Tài liệu Giáo trình sinh học thực vật potx

TRƯỜNG ĐẠI HỌC ĐÀ LẠT
F 7 G







GIÁO TRÌNH
CÔNG NGHỆ SINH HỌC
THỰC VẬT



GS.TS. MAI XUÂN LƯƠNG




2005

Công nghệ Sinh học thực vật
-
1 -
MỤC LỤC
MỤC LỤC 1 -
PHẦN I. NHÂN GIỐNG IN VITRO 3 -
MỞ ĐẦU 3 -
CHƯƠNG I. NHỮNG NGUYÊN TẮC CỦA NUÔI CẤY MÔ 5 -
TRONG CÔNG TÁC VI NHÂN GIỐNG 5 -
I. GIỚI THIỆU CHUNG 5 -
II. TÁI SINH CÂY CON TRONG NUÔI CẤY MÔ 6 -
1. Nhân giống từ hạt trong điều kiện vô trùng 6 -
2. Nuôi cấy phôi 6 -
3. Nuôi cấy tế bào trứng 6 -
III. NHÂN GIỐNG CÂY CON BẰNG BIỆN PHÁP NUÔI CẤY MÔ 7 -
1.Giai đoạn I. Kiến lập và ổn đònh mẫu cấy. 7 -
2.Giai đoạn 2: nhân giống 9 -
3.Giai đoạn 3: hình thành rễ. 9 -
4.Giai đoạn 4. Làm cho các cây tái sinh thích nghi khí hậu 10 -
IV. SƠ LƯC LỊCH SỬ PHÁT TRIỂN CỦA NUÔI CẤY MÔ THỰC VẬT 11 -
CHƯƠNG II. PHÒNG THÍ NGHIỆM NUÔI CẤY MÔ TẾ BÀO THỰC VẬT. - 15 -
I. BẢO ĐẢM ĐIỀU KIỆN VÔ TRÙNG 15 -
1. Ý nghóa cuả vô trùng trong nuôi cấy mô thực vật. 15 -
2. Nguồn nhiễm tạp. 15 -
3. Vô trùng dụng cu ïthủy tinh, nút đậy và môi trường. 15 -
4. Vô trùng mô cấy. 16 -
5. Vô trùng nơi thao tác cấy và tủ cấy vô trùng. 17 -
II. CHUẨN BỊ MÔI TRƯỜNG 17 -
1. Đường. 18 -
2. Các muối khoáng đa lượng. 18 -

3. Các muối khoáng vi lượng. 19 -
4.Các vitamin 19 -
5. Các chất kích thích sinh trưởng (phytohormone). 20 -
6. Các chất hữu cơ khác 21 -
7. Chuẩn bò các dung dòch đậm đặc và dung dòch làm việc. 21 -
8. Vấn đề lựa chọn môi trường 23 -
III. CHỌN VÀ XỬ LÝ MÔ CẤY 23 -
IV. PHÒNG THÍ NGHIỆM NUÔI CẤY MÔ THỰC VẬT. 24 -
1.Cách bố trí phòng thí nghiệm nuôi cấy mô 24 -
2. Các thiết bò chủ yếu của phòng thí nghiệm nuôi cấy mô thực vật. 24 -
CHƯƠNg III. CÁC PHƯƠNG PHÁP NUÔI CẤY MÔ 26 -
I. NUÔI CẤY ĐỈNH SINH TRƯỞNG 26 -
1/ Nuôi cấy đỉnh sinh trưởng cây khoai tây 27 -
2/ Nuôi cấy đỉnh sinh trưởng cây đòa lan 29 -
II. NHÂN GIỐNG BẰNG CON ĐƯỜNG PHÁT SINH PHÔI VÔ TÍNH 32 -
III. NHÂN GIỐNG BẰNG CÁCH TẠO MÔ SẸO (CALLUS) 34 -
IV. NHÂN GIỐNG BẰNG NUÔI CẤY LÁT MỎNG 36 -
GS.TS. Mai Xuân Lương Khoa Sinh học
Công nghệ Sinh học thực vật
-
2 -
V. ỨNG DỤNG KỸ THUẬT VI GHÉP TRONG NHÂN GIỐNG. 38 -
VI. NUÔI CẤY TÚI PHẤN 41 -
1.Chọn vật liệu khởi nguyên 41 -
2.Tạo các tổ hợp gen mới bằng phương pháp lai hữu tính. 41 -
3.Nuôi cấy túi phấn cây lai. 42 -
VII. NUÔI CẤY VÀ DUNG HP PROTOPLAST Ở THỰC VẬT 45 -
1. Tách và nuôi cấy protoplast thực vật. 46 -
2. Dung hợp protoplast 48 -
VIII. CHUYỂN GEN THỰC VẬT 51 -

1. Agrobacterium 51 -
2. Chuyển gen nhờ Agrobacterium 52 -
PHẦN II. NHÂN GIỐNG VÔ TÍNH TRONG VƯỜM ƯƠM 54 -
CHƯƠNG I. YẾU TỐ MÔI TRƯỜNG CỦA NHÂN GIỐNG 54 -
I. CÁC YẾU TỐ CƠ BẢN VỀ VI KHÍ HẬU CỦA MÔI TRƯỜNG NHÂN
GIỐNG. 54 -
1.nh sáng 54 -
2. Nước và độ ẩm 55 -
3. Nhiệt độ. 55 -
4. Khí và trao đổi khí. 55 -
5. Dinh dưỡng khoáng 55 -
II. KHAY, CHẬU TRỒNG CÂY 56 -
1.Khay phẳng đáy 56 -
2. Chậu đất nung 56 -
3. Chậu plastic. 56 -
4. Chậu sợi 56 -
5. Chậu giấy 57 -
6. Túi polyethylene 57 -
7. Khay trồng bằng gỗ. 57 -
III. QUẢN LÝ CÁC YẾU TỐ THỔ NHƯỢNG TRONG NHÂN GIỐNG VÀ
SẢN XUẤT CÂY GIỐNG.
57 -
CHƯƠNG II. KỸ THUẬT NHÂN GIỐNG MỘT SỐ CÂY PHỔ BIẾN. 63 -
I. KÍCH THÍCH TẠO RỄ. 63 -
II. SỬ DỤNG PHYTOHORMONE KÍCH THÍCH CÀNH CHIẾT RA RỄ. 64 -
III. NHÂN GIỐNG CÂY TRỒNG TỪ RỄ. 65 -
IV. NHÂN GIỐNG TỪ VẢY CỦ 69 -
V. NHÂN GIỐNG TỪ LÁ 70 -
VI. NHÂN GIỐNG BẰNG PHƯƠNG PHÁP CHIẾT CÀNH 72 -
VII. NHÂN GIỐNG CÂY ĐỖ QUYÊN. 73 -

VIII. GHÉP CÀNH 74 -





GS.TS. Mai Xuân Lương Khoa Sinh học
Công nghệ Sinh học thực vật
-
3 -


PHẦN I. NHÂN GIỐNG IN VITRO

MỞ ĐẦU
Giống là một khâu rất quan trọng trong sản xuất nông nghiệp. Công tác
giống chủ yếu bao gồm các khâu thu thập nguồn gen, bảo quản quỹ gen, lai tạo,
tuyển chọn, thử nghiệm giống và nhân giống.
Nhờ phương pháp nuôi cấy mô tế bào thực vật nên ngày nay phần lớn các
công việc này được thực hiện một cách khá thuận lợi và nhanh chóng.
Sự hình thành và phát triển của phương pháp nuôi cấy mô tế bào thực vật là
kết quả của những phát hiện sau đây trong lónh vực sinh lý thực vật và di truyền học
phân tử:
1. Tính toàn thể (potipotency) của mô và tế bào thực vật cho phép tái sinh
được cây hoàn chỉnh từ mô, thậm chí từ một tế bào nuôi tách rời;
2. Khả năng tạo các cây đơn bội qua nuôi cấy túi phấn, từ đó tạo các dòng
đồng hợp tử tuyệt đối và nhờ đó rút ngắn được chu trình lai tạo;
3. Khả năng hấp thu ADN ngoại lai vào tế bào thực vật và khả năng
chuyển gen để gây biến đổi (transformation) ở thực vật do ADN ngoại lai nhờ công
nghệ gen (genetic engineering);

4. Khả năng nuôi cấy các tế bào thực vật như nuôi cấy vi sinh vật dẫn đến
khả năng ứng dụng di truyền phân tử vào thực vật bậc cao để phục vụ cho công tác
tạo giống;
5. Kỹ thuật nuôi cấy protoplast và khả năng dung hợp protoplast, tái sinh
cây hoàn chỉnh từ protoplast lai (cybrid);
6. Khả năng loại trừ virus bằng phương pháp nuôi cấy đỉnh sinh trưởng, tạo
các dòng vô tính sạch bệnh ở các cây nhân giống vô tính;
7. Khả năng dùng chồi nách, các thể chồi protocorm vào nhân giống vô
tính với tốc độ cực nhanh một số cây trồng;
8. Khả năng sử dụng phương pháp nuôi cấy phôi để khắc phục hiện tượng
bất thụ khi lai xa;
9. Khả năng bảo quản các nguồn gen bằng nuôi cấy trong ống nghiệm;
10. Khả năng tồn trữ các tế bào thực vật sống trong thời gian dài và ở nhiệt
độ thấp mà không mất tính toàn thể của tế bào.
Nuôi cấy mô tế bào thực vật không chỉ góp phần giải quyết một cách có hiệu
quả công tác giống cây trồng mà còn mở ra một chân trời mới trong nghiên cứu di
GS.TS. Mai Xuân Lương Khoa Sinh học
Công nghệ Sinh học thực vật
-
4 -
truyền thực vật, các cơ chế sinh tổng hợp ở thực vật, sinh lý phát triển, vai trò của
phytohormone trong đời sống thực vật và nhiều vấn đề sinh học cơ bản khác.
Nuôi cấy mô tế bào thực vật còn là công cụ để thu nhận các chất có hoạt tính
sinh học (alcaloid, steroid ) qua nuôi cấy mô tế bào cây thuốc ở quy mô lớn.


GS.TS. Mai Xuân Lương Khoa Sinh học
Công nghệ Sinh học thực vật
-
5 -

CHƯƠNG I. NHỮNG NGUYÊN TẮC CỦA NUÔI CẤY MÔ
TRONG CÔNG TÁC VI NHÂN GIỐNG

I. GIỚI THIỆU CHUNG.
Khả năng kiến lập và duy trì các cơ quan và các mô thực vật (phôi, đỉnh sinh
trưởng, rễ, hoa tế bào, callus, tế bào trần) trong nhân giống vô trùng để tái sinh
những cây mới từ chúng là kết quả của những nghiên cứu cơ bản và nghiên cứu ứng
dụng trong các phòng thí nghiệm thực vật học, bệnh học và di truyền học từ cuối
thế kỷ 19. Công việc này được gọi chung là nuôi cấy mô và cơ quan, nuôi cấy trong
ống nghiệm, vi nhân giống và thuật ngữ mới nhất là công nghệ sinh học.
Các quy trình chính của công nghệ sinh học bao gồm tái sinh chồi, tái sinh
cây con, tạo callus và tạo phôi vô tính.
Vi nhân giống khác với phương pháp nhân giống truyền thống ở chỗ quá trình
được chia thành nhiều giai đoạn để có thể kiểm mỗi khía cạnh của quá trình tái
sinh và phát triển cây con. Mỗi bước của trật tự công việc có thể được thao tác
(hoặc lập chương trình) bằng cách chọn mẫu cấy và kiểm tra môi trường nhân
giống. Nhìn sâu vào các cơ chế sinh học của mỗi quá trình vi nhân giống sẽ có thể
tìm thấy khả năng ứng dụng nó trong phương pháp nhân giốngcây con phục vụ sản
xuất đại trà.
Trong chương này sẽ mô tả các công việc đã nêu và xác đònh các cơ sở hình
thái, sinh lý và di truyền của quá trình sinh trưởng và phát triển của cây trong nuôi
cấy mô.
Trước hết hãy cùng nhau nắm vững ý nghóa của một số thuật ngữ quan trọng.
• Nuôi cấy mô. Thuật ngữ này dùng cho một trật tự các thao tác dùng để
duy trì và sinh trưởng của các mô thực vật (tạo callus, tế bào, tế bào trần), của các
cơ quan trong nuôi cấy vô trùng. Kỹ thuật này dùng để nhân giống, cải biến
genotype (tức tạo giống mới), sản xuất sinh khối chứa các sản phẩm hóa sinh học,
nghiên cứu bệnh học thực vật, bảo quản phôi và các nghiên cứu khoa học. Tất cả
các thao tác này đều được gọi chung là công nghệ sinh học.
• Vi nhân giống. Thuật ngữ dùng để ám chỉ công việc nhân giống thực vật

trong ống nghiệm. Có 4 giai đoạn phát triển đặc trưng của công việc này là kiến
lập, nhân chồi, tạo rễ và làm cho cây con tái sinh thích nghi với khí hậu.
• Mẫu cấy. Đó là mẫu thực vật dùng để nhân giống. Mẫu cấy có thể là đoạn
cành cắt, lát mỏng, chồi hoặc hạt.
• Tạo phôi vô tính. Sự hình thành phôi từ các tế bào sinh dưỡng chứ không
phải từ hợp tử sau khi thụ phấn.
• Callus. Sự hình thành các tế bào không phân hóa (thường là từ các tế bào
nhu mô).
GS.TS. Mai Xuân Lương Khoa Sinh học
Công nghệ Sinh học thực vật
-
6 -
II. TÁI SINH CÂY CON TRONG NUÔI CẤY MÔ.
Phương pháp nhân giống trong ống nghiệm có thể được sử dụng có hiệu quả
trong hàng loạt kiểu thao tác cho nẩy mầm và tái sinh cây con nếu có biện pháp
bảo vệ để tránh sự nhiễm tạp và khi những trở ngại mang tính di trưyền của mẫu
cấy được khắc phục.
1. Nhân giống từ hạt trong điều kiện vô trùng.
Thành công của phương pháp nhân giống từ hạt đạt được đối với hạt hoa lan.
Hạt hoa lan rất bé, không chứa chất dinh dưỡng dự trữ và nói chung phụ thuộc vào
quan hệ cộng sinh với một số loại nấm đặc hiệu để tiếp nhận chất dinh dưỡng.
Người ta đã tính được khoảng 30.000 hạt trong một quả Catleya. Năm 1922 Levis
Knudson thông báo kết quả nuôi cấy thành công hoa lan trong môi trường nuôi
cấy không cộng sinh có cung cấp muối khoáng và đường saccharose. Cơ sở của sự
thành công này là sự phát hiện rằng calcium hypochloride có thể được sử dụng để
khử trùng bề mặt mà không gây độc cho phôi đang nẩy mầm. Quy trình này đã rút
ngắn đáng kể thời gian nhân giống. Hiện nay nó vẫn được sử dụng để cho nẩy
mầm các hạt lai.
2. Nuôi cấy phôi.
Nuôi cấy phôi bao gồm tách phôi từ hạt và cho nó nẩy mầm trong môi trường

vô trùng. Công dụng chủ yếu của kỹ thuật này là “cứu” các phôi không thể nẩy
mầm bên trong hạt trước khi quả chín. Rất nhiều cây lai giữa các loài bước đầu
được nhân giống bằng phương pháp này rất có kết quả nhưng đôi khi phôi bò hỏng
trong quá trình phát triển (hiện tượng bất thụ của phôi vô tính). Những dòng chín
sớm của nhiều loại cây ăn quả có xu hướng cho quả chín trước khi phôi của chúng
phát triển đầy đủ. Trong điều kiện tự nhiên những phôi này dễ bò hỏng nhưng nếu
tách chúng và nuôi chúng trong môi trường nuôi cấy thích hợp thì có thể làm cho
chúng nẩy mầm.
Ứng dụng thứ hai của nuôi cấy phôi là kích thích nẩy mầm những hạt chín
đang ngủ để rút ngắn chu trình nhân giống.
3. Nuôi cấy tế bào trứng.
Hệ thống này bao gồm nuôi cấy vô trùng trứng tách rời, noãn (đã thụ phấn
hoặc chưa thụ phấn), và thực giá noãn gắn bên trong tế bào trứng. Mặc dù kỹ thuật
này đã được sử dụng lần đầu tiên để nghiên cứu các vấn đề về cây ăn quả và sự
phát triển của hạt, quy trình thích hợp đã được sử dụng trong nhân giống, đặc biệt
là trong việc làm hoàn thiện bộ gen.
Tế bào trứng chưa thụ tinh được tách và cấy trong môi trường dinh dưỡng
cùng với phấn hoa và sau đó cho thụ phấn trong ống nghiệm. Quy trình này đã
được sử dụng rất có hiệu quả đối với những cây có nhiều loại tế bào trứng. Phấn
hoa có thể đặt trực tiếp vào thực giá noãn để ống phấn có thể phát triển trực tiếp
vào tế bào trứng.
GS.TS. Mai Xuân Lương Khoa Sinh học
Công nghệ Sinh học thực vật
-
7 -
Tế bào trứng nuôi cấy rất có hiệu quả trong việc cứu phôi khi còn rất non nếu
như chúng chưa bò tách khỏi cây mẹ. Đây là kỹ thuật đơn giản hơn nhiều so với
nuôi cấy phôi. Các tế bào trứng có thể được khử trùng dễ dàng hơn và nói chung có
thể sinh trưởng dễ dàng trong môi trường cơ bản có chứa muối khoáng, đường và
đôi khi cần thêm một số phytohormone.

Kỹ thuật nuôi tế bào trứng ít phổ biến và có nhu cầu dinh dưỡng khoáng thay
đổi. Đối với đa số các loài môi trường cơ bản về muối khoáng vô cơ và đường là
quan trọng, nhưng auxin có thể cần được sử dụng để kích thích sinh trưởng.
III. NHÂN GIỐNG CÂY CON BẰNG BIỆN PHÁP NUÔI CẤY MÔ.
Vi nhân giống phần lớn cây trồng bao gồm 4 giai đoạn chủ yếu được thực
hiện trên các môi trường khác nhau và chòu các biện pháp kiểm tra khác nhau:
- Giai đoạn I: Kiến lập, tức tạo các điều kiện cần thiết để tái sinh cây con từ
mẫu cấy;
- Giai đoạn II: Nhân cây giống
- Giai đoạn III: Tạo rễ;
- Giai đoạn IV: Làm cho các cây tái sinh thích nghi khí hậu.
1.Giai đoạn I. Kiến lập và ổn đònh mẫu cấy.
Mục tiêu của giai đoạn I là đặt thành công mẫu cấy vào môi trường vô trùng
bằng cách tránh bò nhiễm tạp và chuẩn bò đầy đủ môi trường trong ống nghiệm để
tái sinh được cây con một cách ổn đònh. Giai đoạn này bao gồm các nội dung sau:
1/ Chọn mẫu cấy. Sự lựa chọn và duy trì nguồn thực vật là yếu tố quan trọng
đảm bảo sự thành công của vi nhân giống. Có 3 khía cạnh đòi hỏi phải đặc biệt
quan tâm:
a/ Đặc điểm di truyền và phát sinh cá thể của nguồn thực vật dùng để nhân
giống.
b/ Kiểm tra nguồn gây bệnh.
c/ Điều kiện sinh lý của cây cho phép sử dụng nó trong nhân giống.
Trước hết, xác đònh đúng đặc điểm di truyền là rất quan trọng bởi vì sự nhầm
lẫn ở giai đoạn này có thể làm nẩy sinh những vấn đề phức tạp và gây nên sự thiệt
hại đáng kể về kinh tế trước khi tìm được con đường chuyển sang các giai đoạn
tiếp theo. Trong số các loài và giống cây trồng khác nhau có sự biến động đáng kể
về khả năng tái sinh cây con trong các điều kiện nhân giống khác nhau. Cần phải
thực hiện sự nghiên cứu một cách có hệ thống để có được những kiến thức và kinh
nghiệm cần thiết đối với từng loại cây. Cần phải dành thời gian để xác đònh nhu
cầu của những giống cây chưa quen thuộc, mặc dù, nói chung, có thể tìm được

thông tin về những giống cây đó trong các tài liệu đã xuất bản.
Nói chung, những thực vật dễ nhân giống bằng các biện pháp thông thường
thì cũng đễ thực hiện vi nhân giống. Ví dụ các loại thảo mộc vừa dễ nhân giống
thông thường vừa dễ thực hiện vi nhân giống. Trong khi đó các loại cây gỗ thì khó
GS.TS. Mai Xuân Lương Khoa Sinh học
Công nghệ Sinh học thực vật
-
8 -
tái sinh hơn nhiều và đễ nhân giống chúng cần phải tìm được các phương pháp
thích hợp.
Thành công trong vi nhân giống các loài cây gỗ rất phụ thuộc vào đặc điểm
của cây non dùng để nhân giống. Vi nhân giống cây con mọc từ hạt dễ hơn nhiều
so với những cây đã trưởng thành, và các chủng khác nhau của cùng một loài cây
trồng thường có các yêu cầu đặc trưng riêng trong vi nhân giống. Nói chung, yếu tố
hạn chế trong vi nhân giống là sự hình thành rễ chứ không phải là tăng sinh trưởng
bộ rễ đã hình thành. Các thao tác nhằm thu nhận những cây giống trẻ hóa bao gồm
sự lựa chọn những bộ phận còn trẻ của phần gốc cây con sinh ra từ hạt để tạo ra
chồi bất đònh và phối hợp bằng cách ghép những chồi bất đònh này với cây con sinh
trưởng từ hạt.
Mục đích của vi nhân giống là tạo được cây giống trẻ hóa có đầy đủ khả năng
ra rễ. Sự tiến bộ về khả năng ra rễ và song song với nó là những biến đổi về sức
khỏe và hình thái của cây con đã được ghi nhận ở một số loài cây gỗ.
2/ Khử trùng mẫu cấy. Các yếu tố gây nhiễm trong vi nhân giống bao gồm:
a/ Nhiễm nấm, nấm mốc, nấm men và vi khuẩn trên bề mặt mẫu cấy;
b/ Nhiễm virus và các cơ thể tương tự virus;
c/ Các nguồn bệnh bên trong.
Trong một số trường hợp các yếu tố gây nhiễm không chỉ làm ức chế sinh
trưởng và sự ra rễ của cây con thu nhận được trong vi nhân giống mà còn duy trì
tác dụng ức chế này sau khi trồng cây con thu nhận được ra vườn ươm.
Các yếu tố gây nhiễm hầu như có mặt khắp mọi nơi. Để diệt trừ chúng thường

hay sử dụng các chất hóa học mà thông dụng nhất là Calcium hypochloride và
Natrium hypochloride. Những chất này gây tác dụng độc cho vi sinh vật gây
nhiễm nhưng ít độc đối với cây trồng được nhân giống trong ống nghiệm.
3/ Điều kiện sinh lý là sự xử lý mẫu cấy để việc nuôi cấy dễ thành công hơn.
Có 3 điều kiện sinh lý quan trọng là:
a/ Mẫu cấy lấy từ những cây trồng trong các thùng chứa nuôi trong nhà kính
với sự kiểm tra môi trường chặt chẽ;
b/ Phải tạo được những cây giống khỏe mạnh;
c/ Xử lý phytohormone.
4/ Môi trường nuôi cấy. Môi trường nuôi cấy thường dùng là môi trường nửa
rắn có chứa agar hoặc các sản phẩm thương mại tương tự, các muối khoáng dinh
dưỡng đa lượng và vi lượng, nguồn năng lượng mà chủ yếu là đường saccharose và
một số vitamin cần thiết. Ngoài ra, trong phần lớn môi trường còn có chứa các loại
phytohormone thuộc hai nhóm auxin và cytokinin với tỷ lệ thích hợp đối với từng
loại cây. Tốc độ tái sinh cây con trong các môi trường này tùy thuộc vào từng loại
cây trồng.
5/ Dòch rỉ trong vi nhân giống. Một hiện tượng không mong muốn thường xảy
ra khi tiến hành vi nhân giống và hiện tượng dòch rỉ từ mẫu cấy thoát ra. Gây tác
GS.TS. Mai Xuân Lương Khoa Sinh học
Công nghệ Sinh học thực vật
-
9 -
hại nhiều nhất là các hợp chất phenol khác nhau. Khi chúng bò oxy hóa sẽ làm cho
môi trường ngã sang màu nâu, ức chế sự tái sinh và sinh trưởng của cây con. Để
hạn chế tác hại của loại dòch rỉ này cần phải có biện pháp xử lý mà chủ yếu là sử
dụng các chất chống oxy hóa, kể cả bổ sung các chất hấp phụ vào môi trường như
polyvinylpyrrolidone hoặc than hoạt tính.
6/ Làm ổn đònh mẫu cấy. Các mẫu cấy đòi hỏi phải được cắt và cấy chuyền
nhiều lần để tạo ra những cây con đồng nhất và sinh trưởng tốt. Phần lớn cây một
năm và cây thảo mộc được ổn đònh nhanh chóng sau một số lần cấy, trong khi đó

cây gỗ đòi hỏi nhiều lần cấy hơn, thậm chí rất khó đạt được tính ổn đònh. Sự khó
khăn trong việc làm ổn đònh mẫu cấy thường gằn liền với trạng thái sinh trưởng
của mẫu cấy: mẫu cấy còn non dễ được ổn đònh hơn. Mùa vụ sinh trưởng của mẫu
cấy cũng liên quan với sự ổn đònh này.
2.Giai đoạn 2: nhân giống.
Mục đích của giai đoạn 2 là duy trì việc vi nhân giống ở trạng thái ổn đònh và
nhân được nhiều cây con theo yêu cầu. Môi trường cơ bản của giai đoạn 2 cũng
giống như giai đoạn 1.Tốc độ vi nhân giống nhanh chóng sản phẩm thương mại có
thể đòi hỏi sự tối ưu hóa không những các nguyên tố vô cơ mà cả các yếu tố khác
của môi trường. Điều. này có thể thực hiện được bằng cách thử một cách hệ thống
các nồng độ khác nhau của các nguyên tố sử dụng trong sự phối hợp với các yếu tố
khác.
Các chất điều hòa sinh trưởng được dùng để duy trì mức độ sinh trưởng cơ bản
cũng như phản ứng phát triển của cây nhân giống. Cytokinin ở một số nồng độ có
tác dụng khá mạnh trong việc kích thích tạo chồi. Nói chung, nồng độ tối thiểu của
cytokinin kích thích tạo chồi được lựa chọn trong quá trình nhân giống. Nồng độ
cao của cytokinin vẫn kích thích tạo chồi nhưng có thể ức chế quá trình sinh trưởng
của chồi theo chiều dài. Vì vậy, xác đònh chính xác nồng độ cytokinin là rất cần
thiết. Auxin thường được dùng với nồng độ thấp hoặc không được sử dụng ở giai
đoạn 2.
Tỉ lệ nhân giống là số cây thu được trong một lần vi nhân giống. Nói chung, tỉ
lệ nhân giống từ chối bất đònh lớn hơn so với từ chồi nách. Tuy nhiên, tỉ lệ nhân
giống từ một số loại chồi đặc biệt thường có thể cao hơn chồi bất đònh. Vì vậy, tỉ lệ
nhân giống cao nhất không nhất thiết phải là đáng ao ước nhất để duy trì chất
lượng của cây con thu được.Tần số nhân giống có thể kéo dài từ hai đến tám tuần.
Kỹ thuật cấy chuyền cần được tối ưu hoá đối với từng loại cây trồng, bao gồm
kích thước và tính mùa vụ của mẫu cấy, phương pháp cắt và hướng đặt mẫu cấy
lên môi trường.
3.Giai đoạn 3: hình thành rễ.
Chức năng của giai đoạn này là tạo rễ cho mẫu cấy chuyền để sau đó mang

chúng ra trồng trên môi trường vô trùng của vườn ươm. Việc tạo rễ có thể được
thực hiện bên trong hoặc bên ngoài ống nghiệm và bao gồm các cách sau:
Tạo rễ trong ống nghiệm.
GS.TS. Mai Xuân Lương Khoa Sinh học
Công nghệ Sinh học thực vật
-
10 -
a/ Cấy chuyền các đốt cấy sang môi trường tạo rễ có tỉ lệ phytohormone thay
đổi bằng cách giảm hoặc hoàn toàn không chứa cytokinin và tăng auxin. Hàm
lượng muối khoáng thường giảm đi một nửa.
b/ Cấy chuyền các đốt cấy sang môi trường tạo rễ (thường là môi trường
nước) trong một vài ngày và sau đó cấy chuyền chúng sang môi trường không chứa
auxin để tạo rễ. Mẫu cấy có thể được đặt dưới ánh sáng hoặc trong tối đối với vài
loài, trong môi trường có thể chứa các yếu tố bổ sung hữu ích, ví dụ phloroglucinol.
Tạo rễ bên ngoài ống nghiệm
Nhiều hệ thống vi nhân giống thương mại hoặc thực nghiệm tránh tạo rễ
trong ống nghiệm bằng cách xử lý mẫu cấy bằng auxin mà đặt chúng trực tiếp vào
môi trường tạo rễ trong điều kiện sương mù hoặc có độ ẩm cao để cho chúng ra rễ.
Phương pháp này không những tạo ra sự di chuyển tốt đẹp mẫu cấy từ môi trường
ống nghiệm ra điều kiện bên ngoài mà còn giúp tiết kiệm thiết bò nuôi cấy. Có hai
cách thực hiện:
a/ Xử lý mẫu cấy bằng auxin (thường dùng IBA) bằng cách nhúng nhanh
chúng vào dung dòch phytohormone và gắn chúng vào môi trường trong vườn ươm
có độ ẩm cao;
b/ Xử lý mẫu cấy bằng auxin từ 5 đến 15 ngày như xử lý trong ống nghiệm
trên agar hoặc trong môi trường nước, sau đó rửa sạch agar và đặt chúng vào môi
trường ngoài ống nghiệm.
Có sự khác biệt rõ ràng về hình thái giữa sự hình thành rễ trong ống nghiệm
và ngoài ống nghiệm. Các mẫu cấy ngoài ống nghiệm có xu hướng tạo rễ “bình
thường” hơn cá mẫu cấy trong ồng nghiệm. Sau khi chuyển ra trồng ở vườn ươm

những cây tạo rễ trong ống nghiệm có thể bò chết, trong khi những cây tạo rễ ngoài
ống nghiệm dễ thích nghi với điều kiện môi trường hơ và có tỉ lệ sống sót cao.
Một khía cạnh tốt của nhân giống trong ống nghiệm là nhiều loại thực vật
thông thường khó ra rễ bằng cách giâm cành ngoài ống nghiệm lại có thể ra rễ khi
tiến hành vi nghân giống trong ống nghiệm. Điều này chủ yếu liên quan với trạng
thái trưởng thành của cây dùng làm mẫu cấy, bới vì những mẫu cấy lấy từ khu vực
còn non của cây thường dễ nhân giống hơn.
4.Giai đoạn 4. Làm cho các cây tái sinh thích nghi khí hậu.
Giai đoạn này bao gồm sự di chuyển từ đặc điểm dò dưỡng (cần cung cấp
đường) sang đặc điểm tự dưỡng (có khả năng quang hợp) và sự thích nghi của cây
con mới tái sinh với môi trường ngoài ống nghiệm. Giữ cho số cây con này tiếp tục
sinh trưởng là rất quan trọng vì sự thích nghi với khí hậu và phát triển trong điều
kiện tự dưỡng rất phụ thuộc vào khả năng sinh trưởng tiếp tục của cây con từ sau
khi đưa chúng ra khỏi ống nghiệm. Những cây con tái sinh trong ống nghiệm cần
phải giữ trong điều kiện có độ ẩm cao để thích nghi dần với điều kiện môi trường,
đặc biệt là làm cho chúng tránh bò mất nước.
GS.TS. Mai Xuân Lương Khoa Sinh học
Công nghệ Sinh học thực vật
-
11 -
Những chồi con hình thành trong quá trình vi nhân giống có hình thái lá khá
đặc biệt. Kích thước lá và số lớp tế bào tạo ra lá thấp hơn đáng kể so với những là
hình thành sau khi chuyển cây con ra vườn ươm. Do độ ẩm cao trong ống nghiệm
trên lá không phát triển lớp sáp bảo vệ với số lượng và chất lượng cần thiết. Kết
quả là những lá hình thành trong vi nhân giống bò khô rất nhanh sau khi được rút ra
khỏi ống nghiệm.
Xử lý để thúc đẩy tốc độ thích nghi với khí hậu.
Trước khi đưa cây ra khỏi ống nghiệm:
a/ Làm giảm độâ ẩm (khoảng 35%) của môi trường trong ống nghiệm trước khi
đưa cây con ra ngoài. Công việc này có thể được thực hiện bằng cách đặt chất hút

ẩm vào ống nghiệm hoặc làm lạnh đáy ống nghiệm. Mở nắp ống nghiệm từ 5 đến
7 ngày trước khi đem cây con ra ngoài có thể là một biện pháp hiệu quả.
b/ Làm tăng khả năng thẩm thấu của môi trường (thường được thực hiện bằng
cách bổ sung thêm đường saccharose).
c/ Sử dụng các chất điều hòa sinh trưởng trước khi đưa cây con ra ngoài có thể
mang lại các kết quả khả quan khác nhau.
Sau khi đưa cây ra khỏi ống nghiệm:
a/ Giảm từ từ độ ẩm là biện pháp xử lý thông dụng nhất để làm cho cây con
thích nghi với khí hậu. Độ ẩm có thể duy trì bằng cách xử lý sương mù gián độn
hoặc đặt cây con trong màng polyethylene. Đây là bước rất quan trọng trong quá
trình cho cây làm quen với khí hậu.
b/ Chống thoát hơi nước bằng các độc tố thực vật. Công việc này không được
sử dụng rộng rãi với mục đích thương nghiệp.
IV. SƠ LƯC LỊCH SỬ PHÁT TRIỂN CỦA NUÔI CẤY MÔ
THỰC VẬT.
Sau khi học thuyết tế bào của Schwan và Schleiden ra đời năm 1838 nhiều
nhà sinh học tin tưởng rằng bằng cách nuôi cấy người ta có thể tạo thành công các
phôi nhân tạo, và từ đó tạo các cây con hoàn chỉnh, từ các tế bào sinh dưỡng.
Giai đoạn đầu tiên của lòch sử phát triển của nuôi cấy mô tế bào thực vật có
thể được đánh dấu bằng những thí nghiệm đầu tiên của Kotte và Robbins. Năm
1922 hai nhà khoa học này đã bước đầu thành công trong việc dùng đỉnh sinh
trưởng để nuôi cấy rễ của một cây hòa thảo trong môi trường lỏng có chứa muối
khoáng và glucose.
Giai đoạn thứ hai được bắt đầu năm 1934 khi White, một nhà sinh học người
Mỹ, đã nuôi cấy thành công trong một thời gian dài đầu rễ cà chua (Lycopersicum
esculenttum) trong một môi trường lỏng chứa muối khoáng, glucose và nước chiết
nấm men, và sau đó thay thế nước chiết nấm men bằng hỗn hợp 3 loại vitamin
nhóm B là vitamin B
1
, vitamin B

6
và vitamin PP.
Sau khi Went và Thimann pháp hiện chất kích thích sinh trưởng thực vật đầu
tiên là IAA, năm 1939 Gautheret đã sử dụng thành công chất này và các vitamin
GS.TS. Mai Xuân Lương Khoa Sinh học
Công nghệ Sinh học thực vật
-
12 -
nhóm B nói trên để kích thích sinh trưởng mô sẹo của cây cà rốt và duy trì sinh
trưởng của mô sẹo này trong thời gian vô hạn trên môi trường thạch.
Năm 1941 Overbeck chứng minh tác dụng kích thích sinh trưởng của nước
dừa trong nuôi cấy phôi cây họ cà (Dacura); và sau đó, năm 1948, Steward xác
nhận tác dụng của nước dừa trên mô sẹo cà rốt. Trong thời gian này cùng với IAA
một số auxin khác đã được phát hiện và tổng hợp thành công, như NAA và 2,4D.
Nhiều tác giả nhận thấy cùng với nước dừa 2,4D và NAA đã giúp tạo mô sẹo và
phân chia tế bào ở nhiều thực vật rất khó nuôi cấy.
Năm 1954 Skook phát hiện một loại phytohormone đầu tiên thuộc nhóm
cytokinin là 6-furfuryllaminopurin (kinetin) từ dòch thủy phân ADN và tác dụng
kích thích sinh trưởng của nó đối với mô thân cây thuốc lá.
Việc phát hiện vai trò của IAA, NAA, 2,4D, và kinnetin cùng với phát hiện
vai trò của nước dừa và vitamin là những bước tiến rất quan trọng trong quá trình
phát triển của nuôi cấy mô tế bào thực vật. Đó là tiền đề kỹ thuật cho việc xây
dựng các môi trường nuôi cấy ổn đònh về mặt hóa học để thực hiện các thí nghiệm
và nghiên cứu khác nhau, dẫn đến sự phát triển nhanh chóng của kỹ thuật nuôi cấy
mô trong giai đoạn tiếp theo.
Đặc biệt quan trọng là phát hiện của Skoog và Miller năm 1957 về ảnh hưởng
của tỉ lệ cytokinin/auxin trong môi trường nuôi cấy đối với sự hình thành cơ quan
của mô sẹo thuốc lá. Khi tỉ lệ này thấp mô sẹo có khuynh hướng phát triển rễ;
ngược lại, khi tỉ lệ này cao thì mô sẹo có khuynh hướng tạo chồi. Hiện tượng này
được xác nhận ở nhiều cây khác nhau và đóng góp rất lớn vào việc điều khiển sinh

trưởng, phát triển, phát sinh cơ quan của mô tế bào nuôi cấy. Thành công của
Skoog và Miller dẫn đến nhiều phát hiện quan trọng khác, mở đầu cho giai đoạn
thứ ba của nuôi cấy mô thực vật.
Giai đoạn này được đánh dấu bằng những thành công sau đây:
- Tách và nuôi cấy thành công các tế bào đơn ở dạng huyền phù và nuôi cấy
chúng trong thời gian dài (Muir, Hildebrandt và Riker, 1954 – 1959;, Nickell, 1956;
Bergman, 1960 ) Nhiều tác giả đã thành công trong việc tạo được cây hoàn chỉnh
từ một tế bào, chứng minh cho tính toàn thể của tế bào thực vật. Thành công này
mở ra những triển vọng mới trong việc tạo ra các dòng tế bào đột biến, các dòng tế
bào siêu sản xuất (over-production) một sản phẩm thứ cấp nào đó và khả năng tần
số đột biến trong di truyền đột biến ở thực vật bậc cao;
- Thành công trong nuôi cấy túi phấn để tạo cây đơn bội (Guha và
Maheswari, 1966 đối với cây cà độc dược; Bourgin và Nitsch 1967 đối với cây
thuốc lá ). Ngày nay việc tạo cây đơn bội qua nuôi cấy túi phấn và hạt phấn đã
thành công ở rất nhiều cây và đã đóng góp vô cùng to lớn vào việc tăng thêm kiến
thức di truyền thực vật và thực tiễn chọn giống.
- Phát hiện của Cooking (1960) trong việc phân hủy vỏ cellulose của vách tế
bào thực vật, tạo ra các tế bào trần (protoplast). Sau đó (1970) Nagata vàTakebe
tạo lại được vỏ cellulose cho những tế bào trần này và Takabe, Labid Melchers đã
GS.TS. Mai Xuân Lương Khoa Sinh học
Công nghệ Sinh học thực vật
-
13 -
nuôi cấy và tái sinh các cây hoàn chỉnh từ protoplast. Do protoplast có khả năng
dung hợp với nhau và hấp thu các phân tử lớn hoặc thậm chí các cơ quan từ bên
ngoài nên việc nuôi cấy thành công protoplast và tái sinh cây hoàn chỉnh từ chúng
mở ra triễn vọng ứng dụng thành công này trong công tác tạo giống, chọn giống.
Ngày nay hy vọng này đã được thực hiện, khi nhiều nhóm nghiên cứu khác nhau
trên thế giới công bố lai thành công giữa loài nhờ kỹ thuật protoplast, một việc
không thể thực hiện được bằng lai hữu tính cổ điển. Về mặt lý luận, protoplast là

công cụ không thay thế được để nghiên cứu hiện tượng nhiễm sắc thể hòa hợp của
các tế bào khác loài sau khi dung hợp và vai trò của ADN trong các cơ quan tử và
quan hệ của chúng với ADN của nhân tế bào.
- Thành công trong công nghệ chuyển gen từ những năm 1980-1982. Người ta
sử dụng các plasmid, tức các phân tử ADN vòng thường có trong các tế bào vi
khuẩn để chuyển tải các gen từ protoplast này đến protoplast khác. Bằng cách đó
người ta đã đưa được các gen ngoại lai vào tế bào thực vật. Tiếp sau đó người ta
còn sử dụng các biện pháp khác để chuyển gen trong nuôi cấy protoplast như kỹ
thuật sử dụng thiết bò xung điện (electroprorator), kỹ thuật vi tiêm (
microinjection), kỹ thuật siêu âm (ultrasonic gen transfer), kỹ thuật bắn gen (gene
gun)
- Thành công trong công tác nhân giống và phục tráng giống bằng phương
pháp nuôi cấy đỉnh sinh trưởng. Ngay từ 1969 Morel đã nhận thấy đỉnh sinh trưởng
của các loài đòa lan (Cymbidium) khi đem nuôi cấy sẽ hình thành các protocorm.
Khi chia cắt những protocorm này để tiếp tục nuôi cấy sẽ hình thành những
protocorm mới. Khi để trong những điều kiện nhất đònh, những protocorm này sẽ
tái sinh thành những cây hoàn chỉnh. Hơn nữa, các tế bào ở đỉnh sinh trưởng của
thực vật chứa rất ít hoặc hoàn toàn không chứa virus, do đó, với phương pháp nuôi
cấy đỉnh sinh trưởng Morel có thể phục tráng, tạo các dòng vô tính không bò nhiễm
virus.
Việc ứng dụng nuôi cấy mô thực vật trong nhân giống được Nozeran nâng lên
một mức mới khi ông nhận thấy sự hóa trẻ của các chồi nách cây nho và cây khoai
tây đem nuôi cấy và cấy chuyền nhiều lần trong ống nghiệm.
Việc ứng dụng nuôi cấy mô trong nhân giống và phục tráng giống ngày nay
không còn hạn chế ở một vài loại cây mà đã được thực hiện ở quy mô thương mại
đối với hàng loạt cây trồng có ý nghóa kinh tế như chuối, cà phê, cọ dầu, sắn, khoai
lang, khoai tây, mía, cây ăn quả có múi v.v và đã có những đóng góp to lớn cho
nông nghiệp thế giới.
Ngày nay chúng ta đang bước vào giai đoạn phát triển thứ tư của nuôi cấy mô
tế bào thực vật. Đó là giai đoạn nuôi cấy mô thực vật được ứng dụng mạnh mẽ vào

thực tiễn chọn giống, nhân giống, vào việc sản xuất các chất có hoạt tính sinh học
và vào nghiên cứu lý luận di truyền thực vật bậc cao. Những hiểu biết cơ bản về
đời sống của mô, của tế bào tách rời trong môi trường nhân tạo, về nhu cầu của
chúng đối với nguồn carbon, dinh dưỡng khoáng, vitamin, phytohormone những
kỹ thuật cơ bản để tách, nuôi cấy, điều khiển sự phân hóa từ các bộ phận khác nhau
GS.TS. Mai Xuân Lương Khoa Sinh học
Công nghệ Sinh học thực vật
-
14 -
của cây trồng là những tiền đề đã được chuẩn bò từ những giai đoạn trước. Đồng
thời, nhiều công nghệ mới, nhiều trang thiết bò hiện đại đã được phát minh để phục
vụ cho việc ứng dụng các thành tựu của nuôi cấy mô tế bào thực vật vào thực tiễn
sản xuất.

GS.TS. Mai Xuân Lương Khoa Sinh học
Công nghệ Sinh học thực vật
-
15 -
CHƯƠNG II. PHÒNG THÍ NGHIỆM NUÔI CẤY MÔ TẾ BÀO
THỰC VẬT.

Ở các cơ sở nghiên cứu và sản xuất có sử dụng kỹ thuật nuôi cấy mô khác
nhau tùy thuộc vào hoàn cảnh thực tế người ta có thể xây dựng các phòng thí
nghiệm với các trang thiết bò với mức độ hiện đại khác nhau. Tuy nhiên, tất cả các
phòng thí nghiệm này đều phải đảm bảo được ba yêu cầu sau đây:
- Bảo đảm điều kiện vô trùng;
- Chọn đúng môi trường và chuẩn bò môi trường đúng cách;
- Chọn mô cấy thích hợp, xử lý mô cấy thích hợp trước và sau khi cấy.
I. BẢO ĐẢM ĐIỀU KIỆN VÔ TRÙNG.
1. Ý nghóa cuả vô trùng trong nuôi cấy mô thực vật.
Môi trường nuôi cấy mô thực vật rất thích hợp cho nấm và vi khuẩn phát
triển. Do tốc độ sinh trưởng của nấm và vi khuẩn rất nhanh so với tế bào thực vật,
nên nếu trong thời gian nuôi cấy chỉ nhiễm một vài bào tử nấm hoặc vài vi khuẩn
thì chỉ sau vài ngày hoặc vài tuần toàn bộ bề mặt của môi trường nuôi cấy mô sẽ bò
nấm hoặc vi khuẩn phủ đầy, làm cho mẫu mô cấy không thể tiếp tục sinh trưởng và
chết dần.
Thông thường một chu kỳ nuôi cấy mô thực vật kéo dài từ 1 đến 5 tháng, khác
với thí nghiệm vi sinh vật, có thể kết thúc trong vài ngày. Như vậy, mức độ vô
trùng trong thí nghiệm nuôi cấy mô thực vật đòi hỏi rất nghiêm khắc.
2. Nguồn nhiễm tạp.
Có ba nguồn nhiễm tạp chính là:

- Dụng cụ thủy tinh, môi trường và nút đậy không được vô trùng tuyệt đối;
- Trên bề mặt hoặc bên trong mô cấy tồn tại các sợi nấm, bào tử nấm hoặc
vi khuẩn;
- Trong khi thao tác làm rơi nấm hoặc vi khuẩn theo bụi lên bề mặt môi
trường.
3. Vô trùng dụng cu ïthủy tinh, nút đậy và môi trường.
Dụng cụ thủy tinh dùng trong nuôi cấy mô thực vật cần phải chòu được nhiệt
độ 160-180
o
C khi vô trùng khô và 120
o
C khi vô trùng ướt. Trước khi sử dụng, dụng
cụ thủy tinh cần được rửa sạch, để ráo nước và khử trùng khô trong tủ sấy ở 160
o
C
trong 1 giờ. Sau khi để nguội được lấy ra để vào các hộp giấy kín cất vào chỗ ít bụi.
Nút đậy: thường dùng nhất là bông không thấm nước. Nút phải tương đối chặt
để không cho bụi đi qua, đồng thời nước từ môi trường không bò bốc hơi quá dễ
dàng trong quá trình nuôi cấy.
GS.TS. Mai Xuân Lương Khoa Sinh học
Công nghệ Sinh học thực vật
-
16 -
Gần đây người ta dùng nhiều loại nút đậy khác thay thế nút bông, như nút
nhựa (và cả bình cấy) chòu nhiệt, nút cao su, nút kim loại rất thuận tiện cho việc
khử trùng khô hay ướt.
Môi trường: Nói chung, môi trường được pha chế trong điều kiện không vô
trùng và đem hấp vô trùng khi đã phân phối vào các bình cấy và đã đậy nút hoặc
nắp. Thời gian vô trùng từ 20 đến 45 phút ở 120
o

C. Sau khi vô trùng cần phải làm
khô nút bông hoặc nắp đậy. Các dung dòch mẹ dùng để pha môi trường (như dung
dòch muối khoáng, vitamin, phytohormone v.v không nên pha nhiều (100-200ml)
và cần được bảo quản trong ngăn đá của tủ lạnh. Đối với các chất không chòu nhiệt,
có thể bò phân hủy ở nhiệt độ 120
o
C cần tiến hành lọc vô trùng (ví dụ lọc qua phễu
lọc thủy tinh số 5 hay qua các loại màng lọc vô trùng) trước khi được đưa vào môi
trường đã hấp vô trùng.
4. Vô trùng mô cấy.
Mô cấy có thể là tất cả các bộ phận khác nhau của thực vật. Tùy theo sự tiếp
xúc với môi trường, các bộ phận này đều chứa nhiều hay ít vi khuẩn và nấm. Đòng
lúa non khi còn trong bẹ hay mô thòt quả thường ít nhiễm vi sinh vật, ngược lại, lá,
thân, đặc biệt là rễ do nằm trong đất nên có độ nhiễm vi sinh vật rất cao. Vì vậy
đối với các loại mô cấy khác nhau người ta khử trùng bằng các phương pháp khác
nhau.
Phương pháp vô trùng mô cấy thông dụng nhất hiện nay là dùng các chất hóa
học có hoạt tính diệt nấm diệt khuẩn. Hiệu lực diệt nấm, khuẩn của các chất này
phụ thuộc vào thời gian xử lý, nồng độ và khả năng xâm nhập của chúng vào các
kẽ ngách lồi lõm trên bề mặt mô cấy, khả năng đẩy hết các bọt khí bám trên bề
mặt mô cấy. Để tăng tính linh động và khả năng xâm nhập của chất diệt khuẩn,
thông thường người ta xử lý mô cấy trong vòng 30 giây trong rượu ethylic 70%, sau
đó mới xử lý dung dòch diệt khuẩn. Đồng thời, người ta thêm các chất giảm sức
căng bề mặt như Tween 80, fotoflo, teepol vào dung dòch diệt nấm khuẩn.
Các chất diệt nấm khuẩn thường dùng và cho kết quả rất tốt là calcium
hypochloride 9-10% xử lý trong thời gian 5-30 phút, natrium hypochloride 9-10%
xử lý trong thời gian 5-30 phút và nước brôm 1-2% xử lý từ 2-10 phút. Ngoài ra,
hydro peroxide 10-12% xử lý trong 5-10 phút và chlorua thủy ngân 0,1-1,0% xử lý
trong 2-10 phút cũng cho kết quả tốt đối với từng loại mô cấy.
Trong thời gian xử lý mô cấy phải ngập hoàn toàn trong dung dòch diệt khuẩn.

Các bộ phận có nhiều bụi đất, trước khi xử lý cần được rửa sạch bằng nước máy.
Khi xử lý xong, mẫu cấy cần được rửa sạch (ít nhất 3 lần) bằng nước cất vô trùng.
Những phần trên mô cấy bò dung dòch khử trùng làm cho trắng ra cần được cắt bỏ
trước khi đặt mô cấy lên môi trường.
Vô trùng mô cấy là một thao tác khó, ít khi thành công ngay lần đầu tiên. Vì
vậy, cần phải kiên trì tìm cho được nồng độ và thời gian vô trùng thích hợp cho từng
loại mô cấy.
GS.TS. Mai Xuân Lương Khoa Sinh học
Công nghệ Sinh học thực vật
-
17 -
5. Vô trùng nơi thao tác cấy và tủ cấy vô trùng.
Một trong những nguồn nhiễm tạp quan trọng và thường xuyên nhất là bụi rơi
vào dụng cụ nuôi cấy chứa môi trường trong khi mở nắp hoặc nút bông trong khi
thao tác cấy. Cần áp dụng nhiều biện pháp khác nhau để tránh sự nhiễm tạp này.
Buồng cấy: thường là các buồng có diện tích hẹp, rộng từ 10-15 m
2
, có hai lớp
cửa để tránh không khí chuyển động từ bên ngoài trực tiếp đưa bụi vào. Buồng cấy
cần có sàn lát gạch tráng men, tường sơn để có thể lau rửa thường xuyên. Mặt bàn
làm việc cũng cần lát gạch tráng men hay phủ kính để tiện làm vệ sinh hàng ngày.
Trước khi làm việc phải lau mặt bàn bằng cồn 90%.
Trước khi đưa vào sử dụng, buồng cấy cần được xử lý hơi formol bằng cách
rót formol 40% ra một số nắp đóa petri để rãi rác vài nơi trong phòng cho bay hơi tự
do. Đóng kín cửa phòng cấy trong 24 giờ, sau đó bỏ formol đi và khử hơi formol
thừa bằng dung dòch ammoniac 25% cũng trong 24 giờ.
Các dụng cụ mang vào buồng cấy đều phải được khử trùng trước: từ quần áo
choàng, mũ vải, khẩu trang của người cấy đến dao kéo, kẹp, giấy bọc, bông, ống
nghiệm, bình đừng nước cất v.v Trên bàn cấy thường xuyên có một đèn cồn để sử
dụng trong khi cấy và một số cốc đựng cồn 90% để nhúng các dụng cụ làm việc.

Trước khi cấy, người cấy cần lau tay kỹ đến khuỷu tay bằng cồn 90%. Để
đảm bảo mức độ vô trùng cao, trong phòng cấy cần có một đèn tử ngoại 40W treo
trên trần. Chỉ bật sáng đèn này khi không có người trong phòng cấy. Cần giảm sự
chuyển động không khí ở trong buồng cấy đến mức tối thiểu, vì vậy cần tránh ra
vào buồng cấy nhiều lần.
Để tránh sự ngột ngạt trong buồng cấy, có thể quạt không khí qua các lớp
bông thủy tinh ngăn bụi với tốc độ nhỏ vào buồng cấy.
Tủ cấy: Trong một số trường hợp người ta sử dụng các tủ cấy đóng bằng gỗ
hoặc ghép bằng kính. Tuy nhiên, ngày nay các loại tủ cấy vô trùng lamine
(laminar-aie-flow cabinet) được dùng khá phổ biến. Đó là loại tủ cấy có thiết bò
thổi không khí đã lọc vô trùng vào chỗ thao tác cấy. Nhờ có hệ thống màng lọc, tủ
cấy lamine loại trừ một cách có hiệu quả nguồn nhiễm tạp từ bên ngoài và tạo điều
kiện thoải mái cho người cấy.
II. CHUẨN BỊ MÔI TRƯỜNG.
Thành phần môi trường nuôi cấy mô thực vật thay đổi tuỳ thuộc loài, bộ phận
nuôi cấy, mục đích nuôi cấy và nhiều yếu tố khác. Tuy vậy, tất cả các môi trường
nuôi cấy bao giờ cũng gồm 3 thành phần:
- Đường làm nguồn carbon,
- Các muối khoáng đa lượng,
- Các muối khoáng vi lượng
- Các vitamin,
GS.TS. Mai Xuân Lương Khoa Sinh học
Công nghệ Sinh học thực vật
-
18 -
- Các phytohormone.
Ngoài ra, người ta còn thường thêm vào môi trường nuôi cấy một số chất hữu
cơ thành phần hóa học xác đònh (aminoacid, EDTA ) hoặc không xác đònh (nước
dừa, nước chiết nấm men )
1. Đường.

Trong nuôi cấy mô, nguồn carbon để mô, tế bào thực vật tổng hợp nên các
chất hữu cơ giúp tế bào phân chia, tăng sinh khối của mô không phải do quang hợp
cung cấp mà do đường trong môi trường. Hai dạng đường thường sử dụng nhất là
saccharose và gucose, nhưng saccharose được dùng phổ biến hơn.
Tùy theo mục đích nuôi cấy, nồng độ saccharose biến đổi từ 1-6% (w/v),
thông dụng nhất là 2%, tương ứng với 58,4mM.
Trong trường hợp nuôi cấy tế bào quang hợp nồng độ đường có thể giảm
xuống hoặc bỏhẵn.
2. Các muối khoáng đa lượng.
Nhu cầu muối khoáng của mô tế bào tách rời không khác nhiều so với cây
trồng trong điều kiện tự nhiên. Các nguyên tố đa lượng cần phải cung cấp là nitơ,
phospho, kali, magiê, sắt.
Nguồn nitơ: Mô tế bào thực vật trong nuôi cấy có thể sử dụng các dạng nitơ
khoáng như amôn và nitrat, đồng thời có thể sử dụng các dạng nitơ hữu cơ như
aminoacid. Tỷ lệ giũa nitơ dạng amôn và nitrat thích hợp tùy theo loài cây và trạng
thái phát triển của mô.
Nitrat được cung cấp dưới dạng muối canxi nitrat (Ca(NO
3
)
2
,4H
2
O), kali nitrat
(KNO
3
), natri nitrat (NaNO
3
) hoặc amôn nitrat (NH
4
NO

3
). Amôn cung cấp dưới
dạng muối amôn sulphat (NH
4
)
2
SO
4
hoặc amôn nitrat NH
4
NO
3
. Trong một số ít
trường hợp có thể được cung cấp ở dạng urê. Tổng nồng độ của NO
3
-
và NH
4
+
trong
môi trường thay đổi từ 3 đến 6mM, thông thường khoảng 2mM.
Nguồn phospho: Hai dạng phospho thường dùng nhất là NaH
2
PO
4
.7H
2
O và
KH
2

PO
4
. Nồng độ phospho trong môi trường biến thiên từ 0,15 đến 4,00mM,
thường dùng khoảng 1,00mM.
Nguồn kali: Người ta thường cung cấp kali cho mô nuôi cấy dưới dạng kali
nitrat KNO
3
, kali chlorua KCl,kali phosphat KH
2
PO
4
. Nồng độ K
+
trong môi trường
biến thiên từ 2 đến 25 mM, trung bình khoảng 10mM.
Nguồn canxi: Canxi được cung cấp dưới dạng muối canxi nitrat
Ca(NO
3
)
2
.4H
2
O), canxi chlorua CaCl
2
.6H
2
O hoặc CaCl
2
.2H
2

O. Nồng độ Ca
2+
trong
môi trường tứ 1,0 đến 3,5mM, trung bình là 2,0mM.
Nguồn magiê: Magiê được cung cấp dưới dạng magiê sunphat MgSO
4
.7H
2
O,
với nồng độ trong môi trường khoảng 0,5 – 3,0mM.
GS.TS. Mai Xuân Lương Khoa Sinh học
Công nghệ Sinh học thực vật
-
19 -
Nguồn sắt: Những môi trường cổ điển dùng sắt ở dạng chlorua sắt
FeCl
2
.FeCl
3
.6H2O, sulphat sắt FeSO
4
.7H
2
O, Fe
2
(SO
4
)
3
, citrat sắt Fe(C

4
H
4
O
6
). Hiện
nay hầu hết các phòng thí nghiệm đều dùng sắt ở dạng chelat kết hợp với Na
2
-
ethylen diamintetraacetat (EDTA). Ở dạng này sắt không bò kết tủa và giải phóng
dần ra môi trường theo nhu cầu của mô thực vật.
3. Các muối khoáng vi lượng.
Nhu cầu muối khoáng vi lượng của mô thực vật trong nuôi cấy mô là lónh vực
còn ít được nghiên cứu. Để an toàn, người ta cung cấp hầu hết các nguyên tố vi
lượng cần thiết đối với cây cho mô nuôi cấy trong môi trường nhân tạo, vì vậy sự
cung cấp này có tính chất kinh nghiệm chủ nghóa, trong những trường hợp cụ thể có
thể là không cần thiết.
Các vi lượng thông dụng được giới thiệu trong bảng 1.


Bảng 1. Các vi lượng thông dụng
Tên vi lượng Dạng sử dụng Nồng độ
µ
M
Mangan (Mn)
Bo (B)
Kẽm (Zn)
Đồng (Cu)
Molypden (Mo)
Coban (Co)

Iốt (I)
MnSO
4
.4H
2
O
H
3
BO
3
ZnSO
4
.7H
2
O
CuSO
4
.5H
2
O
(NH
4
)
6
Mo
7
O
24
.4H
2

O, NaMoO
4
.2H
2
O
CoCl
2
.6H
2
O
KI
15 – 100
6 – 100
15 – 30
0,04 – 0,08
0,007 – 1,0
0,1 – 0,4
2,5 – 20,0
4.Các vitamin.
Các vitamin sau đây thường được dùng trong các môi trường nuôi cấy (bảng
2).
Bảng 2. Các vitamin thường được dùng trong các môi trường nuôi cấy mô.
Tên vitamin Nồng độ sử dụng (mg/l)
Myo-inozitol
Acid nicotinic (Niacin, vitamin PP)
Pyridoxine HCl (vitamin B
6
)
Thiamine HCl (vitamin B
1

)
Panthotenat canxi
100
0,5 – 1,0
0,05 – 0,5
10 - 50
1 – 5
GS.TS. Mai Xuân Lương Khoa Sinh học
Công nghệ Sinh học thực vật
-
20 -
Riboflavine (vitamin B
2
)
Biotin
Acid folic
1 – 5
0,1 – 1,0
0,1 – 1,0
Các vitamin thường dùng được pha trong hỗn hợp các dung dòch mẹ có nồng
độ cao gấp 500 hoặc 1000 lần dung dòch làm việc và được bảo quản ở nhiệt độ dưới
0
o
C. Nên chia sẵn dung dòch mẹ vitamin ra nhiều lọ nhỏ, mỗi lọ đủ dùng cho một
hoặc vài lít môi trường và bảo quản trong ngăn đá tủ lạnh.
5. Các chất kích thích sinh trưởng (phytohormone).
Các phytohormone thường dùng trong nuôi cấy mô được trình bày trong bảng
3.
Tên phytohormone Nồng độ sử dụng (mg/l)
2,4D (Dichlorophenoxyacetic acid

α- NAA (α- Naphtylacetic acid)
β-IAA (β-Indolacetic acid)
IBA (Indolbutyric acid)
Kinetin (6-Furfurylaminopurine)
BA (6-BAP) (6-Benzylaminopurine)
2-iP (N
6
γ,γ-Dimethylallylaminopurine)
GA
3
(Gibberellic acid)
0,2 – 5,0
0,1 - 5,0
5 – 20
1 – 5
0,1 – 2,0
0,1 – 2,0
0,1 – 2,0
0,1 – 2,0
Thường người ta pha các dung dòch mẹ phytohormone có nồng độ cao gấp
1000 lần dung dòch làm việc. Do một số phytohormone ít tan trong nước nên cần
phải pha như sau: Cân lượng phytohormone đủ pha 100 ml dung dòch mẹ vào một
ly khô. Đối với 2,4D, NAA, IAA, IBA, GA, trước hết thêm 2 – 3 ml rượu ethylic
90% và lắc đến khi tan hết, sau đó thêm nước cất đến 100 ml. Đối với BA và 2-iP
trước hết thêm 2 – 3 ml nước cất và vài giọt HCl 1N, lắc cho tan, sau đó lên thể tích
đến 100ml.
Bảo quản dung dòch mẹ phytohormone trong lọ kín (riêng IAA trong lọ màu
nâu), cất giữ trong tủ lạnh, 2,4D, NAA tương đối bền, có thể bảo quản như vậy
trong một năm. 2-iP, IBA, kinetin, GA bảo quản được từ 2 đến 3 tháng. IAA cần
pha lại hàng tháng để đảm bảo hoạt tính.

Cần chú ý, phytohormone có thể tác động lên mô nuôi cấy ở nồng độ rất thấp,
vì vậy cần dùng pipet riêng cho từng loại phytohormone và chú ý rửa cẩn thận các
dụng cụ thủy tinh đã dùng để đựng và pha chế các phytohormone ở nồng độ cao.
Trừ IAA và GA, các phytohormone còn lại được coi là bền vững trong quá
trình hấp vô trùng.
GS.TS. Mai Xuân Lương Khoa Sinh học
Công nghệ Sinh học thực vật
-
21 -
6. Các chất hữu cơ khác.
Nước dừa: chất có hoạt tính trong nước dừa đã được chứng minh là myo-
inozitol và một số aminoacid. Lượng nước dừa dùng trong môi trường nuôi cấy
thường khá lớn, từ 15 đến 20% thể tích môi trường.
Lấy nước dừa ở trái dừa già, lọc trong và bảo quản trong lạnh sâu cho đến khi
dùng. Thời gian bảo quản không quá vài tháng, tốt nhất là sử dụng tươi.
Nước chiết nấm men: là các chế phẩm thường dùng trong nuôi cấy vi sinh vật,
mô tế bào động vật, đã được tiêu chuẩn hóa và bán dưới dạng thương phẩm. Thành
phần hóa học không rõ, trừ một số aminoacid. Lượng thường dùng là 1 gam cho 1
lít môi trường.
7. Chuẩn bò các dung dòch đậm đặc và dung dòch làm việc.
Để thuận tiện cho việc pha các môi trường nuôi cấy (môi trường làm việc)
người ta pha trước các dung dòch đậm đặc, sau đó chỉ cần pha loãng khi sử dụng.
Các dung dòch đậm đặc được bảo quản dài ngày trong tủ lạnh thường hoặc tủ lạnh
sâu.
Hiện nay một số hãng sản xuất hóa chất đã có bán loại môi trường chuẩn bò
sẵn thành gói gồm đủ các thành phần thích hợp với một mục đích nhất đònh, ví dụ,
môi trường MS để nhân giống một số cây cảnh. Khi dùng chỉ cần hòa một gói vào
một lít nước cất, đun sôi là có ngay một môi trường làm việc.
Sau đây chúng ta sẽ làm quen với công việc pha chế môi trường qua ví dụ với
các môi trường MS và White.

Trước hết chúng ta pha các dung dòch đậm đặc (thường gọi là dung dòch mẹ)
A, B, C, D, E, F, G và H với thành phần và nồng độ theo bảng 1 (môi trường MS)
hoặc bảng 2 (môi trường White).
Bảng 1. Thành phần các dung dòch mẹ MS.
Dung
dòch
mẹ

Hóa chất

Nồng độ (g/l)
Số ml dung dòch mẹ
cần cho 1000ml
dung dòch làm việc
A

EDTA
Fe
2
(SO
4
)
3
0,8
0,38
28
B NH
4
NO
3

KNO
3
82,5
95,0
20


C
H
3
PO
3
KH
2
PO
4
KI
Na
2
MoO
4
.2H
2
O
1,24
34,00
0,166
0,050

5
GS.TS. Mai Xuân Lương Khoa Sinh học
Công nghệ Sinh học thực vật
-
22 -
CoCl
2
.6H
2
O 0,005

D
MgSO
4
.7H
2
O
MnSO
4
.4H
2
O
ZnSO
4
.7H
2
O
CuSO
4
.5H

2
O
74,00
4,46
1,72
0,005

5
E CaCl
2
.2H
2
O 88,00 5
F Thiamine.HCl 0,02 5
G NAA 0,10 1
H Kinetin 0,40 0,5
Sau đó, để pha 1 lít môi trường làm việc cần thực hiện các động tác sau:
- Cho khoảng 800ml nước cất vào một cái bình có dunh tích 2 lít;
- Dùng pipet cho 28ml dung dòch mẹ A, 20ml dung dòch mẹ B, 5ml mỗi
dung dòch mẹ C, D,E, F, 1 ml dung dòch mẹ G và 0,5ml dung dòch mẹ H.
Trong khi trộn lẫn các dung dòch cần luôn luôn khuấy đều;
- Thêm 100 ml mezo-inozitol;
- Đo pH và dùng HCl 0,1N và NaOH 0,1N để chỉnh pH đến 6,5;
- Thêm 20g saccharose và khuấy cho tan
- Thêm 6-8g aga-aga;
- Đun sôi cho đến khi tan hết thạch, vừa đun vừa khuấy đều để aga-aga
không bò cháy;
- Chia hỗn hợp dung dòch này vào các ống nghiệm hay bình nón khi còn
đang nóng trong khi aga-aga chưa đông lại.
Bảng 2. Thành phần các dung dòch mẹ White.

Dung
dòch
mẹ

Hóa chất

Nồng độ (g/l)
Số ml dung dòch mẹ
cần cho 1000ml
dung dòch làm việc


A

Ca(NO
3
)
2
.4H
2
O
Na
2
SO
4
KNO
3
KCl
NaH
2

PO
4
.2H
2
O
3,0
2,0
0,80
0,65
0,19


100
B MgSO
4
.7 H
2
O 75,0 10
MnSO
4
.4H
2
O 0,50
GS.TS. Mai Xuân Lương Khoa Sinh học
Công nghệ Sinh học thực vật
-
23 -

C
ZnSO

4
.7H
2
O
H
3
PO
3
KI
CuSO
4
.5H
2
O
Na
2
MoO
4
.2H
2
O
0,30
0,15
0,075
0,001
0,025

10
D Fe
2

(SO
4
)
3
0.25 10
E Thiamine.HCl
Pyridoxine.HCl
0,01
0,01
10

8. Vấn đề lựa chọn môi trường.
Trong nuôi cấy mô tế bào thực vật có hàng trăm loại môi trường khác nhau.
Tuy nhiên có thể chia chúng thành 3 nhóm:
- Môi trường nghèo dinh dưỡng: điển hình là môi trường Knop, môi trường
Knudson C;
- Môi trường trung bình: điển hình là môi trường môi trường White; môi
trườnng B
5
của Gamborg;
- Môi trường giàu dinh dưỡng: điển hình là môi trường Murashige – Skoog
(môi trường MS).
Vì vậy khi bắt đầu nghiên cứu nuôi cấy mô một đối tượng nào đó mà chưa có
tài liệu tham khảo về môi trường để nuôi cấy đối tượng đó thì trước hết cần tiến
hành thí nghiệm thăm dò một trong 3 loại môi trường nói trên để tìm môi trường
thích hợp. Sau khi đã tìm thấy môi trường thích hợp chúng ta có thể từng bước cải
tiến để tự tìm cho mình môi trường thích hợp nhất cho mục đích, đối tượng và nội
dung nghiên cứu. Ví dụ, chúng ta có thể thử tìm tỷ lệ NO
3
-

/NH
4
+
cho từng loại đối
tượng. Với các cây trồng trên cạn người ta thường không dùng NH
4
+
nhưng đối với
một số cây khác có khả năng hấp thu mạnh NH
4
+
như cây lúa thì sử dụng ion này
trong nuôi cấy mô chắc chắn sẽ đem lại kết quả tốt.
Do môi trường MS được xem là môi trường giàu và cân bằng về chất dung
dòch, thích hợp cho nhiều loại cây nên những người tập sự làm nuôi cấy mô thường
bắt đầu bằng môi trường này trước khi tìm ra môi trường riêng của mình.
III. CHỌN VÀ XỬ LÝ MÔ CẤY.
Về nguyên tắc, trừ những mô đã hóa gỗ các mô khác ttrong cơ thể thực vật
đều có thể dùng làm mô cấy. Tuy vậy, các mô còn non như mô phân sinh ngọn,
tượng tầng, chóp rễ, phôi đang phát triển, thòt quả non, lá non, cuống hoa, đế hoa,
mô phân sinh đốt khi nuôi cấy trong môi trường chứa một lượng phytohormone
thích hợp đều có khả năng tạo mô sẹo hoặc tái sinh cây con. Thông thường, để bắt
GS.TS. Mai Xuân Lương Khoa Sinh học
Công nghệ Sinh học thực vật
-
24 -
đầu nghiên cứu nhân giống vô tính một cây nào đó người ta thường dùng chồi nách
hoặc mô phân sinh ngọn.
Cần chú ý rằng tuy mang một lượng thông tin di truyền như nhau, các mô
khác nhau trên cùng một cây có thể cho các mô sẹo phát triển hoàn toàn khác nhau

với khả năng tái sinh chồi, rễ hay toàn cây rất khác nhau. Vì vậy, khi bắt đầu một
chương trình sử dụng phương pháp nuôi cấy mô để chọn giống và nhân giống một
cây nào đó, trước hết cần thí nghiệm tìm hiểu phản ứng của các bộ phận khác nhau
của cây trong nuôi cấy ở các nồng độ phytohormone khác nhau. Ví dụ, đối với cây
mía, kết quả nghiên cứu của nhiều tác giả cho thấy lá non đang còn bọc trong bẹ
và đòng hoa non là mô cấy thích hợp hơn cả cho việc tạo mô sẹo và tái sinh cây
hoàn chỉnh.
Sau khi cấy, mô cấy cần được đặt trong các điều kiện nhiệt độ và ánh sáng ổn
đònh phù hợp với nhu cầu của từng loại mô cấy nhờ các máy điều hoà tự động.



IV. PHÒNG THÍ NGHIỆM NUÔI CẤY MÔ THỰC VẬT.
Nuôi cấy mô thực vật không cần nhiều máy móc đắc tiền Có thể bắt đầu
hoạt động nuôi cấy với các thiết bò tối thiểu gồm nồi hấp vô trùng và buồng cấy vô
trùng hoặc tủ cấy bằng gỗ có trang bò đèn tử ngoại.
1.Cách bố trí phòng thí nghiệm nuôi cấy mô.
Một phòng thí nghiệm nuôi cấy mô hiện đại được thiết kế phù hợp với tính
chất dây chuyền của công việc như mô tả trong hình 1.
1 2 3 4 5
6
10 9 8 7
Hình 1. Sơ đồ một phòng thí nghiệm nuôi cấy mô hoàn chỉnh:
1: Phòng rửa và sản xuất nước cất; 2: phòng sấy, hấp, kho thủy tinh sạch;
3: phòng chuẩn bò môi trường; 4: phòng chuẩn bò mẫu; 5: phòng cấy vô
trùng; 6: phòng ảnh; 7: phòng kính hiển vi; 8,9: phòng sáng; 10: phòng
sinh hóa.
Bên cạnh phòng thí nghiệm phải có hệ thống nhà kính, vườm ươm để trồng
cây lấy nguyên liệu nuôi cấy và cây tái sinh trong ống nghiệm.
2. Các thiết bò chủ yếu của phòng thí nghiệm nuôi cấy mô thực vật.

Một phòng thí nghiệm nuôi cấy mô thực vật cần có các trang thiết bò chủ yếu
sau đây:
GS.TS. Mai Xuân Lương Khoa Sinh học