NGHIÊN CỨU PHƯƠNG PHÁP LÀM GIÀU FLAVONOID TRONG LÁ HỒNG (DIOSPYROS KAKI) BẰNG CÁC CHẤT HẤP PHỤ

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI
TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN
KHOA HÓA HỌC

NGUYỄN HẢI ANH
NIÊN LUẬN:

NGHIÊN CỨU PHƯƠNG PHÁP LÀM GIÀU
FLAVONOID TRONG LÁ HỒNG (DIOSPYROS KAKI)
BẰNG CÁC CHẤT HẤP PHỤ

Người hướng dẫn: 1. PGS.TS. Chu Ngọc Châu
2. TS. Nguyễn Văn Tài
Nơi thực hiện: Khoa Hóa Thực vật - Viện Dược liệu

HÀ NỘI - 2020


LỜI CẢM ƠN
Để hoàn thành đề tài niên luận này, em xin gửi lời cảm ơn đến ban lãnh đạo,
cán bộ cùng các anh chị tại Khoa hóa thực vật- Viện Dược liệu và các thầy cơ tại
Khoa hóa học- Trường Đại học Khoa học tự nhiên- Đại học Quốc gia Hà Nội.
Em xin gửi lời cảm ơn tới PGS.TS. Chu Ngọc Châu, cảm ơn cô đã định hướng
cũng như tin tưởng và giới thiệu cho em có cơ hội được làm thực nghiệm, nghiên cứu
tại Khoa hóa thực vật- Viện Dược liệu.
Em xin gửi lời cảm ơn tới TS. Nguyễn Văn Tài – Trưởng khoa Hóa thực vật,
Viện Dược liệu đã giao đề tài và ln tận tình giúp đỡ về thời gian, kiến thức cũng
như tạo điều kiện cho em trong suốt quá trình thực hiện đề tài niên luận này.
Em xin gửi lời cảm ơn tới TS. Lê Thành Nghị đã tận tình truyền đạt kiến thức
và hướng dẫn, giúp đỡ để em hoàn thành đề tài một cách tốt nhất.
Tuy nhiên do kiến thức và kinh nghiệm bản thân còn hạn chế nên đề tài niên

luận này cịn những thiếu xót, em mong nhận được lời góp ý, chỉ bảo của thầy cơ để
đề tài được hoàn thiện hơn.
Em xin chân thành cảm ơn.

Hà Nội, ngày tháng 5 năm 2020
Sinh viên
Nguyễn Hải Anh

ii


MỤC LỤC

MỞ ĐẦU.................................................................................................................... 1
Chương 1. TỔNG QUAN VỀ LÁ HỒNG........................................................... 2
1.1.Đặc điểm thực vật……...................................................................................... 2
1.1.1 Đặc điểm thực vật chi Diospyros L……………………………………..…… 2
1.1.2 Đặc điểm thực vật của cây hồng (Diospyros kaki)………………..…………3
1.2. Thành phần flavonoid trong lá hồng............................................................... 5
1.3. Tác dụng dược lý............................................................................................ 7
1.3.1. Tác dụng bảo vệ thần kinh.......................................................................... 7
1.3.2. Tác dụng hạ huyết áp................................................................................... 7
1.3.3. Tác dụng chống xơ vữa động mạch.............................................................. 7
1.3.4. Tác dụng chống oxy hóa.............................................................................. 7
1.3.5. Tác dụng hạ đường huyết ............................................................................. 8
1.3.6. Tác dụng chống ung thư .............................................................................. 8
1.3.7. Hoạt động miễn dịch..................................................................................... 8
1.3.8. Tác dụng chống dị ứng .................................................................................. 8
CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU………….…. 9
2.1. Đối tượng nghiên cứu – Nguyên liệu và thiết bị………………………………... 9

2.1.1. Đối tượng……………………………………………………………………. 9
2.1.2. Dung mơi, hóa chất, thiết bị………………………………………………… 9
2.1.2.1. Dung mơi, hố chất, dụng cụ……………………………………………... 9
2.1.2.2. Thiết bị…………………………………………………………………….. 9
2.2. Phương pháp nghiên cứu………………………………………………………. 10
2.2.1. Phương pháp hấp phụ………………………………………………………... 10
2.2.2. Phương pháp HPLC………………………………………………………….. 10
2.2.3. Đường chuẩn Kaempferol và Quercetin……………………………………... 10
2.3. Quy trình thực hiện…………………………………………………………… 12
iii


2.3.1. Chuẩn bị nhựa……………………………………………………………… 12
2.3.2. Chuẩn bị dịch chiết………………………………………………………… 13
2.3.3. Chuẩn bị cột (đối với hấp phụ động) …………………………………….. 13
2.3.4. Quy trình…………………………………………………………………… 14
2.3.4.2.
Hấp
phụ
động…………………………………………………………………………
……… 15
2.3.4.1.

Hấp

phụ

tĩnh…………………………………………………………………………

…….... 16

TÀI LIỆU THAM KHẢO………………………..…………………………….. 17

iv


DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU VIẾT TẮT

HPLC

Sắc kí lỏng hiệu năng cao ( (High Perfomance Liquid
Chromatography)

NXQ

Naoxinquin

HDL

Lipoprotein tỉ trọng cao

LDL

Lipoprotein tỉ trọng thấp

°C

Độ Celcius

D

Diospyros

F

Flavonoid

MDA

Malondialdehyde

CAT

Catalase

SOD

Superoxide effutase

GSH-Px
C30/ C40/ C70/
C80/ C96

Glutathione peroxidase
Cồn 30°/ Cồn 40°/ Cồn 70°/ Cồn 80°/ Cồn 96°/

v


DANH MỤC CÁC BẢNG BIỂU

Bảng 1; Các đặc điểm thực vật của lá hồng……………………………………..…... 3
Bảng 2: Các hợp chất flavonoid chính trong lá hồng ........................................... 5

DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ

Hình 1. Các dạng lá hồng ( Diospyros kaki L.f) ................................................... 2
Hình 2: Cấu trúc hóa học của một số flavonoid chính trong lá hồng..................... 6
Hình 3: Sự phụ thuộc giữa nồng độ và độ hấp thụ quang của Kaempferol........... 11
Hình 4: Sự phụ thuộc giữa nồng độ và độ hấp thụ quang của Quercetin……….... 12

vi


MỞ ĐẦU

Thuốc Tây y có bản chất là các chất hóa học tổng hợp và ln tồn tại hai mặt:
tác dụng có lợi- có thể điều trị bệnh và tác hại- gây ra những tác dụng không mong
muốn cho người bệnh, mà y học gọi là tác dụng phụ. Thuốc Tây y càng đặc trị thì tác
dụng phụ càng nhiều. Gan và thận là những cơ quan thường bị ảnh hưởng nhiều nhất
dẫn đến suy giảm chức năng của hai cơ quan này
Do vậy gần đây trên thế giới đã có xu hướng quay về sử dụng các sản phẩm
thảo dược trong việc phòng bệnh, cải thiện sức khỏe cũng như điều trị những bệnh
mạn tính nhờ ưu điểm là có hiệu quả đáng tin cậy, ít tác dụng khơng mong muốn
Cây hồng và đặc biệt là lá hồng với tiềm năng lớn cũng đang được các nước
như: Trung Quốc, Hàn Quốc nghiên cứu khai thác để sản xuất các sản phẩm chăm
sóc sức khoẻ. Theo nghiên cứu cao chiết lá hồng với hàm lượng flavonoid cao có tác
dụng như: hạ cholesterol, hạ đường huyết, ngăn ngừa sự tăng mỡ máu, chống xơ vữa
mạch máu, tăng lưu lượng máu lên não, phòng chống đột quỵ não. Cây hồng ở Việt
Nam hiện được trồng nhiều ở các vùng đồng bằng và vùng núi; có nhiều chủng được
như là Hồng Lạng Sơn (hồng vng) với quả hình cầu, chín màu vàng lục thịt dịn;

Hồng Hạc ở Hạc Trì, tỉnh Vĩnh Phú có vỏ mỏng không hạt, ruột đỏ da cam. Lợi thế
về số lượng cây trồng cộng với các tác dụng lớn kể trên là lý do để ta quan tâm đến
việc sử dụng lá hồng làm nguyên liệu để phát triển các sản phẩm tăng cường, bảo vệ
sức khỏe.
Qua tìm hiểu về đề tài “Nghiên cứu quy trình chiết xuất cao định chuẩn lá
hồng (Diospyros kaki)” của anh chị khóa trước, nhận thấy với quy mơ nhỏ (5,0 g
dược liệu) thì hàm lượng Flavonoid mà cụ thể là tổng hàm lượng Kaempferol và
Quercetin thu đươc trong cao là 3,35%.. Tuy nhiên hàm lượng này không cao và cũng
không được đồng đều, ổn định do còn phụ thuộc vào chất lượng của dung môi và
nguyên liệu. Điều này đặt ra yêu cầu cần phải có một quy trình làm giâu, nâng cao
hàm lượng flavonoid trong cao lá hồng. Do đó, em thực hiện đề tài “Nghiên cứu
phương pháp làm giàu flavonoid trong lá hồng (Diospyros kaki) bằng các chất hấp
phụ” mà cụ thể ở đây là hạt nhựa D101 với mục tiêu làm giàu và ổn định hàm lượng
flavonoid trong cao lên mức 20%.

1


CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN VỀ LÁ HỒNG

1.1 Đặc điểm thực vật
1.1.1 Đặc điểm thực vật chi Diospyros L.
Chi Diospyros L. gồm các loài là cây gỗ hoặc cây bụi, rụng lá hoặc thường
xanh, lá mọc so le, nguyên. Hoa thường đơn tính, khác gốc hoặc cùng gốc; hiếm khi
lưỡng tính.
Theo hệ thống phân loại thực vật của Takhtajanc [8], vị trí phân loại của chi
Diospyros L được tổng kết như sau:
Giới thực vật (Plantae)
Ngành Ngọc lan (Magnoliophyta)
Lớp Ngọc lan (Magnoliopsida)

Phân lớp Sổ (Dilleniidae)
Liên bộ Đỗ quyên (Ericanae)
Bộ Thị (Ebenales)
Họ Thị (Ebenaceae)
Chi Diospyros
Chi Diospyros L. là chi lớn nhất trong họ Ebenaceae, phân bố chủ yếu ở khu
vực nhiệt dới và một số nơi thuộc khu vực ơn đới, trong đó đa dạng nhất ở là ở khu
vực Đông và Đông Nam Á
Ở Việt Nam, chi Diospyros L. có khoảng 70 lồi; 9 lồi cho gỗ có giá trị sử
dụng, trong đó có gỗ mun (D.mun A.Chev.); hai lồi có quả ăn được là hồng (D.kaki
L.f.) và cậy (D.lotus L.) [10] Ở vùng Đơng – Nam Á, có 2 lồi hồng khác được trồng
là: D. blancoi A.DC mọc hoang dại ở các cánh rừng nguyên sinh hoặc thứ sinh, thuộc
vùng núi thấp, trung bình và D. digyna Jacq có nguồn gốc ở Vùng Trung Mỹ (Mehico
và Guatemala), cây trồng ở Philippin do người Tây Ban Nha đưa vào.

2


1.1.2 Đặc điểm thực vật của cây hồng (Diospyros kaki)
Tên khoa học: Diospyros kaki L.f. - họ Thị ( Ebenaceae)
Tên tiếng Việt: Hồng, Thị đinh, Hồng thị, Mác pháp, Mạy chí (Tày)
Tên nước ngồi: Kaki- persimmon, kakier, plaqueminier kaki, plaqueminier
du Japon.

Bộ phận

Đặc điểm

Cây

Cây rụng lá theo mùa, thường là cuối mùa thu hay đầu mùa đơng, cây có
thể đạt tới độ cao 14m. Vỏ xám đen, các cành tỏa rộng, trên thân có các
vết sần, có lơng tơ ở các nhánh.

Lá

Lá mọc so le, hình trứng hay trái xoan, dài 5- 18 cm, rộng 2.8- 9 cm, đầu
có mũi lồi ngắn, gốc nhọn dần, mặt trên lá màu lục sẫm, mặt dưới có
lơng tơ nhạt.

Cuống lá

Rộng từ 8- 20mm

Hoa

Ra hoa vào tháng 5.
Hoa đực mọc thành xim 3 hoa ở nách lá, có 2 lá bắc, có 14-24 nhị,
thường là 16; hoa cái mọc đơn độc, đài xẻ 5 thùy, bầu có vịi nhụy và 4
ơ, thường có vách giả chia làm 8 ngăn; hoa lưỡng tính thường có từ 8-12
nhị.

Quả

Ra quả vào tháng 9 và tháng 10
Quả mọng 3,5 – 8cm, hình cầu hoặc hình trứng , nhẵn, phẳng hoặc có
sống dọc, mang đài tồn tại cong lên, khi chín màu vàng hoặc đỏ. Hạt dẹt,
màu nâu vàng hoắc nâu đen

Bảng 1; Các đặc điểm thực vật của lá hồng [13]

3


Hình 1 . Các dạng lá hồng (Diospyros kaki): a. lá non
c.lá vàng

b. lá điển hình
d.lá khơ

Phân bố: Hồng được trồng nhiều ở Trung Quốc, Nhật Bản, các nước ASEAN,
ở phía Bắc vùng Địa Trung Hải
Diospyros kaki L.f lồi ngun sản ở Nhật Bản và Trung Quốc, sau được du
nhập sang các nước Đông Nam Á khác như ở vùng Bắc Thái Lan; đảo Java, Sumatra
(Indonesia); Malaysia. Ở Italia,Israel, Brazil, Mỹ (California) cũng trồng loại hồng
này [1].
Nhật Bản và Trung Quốc sản xuất nhiều hồng nhất thế giới. Năm 1986, Nhật
Bản có 27.000 ha cây hồng màu với sản lượng quả là 291.000 tấn. Riêng đảo Sumatra
(Indonesia) mỗi năm thu hoạch khoảng 1500 tấn xuất khẩu sang Singapore hoặc
Israel thường xuyên có khoảng 1500ha trồng [7]. Hồng trồng ở Việt Nam hiện nay
cũng rất phổ biến ở các tỉnh phía Bắc từ Thanh Hóa trở ra và ở phía Nam thì có Đà
Lạt. Tuy nhiên nhiên ở Việt Nam, cây hồng chỉ được trồng chủ yếu để ăn quả.
4


1.2. Thành phần flavonoid trong lá hồng
Flavonoid là thành phần hoạt chất chính trong lá hồng. Lá hồng có chứa nhiều
flavonoid có lợi bao gồm quercetin và phức hợp glycoside của nó ( ví dụ: hyperin và
isoquercitrin), kaempferol và glycoside của nó (astragalin)
Cấu trúc của các flavonoid khác nhau được tìm thấy trong lá hồng được tổng

kết ở bảng sau [13]:

Các hợp chất
Flavonol

1. Quercetin
2. Kaempferol
3. Isoquercetin
4. Myricitrin

Flavonol glucoside

5. Rutin
6. Quercetin -3-O-β-L-arabinopyranoside
7. Quercetin -3-O-β-D-glucopyranoside
8. Quercetin -3-O-β-D-galactopyranoside
9. Kaempferol-3-O-α-L-rhamnopyranoside
10. Kaempferol-3-O-β-D-galactopyranoside
11. Kaempferol-3-β-D-xylopyranoside
12. Kaempferol-3-O–L-arabinopyranoside
13. Kaempferol-3-O-(200-O-galloyl)-β-Dglucopyranoside
14. Myricetin -3-O-α-D-glucopyranoside
15. Quercetin -3-O-β-D-galaetoside (Hyperin)

Bảng 2: Các hợp chất flavonoid chính trong lá hồng
5


Hình 2: Cấu trúc hóa học của một số flavonoid chính trong lá hồng

6


1.3. Tác dụng dược lý
1.3.1. Tác dụng bảo vệ thần kinh
Weijian Bei và cộng sự đã nhận thấy flavonoid trong lá hồng Trung QuốcNaoxinquin (NXQ) có khả năng chống lại sự tổn thương do H2O2 gây ra cho tế bào
thần kinh NG108-05. Kết quả này đề ra triểm vọng sử dụng NXQ để phòng ngừa và
điều trị chấn thương do thiếu máu cục bộ và các bệnh thối hóa thần kinh khác [11].
Nghiên cứu này đã được thử nghiệm trên chuột với mức liều 40 và 80
mg/kg/ngày . Kết quả là làm giảm đáng kể khối lượng nhồi máu não [12].
1.3.2. Tác dụng hạ huyết áp
Tại Nhật Bản, từ lâu lá hồng được sử dụng để điều trị các bệnh tăng huyết áp.
Kameda và các cộng sự đã nghiên cứu tác dụng ức chế của bốn flavonoid
[astragalin, kaempferol-3-O-(2"-O-galloyl)-glucoside, isoquercitrin và quercetin-3O-(2"-O-galloyl)-glucoside] được phân lập từ lá cây hồng có khả năng ức chế ACE
(ức chế men chuyển angiotensin)- giảm huyết áp bằng cách giúp các mạch máu giãn
ra [2].
Qin và cộng sự đã thử nghiệm trên chuột với liều tiêm 20, 40 và 80 mg/kg thể
trọng . Sau 4 tuần, huyết áp giảm đáng kể theo cách phụ thuộc liều [13].
1.3.3. Tác dụng chống xơ vữa động mạch
Dịch chiết lá hồng cho thấy tác dụng chống xơ vữa động mạch bằng cách làm
giảm triglyceide, cholesterol toàn phần và LDL-C, trong khi tăng tỷ lệ HDL trong
huyết thanh ở chuột với chế độ ăn giàu chất béo. ở chuột với chế độ ăn giàu chất béo.
Sự tích tụ các giọt lipid gan ở những con chuột béo phì đã được giảm xuống. Kết quả
chỉ ra nồng độ lipid trong huyết tương và gan đã được cải thiện, một phần thông qua
việc tăng lipid trong phân ở chuột ăn nhiều chất béo. Nó có thể là do tính chất của các
hợp chất phenolic và hàm lượng chất xơ cao trong lá hồng [5].
1.3.4. Tác dụng chống oxy hóa
Lijun Sun và cộng sự đã nghiên cứu về hoạt động chống oxy hóa của tổng
lượng flavonoid trong dịch chiết lá hồng và nhận thấy khả năng loại bỏ các gốc
superoxide anion, các gốc hydroxy tự do (OH) và giảm đáng kể mức độ của các loại

oxy phản ứng và malondialdehyde (MDA) đồng thời làm tăng hoạt động của catalase
(CAT), superoxide effutase (SOD) và glutathione peroxidase (GSH-Px) trong các tế
bào MC3T3-E1 theo cách phụ thuộc liều [6].

7


Weijian Bei và cộng sự đã nghiên cứu và nhận thấy cao chiết NXQ cải thiện sự
suy giảm các chất chống oxy hóa nội sinh như glutathione và GSH-Px cũng như CAT,
đồng thời làm giảm MDA [11].
1.3.5. Tác dụng hạ đường huyết
Một thử nghiệm trên những con chuột mắc bệnh tiểu đường đã được thực hiện:
chúng sử dụng dịch chiết lá hồng hằng ngày bằng đường uống trong 8 tuần. Kết quả
giúp giảm trọng lượng cơ thể mà không cần giảm lượng thức ăn, các thông số lipid
máu, ức chế tích tụ mỡ ở gan đều cải thiện [9].
1.3.6. Tác dụng chống ung thư
Lá hồng có khả năng ức chế gây ung thư ở chuột. Kawakami và các cộng sư đã
nghiên cứu và nhận thấy điều trị bằng PLE (chiết xuất từ lá hồng) và PLEg (200galloly moiety) làm tăng đáng kể độc tính tế bào của doxorubicin (DOX) trong các tế
bào biểu mô tuyến A549. Kết quả cho thấy đây có thể là một chất hữu ích trong điều
trị ung thư bằng hóa trị [4].
1.3.7. Tác dụng miễn dịch
Xie và các cộng sự đã nghiên cứu tác dụng trên hệ thống miễn dịch của một
hợp phần được chiết xuất từ lá hồng. Hoạt tính ức chế của nó đối với miễn dịch dịch
thể có thể làm giảm tác động có hại đến tim mạch bằng cách ức chế sản xuất kháng
thể hoặc giúp cải thiện các nguy cơ viêm tim [13].
1.3.8. Tác dụng chống dị ứng
Có một số chất chống dị ứng trong dịch chiết lá hồng có thể ức chế giải phóng
histamine từ người. Thử nghiệm trên chuột (bằng đường uống) của Muhammad
Kashif và các cộng sự đã cho kết quả về khả năng ức chế sự phát triển của viêm da và
hiện tượng sừng hóa cũng giảm đi đáng kể [3]

8


CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1. Đối tượng nghiên cứu – Nguyên liệu và thiết bị
2.1.1. Đối tượng
Đối tượng nghiên cứu: là mẫu lá hồng được thu hái tại Lạng Sơn, được giám
định tên khoa học là Diospyros kaki L.f bởi khoa Tài nguyên Dược liệu - Viện Dược
liệu.
Thời gian thu hái: tháng 9 năm 2019
Mẫu lá hồng sau khi thu hái được sấy tại 50°C đến khơ và bảo quản trong túi
nylon kín. Mẫu được lưu trữ tại khoa Hóa thực vật –Viện Dược liệu trong điều kiện
nhiệt độ phịng, để nơi khơ ráo, thống mát.
2.1.2. Dung mơi, hóa chất, thiết bị
2.1.2.1. Dung mơi, hố chất, dụng cụ
- Hạt nhựa D101
- Hóa chất: Dung mơi dùng trong chiết xuất là dung môi công nghiệp đã cất lại.
- Các dụng cụ cần thiết trong quá trình thực nghiệm như bình nón, cốc có mỏ,
ống nghiệm, pipet, phễu chiết,...
- Xác định độ ẩm trên máy PRECISA HA60.
- Cân phân tích Precisa XT 220A, độ chính xác 0,0001 g.
- Thu hồi dung môi bằng máy cất quay Rotavapor R-114 của hãng BUCHI.
- Máy rung siêu âm Power Sonic 405.
- Máy ly tâm
- Máy khuấy từ

2.1.2.2. Thiết bị
- Hệ thống sắc kí lỏng hiệu năng cao (HPLC): Shimadzu Detector UV hai

bước sóng.

9


2.2. Phương pháp nghiên cứu
2.2.1. Phương pháp hấp phụ
Hấp phụ là q trình hút khí (hơi) hoặc lỏng trên bề mặt vật liệu xốp nhờ các
lực bề mặt. Các vật liệu xốp được gọi là chất hấp phụ. Chất khí (hơi) hoặc một chất
tan nào đó trong dung dịch có khả năng được làm giàu trên bề mặt chất hấp phụ gọi là
chất bị hấp phụ.
Hấp phụ xảy ra do lực hút (lực Van der Waals, lực hóa trị) tồn tại ở trên và gần
sat bề mặt trong các mao quản.
Quá trình chuyển chất hấp phụ xem như gồm ba giai đoạn:
- Giai đoạn khuyếch tán chất bị hấp phụ từ mơi trường khí hay lỏng đến bề mặt
hạt chất hấp phụ
- Các chất bị hấp phụ khuyếch tán theo mao quản đến bề mặt chất hấp phụ
- Giai đoạn cuối cùng là tương tác hấp phụ
Giai đoạn đầu phụ thuộc vào tính chất vật lý và thủy động lực của mơi trường.
Hai giai đoạn sau phụ thuộc vào tính chất và cấu trúc chất hấp phụ.
2.2.2. Phương pháp HPLC
Sắc kí lỏng hiệu năng cao (HPLC) là một kĩ thuật tách chất dựa trên sự tổng
hợp của nhiều quá trình. Trong cột sắc kí xảy ra những cân bằng động giữa pha tĩnh
và pha động, chất phân tích được vận chuyển và phân bố lại liên tục theo từng lớp
qua chất nhồi cột (pha tĩnh) từ đầu cột tách đến cuối cột tách. Cấu trúc và tính chất
của mỗi chất khác nhau nên tốc độ di chuyển khác nhau, dẫn đến thời gian lưu trên
cột khác nhau. Khi tới cuối cột tách, các chất được phát hiện bởi detector (Detector
được lựa chọn tùy theo bản chát của chất phân tích)
2.2.3. Đường chuẩn Kaempferol và Quercetin.
Việc định lượng K và Q lá hồng được dựa trên kết quả của đề tài: “Nghiên cứu

tạo chế phẩm từ lá hồng (Diospyros kaki) để phòng và hỗ trợ điều trị tai biến mạch
máu não” thuộc “Chương trình khoa học và cơng nghệ trọng điểm quốc gia phát triển
cơng nghiệp hóa dược đến năm 2020”. Đề tài này đã xây dựng được phương pháp
định lượng Q và K trong lá hồng. Chương trình chạy được khảo sát các thơng số phù
hợp cho phân tích định lượng flavonoid tại Khoa Hoá Thực vật – Viện Dược liệu

10


Tiến hành chạy HPLC
Sau khi chuẩn bị mẫu tiến hành chạy HPLC trên hệ thống
Chương trình chạy như sau:
+ Cột tách: Vertisef C18 (250 mm x 4,6 mm, 5 μm)
+ Detector UV-VIS: bước sóng 360 nm
+ Pha động: Dung dịch đệm (A) – Methanol
+ Dung dịch đệm H3PO4 0,43% (A): Hút 3,0 ml H3PO4 85%, định mức chính
xác bằng nước thành 1000 ml, lắc đều, lọc, siêu âm loại bọt khí.
Sau khi tiến hành khảo sát một số điều kiện: thể tích mẫu tiêm vào cột và hệ
dung mơi pha động, thu được kết quả sau:
+ Hệ dung môi pha động: MeOH- H3PO4 0,43% = 55 – 45
+ Tốc độ dịng: 1 ml/phút
+ Thể tích tiêm mẫu: 20 μl
+ Nhiệt độ cột 25oC
Dưới đây là đường chuẩn Kaempferol và Quercetin với chương trình chạy đã
được khảo sát ở trên:

Hình 3: Sự phụ thuộc giữa nồng độ và độ hấp thụ quang của Kaempferol

11

Hình 4: Sự phụ thuộc giữa nồng độ và độ hấp thụ quang của Quercetin

Phương trình đường chuẩn Kaempferol là y = 83101x- 117938 với hệ số
tương quan R² = 0.9998
Phương trình đường chuẩn Quercetin là y = 70003x – 24032 với hệ số tương
quan là R² = 1,0000.

2.3. Quy trình thực hiện
2.3.1. Chuẩn bị nhựa
- Ngâm hạt nhựa D101 trong C96 (24h)
- Lọc, gạn D101
- Rửa lại nhựa D101 bằng nước
- Số gam nhựa được đem đi hấp phụ:
+ Đối với hấp phụ tĩnh: m(D101 ướt)= 3 x m(D101 khô)= 3 x n x m(cao)
(n là tỷ lệ số gam D101 khô/ số gam cao cần khảo sát)
+ Đối với hấp phụ động: m(D101 ướt)= 3 x m(D101 khô)= 8 x m(cao)

12


2.3.2. Chuẩn bị dịch chiết
- Dược liệu lá hồng xay nhỏ (kích thước 2-3 mm)
- Cân 30,0 g lá hồng đã sấy khô được nghiền nhỏ rồi chiết 3 lần với tỉ lệ thể
tích dung mơi/ số gam dược liệu = 10/1; 8/1; 8/1 (10/8/8) lần lượt trong 2h; 1,5h; 1,5h
(2/1,5/1,5)
- Gộp dịch lọc thu được dịch chiết
- Cô để thu hồi dung môi
- Đưa dịch chiết về C40
2.3.3. Chuẩn bị cột (đối với hấp phụ động)

- Chuẩn bị cột sắc ký
- Ngâm D101 với nước rồi cho lên cột
- Ổn định cột
- Đưa dịch chiết lá hồng lên cột ( chạy với tốc độ 0,2-0.4 Bv)

13


2.3.4. Quy trình
30g dược liệu (~9g cao)
Chiết C70
650ml dịch chiết

50ml
dịch chiết

50ml
dịch chiết

550ml dịch chiết
(~7,6g cao)

Cơ
Phân tích

Thúy phân
(Đưa dịch chiết
về C40)
290ml dịch chiết

190ml
C82

Phân tích

Ly tâm

Cắn

Dịch chiết

+C96
Cơ

Dịch chiết
được chia đều
thành 6 phần

Mỗi phần
tương ứng với
1.27g cao

+C96/Me+ HCl
Định mức

Phân tích

14

2.3.4.1. Hấp phụ tĩnh
(1): lấy m(g) nhựa khố bằng 0.10 m(g) cao

Số gam nhựa ướt cần lấy của:

(2): lấy m(g) nhựa khố bằng 0.25 m(g) cao

(1): 0,380g

(2): 0,953g

(3): lấy m(g) nhựa khố bằng 0.50 m(g) cao

(3): 1,905g

(4): 2,858g

(4): lấy m(g) nhựa khố bằng 0.75 m(g) cao

(1)

(2)

(3)

(4)

+ nhựa D101
Khuấy từ (130v/p-12h)
Lắng

Lọc (bông)

D101 (F)

Dịch chiết không hấp phụ

+C70

Cô

Khuấy từ 8h (rửa nhựa)

Cao

Lọc
Dịch chiết

Phân tích

15


2.3.2.2. Hấp phụ động
(5)

(6)

+ 30,48g nhựa D101
Lên cột ( 0,2-0,5 Bv)

D101 (F)

Dịch chiết
khơng hấp
phụ

+ C30 (loại bỏ tạp, tủa)

Phân tích (mF1)

D101 (F)

Dịch chiết C30

Phân tích (mF2)
Phân tích
(mF3)

Dịch chiết C60

D101 (F)

+ C80

Dịch chiết C80

Phân tích (mF4)
Hàm lượng Flavonoid = mF1+ mF2+ mF3+ mF4
(mF là hàm lượng flavonoid thu được sau khi được đem đi phân tích -chạy
HPLC)

16


TÀI LIỆU THAM KHẢO
Tiếng Việt
[1] Bạc Cẩm My, (2014) “Nghiên cứu đặc điểm thực vật, thành phần hóa học
và tác dụng kháng khuẩn của lá cây hồng”.
Tiếng Anh
[2]. Kameda K, Takaku T, Okuda H, Kimura Y, Okuda T, Hatano T, Agata I,
Arichi S. “Inhibitory effects of various flavonoids isolated from leaves of persimmon
on angiotensin converting enzyme activity”. J Nat Prod.
[3]. Kashif, M., Akhtar, N., & Mustafa, R. (2017). “An overview of
dermatological and cosmeceutical benefits of Diospyros kaki and its
phytoconstituents”. Revista Brasileira de Farmacognosia.
[4]. KAWAKAMI, K., NISHIDA, H., TATEWAKI, N., NAKAJIMA, Y.,
KONISHI, T., & HIRAYAMA, M. (2011). “Persimmon Leaf Extract Inhibits the
ATM Activity during DNA Damage Response Induced by Doxorubicin in A549 Lung
Adenocarcinoma Cells” Bioscience, Biotechnology, and Biochemistry.
[5]. Lee, J.S., Lee,M.K., Ha,T.Y., Bok,S.H., Park,H.M., Jeong,K.S., Woo,M.N.,
Do,G.M., Yeo, J.Y., Choi, M.S. (2006). “Supplementation of whole persimmon leaf
improves lipid profiles and suppresses body weight gain in rats fed high-fatdiet”.
Food and Chemical Toxicology.
[6]. Lijun Sun, Jianbao Zhang, Xiaoyun Lu, Liyu Zhang, Yali Zhang, (2011),
“Evaluation to the antioxidant activity of total flavonoids extract from persimmon
(Diospyros kaki L.) leaves”, Food and Chemical Toxicology.
[7]. PROSEA, No2 – Edible fruits and Nuts, (1992).
[8]. Takhtajan A. (2009). Flowering plants, Spinger, Second Edition.
[9]. Ui-jin Bae, Soo-hyun Park, Su-Young Jung, Byung-hyun Park, Soo wan
Chae, 2015 Aug, “Hypoglycemic effects of aqueous persimmon leaf extract in a

murine model of diabetes”, Molecular Medicine Reports.
[10]. V.V.Dung et al., 1996; Vietnam Forest Trees.
[11]. Weijian Bei, Wenlie Penga, Yan Maa, Anlong Xua, (2005), “Flavonoids
from the leaves of Diospyros kaki reduce hydrogen peroxide- induced injury of
NG108-15 cells”, Life Sciences.
17


[12]. Weijian.Bei, W., Peng, W., Zang, L., Xie, Z., Hu, D., & Xu, A, (2007),
“Neuroprotective Effects of a standardized Extract of Diospyros kaki Leaves on
MCAO Transient Focal Cerebral Ischemic Rats and Cultured Neurons Injured by
Glutamate or Hypoxia”. Planta Medica.
[13]. Xie, C., et al., Persimmon (Diospyros kaki L.) leaves: “A review on
traditional uses, phytochemistry and pharmacological properties”, Journal of
Ethnopharmacology (2015)

18