DANH SÁCH BẢNG

Bảng 3.1: Nguồn gốc các chủng vi khuẩn nghiên cứu 12
Bảng 3.2: Bảng đọc kết quả bộ kit API 20E 14
Bảng 3.3: Bảng đường kính tiêu chuẩn các loại thuốc kháng sinh theo
NCCLS- National Committee Clinical Laboratory Standard 15
Bảng 4.1: Các chỉ tiêu sinh lý và kết quả sinh hóa bằng kit API của
Aeromonas 18
Bảng 4.2: Các chỉ tiêu sinh lý và kết quả sinh hóa bằng kit API của
Enterobacter 20
Bảng 4.3: Các chỉ tiêu sinh lý và kết quả sinh hóa bằng kit API của

Pantoea 21
Bảng 4.4 Đường kính vòng vô trùng của vi khuẩn đối với kháng sinh 24

PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version


vi
DANH SÁCH HÌNH
Trang
Hình 4.1: Hình nhuộm gram của vi khuẩn Aeromonas 17
Hình 4.2: Khả năng lên men oxi hóa O/F của vi khuẩn Aeromonas 19
Hình 4.3 : Khuẩn lạc của Aeromonas trên môi trường Aeromonas agar 19
Hình 4.4: Tính kháng của Aeromonas khi kiểm tra với O/129 19
Hình 4.5: Kết quả test sinh hóa của Aeromonas bằng kit API 20E 19
Hình 4.6: Biểu đồ thể hiện tính kháng của vi khuẩn với kháng sinh 22
Hình 4.7: Tính nhạy của Enterobacter đối với kháng sinh 23
PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version

1
PHẦN I
GIỚI THIỆU
Việt Nam có nhiều tiềm năng để phát triển nuôi trồng thuỷ sản ở khắp mọi miền
đất nước cả về nuôi biển, nuôi nước lợ và nuôi nước ngọt. Đến năm 2003, đã sử
dụng 612.778 ha nước mặn, lợ và 254.835 ha nước ngọt để nuôi thuỷ sản. Trong
đó đối tượng nuôi chủ lực là tôm với diện tích 580.465 ha. Diện tích nuôi tôm
càng xanh tại các tỉnh Đồng Bằng Sông Cửu Long đã tăng nhanh trong những
năm gần đây và hiện đạt gần 5.000ha, tăng gấp 10 lần so với thời điểm 5 năm
trước đây (Thông tấn xã Việt Nam).
Diện tích nuôi tôm càng xanh tập trung lớn nhất tại các tỉnh hai bên bờ sông Tiền
và sông Hậu như An Giang, Đồng Tháp, Vĩnh Long, Bến Tre và Thành phố Cần

Thơ. Năm 2007 diện tích nuôi thuỷ sản của Thành Phố Cần Thơ là 15.245 ha gồm
cá ao, cá tra, cá ruộng và tôm càng xanh, tăng 5% so với năm 2006. Tổng sản
lượng thu hoạch 175.083 tấn, trong đó cá tra đạt 154.564 tấn vượt kế hoạch
14,4%, tôm càng xanh 268 tấn (Nguyễn Thị Đẹp). Hiện nay, thủy sản nói chung
và nghề nuôi tôm nói riêng thì càng xanh luôn gặp nhiều khó khăn từ môi trường,
kinh tế và một trong những đáng ngại là tình hình dịch bệnh đặc biệt là đục cơ.
Bệnh này cũng gây khá nhiều thiệt hại cho người nuôi. Tại Thái Lan, đục cơ gây
tỉ lệ chết cao từ 30 – 100 % ở tôm càng xanh giai đoạn hậu ấu trùng. Tại huyện
Cờ Đỏ - thành phố Cần Thơ, bệnh này gây thiệt hại 10 ha diện tích nuôi tôm càng
xanh và hao hụt từ 60-70% (2004), 70-100% (2005). Bệnh đục cơ ở tôm càng
xanh hiện là vấn đề đang được chú trọng quan tâm trong những năm gần đây. Tác
nhân bệnh đục cơ có thể là do hai loại virus MrNV ( Macrobrachium rosenbergii
Nodavirus) và XSV (Extra small virus) (Hameed et al., 2004) hoặc vi khuẩn
(Yang et al., 2003) gây nên. Xuất phát từ những vần đề trên đề tài “ Xác định chỉ
tiêu sinh hóa và khả năng kháng thuốc kháng sinh của vi khuẩn phân lập từ huyết
tương tôm càng xanh bị bệnh đục cơ nuôi ở thành phố Cần Thơ” được thực hiện
nhằm mục tiêu tìm hiểu đặc điểm sinh hoá và khả năng kháng thuốc kháng sinh
của vi khuẩn nhiễm trên tôm càng xanh bệnh đục cơ ương nuôi tại Cần Thơ.
Đề tài bao gồm hai nội dung:
1. Xác định một số chỉ tiêu sinh hóa của vi khuẩn phân lập từ huyết tương
tôm càng xanh bị bệnh đục cơ.
2. Xác định khả năng kháng thuốc kháng sinh của vi khuẩn phân lập từ huyết
tương tôm càng xanh bị bệnh đục cơ.
PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version

2

PHẦN II
TỔNG QUAN TÀI LIỆU

2.1 Tình hình dịch bệnh trong nuôi trồng thủy sản
Nghề nuôi trồng thủy phát triển rất mạnh ở nước ta nói chung và ở Đồng Bằng
Sông Cửu Long nói riêng trong thời gian gần đây làm cho môi trường nuôi ngày
càng xấu đi, sự bùng phát của dịch bệnh xảy ra ngày càng nhiều. Sự lan truyền
dịch bệnh trong thủy sản đã dẫn đến những hậu quả nghiêm trọng về kinh tế - xã
hội, môi trường và thương mại quốc tế khó lường được. Tại Việt Nam, mỗi năm
có hàng nghìn hộ dân nuôi luân canh tôm lúa bị thua lỗ do tôm bị chết, tổng thiệt
hại trên 4,5 tỉ đồng. (Viện Nghiên Cứu Nuôi Trồng Thủy Sản I,1998). Ở Thái
Lan, sản lượng tôm nuôi giảm từ 225.000 tấn xuống còn 16.000 tấn do dịch bệnh
đốm trắng (giai đoạn 1995 – 1996). Đã làm thiệt hại 500 triệu USD và đến 1997
tình trạng này vẫn chưa được cải thiện (Triệu Thanh Tuấn, 2006)
Trong số các bệnh ở động vật thuỷ sản thì nguyên nhân chủ yếu là do vi khuẩn
gây ra với những vụ dịch bệnh có qui mô lớn. Thông thường, người ta sử dụng
thuốc kháng sinh để kiểm soát các vi khuẩn gây bệnh. Do việc sử dụng không
đúng cách và quá nhiều loại thuốc kháng sinh nên đã gây ra hiện tượng vi khuẩn
kháng thuốc và tích tụ dư lượng thuốc kháng sinh trong thịt thuỷ sản. Một nguyên
nhân khác gây ra hiện tượng vi khuẩn kháng thuốc là việc sử dụng các loại kháng
sinh với hàm lượng nhỏ trong thức ăn của thuỷ sản như một chất kích thích sinh
trưởng (Mai Văn Tài và ctv., 2004).
2.2 Một số bệnh trên tôm càng xanh
2.2.1 Bệnh do vi rút
2.2.1.1 Bệnh trắng đuôi.(White Tail Disease, WTD)
Bệnh trắng đuôi còn gọi là bệnh trắng cơ (White Muscle Disease,WMD) do virut
có tên là Macrobrachium rosenbergii Nodavirus (MrNV) và Extra Small Virus
(XSV) gây ra. Bệnh này gây ra thiệt hại lớn trong các trại giống ở Ấn Độ, Trung
Quốc, Đài Loan. Đối với giai đoạn hậu ấu trùng, tỉ lệ chết là 100% trong vòng 2-3
ngày khi xuất hiện dấu hiệu lâm sàng và hơn 50% đối với tôm trưởng thành
(Hameed, 2003). Ở Trung Quốc, theo Xianle và Huang (2003) thì trắng đuôi còn
gọi là bệnh đục thân (White Body Disease) và cho rằng bệnh này xuất hiện là do
PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version

3
mầm bệnh từ Thái Lan mang sang Trung Quốc. Bệnh đục cơ đã tấn công 60-90%
quần đàn tôm và gây tỉ lệ chết trên 50% ở cỡ 2-8cm. Khi tôm bị bệnh thì phần
thân và đuôi trở nên tái nhợt, trắng đục. Hiện tượng đục cơ xuất hiện từ telson rồi
di chuyển lên phần đầu. (Bùi Quang Tề và ctv, 2004)
2.2.1.2 Bệnh Hepatopancreatic (HPV)
HPV được xem là virus của tôm nuôi Châu Á, Châu Phi, Châu Mỹ. HPV tìm thấy
trên tôm thuộc họ Penaeid nuôi và tự nhiên ở Australia, Trung Quốc, Hàn Quốc,
Philippin, Đài Loan, Indonesia, Singapore…Vào 1990, báo cáo đầu tiên về HPV
trên tôm Penaeus vanamei và P. stylirostric nuôi và tự nhiên ở bờ biển Thái Bình
Dương phía tây Mexico (Lightner, 1996). Theo ông, HPV cũng đã được tìm thấy
trên tôm càng xanh Macrobrachium rosenbergii. Đặc điểm của bệnh này là
không thấy có dấu hiệu đặc trưng ở bên ngoài. Thể vùi của virus bắt màu hồng
của Eosin khi bệnh ở giai đoạn sớm và bắt màu bazơ đậm khi bệnh ở giai đoạn
muộn. Thể vùi được tìm thấy trong nhân phì đại của tế bào E và F trên ống gan
tụy. (Lightner, 1996)
2.2.2 Bệnh do vi khuẩn
2.2.2.1 Bệnh do vi khuẩn Vibrio
Tác nhân gây bệnh thường là các vi khuẩn: Vibrio anguillarium, V.alginolyticus,
V.parahacmolyticus, V. harveyi và những loài khác. Khi nuôi ở mật độ quá dày,
cho ăn quá nhiều và quảng lý môi trường ao nuôi không tốt sẽ làm bệnh xuất
hiện. Ở Trung Quốc, theo Xianle và Huang (2003) tỉ lệ chết thường là 30-50%
tôm ở giai đoạn hậu ấu trùng. Nếu giai đoạn giống bị nhiễm bệnh thì gây tổn thất
nặng hơn hay mất trắng. Do vậy, các trại giống thường xử dụng thuốc kháng sinh
để ngăn chặn bệnh xảy ra và điều này có thể làm xuất hiện nhiều dòng vi khuẩn
kháng thuốc.
2.2.2.2 Bệnh đốm nâu
Nguyên nhân gây ra bệnh này là sự liên kết của nhiều tác nhân: hóa học, dinh
dưỡng, lý học. Vi khuẩn và nấm là tác nhân lây nhiễm thứ hai. Các vi khuẩn gồm:

Aeromonas sp., Pseudomonas sp., Vibris sp … Tôm bị bệnh có dấu hiệu bị hoại
tử, sưng viêm, đốm đen trên thân và phụ bộ; tỉ lệ chết không đáng kể nhưng nó
làm giảm giá trị kinh tế của tôm. Đây là bệnh thường xảy ra ở ao nuôi tôm đặc
biệt là hệ thống nuôi tôm công nghiệp mật độ dày. (trích dẫn bởi Nguyễn Kim
Cương, 2006)
PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version

4
2.2.2.3 Bệnh hoại tử do vi khuẩn (Bacterial Necrosis)
Bệnh này ảnh hưởng đến ấu trùng của tôm càng xanh giai đoạn 4-5 và gây tỉ lệ
chết 100% trong vòng 48h ở Taihiti. Dấu hiệu bệnh lý của bệnh này là cơ thể tôm
hơi xanh hoặc đổi màu, ruột trắng, ấu trùng yếu và lắng xuống đáy bể, có những
đốm nâu trên anten và phụ bộ (trích dẫn bởi Nguyễn Kim Cương, 2006).
2.2.2.4 Bệnh do vi khuẩn dạng sợi
Bệnh này thường do các vi khuẩn dạng sợi: Leucothrix sp., Thiprix sp.,
Flexibacter sp., Cytophaga sp., và Flavobacterium sp gây ra. Nhiễm bệnh vào tất
cả các giai đoạn phát triển của tôm. Bệnh này có thể gây chết 80% hay hơn thế
nữa trong vài ngày đến vài tuần. Ở ấu trùng và tôm bột vi khuẩn phát triển trên bề
mặt cơ thể, nhất là trên các lông và phụ bộ. Ở tôm lớn, vi khuẩn hiện diện trên các
lông tơ của chân bụng, chân ngực, chân đuôi, vảy râu, phụ bộ miệng và mang.
Tôm nhiễm nặng, mang xuất hiện màu vàng đến xanh. Vi khuẩn dạng sợi gây cản
trở hô hấp, lột vỏ, bắt mồi, gây chậm lớn hay gây chết tôm. (Từ Thanh Dung,
2008)
2.2.3 Bệnh do sinh vật bám
Nguyên nhân của bệnh này là do Zoothamnium, Epistylis, Vorticella, Acineta,
hoặc các loại Protozoa bám trên vỏ và mang tôm làm tôm stress nếu bị nặng
thường tôm sẽ không thể lột vỏ được. Kiểm tra tôm trong sàn ăn (vó), thấy vỏ
tôm bị bẩn giống như có nhớt bám trên vỏ tôm và nhiều khi thấy có rong là do
tảo bám trên vỏ tôm, vỏ tôm không sạch. Sau khi bị nhiễm bệnh, tôm giảm ăn, từ
từ yếu đi, nằm vùi trong đống bùn ao. Nếu không trị kịp thời tôm sẽ chết vì

nhiễm các tác nhân gây bệnh cơ hội (vi khuẩn). (Viện nghiên cứu nuôi trồng
thủy sản 1). Ở trung Quốc, bệnh này thường nghiêm trọng hơn vào mùa sản xuất
giống. Các loài kí sinh trùng tấn công vào các ao ương, chúng sẽ sinh sản một
cách nhanh chóng và gây chết tôm giống. Nếu gặp môi trường xấu, giàu chất
dinh dưỡng thì tỉ lệ chết có thể lên đến 60-80% (Xianle và Huang, 2003).
2.2.4 Bệnh do dinh dưỡng và môi trường
2.2.4.1 Hội chứng biến dạng phụ bộ (Appendage Deformity Syndrom, ADS)
Theo Kumar et al. (2004) thì đây là bệnh xuất hiện trên tôm càng xanh và cũng
gây ra tỉ lệ chết cao ở vùng Andhra Pradesh, Ấn Độ. Nguyên nhân gây ra bệnh
này có thể do sự thiếu hụt trong khẩu phần ăn, tác giả chứng minh rằng khi gia
tăng hàm lượng carotenoid trong khẩu phần ăn thì bệnh này giảm xuống .
PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version

5
2.2.4.2 Bệnh đen mang
Nguyên nhân gây ra bệnh đen mang là do đáy ao nuôi bị nhiễm bẩn. Khi kiểm
tra thấy khí độc (Ammonia) ở đáy ao cao vì có nhiều bùn đáy và vật chất hữu cơ
dư thừa ( thức ăn thừa - do thức ăn nhiều tôm ăn không hết, từ tảo chết v.v ).
Bệnh này thường xuất hiện trong ao nuôi với mật độ cao, trong ao nuôi theo hệ
thống không thay nước hoặc ít thay nước. Khi tôm mắc bệnh mang xuất hiện
màu đen và đôi lúc có các chất hữu cơ hoặc vô cơ bám vào mang tôm. Nếu
không xử lý kịp thời sẽ làm tôm nhiễm bệnh từ vi khuẩn. Bình thường bệnh đen
mang xảy ra lúc tôm lớn (tôm được hai tháng rưỡi tới ba tháng trở lên). (Viện
nghiên cứu nuôi trồng thủy sản 1)
2.2.4.3. Bệnh tôm trắng (White Prawn Disease, WPD)
Dấu hiệu đặc trưng của bệnh này là có những đốm màu trắng đục trên lớp vỏ
ngoài nhưng cơ thì bình thường và WPD thường xảy ra trên tôm trưởng thành
(Delves-Broughton and Poupard, 1976). Tuy nhiên bệnh này có ảnh hưởng rất
thấp trong ao nuôi. Ở Thái Lan, vấn đề dinh dưỡng được xem là nguyên nhân gây
ra bệnh này (trích dẫn bởi Nguyễn Kim Cương, 2006).

2.3 Sơ lược về bệnh đục cơ
2.3.1 Dấu hiệu bệnh lý
Hậu ấu trùng nhiễm bệnh đục cơ có trạng thái lờ đờ, giảm ăn và phần cơ bụng có
màu trắng đục. Vùng đuôi (telson) bị đục trước và hiện tượng đục thân này tấn
công dần lên phần đầu của tôm. Sau cùng, tất cả các vùng cơ thuộc phần bụng và
phần đầu ngực đều bị tấn công có thể quan sát rõ các vết đục dưới ánh nắng mặt
trời, tôm bệnh nặng mang chuyển màu trắng đục vỏ mềm, khi luộc chính có màu
hồng nhợt nhạt. Tỉ lệ chết cao, tối đa là 95% nhưng không đồng nhất. (Bùi Quang
Tề và ctv, 2004).
2.3.2 Tác nhân
Tác nhân của đục cơ (White tail disease- WTD hay còn gọi là bệnh đuôi trắng)
hiện nay còn nhiều tranh luận. Theo Winton Cheng và Jiann- Chu Chen (1998-
2001) thì tác nhân là do cầu khuẩn Lactococcus garvieae (Enterococcus
seriolicida). Là vi khuẩn gram (+), có dạng hình cầu hay hình trứng, phát triển ở
10-40
o
C, độ muối thích hợp là 0.5-6ppt, pH=9.6.Theo phân lập của viện nghiên
cứu nuôi trồng thủy sản 1 ở một mẫu tôm càng xanh bị bệnh đục cơ tại Hải
PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version

6
Phòng, đã phân lập được cầu khuẩn gram (+) và trực khuẩn dung huyết mạnh,
gram(-) (Bùi Quang Tề và ctv 2004).
Nhưng hiện nay lại có nhiều báo cáo cho là có 2 loại virut: MrNV (
Macrobrachium rosenbergii Nodavirus) và XSV (Extra small virus) gây ra bệnh
trắng đuôi xảy ra ở trại ương và ao nuôi ở Ấn Độ, Trung Quốc, Đài Loan. Cả hai
loài virus này được phân lập từ tôm càng xanh có dấu hiệu bệnh đục cơ. Tuy
nhiên, khả năng gây bệnh của hai loài virus này thì vẫn còn trong quá trình
nghiên cứu (Hameed, 2005). Mặt khác Wang và ctv (2007) đã xác định tác nhân
gây bệnh đục cơ là M. rosenbergii nodavirus (MrNV) và extra small virus (XSV).

2.3.3 Phân bố và lan truyền bệnh
2.3.3.1 Thế giới
Bệnh đục cơ (White muscle disease) còn được gọi là bệnh trắng đuôi (White tail
disease) ở tôm Càng Xanh (Macrobrachium rosenbergii) là một trong những
bệnh gây thiệt hại nghiêm trọng cho người sản xuất giống cũng như người nuôi
tôm thương phẩm. Bệnh được mô tả lần đầu tiên vào năm 1997 và đến nay đã
xuất hiện ở một số quốc gia trong khu vực châu Á (Bùi Việt Hùng).
Bệnh đục cơ do virus gây ra được báo cáo đã xuất hiện ở các nước như: Trung
Quốc, Đài Loan, Ấn độ và vùng Caribbean (Cộng hoà Dominican, French West
Indies). Tại Thái Lan, bệnh đục cơ được biết là gây tỉ lệ chết cao ở tôm càng xanh
giai đoạn hậu ấu trùng, dao động trong khoảng 30-100%. Tôm càng xanh sau khi
chuyển sang giai đoạn hậu ấu trùng được 2-3 ngày có dấu hiệu bị đục cơ. Tỉ lệ
chết bắt đầu xuất hiện và có khả năng gây chết đến 100% trong vòng 5 ngày kể từ
khi phát hiện có tôm mang dấu hiệu đục cơ.(Hameed, 2005) Ngoài ra, tại Trung
Quốc, Đài Loan tỷ lệ nhiễm đục cơ từ 30- 75% ở các ao nuôi tôm càng xanh
(Macrobrachium rosenbergii). (Bùi Quang Tề và ctv, 2004).
Khoảng giữa tháng một đến tháng 3 năm 2006, bệnh đục thân được biết có sự
hiện diện trên tôm càng xanh bột và giống tại các trại nuôi, ương ở Kaohsiung và
Pingtung thuộc miền nam Đài Loan. (Hsieh và ctv, 2006)
2.3.3.2 Việt Nam
Ở Việt Nam, đục cơ cũng đã xuất hiện một vài năm nay từ năm 2000 khi nhập
tôm càng xanh bột có nguồn gốc từ Trung Quốc về Thanh Trì-Hà Nội, đã có hiện
tượng tôm đục cơ và chết hàng loạt. Đầu năm 2002, đàn tôm bố mẹ 5-6 tạ của
một trại sản xuất tôm giống ở Hải Phòng đã bị đục cơ. Sau khi cho nở ấu trùng và
PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version

7
ương thành tôm bột, tỷ lệ sống rất thấp chỉ đạt khoảng 1%. Tháng 5/2002, một số
ao nuôi tôm càng xanh ở Thanh Trì, Hà Nội thả giống cỡ 0.2g/con nuôi sau 15-
20 ngày tôm đã xuất hiện bệnh đục cơ và chết rải rác. Tỷ lệ nhiễm bệnh trong đàn

tôm nuôi ở Thanh Trì từ 6-90%. (Đỗ Thị Hòa và ctv, 2004)
Riêng ở Thành Phố Cần Thơ, từ năm 2004 đến nay hiện trạng về đục cơ ngày
càng gia tăng. Năm 2004 bệnh đục cơ đã gây thiệt hại 10 ha diện tích nuôi tôm
càng xanh ở Cờ Đỏ và gây hao hụt từ 60-70%. Năm 2005, bệnh đục cơ gây thiệt
hại một số mô hình nuôi ở Cờ Đỏ, mức độ hao hụt từ 70-100% (Theo thông tin
ghi nhận từ 1 số hộ nuôi ở Cờ Đỏ). Từ đầu năm 2006 đến nay, tình hình bệnh đục
cơ lại xuất hiện ở một số trại giống trên địa bàn Thành phố Cần Thơ gây hao hụt
lớn cho các ao nuôi thịt và tỷ lệ hao hụt lên đến 70-100% sau 1 tuần thả nuôi.
2.3.4 Các biện pháp phòng trị bệnh đục cơ do vi khuẩn
Phòng bệnh: không để tôm bị sốc vì môi trường nuôi xấu; nhiệt độ trong ao để
biến thiên trong ngày quá 3
0
C, thiếu oxy vào buổi sáng, pH=7.5-8.5;
H
2
S=0,01mg/l. Bón vôi CaCO
3
với liều lượng 1-2kg/100m
3
nước ao. Cho ăn
vitamin C với liều lượng 2-3g/kg thức ăn, mỗi tháng 2 đợt, mỗi đợt 1 tuần (Bùi
Quang Tề và ctv, 2004)
Trị bệnh: cho ăn một số kháng sinh Amikacin hoặc Ciprofloxancin liều lượng
100mg/kg tôm/ngày thứ 1 và từ ngày thứ 2-7 cho ăn liều 50mg/kg tôm/ngày. (Bùi
Quang Tề và ctv, 2004).
2.4 Sơ lược về vi khuẩn gây bệnh trên tôm
2.4.1 Đặc điểm vi khuẩn Aeromonas
Aeromonas hydrophila thuộc họ Aeromonadaceae có tiên mao nên có khả năng di
đông, gram âm, dạng hình que ngắn, kích thước 0,5x1,0-1,5µm, hai đầu hơi tròn,
yếm khí tùy tiện, có phản ứng Cytochrom oxidase dương tính, có khả năng khử

nitrat, không mẫn cảm với Vibriostat 0/129 (Bùi Quang Tề và ctv, 2004).
Giống Aeromonas là loài vi khuẩn phân bố rộng trong môi trường, cả ở nước ngọt
và nước lợ, có trong cơ thể cá và động vật không xương sống. Có một vài báo cáo
Aeromonas có tiềm năng gây bệnh trên con người (Deodhar et al., 1991) (Từ
Thanh Dung và ctv.,2005).
2.4.2 Đặc điểm vi khuẩn Vibrio
Vibrio spp. thuộc họ Vibrionaceae là vi khuẩn gram (-), dạng hình que hay hình
dấu phẩy, kích thước tế bào từ 0,3–0,5x1,4–2,6µm, có khả năng di chuyển nhờ
PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version

8
tiên mao. Hầu hết vi khuẩn thuộc giống này đều cho phản ứng Oxydase dương
tính, có khả năng lên men, oxy hóa trong môi trường O/F glucose, không có khả
năng sinh H
2
S và mẫn cảm với Vibriostat (O/129). Dựa vào màu sắc khuẩn lạc
trên môi trường chọn lọc Thiosulphate citrate bile salt agar (TCBS) Vibrio spp.
được chia thành 2 nhóm: nhóm có khả năng lên men đường sucrose có khuẩn lạc
màu vàng, nhóm không lên men đường sucrose có khuẩn lạc màu xanh lá
cây.(Bùi Quang Tề và ctv, 2004)
2.4.3 Đặc điểm vi khuẩn Pseudomonas
Pseudomonas spp. là vi khuẩn gram âm, hình que, kích thước 0,5–1x1,5–5µm,
phát triển trên môi trường đơn giản vá hiếu khí. Đa số các loài thuộc nhóm này có
phản ứng oxy hóa hoặc một số ít không oxy hóa và không lên men trong môi
trường O/F glucose. Giới hạn nhiệt độ từ 4-43
o
C. Phân bố khắp nơi trong môi
trường, trong đất và trong nước. Có loài phân bố ở nước ngọt: Pseudomonas
flourescens và loài phân bố nước ở biển: Pseudomonas anguilliseptica,
Pseudomonas chlororaphus. (Bùi Quang Tề và ctv, 2004)

2.4.4 Đặc điểm cầu khuẩn Lactococcus garvieae
Cầu khuẩn Lactococcus garvieae hay còn gọi là Enterococcus seriolicida. Là
các vi khuẩn gram (+), có dạng hình cầu hay hình trứng. Vi khuẩn phát triển ở
nhiệt độ 10-40
0
C, độ muối thích hợp 0,5-6,0 %o, pH 9,6 (theo Winton Cheng,
Jiann-Chu Chen, 1998-2001 được trích dẫn bởi Bùi Quang Tề và ctv, 2004)
2.5 Các nghiên cứu về sự kháng thuốc của vi khuẩn gây bệnh trên động vật
thủy sản
Ở Chille, Miranda et al. (2003) đã tìm ra 25 chủng vi khuẩn khác nhau đã kháng
với Oxytetraxyline từ 4 nông trại nuôi cá. Ở ĐBSCL đã phân lập được 169 dòng
vi khuẩn từ các ao nuôi thủy sản và thử với 6 loại kháng sinh và kết quả cho thấy
2% kháng với Chloramphenicol, có 59% dòng vi khuẩn kháng với 4 hay 5 loại
kháng sinh trong đó có Chloramphenicol. Có 34% kháng nhiều loại kháng sinh
như Chloramphenicol, Ampicilline, Tetracyline, Trimethoprim +
Sulfamchoxazole, Nitrofurantion (Đặng Thị Hoàng Oanh và ctv., 2005).
Kết quả kháng sinh đồ của 26 trong số 27 dòng vi khuẩn phát sáng được thử với 6
loại thuốc kháng sinh thường dùng trong nuôi thủy sản cho thấy 100% số dòng vi
khuẩn thử nghiệm kháng với ampicilin. Các dòng vi khuẩn phát sáng thử nghiệm
mẫn cảm với chloramphenicol, norfloxacin và nitrofurantoin hơn so với
tetracycline và trimethoprim/sulfamethoxazole. Phần lớn các dòng vi khuẩn thử
PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version

9
nghiệm chỉ kháng với một loại kháng sinh (77%). Có khoảng 15% dòng vi khuẩn
kháng với 2 loại kháng sinh, và 4% kháng với 4 loại thuốc được thử. Có 4% số
dòng vi khuẩn kháng với cả 6 loại kháng sinh thử nghiệm.(Đặng Thị Hoàng Oanh
và ctv, 2006).
Gần đây, Pender et al. (2008) đã nghiên cứu sự kháng thuốc của Aeromonas phân
lập từ môi trường nước của các ao nuôi cá da trơn, cá chình và trại sản xuất giống

ở Hà Lan. Kết quả cho thấy sự kháng thuốc của Aeromonas như sau: ampicilin
và oxytetracyclin là 100%, sulfamethoxazole 24%, trimethoprim 3% và
ciprofloxacin và chloramphenicol là 0%.
Năm 1988, khảo sát sự kháng thuốc kháng sinh Tetracycline và Oxytetracycline
của vi khuẩn Aeromonas gây bệnh trên cá nheo Mỹ (Ictalurus punctatus) thì đã
phân lập được 146 dòng vi khuẩn của giống Aeromonas trong đó thì có 89 dòng
vi khuẩn kháng với Oxytetracycline chiếm 61% và 32 dòng vi khuẩn kháng với
Tetracycline chiếm 22% (Depaola et al., 1988). Và đến năm 2006 thì Mohamed
et al., (2006) đã phân lập được 81 dòng vi khuẩn thuộc giống Aeromonas đã
kháng với Tetracycline. Qua kết quả cho thấy sự kháng thuốc của vi khuẩn đã
tăng lên về số lượng chủng vi khuẩn kháng và loại kháng sinh bị kháng. Waltman
and Shotts (1986) đã kiểm tra sự kháng thuốc trên 118 chủng vi khuẩn E. ictaluri
phân lập được ở Mỹ với 37 loại kháng sinh. Kết quả nghiên cứu cho thấy, đa số
các vi khuẩn gram âm nhạy với hầu hết các loại thuốc đã thí nghiệm. Tuy nhiên,
hơn 90% số chủng vi khuẩn kháng với colistin và sulfamid. Khi được kiểm tra sự
nhạy cảm tự nhiên đối với 71 loài kháng sinh của 102 dòng vi khuẩn Edwarsiella
(trong đó có 41 chủng E. ictaluri) cho rằng tất cả các dòng Edwarsiella đều nhạy
cảm tự nhiên với nhóm kháng sinh tetracycline, β-lactamin, quinolone,
chloramphenicol, nitrofurazion… Đồng thời tất cả các chủng đều kháng tự nhiên
với nhóm kháng sinh macrolid và kháng sinh oxonilic acid ( Stock et al., 2001).
Đối với bệnh mủ gan trên cá tra nuôi ở Việt Nam thì vi khuẩn phân lập được từ cá
bệnh và được định danh là E. ictaluri và cũng đã được nghiên cứu sự kháng thuốc
của loài vi khuẩn này. Kết quả nghiên cứu cho thấy loài vi khuẩn này thể hiện
tính đề kháng và đa kháng với các loại kháng sinh thường được sử dụng trong
điều trị bệnh. Tuy nhiên, số lượng, tỷ lệ chủng đề kháng và loại kháng sinh bị
kháng khá khác nhau theo địa phương có bệnh xảy ra (Nguyễn Hữu Thịnh và
Trương Thanh Loan., 2007) điều này cũng phù hợp với, một nghiên cứu của
Crumlish et al. (2002). Kết quả nghiên cứu này cho rằng Vi khuẩn E. ictaluri
phân lập trên cá tra nuôi thuộc tỉnh An Giang thì chỉ kháng với Oxolinic acid
PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version

10
trong khi vi khuẩn được phân lập từ cá nuôi thuộc tỉnh Cần Thơ thì lại cho kết
quả kháng với oxytetracyclin và sulphomamid. Đồng thời, cùng với sự nghiên
cứu của Depaola et al. (1995) còn cho thấy số lượng và tỉ lệ chủng đề kháng khác
nhau theo mùa vụ nuôi. Ngoài ra, thì sự kháng kháng sinh cũng rất khác nhau
giữa các loài vi khuẩn gây bệnh ví dụ như sự kháng Aminoglycoside của E. coli
được phân lập vào mùa xuân thì cao hơn các loài khác (Depaola et al., 1995).
Theo một điều tra của Mattyar et al. (2004) sự kháng thuốc của vi khuẩn còn khác
nhau tùy theo vị trí phân lập được chúng. Kết quả từ nghiên cứu cho thấy vi
khuẩn phân lập từ mang của cá thì đã kháng với 7 loại kháng sinh trong khi vi
khuẩn phân lập được trong nội tạng thì chỉ kháng với 5 loại kháng sinh.



PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version

11
PH
ẦN III
VẬT LIỆU & PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
3.1 Thời gian và địa điểm nghiên cứu
3.1.1 Thời gian thực hiện
Từ tháng 03/2009 đến tháng 05/2009
3.1.2 Địa điểm
Phòng thí nghiệm, khoa thủy sản – Đại Học Cần Thơ.
3.2 Nội dung thực hiện
- Xác định chỉ tiêu sinh hóa bằng kit API 20E.
- Lập kháng sinh đồ
3.3. Vật liệu nghiên cứu

3.3.1 Dụng cụ
- Đèn cồn, bình xịt cồn, que cấy, giấy vệ sinh, cốc thủy tinh, bút lông dầu,
cân, thước đo, pipet, micropipette, hộp đầu col, đầu col, đĩa Petri, ống
nghiệm, chai nấu, ống nhỏ giọt, môi trường, kính hiển vi, máy ảnh, bút chì,
sổ ghi chép.
- Tủ ấm, tủ cấy vi khuẩn, tủ lạnh, nồi autoclave, tủ sấy.
3.3.2 Hóa chất và môi trường
- Môi trường nuôi cấy vi khuẩn: NA (Nutrient agar), Rimler – shotts ,
TCBS agar, môi trường OF(oxidation- fermentation medium)
-
Nước cất, muối NaCl, cồn tuyệt đối, dầu paraffin, glucose, BaCl
2
, H
2
SO
4
- Các hóa chất môi trường test sinh hóa: H
2
O
2
, giấy test oxydase thương
mại, vaselin.
- Bộ kit API 20E, ống McFarland 3.
- Các loại đĩa thuốc kháng sinh thương mại ( Oxoid, Biorad) dùng trong
nghiên cứu kháng sinh đồ: Flofenicol (30µg), Oxolinic acid (2µg),
Amoxycillin (25µg), Doxycycline (30µg), Ciprofloxacin (5µg),
Norfloxacin ( 10µg), Streptomycin (10µg), Colistin (50µg); đĩa 0/129
(150µg).
- Hóa chất nhuộm gram:
PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version

12
o Dung dịch 1: crystal violet, ethanol 95 %, ammonium oxalate, nước
cất.
o Dung dịch 2: iodine, potassium iodide, nước cất.
o Dung dịch 3: 95% ethanol:5% acetone.
o Dung dịch 4: safranin, ethanol 95%, nước cất.
3.3.3 Đối tượng nghiên cứu.
Những chủng vi khuẩn phân lập từ huyết tương tôm càng xanh (Macrobrachium
rosenbergii) bị bệnh đục cơ.
Bảng 3.1: Nguồn gốc các chủng vi khuẩn nghiên cứu
STT Kí hiệu mẫu
Nguồn gốc
phân lập
Địa điểm thu
Kết quả
định danh
1 P
2
P
2
N
3
M. rosenbergii Khu 2-Nông trường sông Hậu-CT Aeromonas
2 P
2
P
2
N
12

M. rosenbergii Khu 2-Nông trường sông Hậu-CT Aeromonas
3 P
2
P
1
N
6
M. rosenbergii Khu 2-Nông trường sông Hậu-CT Aeromonas
4 P
2
P
2
N
10
M. rosenbergii Khu 2-Nông trường sông Hậu-CT Aeromonas
5 P
2
P
2
N
17
M. rosenbergii Khu 2-Nông trường sông Hậu-CT Aeromonas
6 P
2
P
1
N
3
M. rosenbergii Khu 2-Nông trường sông Hậu-CT Aeromonas
7 P

2
P
2
N
13
M. rosenbergii Khu 2-Nông trường sông Hậu-CT Aeromonas
8 P
2
P
2
N
11
M. rosenbergii Khu 2-Nông trường sông Hậu-CT Aeromonas
9 P
2
P
2
N
14
M. rosenbergii Khu 2-Nông trường sông Hậu-CT Aeromonas
10 P
2
P
2
N
16
M. rosenbergii Khu 2-Nông trường sông Hậu-CT Aeromonas
11 P
2
P

2
N
15
M. rosenbergii Khu 2-Nông trường sông Hậu-CT A. hydrophila
12 P
13
b
1
N
1
M. rosenbergii Thới Lai-Cần Thơ Aeromonas
13 P
2
P
1
N
9
M. rosenbergii Khu 2-Nông trường sông Hậu-CT Enterobacter
14 P
2
P
1
N
12
M. rosenbergii Khu 2-Nông trường sông Hậu-CT Enterobacter
15 P
2
P
1
N

4
M. rosenbergii Khu 2-Nông trường sông Hậu-CT Enterobacter
16 P
2
P
2
N
1
M. rosenbergii Khu 2-Nông trường sông Hậu-CT Pantoea
17 P
2
P
2
N
4
M. rosenbergii Khu 2-Nông trường sông Hậu-CT -
18 P
2
P
1
N
1
C M. rosenbergii Khu 2-Nông trường sông Hậu-CT -
19 P
6
M
1
N
3
M. rosenbergii Thới Lai-Cần Thơ -

20 P
6
M
1
N
4
M. rosenbergii Thới Lai-Cần Thơ -
21 P
6
M
1
N
12
M. rosenbergii Thới Lai-Cần Thơ -
22 P
3
P
1
N
16
M. rosenbergii Khu 2-Nông trường sông Hậu-CT -
23 P
3
P
2
N
4
M. rosenbergii Khu 2-Nông trường sông Hậu-CT -
24 P
3

P
2
N
14
M. rosenbergii Khu 2-Nông trường sông Hậu-CT -
25 P
3
P
1
N
10
M. rosenbergii Khu 2-Nông trường sông Hậu-CT -
26 P
6
M
1
N
10
M. rosenbergii Thới Lai-Cần Thơ -
27 P
6
M
1
N
16
M. rosenbergii Thới Lai-Cần Thơ -
28 P
3
P
2

N
13
M. rosenbergii Khu 2-Nông trường sông Hậu-CT -
29 P
3
P
1
N
18
M. rosenbergii Khu 2-Nông trường sông Hậu-CT -
30 P
3
P
2
N
19
M. rosenbergii Khu 2-Nông trường sông Hậu-CT -
CT: Cần Thơ
PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version

13
3.4 Phương pháp nghiên cứu
3.4.1 Phương pháp xác định chỉ tiêu sinh hóa
- Xác định hình dạng, kích thước, màu sắc khuẩn lạc, tính ròng .
- Thực hiện các test cơ bản: nhuộm gram, di động, Oxidase, Catalase, O/F.
Phương pháp thực hiện được trình bày chi tiết ở phần phụ lục .
- Định danh bằng kit API 20E theo hướng dẫn của nhà sản xuất
(BioMerieux)
o Cho một ít nước cất hoặc nước máy vào trong khay nhựa của bộ kit để
giữ ấm trong quá trình ủ trong tủ ấm.

o Đặt kit API vào khay nhựa
o Chuẩn bị dung dịch vi khuẩn: dùng que cấy tiệt trùng lấy một ít khuẩn
lạc cho vào 5 ml nước muối sinh lý hoặc nước cất tiệt trùng lắc trộn
đều.
Các bước thực hiện:
o Dùng dung dịch vi khuẩn cho vào đầy các ô CIT, VP và GEL.
o Tương tự chi vi khuẩn vào đầy phần tuýp các ô ADH, LCD, ODC, H
2
S
và URE, kế tiếp cho dầu paraffin vào đầy phần lõm các ô này.
o Tiếp theo dùng dung dịch vi khuẩn cho vào đầy phần tuýp các ô còn
lại.
o Đậy nắp khay và ủ trong tủ ấm ở 26-28
o
C
o Đọc kết quả sau 24-48 giờ
- Đọc kết quả:
- Kiểm tra và ghi nhận các chỉ tiêu không cần thêm thuốc thử.
- Kiểm tra kết quả test API 20E
- Các chỉ tiêu cần thêm thuốc thử:
- Cho một giọt thuốc thử TDA vào ô TDA, đọc kết quả sau vài giây.
- Cho một gọt thuốc thử IND vào ô IND, đọc kết quả sau vài giây.
- Cho một giọt thuốc thử VP1 sau đó cho tiếp giọt thuốc thử VP2 vào ô
VP, đọc kết quả sau 10-15 phút.
PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version

14
- Trước khi đọc kết quả , bộ kit API 20E phải đạt tối thiểu 3 chỉ tiêu cho kết
quả dương tính. Ngược lại cần ủ mẩu thêm vài giờ.
- Sau khi cho thuốc thử vào thì đậy nắp khay nhựa lại.

- Khi đã cho thuốc thử vào các chỉ tiêu rồi thì không nên ủ lại trong tủ ấm
Bảng 3.2: Đọc kết quả bộ kit API 20E.















3.4.2 Phương pháp lập kháng sinh đồ
Phương pháp làm kháng sinh đồ nhóm vi khuẩn bằng phương pháp Kirbry-Bauer
(1966), sử dụng môi trường NA (Nutrient Agar), chọn 8 loại kháng sinh: (Oxoid,
Biorad) dùng trong nghiên cứu kháng sinh đồ: Flofenicol (FFC,30µg), Oxolinic
acid (2µg), Amoxycilin (25µg), Doxycycline (30µg), Ciprofloxacin (5µg),
Norfloxacin ( 10µg), Streptomycin (10µg), Colistin (50µg).
Chỉ tiêu Âm tính Dương tính
ONPG Không màu Vàng
ADH Vàng Đỏ/cam
LDC Vàng Đỏ/cam
ODC Xanh nhạt/vàng Xanh lá/xanh
CIT Không màu/xám nhạt Vệt đen mãnh
H

2
S Vàng Đỏ/cam
URE Vàng Nâu đỏ nhạt
TAD Xanh nhạt/vàng Hồng
IND Không màu Hồng/đỏ
VP Không có màu đen Khuyếch tán màu đen
GEL Xanh/xanh lá Vàng
GLU Xanh/xanh lá Vàng
MAN Xanh/xanh lá Vàng
INO Xanh/xanh lá Vàng
SOR Xanh/xanh lá Vàng
RHA Xanh/xanh lá Vàng
SAC Xanh/xanh lá Vàng
MEL Xanh/xanh lá Vàng
AMY Xanh/xanh lá Vàng
ARA Xanh/xanh lá Vàng
PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version

15

Bảng 3.3: Đường kính chuẩn vòng vô trùng chủng E.coli LMG8223 (theo
NCCLS - National Committee Clinical Laboratory Standard, 1998 & 2004).

Thuốc kháng sinh Đường kính vòng vô trùng (mm)
Kháng

TB nh
ạy

Nh

ạy

Streptomycin (S, 10µg) ≤11 12 – 14 ≥15
Colistin (Cs, 10µg)

≤ 8

9
–

10

≥11

Norfloxacin(Nor,10ppm)

≤12

13
–

16

≥17

Flofenicol (Ffc,30µg)

≤16

17

–

19

≥20

Oxolinic acid (O, 2µg)

≤10


–


≥11

Amoxycillin (Amx, 30µg)

≤16

17
–

19

≥20

Doxycycline (Do, 30
µg)

≤12

13
–

15

≥16

Ciprofloxacin (Cip, 5µg) ≤15 16 – 20 ≥21

Các bước lập kháng sinh đồ theo phương pháp của Kirbry-Bauer (1966)
Phương pháp xác định mật số vi khuẩn dựa vào ống chuẩn McFarland số 3
Vi khuẩn sau khi được phục hồi và tách ròng đến thuần thì tiến hành kiểm tra
kháng sinh đồ.
Dùng que cấy tiệt trùng lấy khuẩn lạc trên đĩa vi khuẩn cho vào ống nghiệm chứa
5 ml nước muối sinh lý (0,85% NaCl) đã tiệt trùng. Trộn đều và so sánh độ đục
với ống chuẩn McFarland số 3 (9,7 ml 1% H
2
SO
4
và 0,3 ml 1% BaCl
2
). Nếu độ
đục thấp hơn ống chuẩn McFarland thì tiếp tục cho khuẩn lạc vào, ngược lại nếu
độ đục cao hơn thì cho thêm nước muối sinh lý vào cho đến khi độ đục ngang
bằng với ống chuẩn McFarland. Khi đó mật vi khuẩn trong ống nghiệm vào
khoảng 9x10
8
cfu/ml.

Sau khi đã xác định mật số vi khuẩn thì tiến hành cho vi khuẩn lên môi
trường thạch
Cách trãi dung dịch vi khuẩn: dùng pipet tiệt trùng hút 0,1ml dung dịch vi khuẩn
cho lên môi trường thạch NA. Dùng que trãi thủy tinh trãi đều đến vừa khô. Sau
đó để yên khoảng 1 phút rồi dùng pel tiệt trùng lấy đĩa thuốc kháng sinh đặt vào
đĩa Petri sao cho khoảng cách giữa 2 tâm của các đĩa thuốc kháng sinh khoảng 24
mm và khoảng cách giữa tâm đĩa kháng sinh với mép đĩa Petri 10-15 mm. Mỗi
đĩa Petri (Ө 100 cm) môi trường đặt tối đa 6 đĩa kháng sinh.
PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version

16
Đọc kết quả
Đo đường kính vòng vô trùng (mm) dựa vào chuẩn đường kính vòng vô trùng
theo NCCLS (National Committee Clinical Laboratory Standard, Bảng 3.3) để
xác định loại kháng sinh nhạy, trung bình nhạy và kháng.

PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version

17
PHẦN VI
KẾT QUẢ THẢO LUẬN

4.1 Kết quả định danh vi khuẩn bằng bộ kit API 20E
Các chủng vi khuẩn sau khi phục hồi từ tủ -80°C được kiểm tra tính ròng qua kết
quả nhuộm gram và các chỉ tiêu cơ bản gồm hình dạng, khả năng di động,
oxidase, catalase và O/F.
Aeromonas
Kết quả định danh vi khuẩn Aeromonas được thể hiện ở Bảng 4.1. Nhóm này
gồm có 12 chủng, trong đó 1 chủng là Aeromonas hydrophila (P
2

P
2
N
15
) còn lại
11 chủng chỉ định danh được đến giống. Từ Bảng 4.1, ta thấy tất cả các chủng
đều có dạng hình que, gram âm (Hình 4.1), dương tính với oxidase, catalase, có
khả năng di động, có khả năng lên men trong môi trường O/F glucose (Hình 4.2)
(trừ chủng P10: P
2
P
2
N
16
).



Hình 4.1: Hình nhuộm gram của vi khuẩn Aeromonas

Ngoài ra, vi khuẩn sau khi tách ròng đều cho khuẩn lạc dạng tròn, hơi nhô trên
mặt thạch agar, có màu vàng kem nhạt trên môi trường NA (Nutrient agar) và
màu vàng trên môi trường đặc trưng Aeromonas agar (Hình 4.3), đồng thời kháng
với 0/129. (Bảng 4.1 và Hình 4.4). Từ kết quả sinh hóa bằng API 20E (Bảng 4.1),
tất cả các chủng đều có khả năng phân giải arginine, sinh indol và sử dụng
glucose nhưng không có khả năng sử dụng H
2
S, inositol, urea, không có khả năng
phân giải ornithin. Đặc biệt hầu hết các chủng đều chỉ sử dụng 2-3 loại
đường.(Hình 4.5). Riêng chỉ có 2 chủng P5 và P9 sử dụng nhiều loại hơn các

PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version

18
chủng còn lại (glucose, mantose, sorbitol, rhamnose, sucrose, melibiose,
arabinose).
Bảng 4.1 Các chỉ tiêu sinh lý và kết quả kiểm tra sinh hóa bằng kit API 20E
Ghi chú: (+): phản ứng dương tính; (-): phản ứng âm tính; d: phản ứng thay đổi; k:
kháng; q: hình que.
ONPG: Ortho-nitrophenyl galactosidase; ADH: Arginine; LDC: Lysine; ODC:
Ornithine; CIT: Sodium sitrate; H
2
S: sinh H
2
S; URE: Urea; TDA: L-
Tryptophane; IND: Indole; VP: phản ứng Voges-Proskauer; GEL: Gelatin;
GLU: Glucose; MAN: Manitol; INO: Inositol; SOR: Sorbitol; RHA:
Rhamnose; SAC: Sucrose; MEL: Melibiose; AMY: Amygdalin: ARA:
Arabinose.Từ P1 – P12: các chủng vi khuẩn
P1: P
2
P
2
N
3
P7: P
2
P
2
N
13

P2: P
2
P
2
N
12
P8: P
2
P
2
N
11

P3: P
2
P
1
N
6
P9: P
2
P
2
N
14

P4: P
2
P
2

N
10
P10: P
2
P
2
N
16
P5: P
2
P
2
N
17
P11: P
2
P
2
N
15

P6: P
2
P
1
N
3
P12: P
13
b

1
N
1
Chỉ tiêu
Chủng vi khuẩn
P1 P2 P3 P4 P5 P6 P7 P8 P9 P10 P11 P12
Gram - - - - - - - - - - - -
Hình dạng q q q q q q q q q q q q
Di động + + + + + + + + + + + +
Oxidase + + + + + + + + + + + +
Catalase + + + + + + + + + + + +
O/F -/+ -/+ +/+ +/+ -/+ +/+ -/+ +/+ +/+ +/- +/+ +/+
O/129 k k k k k k k k k k k k
ONPG + + + + + + - + - + + +
ADH + + + + + + + + + + + +
LDC + + + + + + - + - + + +
ODC - - - - - - - - - - - -
CIT + + + - + + - - - + + +
H
2
S - - - - - - + - - - - -
URE - - - - - - - - - - - -
TAD + + + - + + + + - + - +
IND + + + + + + + + + + + +
VP + + + + + + + + - + - +
GEL + + + + + + - + + + + +
GLU + + + + + + + + + + + +
MAN + + + + + + - + + + + +
INO - - - - - - - - - - - -
SOR - - - - + - - - + - - -

RHA - - - - + - - - + - - -
SAC + + + + + + - + + - - -
MEL - - - - + - - - + - - +
AMY - - - + - + - + - + d -
ARA + - - - + - + - + + - d
PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version