TUYỂN CHỌN VÀ NGHIÊN CỨU ĐẶC ĐIỂM SINH HỌC CỦA MỘT SỐ CHỦNG VI KHUẨN LACTIC NHẰM ỨNG DỤNG LÊN MEN THỨC ĂN THÔ XANH CHO LỢN Giáo viên hướng dẫn ThS NCS Vũ Thị Hạnh Nguyên Sinh viên Phùng Thị Huệ Lớp 1402 Hà Nội 2018 VIỆN ĐẠI HỌC MỞ HÀ NỘI KHOA CÔNG NGHỆ SI

VIỆN ĐẠI HỌC MỞ HÀ NỘI
KHOA CƠNG NGHỆ SINH HỌC

KHĨA

LUẬN

TỐT

NGHIỆP

Đề tài: TUYỂN CHỌN VÀ NGHIÊN CỨU ĐẶC ĐIỂM SINH HỌC
CỦA MỘT SỐ CHỦNG VI KHUẨN LACTIC NHẰM ỨNG DỤNG
LÊN MEN THỨC ĂN THÔ XANH CHO LỢN

Giáo viên hướng dẫn: ThS. NCS. Vũ Thị Hạnh Nguyên
Sinh viên

: Phùng Thị Huệ

Lớp

: 1402

Hà Nội - 2018

VIỆN ĐẠI HỌC MỞ HÀ NỘI
KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC


KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP

Đề tài: TUYỂN CHỌN VÀ NGHIÊN CỨU ĐẶC ĐIỂM SINH
HỌC CỦA MỘT SỐ CHỦNG VI KHUẨN LACTIC NHẰM
ỨNG DỤNG LÊN MEN THỨC ĂN THÔ XANH CHO LỢN

Giáo viên hướng dẫn : ThS. NCS. Vũ Thị Hạnh Nguyên
Sinh viên thực hiện

: Phùng Thị Huệ

Lớp

: 1402

Hà Nội - 2018


Khóa luận tốt nghiệp
02

CNSH 14-

LỜI CẢM ƠN
Trong suốt q trình thực hiện đề tài nghiên cứu trong luận văn này, tơi đã
nhận được sự giúp đỡ tận tình của các thầy cơ và cán bộ phịng Cơng nghệ lên
men, Viện Công nghệ Sinh học, Viện Hàn lâm Khoa học và Cơng nghệ Việt
Nam.
Với tấm lịng chân thành và sự biết ơn sâu sắc nhất, tôi xin được gửi lời cảm
ơn đặc biệt tới ThS. NCS. Vũ Thị Hạnh Nguyên – cán bộ phịng Cơng nghệ lên
men, người đã trực tiếp hướng dẫn, chỉ bảo tơi trong suốt q trình thực hiện đề tài

này.
Đồng thời, tôi cũng xin cảm ơn PGS. TS. Phí Quyết Tiến, Phó Viện trưởng
Viện Cơng nghệ Sinh học, Trưởng phịng Cơng nghệ lên men đã tạo điều kiện để
tơi được thực tập tại phịng Cơng nghệ lên men.
Tôi cũng xin gửi lời cảm ơn các thầy cô giáo trong Khoa Công nghệ sinh
học – Viện Đại học Mở Hà Nội đã đồng hành cùng tôi trong suốt thời gian học tập
và nghiên cứu.
Và cuối cùng, tôi xin được cảm ơn gia đình, người thân và bạn bè đã giúp
đỡ, động viên và là chỗ dựa tinh thần vững chắc cho tôi suốt thời gian qua.
Hà Nội, ngày tháng năm 2018
Sinh viên

Phùng Thị Huệ

Phùng Thị Huệ

3


Khóa luận tốt nghiệp
02

CNSH 14-

MỤC LỤC

Phùng Thị Huệ

4

Khóa luận tốt nghiệp
02

CNSH 14-

DANH MỤC CHỮ CÁI VIẾT TẮT
Chữ viết tắt

Tên đầy đủ

CTAB

Cetyltrimethylammonium bromide

DNA

Deoxyribonucleic acid

FLF

Fermented Liquid Feed

KS

Kháng sinh

LAB

Lactic acid bacteria

OD

Mật độ quang

rDNA

Deoxyribonucleic acid ribosome

SDS

Sodium dodecyl sulfate

TE

Tris – EDTA

VK

Vi khuẩn

VSV

Vi sinh vật

Phùng Thị Huệ

5

Khóa luận tốt nghiệp
02

CNSH 14-

DANH MỤC CÁC BẢNG

Phùng Thị Huệ

6


Khóa luận tốt nghiệp
02

CNSH 14-

DANH MỤC CÁC HÌNH

Phùng Thị Huệ

7


Khóa luận tốt nghiệp
02

CNSH 14-

MỞ ĐẦU

1. Đặt vấn đề
Trong những năm gần đây, chăn nuôi lợn là một trong những ngành kinh tế
mũi nhọn ở nước ta. Các sản phẩm của ngành chăn nuôi không những đã đáp
ứng nguồn thực phẩm cho nhu cầu tiêu dùng trong nước mà còn xuất khẩu thu
ngoại tệ cho kinh tế quốc dân. Trong chăn ni lợn, thức ăn chiếm tới 70% chi
phí và là yếu tố chính quyết định chất lượng, giá thành sản phẩm. Vì vậy việc
chế biến và bảo quản thức ăn vô cùng quan trọng đối với ngành chăn nuôi.
Từ xưa, thức ăn thơ xanh đã đóng vai trị quan trọng đối với người chăn
nuôi lợn. Tùy thuộc chủng loại ngun liệu, thức ăn thơ xanh có thể chứa hầu hết
các chất dinh dưỡng mà vật nuôi cần như protein, các vitamin, khoáng đa lượng
và vi lượng thiết yếu và các chất có hoạt tính sinh học cao... Ở Việt Nam, các
nguồn thức ăn thô xanh rất phong phú như cỏ, rơm, rạ.... Để khơng lãng phí
nguồn ngun liệu này, người ta đã tìm ra biện pháp sử dụng chế phẩm sinh học
để lên men thức ăn thô xanh kết hợp với phế phụ phẩm nông nghiệp để tạo thức
ăn dạng lỏng cung cấp cho chăn nuôi lợn. Đây là một phương thức chăn nuôi
hữu cơ - một giải pháp cơng nghệ phù hợp vì có nhiều ưu điểm vượt trội, đem lại
hiệu quả về kinh tế (năng suất, chất lượng), xã hội (vệ sinh an tồn thực phẩm),
mơi trường (tận dụng hiệu quả nguồn tài nguyên sẵn có).
Nhóm vi sinh vật chủ yếu sử dụng trong công nghệ trên gồm nấm men
Saccharomyces cerevisiae, Bacillus spp., Lactobacillus spp.. Trong đó, vi khuẩn
lactic là nhóm vi khuẩn có khả năng sinh acid lactic do lên men đồng hình và dị
hình, nó cịn có thể sinh hàng loạt các hợp chất có hoạt tính kháng sinh được gọi
chung là bacterioxin gồm nizin, diplocoxin, acidofilin, lactoxindin, lactolin,
brevin,… Các chất này được sử dụng rộng rãi trong bảo quản thực phẩm, trong
chăn nuôi với vai trị là chất kích thích sinh trưởng, ứng dụng trong việc phịng
và trị các bệnh đường tiêu hóa cho người và vật nuôi.
Phùng Thị Huệ


Khóa luận tốt nghiệp

02

CNSH 14-

Từ đó, chúng tơi tiến hành nghiên cứu đề tài “Tuyển chọn và nghiên cứu
đặc điểm sinh học của một số chủng vi khuẩn lactic nhằm ứng dụng lên men
thức ăn thô xanh cho lợn”. Nghiên cứu này góp phần tìm kiếm các chủng vi
khuẩn phù hợp có thể định hướng tạo chế phẩm sinh học lên men và bảo quản
thức ăn thô xanh, tận thu phế phụ phẩm nông nghiệp nâng cao hiệu quả trong
chăn ni và giảm ơ nhiễm mơi trường.
2. Mục đích nghiên cứu
Tuyển chọn, nghiên cứu đặc điểm sinh học và phân loại được chủng vi
khuẩn lactic có hoạt tính probiotic nhằm ứng dụng trong lên men thức ăn thô
xanh cho lợn.
3. Nội dung nghiên cứu
-

Tuyển chọn các chủng vi khuẩn lactic có đặc tính probiotic phù hợp nhằm ứng

-

dụng trong lên men thức ăn thô xanh cho lợn
Nghiên cứu đặc điểm sinh học của chủng vi khuẩn lactic được tuyển chọn
Phân loại chủng vi khuẩn lactic được tuyển chọn

Phùng Thị Huệ


Khóa luận tốt nghiệp
02

CNSH 14-

PHẦN 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1. Thức ăn thô xanh dạng lỏng dùng cho chăn nuôi lợn
Thức ăn thô xanh dạng lỏng (Fermented Liquid Feed, FLF) là thức ăn đã
được trộn với nước ở tỷ lệ khác nhau, từ 1: 1,5 đến 1: 4 (Missotten et al.,
2015). Thức ăn thơ xanh dạng lỏng có thể được sản xuất bằng cách lên men một
hoặc một số loại nguyên liệu như hạt ngũ cốc, nguyên liệu giàu protein, nguyên
liệu tổng hợp khác (bột đậu tương, bột cá, bột xương), sinh khối thực vật... và
phối trộn thức ăn đã lên men này với các thành phần thức ăn không lên men khác
để cung cấp thức ăn hoàn chỉnh cho lợn. Tuy nhiên, phương pháp lên men thức
ăn dạng lỏng có thể gặp một số vấn đề: gây ra mất các chất dinh dưỡng thiết yếu
như vitamin và acid amin, đặc biệt là sinh tổng hợp các acid amin thiết yếu đã
được bổ sung vào thức ăn. Dù vậy, về tổng thể các nghiên cứu cũng đưa ra kết
luận cho lợn ăn nguồn ngũ cốc hoặc thức ăn đã lên men thay vì các loại thức ăn
tổng hợp thơng thường hoặc là thức ăn khô sẽ mang lại hiệu quả về kinh tế, chất
lượng thịt và bảo vệ môi trường (Brooks et al., 2003; Canibe et al., 2012).
Ngoài ra, khi cung cấp thức ăn lỏng lên men đúng cách có thể làm tăng vai
trò của dạ dày như là hàng phòng vệ đầu tiên chống lại các bệnh nhiễm trùng
bằng cách làm giảm pH trong đường tiêu hóa, giúp loại trừ các vi khuẩn gây
bệnh đường ruột. thức ăn lỏng lên men cho lợn đã được chứng minh là cải thiện
hiệu quả trong chăn nuôi đối với lợn con, lợn cai sữa và lợn trưởng thành. Trên
thực tế khi lợn con sử dụng FLF là đã được cung cấp đồng thời nước và thức ăn.
Theo cách này lợn con không cần đào tạo riêng cho việc ăn và uống. Để ức chế
sự phát triển của VSV gây bệnh, thức ăn lỏng lên men phải chứa đủ hàm lượng
acid lactic. Việc sản xuất acid lactic có thể phát sinh từ quá trình lên men tự
nhiên hoặc bằng cách bổ sung vào thức ăn VK lactic trước khi lên men
(Missotten et al., 2015).

Phùng Thị Huệ

10


Khóa luận tốt nghiệp
02

CNSH 14-

1.2. Vi sinh vật trong sản xuất thức ăn thô xanh dạng lỏng
Hệ VSV trong thức ăn dạng lỏng thông thường đạt 10 6-107CFU/ml (Royer
et al., 2003). Lên men thức ăn cho lợn hoàn chỉnh thường thông qua 3 pha. Trộn
nguyên liệu với nước pH > 6 cho phép sự tăng nhanh của trực khuẩn đường ruột
(Pha 1) ( Russell et al., 1996). Lên men bằng LAB, ức chế vi khuẩn gây bệnh
nhờ acid hữu cơ (1 phần acid lactic), hydrogen peroxide và bacteriocin (chất
kháng khuẩn tự nhiên) và làm giảm pH (Lindgren và Dobrogosz, 1990). Sau khi
lên men thức ăn, pH xuống ~ 4.0 giúp hạn chế sự phát triển của các vi khuẩn
thuộc chi Enterobacteriaceae và các vi khuẩn gây bệnh đường ruột khác (Pha 2)
(Russell et al., 1996). Tiếp theo, quần thể LAB giúp ổn định pH, mật độ nấm
men trong thức ăn tiếp tục tăng nhờ sử dụng các nguồn protein trong nguyên liệu
thô xanh (Pha 3) (Plumed‐Ferrer và Von Wright, 2009), giúp thức ăn ổn định và
tăng cường hàm lượng protein nấm men đơn bào (yeast single cell protein) trong
thức ăn.
Chất lượng của FLF có thể được cải thiện khi bổ sung vi khuẩn sinh axit
lactic (Missotten et al., 2009). Khi bổ sung vi khuẩn lactic vào thức ăn dạng hạt
sẽ giúp làm lỏng thức ăn và tạo thành một hỗn hợp thức ăn hoàn chỉnh (Brooks,
2008). Chủng vi khuẩn được sử dụng cho sản xuất phải có khả năng sinh axit
lactic cao để ức chế các loại VSV gây bệnh trong hệ tiêu hóa (Winsen et al.,
2000). Theo nhiều nghiên cứu đã chọn các chủng vi khuẩn axit lactic để sản xuất

thức ăn chăn nuôi lên men cho lợn (Missotten et al., 2009). Năm 2009, Missotten
và cộng sự đã tìm thấy 146 chủng vi khuẩn có khả năng kiểm sốt Salmonella có
trong FLF. Vi khuẩn LAB thường được sử dụng trong sản xuất FLF là
Lactobacillus plantarum và Pediococcus spp. (Missotten et al., 2010).
Đa dạng nấm men trong FLF khá cao và đã được công bố trong một số
nghiên cứu. Tại châu Âu, khi lên men sản xuất FLF từ ngũ cốc, phế phụ phẩm
Phùng Thị Huệ

11


Khóa luận tốt nghiệp
02

CNSH 14-

nơng nghiệp các lồi nấm men chủ yếu được phân lập và bổ sung vào mẻ lên
men sau chủ yếu gồm Pichia galeiformis, Pichia membranifaciens và Pichia
anomala. Trong một vài nghiên cứu khác, nấm men chủ yếu sử dụng là Pichia
fermentans. Tuy nhiên, một số nghiên cứu tại Châu Á sản xuất FLF từ nguyên
liệu thức ăn thô xanh sử dụng chủ yếu Candida milleri (60%), Kazachstania
bulderi (20%), Saccharomyces cerevisiae (20%). Đối với vi sinh vật phân giải
chất xơ, vi khuẩn thuộc chi Bacillus, chủ yếu là Bacillus subtilis, B.
licheniformis, B. amyloliquefaciens được sử dụng. Nhóm vi khuẩn này vừa có
hoạt tính phân giải chất xơ, giàu enzym thủy phân và có hoạt tính probiotic (Gori
et al., 2011).
Theo một số cơng bố, q trình lên men sẽ hiệu quả hơn khi sử dụng
khoảng 20% thức ăn đã được lên men để dùng làm giống cho lên men các mẻ
thức ăn tiếp theo (Salovaara, 1998; Nout et al., 1989). Tuy nhiên, việc này sẽ dẫn
đến sự phát triển nhanh chóng của các lồi nấm men, tùy thuộc vào lồi nấm

men phát triển sẽ có tác động tích cực hoặc tiêu cực đến chất lượng của thức ăn
được lên men (Missotten et al., 2010). Vì vậy, quá trình lên men thức ăn chịu tác
động của nhiều yếu tố như: tỷ lệ và chủng loại VSV bổ sung, lượng chất dinh
dưỡng và các thông số khác … (Missotten et al., 2010; Canibe et al., 2012).
1.3. Tổng quan về probiotic
1.3.1.

Lịch sử nghiên cứu probiotic
Lịch sử nghiên cứu probiotic bắt đầu trong những năm cuối thế kỷ 19, khi
các nhà vi sinh vật học phát hiện ra sự khác biệt giữa hệ VSV trong ống tiêu hóa
của người bệnh và người khỏe mạnh. Hệ vi sinh vật có ích trong hệ thống ống
tiêu hóa được gọi là probiotic.
Năm 1870, khi nghiên cứu tại sao những người nơng dân Bungary có sức
khỏe tốt, nhà sinh lý học người Nga Eli Metchnikoff đã đưa ra thuật ngữ
Phùng Thị Huệ

12


Khóa luận tốt nghiệp
02

CNSH 14-

“probiotic” có nguồn gốc từ Hy Lạp, theo nghĩa đen là “vì cuộc sống” để chỉ
những vi sinh vật đã được chứng minh có ảnh hưởng tốt đến sức khỏe của người
và động vật. Năm 1925, Beach là người đầu tiên có những nghiên cứu thực
nghiệm về thức ăn có chứa "Lactobacilius acidophilus" (Kim et al., 2001).
Năm 1968, King đã nghiên cứu thành công trong việc kích thích sự tăng
trưởng của heo bằng thức ăn có bổ sung L. acidophilus (King, 1968).

Theo Kim và cộng sự thì “Probiotic là chế phẩm sinh học hay là thức ăn bổ
sung có chứa tế bào VK sống hoặc những phần tử của VK mà nó ảnh hưởng có
lợi cho sức khoẻ của vật chủ” (Kim et al., 2001).
Một định nghĩa khác về probiotic là “các vi sinh vật sống có ích cho sức
khỏe của vật chủ khi được bổ sung một lượng vừa đủ” (Stackebrandt et al.,
2002). Đây là những nhóm VK sống trong đường tiêu hóa của người, chúng tạo
thành một khu hệ VSV, cản trở sự phát triển của một số VSV gây bệnh, cung cấp
cho con người một số chất có lợi cho cơ thể, ảnh hưởng tốt đến hệ miễn dịch.
Con người sử dụng các chế phẩm probiotic như một loại thực phẩm, thuốc phòng
và chữa bệnh (Stackebrandt et al., 2002).
1.3.2. Thành phần và đặc điểm của vi sinh vật được sử dụng trong probiotic
Vi sinh vật được sử dụng làm probiotic gồm nhiều nhóm khác nhau như vi
khuẩn, xạ khuẩn, nấm men, nấm mốc. Tuy nhiên, vì những đặc tính ưu việt của
vi khuẩn lactic (LAB) phù hợp với việc tạo chế phẩm probiotic cho người cũng
như vật nuôi nên thành phần của hầu hết các chế phẩm probiotic hiện nay chủ
yếu là các chủng LAB.
Những VK lactic có lợi thường được sử dụng trong các chế phẩm probiotic
như L. acidophilus, Lactobacillus deibrueckii subs, Lactobacillus casei, L.
plantarum, Lactobacillus bulgaricus, Bifidobacterium breve, Enterococcus
faecium,... (Vinderola et al., 2002).

Phùng Thị Huệ

13


Khóa luận tốt nghiệp
02

CNSH 14-

Trong probiotic cịn có một số loài như Bacillus subtilis, Bacillus clausii (vi
khuẩn), S. cerevislae (nấm men), Aspergillus niger và Aspergillus oryzae (nấm
mốc) (Power và Moore, 1994).
Các VK lactic trong chế phẩm probiotic có khả năng bám chặt vào màng
nhầy của ruột, ức chế sự bám của vsv gây bệnh. Chúng sản xuất các acid lactic
làm giảm pH đường ruột, tạo môi trường không thuận lợi cho vsv có hại phát
triển. Ngồi ra, chúng cịn sản xuất chất kháng sinh, sinh H 2O2, sản xuất các
enzym tiêu hóa (amylase, cellulase, lipase, protease), các vitamin (B 1, B2, B6,
B12), khử độc tố trong đường ruột (Carbonelle et al., 1987; Kim et al., 2001).
Nấm men trong chế phẩm probiotic tạo ra sinh khối chứa acid amin, các
vitamin nhóm B, hấp thu độc tố và bài thải ra ngoài. Chúng chuyển hóa glucose
thành acid pyruvic là cơ chất cho các VSV có lợi hoạt động và sinh sản. Ngồi
ra, chúng cịn tiết các enzym tiêu hóa như amylase, protease,...
Nấm mốc trong chế phẩm probiotic có vai trị tạo sinh khối chứa nhiều acid
amin, sản xuất amylase, protease nhằm làm tăng khả năng tiêu hóa thức ăn ở vật
ni (Carbonelle et al., 1987).
1.3.3. Vai trị của probiotic trong chăn ni
Sử dụng probiotic trong chăn nuôi gia súc và gia cầm sẽ làm tăng hiệu quả
kinh tế cho người sản xuất. Phần lớn chế phẩm probiotic đều bao gồm một hay
nhiều chủng VK lactic có chức năng cải thiện khu hệ VSV đường ruột, nâng cao
chất lượng sản phẩm, tận dụng thức ăn, … Hệ VSV đường ruột của động vật
trong đó có các VK lactic có một vai trị quan trọng trong sự tiêu hóa và hấp thu
thức ăn của vật chủ. Nó sản sinh nhiều acid lactic, acid acetic, acid pyruvic, acid
propionic, do đó có tác dụng ức chế VSV gây bệnh đường ruột. Ngồi ra, nó cịn
có vai trị quan trọng là tổng hợp vitamin nhóm B, vitamin nhóm K, sản sinh các
enzym (amylase, pectinase, cellulase) làm tăng khả năng tiêu hóa chất dinh

Phùng Thị Huệ

14


Khóa luận tốt nghiệp
02

CNSH 14-

dưỡng. Bên cạnh đó, độc tố đường ruột được sinh ra bởi các VK gây bệnh có thể
được trung hịa bởi probiotic.
Bảng 1.1. Ảnh hưởng của probiotic lên vật nuôi (Kim et al., 2001)
Vật nuôi
Probiotic
Liều sử dụng
Ảnh hưởng
Bò đực cai sữa Bifidobacterium
1 g/ngày
Giảm sự xuất hiện bệnh tiêu
pseudolongum
chảy
Heo còn bú
Bifidobacterium
0,5 g/ngày
Giảm sự xuất hiện bệnh tiêu
pseudolongum
chảy, sức khỏe tốt
Heo cai sữa
Lactobacillus
500 ml/ngày Tỷ lệ % Escherichia coli thấp
bulgaricus

36 g/ngày
ở trực tràng, giảm tỷ lệ chết ở
heo
1.4. Một số loài vi khuẩn lactic thường sử dụng trong chăn ni
Lactobacillus acidophilus: là vi khuẩn probiotic có mặt trong hầu hết các
men tiêu hóa. Lần đầu tiên được phân lập bởi Moro từ phân của trẻ sơ sinh đã
qua phẫu thuật. Có dạng hình que kích thước từ 0,5-1 x 2-10 µm, là vi khuẩn
gram dương, đi theo cặp hoặc dạng chuỗi ngắn. Đây là LAB ưa nhiệt, có thể phát
triển ở 45oC. L. acidophilus có lợi đối với hệ VSV đường ruột. Chúng có khả
năng sống 2 ngày trong dịch vị, 5 ngày trong dịch mật tinh khiết và 8 ngày trong
dịch ruột. Hiện nay, người ta sử dụng sinh khối chủng này như là một loại thuốc
để chữa các bệnh như chứng rối loạn đường tiêu hóa, tiêu chảy cấp tính hoặc
mãn tính, táo bón, trướng bụng, hoặc do dùng kháng sinh, dùng hoa trị làm phá
vỡ sự cân bằng của hệ VSV đường ruột (Paula et al., 1999).
Lactobacillus bulgaricus: đây là loài VK quen thuộc, cư trú thường xuyên
trong ruột người và động vật, cùng với các lồi VK khác tạo thành một khu hệ
VSV khơng thể thiếu. L. bulgaricus đã được ứng dụng cho lên men sữa chua từ
rất lâu (Carr et al., 2002).
Lactobacillus casei: trực khuẩn nhỏ, có kích thước rất ngắn. Chúng có thể
tạo thành chuỗi, khơng chuyển động, gram dương. Chúng có khả năng lên men
Phùng Thị Huệ

15


Khóa luận tốt nghiệp
02

CNSH 14-

được các loại đường glucose, fructose, mannose, galactose, maltose, lactose,
salicin. Trong quá trình lên men chúng tạo thành acid L-lactic với nồng độ
khoảng 180 g/l trong tổng số 210 g/l acid lactic (Carr et al., 2002).
Lactobacillus kefir: có chứa nhiều tryptophan là một trong những acid amin
quan trọng có tác dụng an thần. Ngồi ra, chúng cũng có thể cung cấp nhiều Ca
và Mg, là những khoáng chất rất quan trọng cho hệ thần kinh. Chúng cung cấp
photpho, carbonhydrat, chất béo và các protein giúp tế bào cơ thể phát triển và
duy trì năng lượng. Trong thành phần tế bào VK còn chứa nhiều vitamin B 1, B12,
K rất tốt cho da (Carr et al., 2002).
Lactobacillus delbruckii: có thể lên men được các loại đường glucose,
maltose, fructose, galactose và dextrin. Chúng khơng có khả năng lên men
xylose, arabinose, rhamnose, lactose, raffinose, trehalose, inulin, mannitol. L.
delbrukii sản xuất 90% là acid L- lactic từ nguồn đường glucose. Trong thành
phần tế bào có chứa các chất khống, acid amin quan trọng giúp cơ thể nhanh
chóng hồi phục sức khỏe (Carr et al., 2002).
Lactobacillus sporogenes: VK này đóng vai trị quan trọng trong q trình
tiêu hóa và biến dưỡng của con người. Ổn định ở nhiệt độ phòng, tăng sinh rất
nhanh trong ruột. Quá trình lên men tạo acid L (+) lactic, cung cấp phức hợp
vitamin B và các enzym tiêu hóa như protase, lipase, amylase, lactase,… Chúng
cũng sản xuất bacteriocin, giúp kiểm soát sự tăng trưởng vượt mức của những
nhóm VSV gây thối trong ruột, duy trì sự cân bằng pH acid (Carr et al., 2002).
Streptococcus faecalis: tế bào hình cầu, đường kính nhỏ hơn 1 µm, thường
xếp dạng đôi hoặc 4 tế bào. Phát triển tốt ở nhiệt độ từ 20 oC – 40oC. Nhiệt độ tối
thích cho sự tăng trưởng là 37 oC. Chúng có thể phát triển trong điều kiện vi hiếu
khí hoặc kị khí, 6,5% NaCl, pH 9,6 và trong sữa chứa 0,1% xanh methylen. Khử
cacboxyl tyrozin, khơng dịch hóa gelatin. Lên men lactic đồng hình tạo ra lượng
acid khoảng 90 - 95%. Trong điều kiện pH trung tính, VK này cịn tạo ra một số
chất có khả năng kháng khuẩn như ethanol, acid acetic, diacetyl, H 2O2. Một số
Phùng Thị Huệ

16


Khóa luận tốt nghiệp
02

CNSH 14-

chủng sinh bacteriocin dạng cytolysin, streptococcin và nisin. Hiện nay, người ta
thường sử dụng chủng Streptococcus faecalis cùng với Lactobacillus
acidophilus và Bifidobacterium trong chế phẩm probiotic trị bệnh tiêu chảy cho
heo (Teuber et al., 1999).
Pediococcus: các dịng Pediococcus được tìm thấy trong thực phẩm, thực
vật. Chúng sản xuất acid lactic và được dùng chủ yếu trong lên men dưa cải,
nước ủ rượu, bia và hèm rượu. Là dòng LAB đặc biệt, giúp cân bằng hệ VK
đường ruột (Cai et al., 1999).
1.5. Đánh giá hoạt tính probiotic của các chủng vi khuẩn lactic sử dụng
trong lên men thức ăn thô xanh
Các VK được sử dụng làm probiotic phổ biến nhất là các VK lactic như
Bifidobacterium spp., L. acidophilus. Đây là các VK hiện diện bình thường trong
ruột người, động vật và có khá nhiều tài liệu nghiên cứu về hoạt tính probiotic
của chúng: khả năng sinh acid lactic, khả năng sinh các hợp chất kháng khuẩn,
kháng kháng sinh, chịu pH acid,... Vì vậy, VK lactic có nhiều đặc tính phù hợp
để tạo chế phẩm sinh học.
1.5.1. Khả năng sinh acid lactic
Trong nhiều nghiên cứu cho thấy, LAB có hoạt tính kháng khuẩn trên diện
rộng. Trong số các hoạt tính này, khả năng sản xuất acid lactic và acid acetic
được xem là quan trọng nhất. Trong quá trình lên men, LAB sinh ra sản phẩm
chủ yếu là acid lactic tạo ra mơi trường khơng thích hợp cho sự phát triển của
những VSV gây bệnh hay gây hư hỏng sản phẩm, tác động lên màng tế bào chất

của VK, ảnh hưởng đến chức năng bảo vệ và chức năng dinh dưỡng của màng tế
bào, ức chế quá trình vận chuyển chủ động của màng tế bào. Acid lactic dễ dàng
thấm qua màng tế bào, làm giảm pH nội bào hoặc tự oxi hố, làm ngưng q
trình trao đổi chất, gây chết những tế bào nhạy cảm với nó, loại trừ những VSV
Phùng Thị Huệ

17


Khóa luận tốt nghiệp
02

CNSH 14-

gây hại trong đường ruột. Chẳng hạn như các VSV gây bệnh như E. coli (gây
viêm ruột ở động vật non và trẻ em), Salmonella typhimurium, Salmonella
cholerasuis (gây bệnh thương hàn),… (Lee et al., 2009). Winsen và cộng sự đã
chỉ ra rằng nồng độ acid lactic là chất chính chịu trách nhiệm về tác dụng kháng
khuẩn của FLF (Winsen et al., 2000). Các chủng được sử dụng như là chế phẩm
vi sinh để sản xuất FLF cần có khả năng sản xuất acid lactic cao để hoạt động
chống lại các bệnh đường ruột (Winsen et al., 2001). Do đó, một số nghiên cứu
đã được tiến hành để lựa chọn các chủng lactic có ích để sản xuất thức ăn lỏng
lên men lợn. Ví dụ, Missotten đã kiểm tra 146 chủng vi khuẩn về khả năng
kháng Salmonella (Missotten et al., 2007). Các loài vi khuẩn thường được sử
dụng để bổ sung vào thức ăn gia súc để sản xuất thức ăn lỏng lên men là L.
plantarum và Pediococcus spp. (Missotten et al., 2010).
1.5.2. Khả năng sinh các hợp chất kháng khuẩn
Vi khuẩn lactic có hoạt tính kháng khuẩn diện rộng do có khả năng sản xuất
ra các chất ức chế: như một số acid hữu cơ, hydrogen peroxide, diacetyl, các chất
có khối lượng phân tử thấp và bacteriocin (Lê Ngọc Thùy Trang, 2014).

1.5.2.1. Bacteriocin
Bacteriocin là các peptide được sản sinh tự nhiên bởi một vài VK để ức chế
sự phát triển của các VSV cạnh tranh khác, chúng có phổ kháng khuẩn hẹp, chủ
yếu là ức chế các loài gần với các chủng sản sinh bacteriocin (Parada et al.,
2007). Bacteriocin có thể được tìm thấy ở nhiều loại VK khác nhau, tuy nhiên
bacteriocin sinh ra bởi LAB vẫn thu hút được sự chú ý đặc biệt của các nhà khoa
học bởi tính an tồn và tác dụng ức chế nhiều VK gây bệnh nguy hiểm như
Staphylococcus aureus, Listeria monocytogenes,… (De Vuyst et al., 2007).
Trong số khoảng 200 bacteriocin đã được mô tả cho đến nay, bacteriocin từ LAB
chiếm tới 90% (Desriac et al., 2010). Trong những nghiên cứu gần đây cho thấy
Phùng Thị Huệ

18


Khóa luận tốt nghiệp
02

CNSH 14-

một số bacteriocin có phổ kháng khuẩn rộng, có khả năng ức chế cả VK Gram
âm và VK Gram dương (Carbonelle et al., 1987). Bacteriocin được cho là đóng
vai trị quan trọng trong hoạt động của các probiotic, là một trong các tiêu chí lựa
chọn chủng vi sinh vật làm probiotic. Đã có nhiều giả thiết được đưa ra về cơ chế
bacteriocin tham gia vào hoạt động của probiotic. Một là, bacteriocin giúp
probiotic xâm nhập và chiếm ưu thế trong hệ VSV đường ruột. Hai là,
bacteriocin thể hiện tác dụng kháng khuẩn, trực tiếp ức chế các VK gây bệnh. Ba
là, bacteriocin mang tín hiệu kích thích hệ miễn dịch của lợn (Dobson et al.,
2012). Chẳng hạn, khi cho lợn Đại Bạch (Large White pig) sử dụng
Lactobacillus fermentum 14 kết hợp với Streptococcus salivarius 312, sẽ làm

giảm số lượng lớn E. coli trong dạ dày và tá tràng. Khi chỉ dùng L. fermentum
14, cũng có tác dụng làm giảm số lượng E. coli trong dạ dày (Barrow et al.,
2001).
1.5.2.2. Các hợp chất kháng khuẩn khác
Kháng khuẩn do sinh H2O2: Một số chủng LAB như L. lactics, Leuconostoc
cremoris có thể sản sinh H2O2 (hydrogen peroxide) khi chuyển từ mơi trường kị
khí sang hiếu khí. Vì VK lactic khơng có catalase nên trong điều kiện có oxygen,
chúng sẽ sinh ra H2O2. Dahiya và cộng sự đã chứng minh khả năng ức chế
Staphylococus aureus của chủng L. lactic nhờ khả năng sinh ra H2O2 (Dahiya et
al., 1968).
Kháng khuẩn do sinh diacetyl: Diacetyl được sinh ra bởi nhiều loài VK
lactic. Đây là chất có khả năng ức chế sự phát triển nhiều VSV gây bệnh. Hoạt
tính ức chế này tăng lên trong môi trường acid, ức chế mạnh hơn đối với VK
Gram âm và nấm mốc, đặc biệt với M. turberculosis (VK gây bệnh lao). Tuy
nhiên, nồng độ tối thiểu có tác dụng của chúng thường cao hơn mức thường thấy
trong thực phẩm. Vì vậy, tác dụng của riêng diacetyl khơng thể giải thích cho
khả năng kháng khuẩn của VK lactic (DeVuyst et al., 1994).
Phùng Thị Huệ

19


Khóa luận tốt nghiệp
02

CNSH 14-

1.5.3. Khả năng kháng kháng sinh
Kháng sinh đã được sử dụng rộng rãi để thúc đẩy tăng trưởng và dự phịng
tiêu chảy ở động vật ni (Thacker, 2013). Là một chất phụ gia thông dụng trong

thức ăn chăn ni, kháng sinh góp phần nâng cao hiệu quả kinh tế. Tuy nhiên,
những tác động tiêu cực của kháng sinh ngày càng trở nên nổi bật. Người tiêu
dùng đang ngày càng quan tâm đến dư lượng kháng sinh trong các sản phẩm thịt
(Vondruskova et al., 2010). Hơn nữa, việc sử dụng kháng sinh liên tục có thể dẫn
đến thay đổi sự cân bằng hệ VSV của ruột và gây ra một vài ảnh hưởng xấu có
thể tồn tại lâu dài ngay cả sau khi ngưng sử dụng cách điều trị này. Việc sử dụng
kháng sinh như chất kích thích tăng trưởng đã bị cấm ở nhiều quốc gia, chẳng
hạn như Liên minh Châu Âu và Nhật Bản. Ngoài ra, các nước khác bao gồm cả
Trung Quốc và Hoa Kỳ đang cấm hoặc có kế hoạch cấm việc đưa kháng sinh vào
khẩu phần của lợn. Chính vì vậy, việc sử dụng probiotic thường được chỉ định
uống trong thời gian điều trị bệnh bằng kháng sinh, để phòng mất cân bằng hệ
VSV trong đường ruột. Do đó, các chủng dùng làm probiotic cần phải có khả
năng chịu đựng được kháng sinh.
1.5.4. Khả năng chịu muối mật
Vi sinh vật probiotic khi được bổ sung vào cơ thể qua đường tiêu hóa,
chúng tác động thông qua một số cơ chế khác nhau. Tuy nhiên, để có thể tác
động lên hệ tiêu hóa vật chủ thì trước hết chúng phải có khả năng sống sót ở điều
kiện khắc nghiệt trong đường tiêu hóa như pH acid, muối mật,…
Muối mật được coi là chất kháng khuẩn trong đường tiêu hóa, bảo vệ ruột
khỏi sự xâm nhập của các VSV gây bệnh. Ở hầu hết các sinh vật (bao gồm
người), quá trình tổng hợp muối mật chủ yếu thông qua sự tiêu thụ cholesterol.
Cơ thể tổng hợp khoảng 8 mg cholesterol một ngày và dùng 4 mg cholesterol để
tổng hợp muối mật. Tổng cộng có khoảng 20-30 g muối mật tiết vào ruột mỗi
ngày ( />Phùng Thị Huệ

20


Khóa luận tốt nghiệp
02

CNSH 14-

Do vậy, khi thức ăn cùng VSV từ dạ dày chuyển xuống vùng ruột. Tại đây,
chúng chịu sự tác động của muối mật. Khi muối mật đi vào khu vực tá tràng thì
số lượng VSV sẽ giảm. Khả năng chịu đựng muối mật là một trong những đặc
tính cần thiết của VSV có hoạt tính probiotic (Stackebrandt et al., 2002).
1.5.5. Khả năng chịu pH acid
Đây là yếu tố cần thiết để tạo sự thích nghi ban đầu. Các nhà khoa học đã
chứng minh, các probiotic phải trải qua các q trình tiêu hóa khắc nghiệt hơn 90
phút trước khi được giải phóng từ dạ dày vào ruột. Tuy nhiên, các q trình tiêu
hóa có thời gian xảy ra lâu hơn nên VSV probiotic phải chống lại được các điều
kiện áp lực của dạ dày với pH acid đến khoảng 1,5. Do đó, các chủng được chọn
lọc để sử dụng như trong chế phẩm probiotic cần phải chịu được mơi trường pH
acid ít nhất 90 phút. Khả năng sống sót ở pH 3,0 trong 2 giờ và nồng độ acid
1000 mg/l được xem như là khả năng chịu acid tối ưu đối với các chủng
probiotic (Liong et al., 2005).
Tiếp đến, chúng phải gắn vào biểu mô và phát triển được trong ruột trước
khi chúng có thể bắt đầu phát huy vai trò đối với sức khỏe vật chủ.
Ngoài ra, VSV probiotic phải chống lại được các enzym trong đường miệng
như lysozyme. Vì vậy, khả năng chịu acid là một trong những tính chất để sàng
lọc khi muốn tuyển chọn các dịng probiotic (Liong et al., 2006).
1.6. Tình hình nghiên cứu và sử dụng các chủng vi khuẩn lactic trong lên
men thức ăn thô xanh
Với đặc điểm sinh lý, sinh hóa ưu việt, VK lactic là một nguồn gen phong
phú, được ứng dụng rộng rãi trong nhiều lĩnh vực khác nhau như: trong công
nghiệp thực phẩm, trong lĩnh vực công nghệ sinh học, trong lĩnh vực y học,…
Đặc biệt là trong chăn nuôi, con người đã sử dụng chúng một cách hiệu quả
trong việc tạo ra nhiều chế phẩm probiotic giúp phòng và điều trị một số bệnh
đường tiêu hóa ở gia súc - gia cầm,…

Phùng Thị Huệ

21


Khóa luận tốt nghiệp
02

CNSH 14-

1.6.1. Tình hình nghiên cứu trong nước
Tại Việt Nam, một số cơ sở nghiên cứu đã sản xuất và thử nghiệm chế
phẩm VSV để lên men thức ăn gia súc, sử dụng làm probiotic phục vụ cho đời
sống dân sinh nói chung và chăn ni nói riêng còn rất mới mẻ và bắt đầu được
quan tâm trong khoảng một thập kỉ gần đây. Năm 2002, Phạm Khắc Hiếu và
cộng sự nghiên cứu tác dụng kháng khuẩn của chế phẩm EM1 trên lợn con đã
cho thấy phế phẩm EM1 có tác dụng ức chế đối với E. coli, Salmonella,
Klebsiella, Shigella, Proteus, Staphylococcus, Streptococccus, Clostridium,
Sarcina lutea (Phạm Khắc Hiếu và cộng sự, 2002). Năm 2003, Phạm Thị Ngọc
Lan và Lê Thanh Bình đã phân lập được hai trong số 789 chủng VK lactic trong
ruột gà. Bằng các phương pháp nghiên cứu sinh học phân tử, nhóm tác giả đã
xác định được các chủng CH123 và CH156 có những tính chất probiotic gần với
Lactobacillus agillis và Lactobacillus salivarius (có khả năng đề kháng được với
40% acid mật, sinh trưởng ở môi trường pH = 4,0 và nồng độ NaCl= 6%, có hoạt
tính đối kháng với Salmonella, E. coli) được ứng dụng trong chăn nuôi (Phạm
Thị Ngọc Lan và Lê Thanh Bình, 2003). Cũng trong năm 2003, Nguyễn Thị
Hồng Hà và cộng sự đã sử dụng hai chủng Bifidobacterium bifidum và L.
acidophilus để sản xuất chế phẩm probiotic, bước đầu đã nghiên cứu được công
nghệ sản xuất bằng phương pháp sấy phun. Chế phẩm sau 6 tháng vẫn có số tế
bào VK sống ở mức 106 CFU/g và có khả năng ức chế VK Salmonella (Nguyễn

Thị Hồng Hà và cộng sự, 2003). Năm 2009, Phạm Quốc Việt và cộng sự thuộc
Viện Chăn nuôi Việt Nam đã nghiên cứu sản xuất probiotic và enzyme tiêu hóa
dùng trong chăn ni. Kết quả đã tìm ra 2 quy trình sản xuất và 2 chế phẩm
probiotic làm tăng sinh trưởng vật nuôi 10%, tăng hiệu quả sử dụng thức ăn
10%, hạn chế 15% tỉ lệ bệnh đường tiêu hóa ở vật ni (Phạm Quốc Việt, 20062009).
Phùng Thị Huệ

22


Khóa luận tốt nghiệp
02

CNSH 14-

1.6.2. Tình hình nghiên cứu trên thế giới
Năm 2002, Wutai và cộng sự sử dụng hai chế phẩm: chất A có L. plantarum
và Enterococcus faccium và chất B là L. plantarum và Baccillus subtilis để ủ
chua cây cao lương tại Trung Quốc cho thấy tác dung rõ rệt khi ủ đơn chủng, cụ
thể là làm giảm nhanh độ pH, tăng hàm lượng acid lactic (Wutai et al., 2002).
Theo Lema và cộng sự (2001), dùng probiotic cho lợn với L. acidophilus (lô 1),
Streptococcus faecium (lô 2), hoặc phối hợp giữa L. acidophilus với
Streptococcus faecium (lô 3), hoặc giữa L. acidophilus với S. faecium, L. casei,
Lactobacillus fermentum và L. plantarum (lô 4). Để kiểm tra sự bài thải của VK
E. coli Q157, ông đã trộn các VK trên với liều 6 x l06 CFU/kg thức ăn liên tục
trong 7 tuần. Kết quả cho thấy lơ 4 có sự bài thải VK E. coli trong phân thấp hơn
các lô khác. Khác biệt này hồn tồn có ý nghĩa so với lô đối chứng không dùng
probiotic (Lema et al., 2001). Năm 2017, Balasingham và cộng sự đã sử dụng 2
chủng L. plantarum và L. acidophilus được phân lập từ ruột lợn để sử dụng làm
chế phẩm probiotic (Balasingham et al., 2017). Cũng trong năm 2017, Dlamini

và cộng sự đã nghiên cứu sự ảnh hưởng của VK probiotic L. reuteri ZJ625, L.
reuteri VB4, L. salivarius ZJ614 và Streptococcus salivarius NBRC13956 trong
chăn nuôi lợn. Kết quả cho thấy khi sử dụng các chủng VK này đã làm giảm hiệu
chứng tiêu chảy của lợn sau cai sữa (Dlamini et al., 2017).
Tóm lại, dựa vào sự hiểu biết các đặc tính quan trọng của VK lactic như khả
năng chịu acid, chịu mật, đề kháng kháng sinh và sản xuất bacteriocin,... Con
người đã biết sử dụng hiệu quả các chủng lactic trong việc tạo ra nhiều chế phẩm
probiotic hổ trợ đường tiêu hóa, điều trị tiêu chảy giúp duy trì cân bằng hệ VSV
đường ruột cho người cũng như vật nuôi.

Phùng Thị Huệ

23


Khóa luận tốt nghiệp
02

CNSH 14-

PHẦN 2. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1. Vật liệu và hóa chất dùng trong nghiên cứu
2.1.1. Chủng giống vi sinh vật
Tổng số 32 chủng VK và 3 chủng VSV kiểm định: Salmonella enterica
ATCC 14028, Escherichia coli ATCC 11105, Staphylococcus epidermidis ATCC
12228 nhận từ Bộ sưu tập giống của Phịng Cơng nghệ lên men, Viện Cơng nghệ
sinh học, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam.
2.1.2. Hóa chất và thiết bị
Hóa chất: Cao malt (Himedia, Ấn Độ); Cao nấm men (Himedia, Ấn Độ);
(Chameleon, Nhật Bản); Sodium dodecyl sulfate (SDS); Ethylene diamine tetraacetic acid (EDTA) (BioLabs, Mỹ); Phenol (Trung Quốc), Isoamylalcohol

(Trung Quốc), Glycerol (Trung Quốc), Ethanol (Trung Quốc), Chloroform
(Trung Quốc), Agarose (Merck, Đức); Thạch (Việt Nam) và một số hóa chất
khác.
Thiết bị nghiên cứu: tủ ấm (Mỹ), máy ly tâm (Eppendorf, Đức), lị vi sóng
(Sam Sung, Hàn Quốc), máy lắc ổn nhiệt (CPT inc, Hàn Quốc), máy chạy điện
di (Mupid, Nhật Bản), máy PCR (Applied biosystems, Mỹ), máy đo OD (S-300
nano, Optima, Nhật Bản) và một số thiết bị nghiên cứu khác.
2.1.3. Môi trường nuôi cấy
Các môi trường được sử dụng trong nuôi cấy, đánh giá khả năng kháng
VSV kiểm định và nghiên cứu đặc điểm sinh học của chủng VK lactic (Phụ lục
1).

Phùng Thị Huệ

24


Khóa luận tốt nghiệp
02

CNSH 14-

2.2. Phương pháp nghiên cứu
2.2.1. Tuyển chọn các chủng vi khuẩn lactic có đặc tính probiotic phù hợp cho
lên men thức ăn thô xanh
2.2.1.1. Khả năng sinh acid lactic
a. Xác định khả năng sinh acid tổng số bằng phương pháp cấy chấm điểm
Chuẩn bị các đĩa petri chứa mơi trường MRS có bổ sung CaCO 3 với lượng
5 g/l. Tiến hành cấy chấm điểm các chủng VK trên đĩa, nuôi ở 37 oC, 2 ngày. Khi
khuẩn lạc mọc, nếu chủng có sinh acid thì xung quanh KL có vịng phân giải.

Vịng phân giải càng lớn chứng tỏ lượng acid sinh ra càng nhiều, ngược lại là
chủng khơng sinh acid (Trần Thị Ái Liên, 2011).
b. Định tính khả năng sinh acid lactic bằng thuốc thử Uphenmen
* Nguyên tắc: acid lactic khi phản ứng với nhân phenol có trong thuốc thử
Uphenmen làm đổi màu thuốc thử, từ màu tím sẽ chuyển sang màu vàng. Nhờ
đó, xác định được VK có sinh acid lactic hay khơng.
* Cách tiến hành (Trần Thị Ái Liên, 2011)
- Chủng giống được nuôi trong môi trường MRS lỏng ở 37oC trong 48 giờ.
- Ly tâm 5000 vòng/phút trong 2 phút để loại bỏ sinh khối, thu dịch lên men.
- Cho 50 µl dịch lên men vào ống nghiệm, thêm 2 ml thuốc thử Uphenmen.
- Ống đối chứng: 2 ml thuốc thử Uphenmen
- Quan sát và ghi nhận sự chuyển màu của thuốc thử: Màu vàng tạo thành càng
đậm chứng tỏ lactic acid được tạo ra càng nhiều.
c. Định lượng acid lactic bằng phương pháp quang phổ
* Cơ sở của phương pháp là dựa vào sự thay đổi bước sóng hấp thu cực đại
của phản ứng giữa sắt (III) clorua và dung dịch acid lactic dẫn đến sự hình thành
Phùng Thị Huệ

25