ảnh hưởng của dipterex lên các chỉ tiêu sinh hóa của cá tra giống (pangasianodon hypophthalmus) nuôi trong điều kiện thí nghiệm

TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ
KHOA THỦY SẢN








NGUYỄN THỊ CÀ SUM







ẢNH HƯỞNG CỦA DIPTEREX LÊN CÁC CHỈ TIÊU
SINH HÓA CỦA CÁ TRA GIỐNG (Pangasianodon
hypophthalmus) NUÔI TRONG ĐIỀU KIỆN THÍ NGHIỆM

LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC
CHUYÊN NGÀNH BỆNH HỌC THỦY SẢN








2009





TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ
KHOA THỦY SẢN






NGUYỄN THỊ CÀ SUM

ẢNH HƯỞNG CỦA DIPTEREX LÊN CÁC CHỈ TIÊU
SINH HÓA CỦA CÁ TRA GIỐNG (Pangasianodon
hypophthalmus) NUÔI TRONG ĐIỀU KIỆN THÍ NGHIỆM





LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC
CHUYÊN NGÀNH BỆNH HỌC THỦY SẢN






CÁN BỘ HƯỚNG DẪN
PGs. Ts. NGUYỄN THANH PHƯƠNG
Ts. HUỲNH THỊ TÚ








2009

LỜI CẢM TẠ


Em xin chân thành cảm ơn thầy PGs.Ts Nguyễn Thanh Phương, trưởng
khoa Thủy Sản trường Đại Học Cần Thơ và cô Ts Huỳnh Thị Tú đã quan
tâm, giúp đỡ và tạo điều kiện tốt nhất cho em trong suốt thời gian học tập
cũng như thực hiện đề tài này.
Xin chân cảm ơn cô Ts Đỗ Thị Thanh Hương, trưởng bộ môn Dinh Dưỡng và
Chế Biến Thủy Sản, trường Đại Học Cần Thơ, chị Hà và chị Thùy cùng với
các thầy cô và các anh chị trong bộ môn DD & CBTS đã tận tình dìu dắt,
động viên và chỉ dạy cho em những kinh nghiệm quý báu trong suốt thời gian
qua để thực hiện và hoàn thành luận văn tốt nghiệp này.
Xin chân thành cảm ơn các quý Thầy, Cô đã dạy và truyền đạt cho em những
kiến thức quý báu trong suốt khóa học.
Xin chân thành cảm ơn các bạn trong tập thể lớp Bệnh Học Thủy Sản K31 và
tất cả các bạn bè xung quanh đã giúp đỡ tôi trong thời gian học tập và thực
hiện đề tài này.
Nguyễn Thị Cà Sum

TÓM TẮT

Mục đích của thí nghiệm nhằm tìm hiểu sự biến đổi một số chỉ tiêu sinh hoá
của cá tra (Pangasianodon hypophthalmus) nuôi dưới sự tác động của thuốc
trừ sâu Dipterex trong điều kiện thí nghiệm. Thí nghiệm được bố trí hoàn toàn
ngẫu nhiên và được lặp lại 3 lần với mật độ 70 con/bể 500 L với các nồng độ:
không có Dipterex, 0,01ppm, 0,1ppm, 0,5pm. Các chỉ tiêu sinh hóa của cá
được theo dõi là ChE, CAT, GST và LPO ở cơ, mang, gan và não tại các thời
điểm 0 giờ, 6 giờ, 96 giờ, 14 ngày, 56 ngày. Kết quả cho thấy sau khi cho cá
tiếp xúc với Dipterex đã làm biến động họat tính cả 4 lọai men ChE, CAT,
GST và LPO ở cơ, mang, gan và não của cá tra giai đọan con giống. Dipterex
tác động gây ức chế làm giảm hoạt tính của ChE có ý nghĩa thống kê ở mang
và gan ở tất cả các nghiệm thức ở các thời điểm thu mẫu 6 giờ, 96 giờ, 14
ngày, 56 và không thấy có hiện tượng hồi phục sau 56 ngày. Dipterex cũng
làm giảm có ý nghĩa thống kê họat tính GST ở mang và gan, CAT ở não và
mang và làm tăng LPO ở gan, mang, não của cá. Khi cá tiếp xúc với Dipterex

men ChE ở cá bị ức chế một cách đáng kể, điều này có thể dẫn đến các hiện
tượng ức chế các hoạt động sinh học khác trong cơ thể cá.

























MỤC LỤC
Chương I. Đặt vấn đề 1
Chương II. Lược khảo tài liệu 3

2.1. Đặc điểm sinh học của cá Tra 3
2.1.1. Phân loại 3
2.1.2. Một vài đặc điểm sinh học cá Tra 3
2.1.3. Hình thái 3
2.2. Một số chỉ tiêu sinh hóa và các tác nhân gây nên sự thay đổi của
các chỉ tiêu sinh hóa 4
2.3. Sơ lược về Dipterex 6
2.3.1. Đại cương về Dipterex 6
2.3.2. Một vài tính chất của Dipterex 6
2.3.3. Ứng dụng của Dipterex 7
Chương III. Vật liệu và phương pháp nghiên cứu 8
3.1. Vật liệu nghiên cứu 8
3.2. Phương pháp nghiên cứu 8
3.2.1. Phương pháp bố trí thí nghiệm 8
3.2.2. Phương pháp pha hóa chất 9
3.2.3. Thời gian thu mẫu 10
3.2.4. Phương pháp thu mẫu 10
3.2.5. Phương pháp phân tích mẫu 10
Chương IV. Kết quả và thảo luận 16
4.1. Ảnh hưởng của Dipterex lên hoạt tính của Acetylcholinesterase
(AChE) trong não, mang, ga, cơ của cá Tra giống 16
4.2. Ảnh hưởng của Dipterex lên hoạt tính của Lipid peroxidation (LPO)
trong não, mang, ga, cơ của cá Tra giống 19

4.3. Ảnh hưởng của Dipterex lên hoạt tính của Glutathione-S-
Stransferase (GST) trong mang, gan của cá Tra giống 21
4.4. Ảnh hưởng của Dipterex lên hoạt tính của Catalase (CAT) trong
não, mang của cá Tra giống 22
Chương V. Kết luận và đề xuất 25
5.1. Kết luận 25

5.2. Đề xuất 25
Tài liệu tham khảo 26
Phụ lục 29

DANH SÁCH HÌNH
Hình 2.1. Công thức cấu tạo của Dipterex(Trần Lâm Ban – Đỗ Phổ, 1987) 6
Hình 2.2. Công thức cấu tạo của DDVP (Trần Lâm Ban – Đỗ Phổ, 1987) 7
Hình 3.3. Dipterx dùng trong thí nghiệm 8
Hình 4.4. Biến đổi của hoạt tính của ChE trong mang ở cá Tra qua các lần thu
mẫu 16
Hình 4.4. Biến đổi của hoạt tính của ChE trong não gan ở cá Tra qua các lần
thu mẫu 17
Hình 4.4. Biến đổi của hoạt tính của ChE trong não ở cá Tra qua các lần thu
mẫu 18
Hình 4.4. Biến đổi của hoạt tính của ChE trong cơ ở cá Tra qua các lần thu
mẫu 19
Hình 4.5. Biến đổi của hoạt tính của LPO trong não ở cá Tra qua các lần thu
mẫu 19
Hình 4.5. Biến đổi của hoạt tính của LPO trong mang, gan ở cá Tra qua các
lần thu mẫu 20
Hình 4.5. Biến đổi của hoạt tính của LPO trong gan ở cá Tra qua các lần thu
mẫu 20
Hình 4.6. Biến đổi hoạt tính của GST trong mang của cá Tra qua các lần thu
mẫu 21
Hình 4.6. Biến đổi hoạt tính của GST trong gan của cá Tra qua các lần thu
mẫu 22
Hình 4.7. Biến đổi hoạt tính của CAT trong mang của cá Tra qua các lần thu
mẫu 23

Hình 4.7. Biến đổi hoạt tính của CAT trong não của cá Tra qua các lần thu
mẫu 24







DANH SÁCH BẢNG
Bảng 2.1: Thời gian phân hủy 50% của Dipterex theo pH và nhiệt độ (Trần
Lâm Ban – Đỗ Phổ, 1987) 7
Bảng 3.2. Tiến trình lập đường chuẩn MDA 11
Bảng 3.3 Quy trình phân tích Enym GST 12
Bảng 3.4 Quy trình phân tích Enzym Catalase 13
Bảng 3.5. Quy trình phân tích enzym AChE
Bảng 3.6. Quy trình phân tích Protein 17
1
CHƯƠNG 1
ĐẶT VẤN ĐỀ
Xuất phát từ sự hội tụ những điều kiện tự nhiên thuận lợi, đồng bằng Sông
Cửu Long (ĐBSCL) từ lâu không chỉ là vựa lúa lớn nhất của cả nước mà còn
là khu vực có sản lượng Thủy Sản lớn. Trong những năm gần đây, do nhu cầu
về thực phẩm trên thế giới tăng nhanh cùng với sự phát triển của khoa học kĩ
thuật nên các hoạt động Thủy Sản cũng phát triển rất nhanh. Hiện nay Thủy
Sản đã trở thành một trong những nghành kinh tế mũi nhọn, góp phần quan
trọng trong tổng thu nhập của cả nước.
Cá Tra (Pangasianodon hypophthalmus) là đối tượng nuôi có giá trị xuất khẩu
quan trọng nên phong trào nuôi cá Tra ngày càng phát triển nhanh chóng.
Theo Bộ Nông nghiệp và Phát triển Nông thôn (2008) thì năm 2007 sản lượng

cá Tra, Basa nuôi đã đạt được khoảng 1,2 triệu và kim ngạch xuất khẩu gần 1
tỉ USD. Vì sự phát triển nhanh về diện tích và gia tăng mật độ nuôi cá Tra (từ
20–30 con/m
2
lên đến 50-70 con/m
2
đối với nuôi ao) đã góp phần làm gia tăng
sản lượng, tăng thu nhập, góp phần cải thiện cuộc sống cho người dân.
Tuy nhiên, nghề nuôi cá Tra hiện nay gặp không ít những khó khăn: tình hình
sử dụng thuốc và hóa chất cấm để trị bệnh cho cá Tra nuôi vẫn còn và rất khó
kiểm soát, tình trạng môi trường bị ô nhiễm dẫn đến dịch bệnh xảy ra tràn lan,
giá cả thị trường không ổn định…đã gây ảnh hưởng đến nghề nuôi cá Tra của
nước ta hiện nay. Đa số người dân sử dụng thuốc và hóa chất chủ yếu là theo
kinh nghiệm, ít theo sự hướng dẫn của các cán bộ khuyến ngư. Theo Nguyễn
Chính (2005) thì có đến 59,5% người nuôi sử dụng thuốc theo kinh nghiệm và
đặc biệt là không có người nuôi nào sử dụng hóa chất theo hướng dẫn của cán
bộ thủy sản. Điều này cho thấy tâm lí chủ quan và sự thiếu hiểu biết của người
dân về những ảnh hưởng của thuốc và hóa chất, đặc biệt là hóa chất độc hại đã
bị cấm sử dụng trong nuôi trồng thủy sản đến sức khỏe của cá nuôi, môi
trường và người tiêu dùng. Dipterex hiện nay được dùng khá phổ biến trong
các ao nuôi Cá (đặc biệt là ao nuôi cá Tra) để diệt nấm, giáp xác, giun sán rất
hữu hiệu mà hiện nay chưa có một loại thuốc nào có thể thay thế được. Vì thế
mà người dân vẫn còn sử dụng loại thuốc này để trị bệnh cho cá trong khi đã
có quyết định của Bộ Trưởng bộ Nông nghiệp và Phát triển nông thôn vê việc
ban hành danh mục thuốc bảo vệ thực vật được phép sử dụng, hạn chế sử
dụng, cấm sử dụng ở Việt Nam năm 2005. Trong đó Dipterex là một trong
những loại hóa chất thuộc danh mục thuốc Bảo Vệ Thực Vật cấm sử dụng.
Trước khi có những khuyến cáo cũng như các quy định về việc sử dụng thuốc
và hóa chất thì các nhà quản lý cần có những thông tin cơ bản về tính nghiêm
trọng của việc sử dụng loại hóa chất này lên các ảnh hưởng đến sinh lý, sinh

hóa của cá Tra nuôi. Tuy nhiên các nghiên cứu về ảnh hưởng của hóa chất này
trên đối tượng Cá Tra còn ít. Do vậy mà đề tài “Ảnh hưởng của Dipterex lên
một số chỉ tiêu sinh hóa trong cá Tra (Pangasianodon hypophthalmus)
giống” trở nên rất thiết thực góp phần vào sự bền vững của nghề nuôi cá Tra
2
của nước ta hiện nay theo hướng bảo vệ môi trường, sản xuất ra các sản phẩm
có chất lượng và vệ sinh an toàn thực phẩm.
Mục tiêu đề tài
Xác định sự ảnh hưởng của Dipterex lên sức khỏe của cá Tra (Pangasianodon
hypophthalmus) giống thông qua sự thay đổi của một số chỉ tiêu sinh hóa
trong cơ thể cá nhằm đánh giá mức độ độc hại của loại hóa chất này và ứng
dụng trong quản lý sử dụng đúng loai hóa chất này.
Nội dung đề tài:
Xác định ảnh hưởng của Dipterex đến hoạt tính của một số chỉ tiêu sinh hóa:
- Cholinesterase (ChE)
- Lipid peroxidation (LPO)
- Catalase (CAT)
- Glutathion S-transferase (GST)


3
CHƯƠNG 2

LƯỢC KHẢO TÀI LIỆU

2.1 Đặc điểm sinh học cá Tra
2.1.1 Phân loại
Cá Tra là một loài trong số 11 loài thuộc họ cá Tra (Pangasiidae) đã được xác
định ở sông Cửu Long. Tài liệu phân loại gần đây nhất của tác giả Rainboth
xếp cá Tra nằm trong giống cá Tra dầu (Pangasianodon).

Phân loại cá Tra
Bộ cá nheo: Siluriformes
Họ cá Tra: Pangasiidae
Giống cá Tra dầu: Pangasianodon
Loài cá Tra: Pangasianodon hypophthalmus
2.1.2 Một vài đặc điểm sinh học cá Tra
Cá Tra thuộc nhóm cá trắng (cá sông) sống trên dòng chính và các nhánh sông
rạch lớn. Cá có khả năng sống tốt trong điều kiện ao tù nước đọng, nhiều mùn
bả hữu cơ, oxy hòa tan thấp và có thể nuôi với mật độ rất cao (Dương Nhựt
Long, 2003). Cá tra là loài ăn tạp, trong tự nhiên cá ăn mùn bã hữu cơ, rễ cây
thủy sinh, rau quả, tôm tép, cua, côn trùng, ốc và cá,…. Trong điều kiện nuôi
cá có thể ăn thức ăn viên, các thức ăn có nguồn gốc động vật sẽ giúp cá lớn
nhanh (Dương Nhựt Long, 2003). Cá Tra lớn nhanh trong ao nuôi, sau khoảng
6 tháng nuôi cá đạt trọng lượng 1–1,2 kg/con.
2.2. Một số chỉ tiêu sinh hóa và các tác nhân gây nên sự thay đổi của các
chỉ tiêu sinh hóa
Cholinesterase (ChE) là một chất hoá học thần kinh đóng vai trò như một tác
nhân dẫn truyền thông tin qua các thể tiếp hợp giữa hai tế bào thần kinh
(Ellman và ctv., 1961). ChE rất cần thiết cho các chức năng bình thường của
thần kinh trung ương và thần kinh ngoại biên. ChE phân bố nhiều ở mô thần
kinh và cũng có ở các mô khác. ChE khi bị ức chế dẫn đến sự tích tụ của
acetylcholine tại các synap (các khoảng trống giữa hai tế bào thần kinh), làm
mất chức năng dẫn truyền của các xung thần kinh (Hart, 1993). Trong nghiên
cứu độc học, ChE được sử dụng nhiều và có vai trò như chất đánh dấu sinh
học.
Lipid peroxidation (LPO) là chất có liên quan đến các tác nhân oxy hoá trong
cơ thể thường góp phần vào tiến trình phát sinh bệnh. Trong quá trình hô hấp
hiếu khí tế bào đã sản sinh ra các gốc oxy hoá (Reactive oxygen species –
4
ROS): superoxide anion (O

2
-
), hydrogen peroxide (H
2
O
2
), hydroxyl (
-
OH).
ROS được tạo ra trong quá trình hô hấp hiếu khí này cần được phân huỷ và
trung hoà để tránh gây tổn thương cho sinh vật và thành phần nhạy cảm nhất
của tế bào đối với ROS là chuỗi acid béo chưa bão hoà trên màng tế bào. Hệ
quả của quá trình này là LPO được tạo thành (điều kiện bình thường LPO vẫn
được sinh ra). Đây là chất độc đối với tế bào. Tuy nhiên để chống lại ROS cơ
thể sinh vật thích ứng bằng cách sử dụng các nhân tố chống oxy hoá bao gồm
các chất không phải là enzyme (vitamine E, vitamin C, glutathione…) và
enzyme Catalase (CAT) , Glutathione reductase, SOD) ( Zhang và ctv., 2004)
Catalase (CAT) là một trong những enzyme chống oxy hoá phân bố tại các
perixosome có vai trò quan trọng trong việc loại bỏ H
2
O
2
, chất được sinh ra
trong quá trình - oxy hoá chuỗi acid béo dài CAT được nghiên cứu để đánh giá
sự tác động của chất độc cũng như khả năng của cơ thể chống lại ROS do chất
độc gây ra
Glutathione – S transferase (GST) là enzyme có chức năng xúc tác phản ứng
giữa các hợp chất có ái lực điện tử (thuốc trừ sâu, kim loại nặng) với GSH; các
hợp chất lạ từ đó chuyển hoá thành N-acetyl cystine S dạng kết hợp sau đó sẽ
được thải qua nước tiểu và phân (Yawad, 1989). Ngoài ra Storey (1996) cũng

cho rằng GST có vai trò quan trọng trong việc xúc tác phản ứng giữa GSH
với các thành phần tổn thương của tế bào bị tấn công bởi ROS. Theo Zhang và
ctv., (2004) enzyme này có liên quan đến việc giải độc đối với những chất
ngoại sinh, đóng vai trò quan trọng trong việc bảo vệ các mô từ sự tác động
của ROS.
Theo Guimaraes et al., 2006 ở nồng độ 0,25 ppm, sau 72 giờ gây nhiễm,
Trichlorfon đã gây nên hiện tượng phù và sung huyết ở cá rô phi
(Oreochromis niloticus) đồng thời làm tăng hoạt tính của ChE ở cơ của cá.
Theo Nguyễn Ngọc Hiền (2007), nghiên cứu ảnh hưởng của mật độ và
Enrofloxacine lên một số chỉ tiêu sinh hóa của cá Tra (Pangasianodon
hypophthalmus) trong điều kiện thí nghiệm. Kết quả cho thấy, sau 171 giờ cho
an kháng sinh Enroflloxacine đã làm biến động hoạt tính cả 4 loại men: ChE,
CAT, GST, LPO khi khảo sát ở các cơ quan: mang, gan, não, cơ trong diều
kiện thí nghiệm. Kháng sinh Enrofloxacine tác động gây ức chế làm giảm hoạt
tính của ChE. 24h sau khi ngừng cho ăn kháng sinh thì hoạt tính của ChE có
xu hướng chậm và bắt đầu tăng dần trở lại sau 171giờ. Trong khi đó kháng
sinh Enrofloxacine làm tăng hoạt tính của các men: CAT, GST, LPO ở các cơ
quan cơ, gan, mang của cá. Mật độ ương nuôi càng cao trong thời gian dài thì
hoạt tính của các men GST, CAT, LPO ở các cơ quan gan, mang, cơ của cá
càng tăng cao, ngược lại thì hoạt tính của ChE càng giảm. Hoạt tính của ChE,
CAT, và LPO được tìm thấy cao nhất ở não và GST cao nhất ở gan.
Theo Trần Văn Phú (2008) sau 171 giờ cho ăn kháng sinh Enrofloxacine đã
làm biến động họat tính của cả 4 lọai men: ChE, CAT, GST và LPO khi khảo
sát ở não, mang, gan và cơ của cá tra giai đọan con giống.
5
Kháng sinh Enrofloxacine có tác động gây ức chế làm giảm hoạt tính của ChE
ở tất cả các nghiệm thức. Sau khi ngừng cho ăn kháng sinh Enrofloxacine 24
giờ, thì họat tính ChE có xu hướng giảm chậm và bắt đầu tăng dần trở lại sau
171 giờ. Trong khi đó kháng sinh Enrofloxacine làm tăng họat tính GST, CAT
và LPO ở các cơ quan cơ, mang và gan của cá.

Hồ Thị Thanh Tuyến (2008), ảnh hưởng của mật độ và kháng sinh
Enrofloxacin đến một số chỉ tiêu sinh lý, sinh hóa của cá Tra (Pangasianodon
hypophthalmus) nuôi trong ao. Kết quả thí nghiệm cho thấy mật độ nuôi đã
làm ảnh hưởng đến các chỉ tiêu sinh hóa của cá Tra, thời gian nuôi với mật độ
cao càng dài thì hoạt tính của ChE ở tất cả các cơ quan càng giảm và hoạt tính
của CAT (trừ ở não) , GST, LPO càng tăng cao. Và kháng sinh Enrofloxacin
cũng tác động gây ức chế làm giảm hoạt tính của ChE ở cả hai mật độ nuôi.
Một ngày sau khi cho ăn kháng sinh thì hoạt tính của ChE có xu hướng giảm
và phục hồi trở lại sau 7 ngày. Kháng sinh Enrofloxacin cũng làm tăng hoạt
tính CAT và hoạt tính này bắt đầu hồi phục trở lại sau khi cá ăn kháng sinh 3
ngày ở gan, não và sau khi cá ăn kháng sinh 7 ngày ở mang trong ao nuôi có
mật độ thấp. Ở ao nuôi mật độ cao, hoạt tính này bắt đầu hồi phục trở lại sau
khi cá ăn kháng sinh 7 ngày. Kháng sinh Enrofloxacin làm tăng hoạt tính GST,
LPO và hoạt tính này bắt đầu hồi phục trở lại sau khi cá ăn kháng sinh 7 ngày
ở các ao có mật nuôi khác nhau.
Theo Nguyễn Đăng Khoa (2006), nghiên cứu ảnh hưởng của Endosulfan lên
một số chỉ tiêu sinh hóa trong Tôm sú (Penaeus monodon). Ông cho rằng: Ở
Tôm sú giống nhỏ, Endosulfan tác động gây ức chế làm giảm hoạt tính của
ChE ở nghiệm thức 0,1µg/L (43%) và 1µg/L (51%) và ChE phục hồi tốt sau 7
ngày tiếp xúc với Endosulfan. Và endosulfan không làm biến đổi hàm lượng
LPO trên tôm giống nhưng gây ra những biến đổi GST và CAT theo hướng
khác so với bình thường. Còn ở Tôm sú lớn, ông cũng cho rằng Endosulfan
cũng làm giảm hoạt tính của ChE trên mang nhưng không làm gia tăng LPO ở
cả hai cơ quan mang và gan tụy ở các nồng độ thí nghiệm. Endosulfan cũng
gây ra những biến đổi GST và CAT ở mang và gan tụy theo hướng khác so
với bình thường.
Nguyễn Văn Công và ctv (2006), khi nghiên cứu ảnh hưởng của Diazon lên
hoạt tính của enzym cholinesterase và tăng trọng của cá Lóc (Chana striata).
thấy rằng Diazon làm giảm đáng kể hoạt tính ChE ở nồng độ 0,016mg/l, tốc
độ tăng trưởng bị ức chế ở nồng độ cao nhất (0,35mg/l). Điều này cho thấy

hoạt tính ChE có thể làm chất chỉ thị để phát hiện ra sinh vật bị ảnh hưởng của
chất độc Diazon.
Theo Nguyễn văn Công và ctv (2006), nghiên cứ ảnh hưởng của nhiệt độ và
oxy hòa tan lên độc tính của Basudin 50EC ở cá Lóc (Chana striata). Kết quả
cho thấy trong điều kiện bình thường thì hoạt tính của ChE tập trung nhiều
nhất là ở não, kế đến là thịt, thấp nhất là ở gan. Hoạt tính này không chịu ảnh
hưởng bởi khảng DO và nhiệt độ trong thí nghiệm. Và Ông cho rằng nhiệt
độlà yếu tố ảnh hưởng đến độc tính của Basudin 50EC, khi nhiệt độ tăng thì
6
làm tăng mức độ ức chế AchE trong não và trong thịt nhưng trong gan không
thể hiện rõ.
Theo Nguyễn Thị Em (2008), nghiên cứu sự ảnh hưởng của các độ mặn khác
nhau lên một số chỉ tiêu sinh lý, sinh hóa và sinh trưởng của Tôm Càng xanh
(Macrobrachium rosenbergii) ở độ mặn 15 và 25% thì hoạt tính của enzym
ChE ở cơ và mang của Tôm Càng Xanh đều giảm sau 6 giờ và phục hồi sau 24
giờ, ở gan tụy hoạt tính của ChE giảm so với đối chứng và không có khả
năng phục hồi sau 7 ngày. Hoạt tính của CAT ở mang và gan tụy ở cả 2 độ
mặn 15 và 25% đều tăng cao so với đối chứng (trong đó CAT ở mang tăng cao
hơn gan tụy). Ở nghiệm thức 15% hoạt tính của LPO ở mang có khuynh
hướng giảm và tăng ở gan tụy tuy nhiên ở độ mặn 25% thì hoạt tính của LPO
ở cả mang và gan tụy đều có xu hướng tăng so với đối chứng. Còn đối với
hoạt tính của GST sau 6 – 24 giờ ở mang giảm và tăng cao sau 3-7 ngày.
2.3. Sơ lược về Dippterex
2.3.1. Đại cương về Dipterex
- Công thức hóa học của Dipterex là C
4
H
8
O
4

Cl
3
P.
- Công thức cấu tạo: Dimethyl (2,2,2-trichloro-hydroxyethyl)phosphonate
- Khối lượng phân tử: 257,45
- Tên khoa học: dimethyl–(2,2,2-tricholoro-1-hydroxyethyl) phosphonate.
- Tên thường dùng: Trichlorfon
- Tên thương phẩm: Dylox (Mỹ), triclophon, Tuzon, Neguvon, hay chlophos
(Liên Xô)

Hình 2.1. Công thức cấu tạo của Dipterex(Trần Lâm Ban – Đỗ Phổ, 1987)

2.3.2. Một vài tính chất của Dipterex

Là chất rắn, kết tinh màu trắng, mùi dễ chịu, nóng chảy ở 83–84
o
C. Hòa tan
được trong alcol, benzen và đa số hydrocacbon chlor hóa khác. Dipterex bền ở
nhiệt độ phòng, mang tính axit, ở pH=5,5 thì Dipterex chuyển hóa chậm thành
dimetyl diclovinyl photphat (DDVP).
7
Bảng 2.1:Thời gian phân hủy 50% của Dipterex theo pH và nhiệt độ (Trần
Lâm Ban – Đỗ Phổ, 1987)
Khoảng pH 1–5 Nhiệt độ 70
o
C
Nhiệt độ
(
o
C)

Thời gian phân hủy
(ngày)
pH Thời gian phân hủy
(giờ)
10 2.400 1 32
20 526 2 34
30 140 3 33
40 41 4 26,6
50 10,7 5 15,3
60 3,2 6 3,0
70 1,13 8 0,6



Hình 2.2. Công thức cấu tạo của DDVP (Trần Lâm Ban – Đỗ Phổ, 1987)
2.3.3 Ứng dụng Dipterex
Trong ngành vệ sinh y tế thì Dipterex dùng diệt ruồi và côn trùng nên hạn chế
nhiều bệnh tật nguy hiểm.
Trong thú y thì Dipterex dùng vệ sinh chuồng trại, diệt kí sinh trùng bên ngoài
và bên trong. Trong thủy sản thì Dipterex dùng trị một số bệnh phổ biến do
giun sán, rận cá, giáp xác, nấm kí sinh…(Trần Lâm Ban – Đỗ Phổ, 1987)

8
CHƯƠNG 3

VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

3.1. Vật liệu nghiên cứu:
Cá Tra giống thí nghiệm được mua từ các các trại giống ở Cần Thơ, có khối
lượng trung bình từ (17,9 ± 4,1g), màu sắc của cá tươi sáng, đồng cỡ, không bị

dị tật và không có dấu hiệu bệnh lý.
Hóa chất thí nghiệm: Dipterex sử dụng có tên thương mại là ĐỊCH BÁCH
TRÙNG 90SP chứa 90% hoạt chất Trichlorfon (Hình 3.3), dạng chất rắn và
đang được sử dụng phổ biến hiện nay. Thuốc được khuyến cáo sử dụng trị sâu
bệnh cho các loại cây trồng như bọ trĩ, bọ xít, sâu khoang trên lúa, vải thiều,
đậu tương với nồng độ từ 1,0 đến 1,2 kg/ha.
Thức ăn sử dụng trong thí nghiệm là thức ăn công nghiệp Cargill có hàm
lượng đạm 30 %, mỗi ngày cho cá ăn 2 lần, khẩu phần ăn từ 5-7 % khối lượng
thân.
Bể xi măng 1000 lít (3 bể), bể composit hình chữ nhật 500 lít, máy so màu
quang phổ, watter bath, máy li tâm, kính hiển vi, pipet, tủ trữ đông mẫu (-
80
o
C)
Nguồn nước dùng thí nghiệm là nguồn nước máy. Các hoá chất, dụng cụ và
phương tiện sử dụng trong phòng thí nghiệm Bộ môn Dinh Dưỡng và Chế
Biến Thuỷ Sản – Khoa Thuỷ Sản - Trường Đại học Cần Thơ.

Hình 3.3. Dipterx dùng trong thí nghiệm
3.2. Phương pháp nghiên cứu:
3.2.1. Phương pháp bố trí thí nghiệm:
Thí nghiệm được bố trí với 4 nghiệm thức khác nhau và mỗi nghiệm thức
được lập lại 3 lần. Cá được bố trí hoàn toàn ngẫu nhiên trong hệ thống bể
9
composite có thể tích là 500 lít với mật độ là 70 con/bể. Hệ thống bể được sục
khí liên tục. Cá được bố trí với các nghiệm thức sau :
Nghiệm thức 1 : Bể không có Dipterex ( đối chứng).
Nghiệm thức 2 : Bể có Dipterex 0,01ppm
Nghiệm thức 3 : Bể có Dipterex 0,1ppm
Nghiệm thức 4 : Bể có Dipterex 0,5ppm

3.2.2. Phương pháp pha hóa chất :
Từ hóa chất ĐỊCH BÁCH TRÙNG 90SP thương mại chứa 90% hoạt chất
Trichlorfon pha thành dung dịch mẹ có nồng độ 10.000ppm. Từ dung dịch gốc
pha thành các nồng độ 0,01pp, 0,1ppm, 0,5ppm theo công thức :
C
1
V
1
= C
2
V
2

Trong đó : C
1
: là nồng độ của dung dịch gốc
V
1
: Thể tích dung dịch gốc dùng để pha.
C
2
: Nồng độ dung dịch cần pha (0,01ppm, 0,1ppm, 0,5ppm)
V
2
: Thể tích cần pha.
3.2.3. Thời gian thu mẫu : Mẫu được thu vào 5 thời điểm
Lần thu mẫu 1: Trước khi cho hóa chất vào bể 0 giờ
Lần thu mẫu 2: Khi cho hóa chất vào bể sau 6 giờ
Lần thu mẫu 3: Khi cho hóa chất vào bể sau 96 giờ
Lần thu mẫu 4: Khi cho hóa chất vào bể sau 14 ngày

Lần thu mẫu 5: Khi cho hóa chất vào bể sau 56 ngày
3.2.4. Phương pháp thu mẫu
Cá được thu ngẫu nhiên 5 con/bể, riêng lần thu thứ nhất chỉ thu 1con/bể. Cá
sau khi thu được cân trọng lượng và đo chiều dài.
Mẫu dùng để phân tích các chỉ tiêu sinh hóa bao gồm : não, mang, gan, cơ
được thu vào ống ependoff , quá trình thu mẫu được thực hiện trong điều kiện
lạnh và mẫu được cố định bằng cách nhúng vào Nitơ lỏng. Sau khi thu xong
thì toàn bộ mẫu được trữ lạnh ở -80
0
C cho đến khi mẫu được phân tích.
10
3.2.5. Phương pháp phân tích mẫu:
3.2.5.1. Phương pháp nghiền mẫu:
Tất cả các mẫu não, mang, gan, cơ đều được nghiền trong dung dịch buffer
KH
2
PO
4
/K
2
HPO
4
50mM.
Quy trình nghiền mẫu:

Sau khi nghiền đem mẫu chia làm 2 phần:
 1 phần được cho vào trong ống ependoff để phân tích LPO
sau đo đem trữ ở -80
0
C cho đến khi phân tích
 1 phần đem ly tâm 10000 vòng/10 phút (4
0
C) lấy phần nước
trong nổi ở trên cho vào ống ependoff để phân tích các chỉ
tiêu ChE, CAT, GST đem trữ ở -80
0
C cho đến khi phân tích.

3.2.5.2. Phương pháp phân tích các chỉ tiêu sinh hóa:
a) Lipid peroxidation (LPO):
Nguyên lý: Phân tích LOOHs như là một phương pháp xác định phản ứng
LPO. Thiobarbituric Acid Reactive Substance (TBARS) được áp dụng phổ
biến nhất. TBARS phản ứng với MDA, sản phẩm được xác định thông qua
máy so màu quang phổ ở bước sóng 535 nm (Fatima và ctv, 2000). Chuẩn bị
đường chuẩn với nồng độ MDA tăng dần. Trị số đọc được trên máy so màu
quang phổ cho phép tính LPO (µmol MDA/g mẫu).
 Chuẩn bị hóa chất:
Trichloroacetic acid 5% (TCA 5%): 5g TCA/100ml H
2
O, giữ lạnh và sử dụng
trong ngày.
Thiobabituric acid 0,67% (TBA 0,67%): 67mg TBA/1ml Dimethyl sulfoxide
(DMSO), trộn đều, sau đó thêm 9ml H
2
O, bảo quản tốt, tránh ánh sáng (che tối

bằng giấy bạc).
Mẫu não, gan, mang, cơ, giải đông và được trữ trong nước đá
Cân mẫu từ 0,1-0,3g cho vào ống nghiền bằng nhựa
Cho 3ml KH
2
PO
4
/K
2
HPO
4
50mM (pH = 7,5)

Cân mẫu (mẫu và buffer)

11
 Quy trình bao gồm:
Sử dụng 500µL mẫu nghiền với 0,5ml trichloroacetic (TCA) 5% và 0,5ml
thiobarbituric acid (TBA) 0,67% .
Ủ hỗn hợp 15 phút . Ly tâm ở 3000 vòng/phút trong 10 phút ở 4
o
C, lấy phần
nổi. Cho phần nổi vào ống thuỷ tinh đun trong nước sôi 15 phút. Lấy ống thuỷ
tinh ra, làm mát ở nhiệt độ phòng. Đo độ hấp thụ ở 535 nm.

Đường chuẩn với giá trị MDA cho phép xác định được LPO thể hiện qua
µmol MDA tương đương/g mẫu
b) Glutathione S-transferase (GST)
Nguyên lý : phản ứng mang tính kiềm của sự kết hợp của GSH với 1 – chloro-
2,-dinitrobenzene (CDNB) thông qua hoạt động của GST.
 Chuẩn bị hóa chất:
- 1-chloro-2,4-diitrobenzen (CDNB)50mM: 50,5mg/5ml ethanol, giữ trong
tủ mát.
- GSH 50mM: 76,83mg/5ml dung dịch Hepes, pH= 7,5.
Nồng độ MDA Thể tích pha loãng
Dung dịch chuẩn 500

1 100 1ml dung dịch chuẩn + 4ml nước
2 50 2ml dung dịch 1 + 2ml nước
3 10 1ml dung dịch 2 + 4ml nước
4 5 2ml dung dịch 3 + 2ml nước
5 2,5 2ml dung dịch 4 + 2ml nước
6 1,25 2ml dung dịch 5 + 2ml nước
7 0,625

2ml dung dịch 6 + 2ml nước
8 0 Nước
Nồng độ MDA (µM)

0 0,625 1,25 2,5 5 10 50 100
1ml 1ml 1ml 1ml 1ml 1ml 1ml 1ml
Bảng 3.2. Tiến trình lập đường chuẩn MDA
Thêm vào 1ml TBA 0,67%
Ủ trong nước sôi khoảng 10 phút
Đọc ở bước sóng 535 nm
12
- Dung dịch đệm phosphat pH=7,5

Hóa chất
Test (µl)

Blank (µl)

Đệm Hepes pH 7,5 700 700
CDNB (trong ethanol) 1,5mM 30 30
GSH 30 30
H2O 220 240
Mẫu 20 /
Đo ở bước sóng 340 nm trong 3 phút
Công thức tính :
Hoạt tính của GST = ( A
340/phút
– A
blank
) x độ pha loãng x coff.ExMol
CDNBcoeff = 9,6mM
-1
cm
-1

là hệ số CDBN chuyển thành CDBN-GST + HCl
dưới tác dụng của GST.
Đơn vị của GST là nmol/mg protein/phút
c) Catalase (CAT)
Nguyên lý: Phương pháp thông thường xác định CAT dựa trên sự thay đổi của
dung dịch đo ở bước sóng 240nm. Phương pháp yêu cầu trong đo quang phổ
phải sử dụng curvet thạch anh để tránh sự nhiễu. Titanium oxisulfate
(TiOSO
4
) phản ứng với H
2
O
2
mà không bị khử bởi catalase sau 6 phút.
 Chuẩn bị hóa chất:
- Dung dịch BC: gồm 1g Albumine bovine (BSA, Sigma); 100ml Imidazol
buffer 0,02 M pH 7,0.
- Sau đó, cho 50µl H
2
O
2
30% vào 250ml BC để tạo thành dung dịch SC
- Chuẩn bị dung dịch TiOSO
4
: 1,7g TiOSO
4
pha loãng trong 500ml H
2
SO
4

2N. Đun sôi trong 10 phút và để nguội dung dịch đến ngày hôm sau. Pha
loãng 1,5 lần với H
2
SO
4
2N
- Tiếp đến, thêm 0,75 ml TiOSO
4
vào 1,25 ml SC và đọc ở bước sóng 420nm.
Độ hấp thụ phải nằm trong khoảng 0,75 và 0,95 và là độ hấp thụ cao nhất
(H
2
O
2
không bị khử bởi catalase) nếu không thay đổi thể tích H
2
O
2
.
Bảng 3.3. Quy trình phân tích Enzym GST
13


Độ hấp thụ mẫu trắng 1 (không H
2
O
2
) được hiệu chỉnh về 0. Độ hấp thụ mẫu
trắng 2 được làm nền từ mẫu. Nó tương đương phản ứng của mẫu với TiOSO

4
.
Công thức tính:
CAT (U/mg protein) = log SC – log (hấp thụ) * V(ml) phản ứng/ V(ml) SC/
V(ml) mẫu/T(phút) phản ứng * độ pha loãng/mg protein
d) Cholinesterase (ChE)
Nguyên lý: Hoạt tính ChE được xác định ở 25
o
C sử dụng phương pháp so
màu quang phổ (bổ sung bởi Ellman và ctv (1961)) mà acetylthiocholine bị
thuỷ phân bởi acetylcholinesterase tạo ra thiocholine. Sự kết hợp tiếp theo với
DTNB (5,5 dithiobis 2 nitrobenzoic acid) hình thành màu vàng anion 5-thio-2-
nitrobenzoic acid được hấp thu mạnh ở bước sóng 412 nm.
 Chuẩn bị hoá chất:
- Dithiobisnitrobenzoate (DTNB) 167µM: 66,1mg/100ml Sodium phosphate
50mM, pH=7,5.
- Cơ chất Acetylthiocholine iodide (AchI) 30mM: 8,67mg/1ml Sodium
photphate, pH= 7,5.

Phân tích
(µ

l)

Trắng 1

(µ

l)

Trắng 2
(µ

l)

SC 1250 / /
BC / 1250 1250
TritonX-
100 0,02% hay
Tween 0,04%
25 25 25
Đệm phosphate / 25 /
Mẫu 25 / 25
Ủ 6 phút ở 0
o
C
TiOSO
4
750 750 750
Đọc ở bước sóng 420nm sau 5 đến 10 phút.
Bảng 3.4. Quy trình phân tích Enzym Catalase
14






Công thức tính:
R = Abs * pha loãng/ [(thể tích mẫu (ml) * 0,0136)/protein (mg/ml)]

R: Số mole cơ chất thuỷ phân/phút/mg protein 0,0136 là hệ số
Acetylcholine iodide chuyển thành thiocholine và acetat.
e) Protein
Nguyên tắc: Lượng protein được xác định theo phương pháp Lowry và ctv,
(1951) sử dụng Albumine bovine (BSA, Sigma) làm đường chuẩn. Trong môi
trường kiềm đồng sẽ tạo phức với protein. Khi Folin được đưa vào, Folin sẽ
kết dính với protein. Phản ứng khử sẽ chuyển màu từ màu vàng sang màu
xanh.
 Chuẩn bị hoá chất:
- BSA 10mg/ml H
2
O
- Hỗn hợp A: 150ml Na
2
CO
3
2% + 1,5ml CuSO
4
1% + 1,5ml NaK Tartrate2%
- Folin: 10ml folin + 10ml H
2
O

Trắng (µl)

Mẫu (µl)

DTNB (150 µM )
900 900
Đệm (phosphate hay tris) 50 /

Sample / 50
Đọc ở bước sóng 412 nm trong 10 phút
Chất nền (nồng độ 4,5mM)

50 50
Bảng 3.5. Quy trình phân tích enzym ChE
15

Hoá
chất
Đường chuẩn Mẫu


0mg 0,05 mg 0,1mg 0,2mg 0,5mg
protein protein protein protein protein


BSA
Mẫu
H
2
O
NaOH
1N
0µl 5µl 10µl 20µl 50µl
/ / / / /
500

µl 495µl 490

µl 480

µl 450

µl
500

µl 500µl 500µl 500µl 500µl
/
10µl
490µl
500µl
Ủ trong 30 – 120 phút
Hỗn
hợp A
5ml 5ml 5ml 5ml 5ml 5ml
Ủ trong 15 phút
Folin
500µl 500µl 500µl 500µl 500µl 500µl
Ủ trong 30 phút
Đọc ở bước sóng 660nm
Đường chuẩn Albumine bovine cho phép xác định được lượng protein có
trong mẫu (mg protein/ml)
Bảng 3.6. Quy trình phân tích Protein
16
CHƯƠNG 4: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
4.1. Ảnh hưởng của Dipterex lên hoạt tính của men Cholinesterase (ChE)
trong não, mang, gan, cơ của cá Tra giống
Cholinesterase (ChE) là một chất hóa học thần kinh đóng vai trò như một tác
nhân dẫn truyền thông qua các thể tiếp hợp giữa hai tế bào thần kinh (Ellman

và ctv, 1961). Khi cho cá tiếp xúc với thuốc ở các nồng độ thuốc: đối chứng;
0,01 ppm, 0,1 ppm và 0,5 ppm thì sự biến đổi về hoạt tính của ChE trong cơ,
mang, gan, não của cá được trình bày ở Hình 4.3, 4.5, 4.6 và 4.7. Kết quả cho
thấy hoạt tính của enzyme ChE ở cơ, mang, gan và não của cá có chiều hướng
bắt đầu giảm so với nghiệm thức đối chứng kể từ khi cá tiếp xúc với Dipterex.
Ở mang, ở nghiệm thức không có Dipterex (0ppm) hoạt tính của ChE tăng ở
thời điểm thu mẫu 6 giờ khác biệt có ý nghĩa thống kê so với thời điểm thu
mẫu 0 giờ. Ở thời điểm thu mẫu 96 giờ, 14 ngày, 56 ngày hoạt tính của ChE
giảm tuy nhiên sự giảm này không có ý nghĩa thống kê so với thời điểm thu
mẫu 0 giờ. Ở nghiệm thức có Dipterex 0,01ppm, 0,1ppm, 0,5ppm hoạt tính
của ChE giảm khác biệt ở ý nghĩa thống kê qua các thời điểm thu mẫu sau khi
tiếp xúc với Dipterex lần lượt ở 6 giờ, 96 giờ, 14 ngày, 56 ngày so với lần thu
mẫu 0 giờ và nồng độ thuốc càng cao thì hoạt tính của ChE càng bị ức chế (ở
nồng độ 0,01ppm thì hoạt tính của ChE bị ức sau khi tiếp xúc với Dipterex là
67%, 0,1ppm thì 71%, còn ở nồng độ 0,5ppm là 81%).
0.0
20.0
40.0
60.0
80.0
100.0
120.0
140.0
160.0
0ppm 0.01ppm 0.1ppm 0.5ppm
µmol/min/mg Protein
0 giờ
6 giờ
96 giờ
14 ngày

56 ngày
a
b
c
b
b
a
b
a
a a
a
a
a
a
a
a
a
a a a
Hình.4.4 .Biến đổi hoạt tính của ChE trong mang của cá Tra qua các thời
điểm thu mẫu (các chữ cái (a,b,c,d) thể hiện sự khác biệt thống kê trong cùng một nghiệm
thức, các cột có cùng một chữ cái thì khác biệt không có ý nghĩa (p<0.05))
Gan là cơ quan có chức năng quan trọng trong quá trình giải độc sau khi hóa
chất xâm nhập vào cơ thể, nhiều loại men có chức năng oxy hóa hay giải độc
của đa số sinh vật đều do gan sản sinh ra. Hoạt tính của ChE ở gan có xu
hướng giảm khi tiếp xúc với thuốc Dipterex. Ở nghiệm thức không có
Dipterex hoạt tính của ChE tăng ở thời điểm thu mẫu 6 giờ và 56 ngày và
17
giảm ở thời điểm thu mẫu 96 giờ, 14 ngày khác biệt không có ý nghĩa thống
kê so với thời điểm thu mẫu 0 giờ. Ở các nghiệm thức có Dipterex họat tính
của ChE giảm khác biệt có ý nghĩa thống kê qua các lần thu mẫu. Ở nghiệm

thức 0,01ppm hoạt tính của ChE giảm khác biệt có ý nghĩa thống kê ở thời
điểm thu mẫu 14 ngày so với thời điểm thu mẫu 0 giờ. Ở nghiệm thức 0,1ppm
hoạt tính của ChE giảm khác biệt có ý nghĩa sau khi tiếp xúc với Dipterex ở
các tất cả các thời điểm thu mẫu 6 giờ, 96 giờ, 14 ngày, 56 ngày (p<0.05). Còn
ở nghiệm thức 0,5ppm hoạt tính của ChE giảm ở tất cả các thời điểm thu mẫu
và sự sai khác này có ý nghĩa về mặt thống kê (p<0,05) ở thời điểm thu mẫu
14 ngày, 56 ngày so với thời điểm thu mẫu 0 giờ. Ở thời điểm thu mẫu 0 giờ ở
nghiệm thức 0,1ppm hoạt tính của ChE tăng khác biệt có ý nghĩa thống kê so
với các nghiệm thức: không có Diprerex, 0,01ppm, 0,5ppm.

0
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
0ppm 0.01ppm 0.1ppm 0.5ppm
µmol/min/mg protein
0 giờ
6 giờ
96 giờ
14 ngày
56 ngày
ab
b

b
b
b
ab
a
ab
a
ab
a
ab
a
a
a a
a a
b
ab

Hình 4.5. Biến đổi của hoạt tính của ChE trong gan ở cá Tra qua các lần thu
mẫu (các chữ cái (a,b,c,d) thể hiện sự khác biệt thống kê trong cùng một nghiệm thức, các
cột có cùng một chữ cái thì khác biệt không có ý nghĩa (p<0.05))
Ở não, ở nghiệm thức không có Dipterex và nghiệm thức có Dipterex 0,01ppm
hoạt tính của ChE giảm không có ý nghĩa ở tất cả các thời điểm thu mẫu 6
giờ, 96 giờ,14 ngày, 56 ngày so với lần thu mẫu đối chứng. Tuy nhiên ở
nghiệm thức 0,01ppm hoạt tính của ChE giảm 48% so với nghiệm thức không
có Dipterex. Trong khi đó ở thời điểm thu 6 giờ ở nghiệm thức 0,1ppm và
0,5ppm hoạt tính của ChE lại tăng so với lần thu mẫu đối chứng nhưng chỉ
khác biệt ở có ý nghĩa ở nghiệm thức 0,5ppm. So với thời điểm thu mẫu 0 giờ.