Tải bản đầy đủ (.docx) (124 trang)

Nghiên cứu khả năng sinh trưởng và tích lũy oleanolic acid trong tế bào đinh lăng (Polyscias fruticosa L. Harms) nuôi cấy in vitro.

Bạn đang xem bản rút gọn của tài liệu. Xem và tải ngay bản đầy đủ của tài liệu tại đây (7.33 MB, 124 trang )

ĐẠI HỌC HUẾ
TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC

PHAN THỊ Á KIM

NGHIÊN CỨU KHẢ NĂNG SINH TRƯỞNG
VÀ TÍCH LŨY OLEANOLIC ACID CỦA TẾ BÀO
ĐINH LĂNG (POLYSCIAS FRUTICOSA (L.) HARMS)
NUÔI CẤY IN VITRO

LUẬN ÁN TIẾN SĨ SINH HỌC

HUẾ - NĂM 2022


ĐẠI HỌC HUẾ
TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC

PHAN THỊ Á KIM

NGHIÊN CỨU KHẢ NĂNG SINH TRƯỞNG
VÀ TÍCH LŨY OLEANOLIC ACID CỦA TẾ BÀO
ĐINH LĂNG (POLYSCIAS FRUTICOSA (L.) HARMS)
NUÔI CẤY IN VITRO

Ngành: CÔNG NGHỆ SINH HỌC
Mã số: 942.02.01

LUẬN ÁN TIẾN SĨ SINH HỌC

Người hướng dẫn khoa học:


1. TS. LÊ VĂN TƯỜNG HUÂN
2. PGS. TS. VÕ THỊ MAI HƯƠNG


LỜI CẢM ƠN
Trong suốt thời gian học tập và hoàn thành luận án, em đã nhận được rất
nhiều sự quan tâm, giúp đỡ của Phòng đào tạo sau đại học, các Thầy Cô giáo
Khoa Sinh, Bộ môn Công nghệ sinh học - Trường đại học Khoa học Huế, Sở
Khoa học và Công nghệ tỉnh Quảng Nam. Em xin chân thành cảm ơn sự giúp đỡ
quý giá đó.
Em xin gửi lời cảm ơn đến TS. Lê Văn Tường Huân, PGS. TS. Võ Thị Mai
Hương đã tận tình hướng dẫn, giúp đỡ em trong suốt thời gian học tập; xin cảm
ơn các anh chị cơng tác tại Phịng thí nghiệm Bộ mơn Công nghệ sinh học, Đại
học Khoa học Huế; Viện Công nghệ Sinh học, Đại học Huế đã nhiệt tình giúp đỡ
em thực hiện đề tài.
Đặc biệt, em xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành và lời cảm ơn sâu sắc đến
GS. TS. Nguyễn Hoàng Lộc – Người Thầy giáo mẫu mực, tận tình hướng dẫn và
tạo mọi điều kiện thuận lợi nhất cho em trong suốt quá trình thực hiện luận án
này.
Cuối cùng, em xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến những người thân trong
gia đình, bạn bè, đồng nghiệp đã động viên và giúp đỡ em trong suốt thời gian
học tập cho đến khi hoàn thành luận án này.
Một lần nữa, em xin chân thành cảm ơn!
Thừa Thiên Huế, tháng 4 năm 2022
Phan Thị Á Kim


LỜI CAM ĐOAN

Tơi xin cam đoan đây là cơng trình nghiên cứu của riêng tơi. Các số liệu,

kết quả trình bày trong luận án là trung thực, khách quan và nghiêm túc, tài liệu
tham khảo có nguồn gốc rõ ràng.
Nếu có gì sai sót, tơi xin chịu hồn tồn trách nhiệm.

Tác giả luận án


BẢNG CHÚ THÍCH CHỮ VIẾT TẮT
2,4-D

2,4-dichlorophenoxy acetic acid

BAP

6-benzyl aminopurine

CAS

Casamino acids

Cs

Cộng sự

ĐC

Đối chứng

DW


Dry weight (khối lượng khô)

FW

Fresh weight (khối lượng tươi)

GI

Growth index (Chỉ số sinh trưởng)

GPX

Glutathione peroxidase

GSH-px

Gluthatione peroxidase

HCTC

Hợp chất thứ cấp

HepG2

Human hepatocellular carcinoma (tế bào ung thư gan ở
người)

HPLC

High-performance liquid chromatography (Sắc ký lỏng hiệu

năng cao)

IBA

3-indolebutyric acid

IC50

Half maximal inhibitory concentration (nồng độ ức chế tối đa
một nữa)

JA

Jasmonic acid

KIN

Kinetin

KTST

Kích thích sinh trưởng

MDA

Malonaldehyde

MeJA

Methyl jasmonate


MIC

Minimum inhibitory concentration (nồng độ ức chế tối thiểu)

MS

Murashige and Skoog (1962)

MT

Môi trường
i


NAA

Naphthalene acetic acid

OA

Oleanolic acid

PAA

Phenyl acetic acid

PGE2

Prostaglandin E2


ROS

Reactive oxygen species

SA

Salicylic acid

SOD

Superoxide dismutase

TB

Tế bào

TPA

12-O-tetradecanoylphorbol 13-acetate

TRYP

Tryptone

UA

Ursolic acid

YE


Yeast extract (dịch chiết nấm men)


MỤC LỤC
LỜI CAM ĐOAN.........................................................................................iv
MỤC LỤC......................................................................................................i
BẢNG CHÚ THÍCH CHỮ VIẾT TẮT......................................................... i
DANH MỤC CÁC BẢNG..........................................................................vii
DANH MỤC CÁC HÌNH ẢNH................................................................ viii
MỞ ĐẦU.......................................................................................................1
1. TÍNH CẤP THIẾT CỦA ĐỀ TÀI.............................................................1
2. MỤC TIÊU NGHIÊN CỨU......................................................................3
3. NỘI DUNG VÀ PHẠM VI NGHIÊN CỨU.............................................3
4. ĐÓNG GÓP MỚI CỦA LUẬN ÁN..........................................................3
5. Ý NGHĨA KHOA HỌC VÀ THỰC TIỄN CỦA LUẬN ÁN....................4
Chương 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU............................................................5
1.1. TỔNG QUAN VỀ CÂY ĐINH LĂNG LÁ NHỎ..................................5
1.1.1. Đặc điểm thực vật................................................................................. 5
1.1.2. Thành phần hóa học của cây đinh lăng lá nhỏ.......................................7
1.1.3. Giá trị dược lý của cây đinh lăng lá nhỏ................................................8

1.2. ELICITOR............................................................................................10
1.2.1. Khái niệm............................................................................................10
1.2.2. Phân loại............................................................................................. 10
1.2.3. Cơ chế tác dụng của elicitor.................................................................12
1.2.4. Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình kích kháng..................................14
1.2.5. Ni cấy tế bào thực vật để sản xuất các hợp chất thứ cấp..................17
1.2.6. Một số thành tựu trong sản xuất hợp chất thứ cấp ở thực vật được xử lý


elicitor...........................................................................................................19
1.3. TỔNG QUAN VỀ OLEANOLIC ACID............................................. 25


1.3.1. Vai trị và phân bố............................................................................... 25
1.3.2. Một số cơng dụng của oleanolic acid................................................... 25
1.3.3. Cấu trúc hóa học và tính chất vật lý..................................................... 28
1.3.4. Sinh tổng hợp oleanolic acid................................................................29
1.3.5. Các nghiên cứu sản xuất oleanolic acid bằng nuôi cấy mơ và tế bào thực

vật

31

1.4. TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU NI CẤY IN VITRO VÀ SẢN XUẤT
HỢP CHẤT THỨ CẤP Ở CÂY ĐINH LĂNG...........................................36
1.4.1. Nhân giống in vitro cây đinh lăng lá nhỏ..............................................36
1.4.2. Sản xuất hợp chất thứ cấp từ cây đinh lăng lá nhỏ...............................39
1.4.3. Sản xuất oleanolic acid từ nuôi cấy tế bào đinh lăng lá nhỏ.................40
1.4.4. Xây dựng quy trình thu nhận hợp chất thứ cấp từ cây đinh lăng lá nhỏ
41

Chương 2. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU...............43
2.1. ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU..............................................................43
2.1.1. Đối tượng nghiên cứu..........................................................................43
2.1.2. Nguyên liệu nghiên cứu.......................................................................43

2.2. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU........................................................45
2.2.1. Hóa chất và môi trường nuôi cấy.........................................................45
2.2.2. Nghiên cứu ảnh hưởng của môi trường nuôi cấy lên khả năng sinh


trưởng của callus...........................................................................................46
2.2.3. Nghiên cứu ảnh hưởng của môi trường nuôi cấy lên khả năng sinh

trưởng của tế bào.......................................................................................... 47
2.2.4. Xử lý elicitor....................................................................................... 48
2.2.5. Định lượng oleanolic acid....................................................................49
2.2.6. Xử lý thống kê.....................................................................................50

Chương 3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU........................................................52


3.1.

ẢNH HƯỞNG CỦA MÔI TRƯỜNG NUÔI CẤY ĐẾN SINH

TRƯỞNG CỦA CALLUS.......................................................................... 52
3.1.1. Ảnh hưởng của 2,4-D kết hợp với KIN lên sinh trưởng của callus......52
3.1.2. Ảnh hưởng của nguồn nitơ lên sinh trưởng của callus thân................. 57

3.2. ẢNH HƯỞNG CỦA MƠI TRƯỜNG NI CẤY ĐẾN KHẢ NĂNG
SINH TRƯỞNG VÀ TÍCH LŨY OLEANOLIC ACID CỦA TẾ BÀO.....60
3.2.1. Nuôi cấy tế bào....................................................................................60
3.2.2. Ảnh hưởng của nguồn carbon..............................................................62
3.2.3. Ảnh hưởng của chất điều hòa sinh trưởng............................................63

3.3. ẢNH HƯỞNG CỦA MỘT SỐ ELICITOR LÊN SINH TRƯỞNG VÀ
TÍCH LŨY OLEANOLIC ACID TRONG TẾ BÀO HUYỀN PHÙ..........66
3.3.1. Ảnh hưởng của dịch chiết nấm men.....................................................66
3.3.2. Ảnh hưởng của methyl jasmonate........................................................70


Chương 4. BÀN LUẬN.............................................................................. 75
4.1. ẢNH HƯỞNG CỦA MÔI TRƯỜNG NUÔI CẤY LÊN SINH
TRƯỞNG CỦA CALLUS.......................................................................... 75
4.1.1. Ảnh hưởng của chất điều hòa sinh trưởng............................................75
4.1.2. Ảnh hưởng của nguồn nitơ.................................................................. 76

4.2. ẢNH HƯỞNG CỦA MÔI TRƯỜNG NUÔI CẤY ĐẾN SINH
TRƯỞNG CỦA TẾ BÀO VÀ HÀM LƯỢNG OLEANOLIC ACID.........77
4.2.1. Nuôi cấy tế bào huyền phù.................................................................. 77
4.2.2. Ảnh hưởng của nguồn carbon..............................................................78
4.2.3. Ảnh hưởng của chất điều hòa sinh trưởng............................................79
4.2.4. Tích lũy oleanolic acid trong tế bào..................................................... 80

4.3. ẢNH HƯỞNG CỦA MỘT SỐ ELICITOR LÊN SINH TRƯỞNG VÀ
TÍCH LŨY OLEANOLIC ACID TRONG TẾ BÀO HUYỀN PHÙ..........82
4.3.1. Đặc điểm của elicitor...........................................................................82
4.3.2. Ảnh hưởng của một số elicitor lên sinh trưởng tế bào..........................84


4.3.3. Ảnh hưởng của một số elicitor lên tích lũy oleanolic acid....................85

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ.....................................................................90
KẾT LUẬN................................................................................................. 90
KIẾN NGHỊ................................................................................................ 90
CÁC CƠNG TRÌNH CƠNG BỐ LIÊN QUAN ĐẾN LUẬN ÁN..............91
TÀI LIỆU THAM KHẢO...........................................................................92
PHỤ LỤC..................................................................................................108



DANH MỤC CÁC BẢNG
Bảng 1.1. Phân loại elicitor trong sản xuất các hợp chất thứ cấp...................11
Bảng 2.1. Các hóa chất chính sử dụng trong nghiên cứu............................... 45
Bảng 3.1. Ảnh hưởng của 2,4-D kết hợp với KIN lên khả năng sinh trưởng của
callus lá sau 5 tuần nuôi cấy................................................................................ 53
Bảng 3.2. Ảnh hưởng của 2,4-D và KIN lên khả năng sinh trưởng của callus
thân sau 5 tuần nuôi cấy.......................................................................................54
Bảng 3.3. Ảnh hưởng của 2,4-D và KIN lên khả năng sinh trưởng của callus rễ
sau 5 tuần nuôi cấy.............................................................................................. 56
Bảng 3.4. Ảnh hưởng của TRYP lên khả năng sinh trưởng của callus thân sau 5
tuần nuôi cấy........................................................................................................58
Bảng 3.5. Ảnh hưởng của CAS lên khả năng sinh trưởng của callus thân sau 5
tuần nuôi cấy................................................................................................... 59
Bảng 3.6. Ảnh hưởng của nguồn carbon lên sự sinh trưởng của tế bào đinh lăng
lá nhỏ................................................................................................................... 62
Bảng 3.7. Ảnh hưởng của KIN và BAP kết hợp với 2,4-D lên khả năng sinh
trưởng của tế bào................................................................................................. 64
Bảng 3.8. Hàm lượng oleanolic acid trong các loại mẫu khác nhau...............65
Bảng 3.9. Ảnh hưởng của YE lên sinh trưởng của tế bào đinh lăng lá nhỏ...67
Bảng 3.10. Ảnh hưởng của YE lên tích lũy oleanolic acid của tế bào đinh lăng lá
nhỏ....................................................................................................................... 69
Bảng 3.11. Ảnh hưởng của MeJA lên sinh trưởng của tế bào đinh lăng lá nhỏ 71
Bảng 3.12. Ảnh hưởng của MeJA lên tích lũy oleanolic acid của tế bào đinh lăng
lá nhỏ................................................................................................................... 73


DANH MỤC CÁC HÌNH ẢNH
Hình 1.1. Cấu trúc hóa học của oleanolic acid............................................... 28
Hình 1.2. Sinh tổng hợp cation dammarenyl (I), oleanyl, lupenyl và lupeol từ
squalene............................................................................................................... 29

Hình 1.3. Sinh tổng hợp UA (4) và OA (5) từ cation oleanyl.........................30
Hình 1.4. Chu trình tổng hợp oleanolic acid ở thực vật................................. 30
Hình 2.1. Cây đinh lăng lá nhỏ tự nhiên.........................................................43
Hình 2.2. Callus có nguồn gốc từ lá sau 5 tuần ni cấy................................44
Hình 2.3. Callus có nguồn gốc từ thân sau 5 tuần ni cấy............................44
Hình 2.4. Callus có nguồn gốc từ rễ sau 5 tuần ni cấy............................... 44
Hình 2.5. Sơ đồ thí nghiệm.............................................................................51
Hình 3.1. Callus lá sinh trưởng trên mơi trường có bổ sung 1 mg/L 2,4-D kết
hợp với 0,5 mg/L KIN sau 5 tuần ni cấy..........................................................53
Hình 3.2. Callus thân sinh trưởng trên mơi trường có bổ sung 1 mg/L 2,4-D và
0,5 mg/L KIN sau 5 tuần ni cấy.......................................................................55
Hình 3.3. Callus rễ sinh trưởng trên mơi trường có bổ sung 2 mg/L NAA và 0,5
mg/L KIN sau 5 tuần ni cấy.............................................................................56
Hình 3.4. Callus thân sinh trưởng trên mơi trường có bổ sung 0,8 g/L TRYP sau
5 tuần ni cấy.....................................................................................................58
Hình 3.5. Callus thân sinh trưởng trên mơi trường có bổ sung 0,4 g/L CAS sau 5
tuần ni cấy........................................................................................................60
Hình 3.6. Đường cong sinh trưởng của tế bào huyền phù đinh lăng lá nhỏ trong
môi trường cơ bản MS chứa 1 mg/L 2,4-D và 0,5 mg/L KIN.............................61
Hình 3.7. Sinh khối tươi (A) và sinh khối khơ (B) của tế bào đinh lăng lá nhỏ
. ....................................................................................................................... 61


Hình 3.8. Sắc ký đồ HPLC phân tích hàm lượng oleanolic acid. A. Chất chuẩn
oleanolic acid, B. Mẫu lá, C. Tế bào trên môi trường cơ bản MS chứa 1 mg/L
BAP và 0,5 mg/L 2,4-D, D. Tế bào trên môi trường cơ bản MS chứa 1,25 mg/L
KIN và 1 mg/L 2,4-D...........................................................................................66
Hình 3.9. Dịch huyền phù tế bào (A), sinh khối tươi (B) và sinh khối khô (C)
của tế bào đinh lăng lá nhỏ trong mơi trường cơ bản MS có 20 g/L sucrose; 1
mg/L BAP; 0,5 mg/L 2,4-D bổ sung YE 3 g/L lúc bắt đầu ni cấy...................70

Hình 3.10. Dịch huyền phù tế bào (A), sinh khối tươi (B) và sinh khối khô
(C) của tế bào huyền phù đinh lăng lá nhỏ trong mơi trường cơ bản MS có 20
g/L sucrose; 1 mg/L BAP; 0,5 mg/L 2,4-D bổ sung YE 1 g/L sau 6 ngày ni
cấy........................................................................................................................70
Hình 3.11. Dịch huyền phù tế bào (A), sinh khối tươi (B) và sinh khối khô
(C) của tế bào huyền phù đinh lăng lá nhỏ trong mơi trường cơ bản MS có 20
g/L sucrose; 1 mg/L BAP; 0,5 mg/L 2,4-D bổ sung MeJA 10 µM lúc bắt đầu
ni cấy................................................................................................................74
Hình 3.12. Dịch huyền phù tế bào (A), sinh khối tươi (B) và sinh khối khô
(C) của tế bào huyền phù đinh lăng lá nhỏ trong môi trường cơ bản MS có 20
g/L sucrose; 1mg/L BAP; 0,5 mg/L 2,4-D bổ sung MeJA 100 µM sau 3 ngày
ni cấy................................................................................................................74


MỞ ĐẦU
1. TÍNH CẤP THIẾT CỦA ĐỀ TÀI
Cùng với sự phát triển của nền y học, việc nghiên cứu chiết xuất các hoạt
chất tự nhiên có hoạt tính sinh học cao để tạo ra những loại thuốc mới phục vụ sức
khỏe con người ngày càng được quan tâm. Nhiều dược liệu có nguồn gốc thực vật
đã và đang được sử dụng rộng rãi như là nguồn cung cấp các loại thuốc chữa bệnh
hoặc thực phẩm chức năng cho đại đa số người dân trên thế giới.
Đinh lăng còn gọi là cây gỏi cá, nam dương sâm, có tên khoa học là
Polyscias spp., thuộc họ Nhân sâm (Araliaceae), là một loài cây thuốc đã được
đưa vào dược điển Việt Nam. Trong số các loài đinh lăng thuộc chi Polyscias,
đinh lăng lá nhỏ (P. fruticosa (L.) Harms) là loài được dân gian sử dụng rộng rãi
làm thuốc tăng cường sức khỏe và hoạt huyết dưỡng não từ rất lâu [4]. Trong
đinh lăng có các loại alkaloid, glycoside, saponin, flavonoid, tannin, vitamin B1,
và amino acid như methionine, lycine, cysteine và các amino acid thiết yếu khác.
Đinh lăng chứa các hợp chất saponin tương tự như ở nhân sâm. Trong một số
trường hợp, rễ củ đinh lăng được thay thế cho nhân sâm như một nguyên liệu dễ

tìm ở Việt Nam [11].
Đặc biệt, trong thành phần của đinh lăng, oleanolic acid là một triterpene
thuộc nhóm saponin có hoạt tính sinh học cao, phổ biến trong nhiều lồi thực
vật. Oleanolic acid khơng chỉ tồn tại như một phân tử tự do ở thực vật, mà còn
là tiền chất aglycone của các saponin triterpenoid. Những tiềm năng to lớn của
oleanolic acid trong y học như khả năng kháng viêm, bảo vệ gan, chống khối u,
điều trị tiểu đường, chống cao huyết áp,... [64, 108] đòi hỏi phải có những
hướng sản xuất phù hợp để thương mại hóa sản phẩm đáp ứng nhu

1


cầu sử dụng.
Hiện nay, nhu cầu về oleanolic acid trong dược phẩm đang tăng cao, trong
khi đó, nguồn nguyên liệu tự nhiên không ổn định do việc nhân trồng cây đinh
lăng, chủ yếu theo phương pháp truyền thống (giâm hom), thời gian thu hoạch
khá lâu, ít nhất từ 3-5 năm trở lên, năng suất thường thấp, phụ thuộc rất lớn vào
điều kiện thời tiết, mùa vụ, đất đai, diện tích canh tác,... nên trữ lượng của chúng
ngày càng giảm, không đáp ứng đủ nguyên liệu cho ngành công nghiệp dược. Vì
vậy, những nghiên cứu thu nhận oleanolic acid bằng phương pháp nuôi cấy tế
bào thực vật là một hướng rất được quan tâm, hứa hẹn tiềm năng to lớn.
Bên cạnh đó, nhiều nghiên cứu cho thấy, hàm lượng các chất có hoạt tính
sinh học tích lũy trong tế bào thực vật nuôi cấy in vitro thường là tương đương
hoặc cao hơn nhiều lần so với bộ phận tích lũy chúng ở cây ngồi tự nhiên [118].
Thành phần mơi trường, điều kiện ni cấy, các tiền chất hoặc các elicitor (chất
kích kháng) trong mơi trường ni cấy tế bào có ảnh hưởng đến việc tăng hiệu
suất tổng hợp các chất chuyển hóa thứ cấp, rút ngắn thời gian và giảm chi phí
sản xuất.
Hiện nay, các nghiên cứu về nhân giống in vitro cây đinh lăng lá nhỏ [5,
101], nuôi cấy tế bào huyền phù [8] và nuôi cấy rễ tơ [3] để sản xuất saponin

từ cây đinh lăng lá nhỏ cũng đang được quan tâm. Tuy nhiên, các nghiên cứu
về sử dụng elicitor trong q trình ni cấy tế bào cây đinh lăng lá nhỏ lại
chưa được thực hiện nhiều. Từ những lý do trên, đề tài: “Nghiên cứu khả
năng sinh trưởng và tích lũy oleanolic acid của tế bào đinh lăng
(Polyscias fruticosa (L.) Harms) nuôi cấy in vitro” được thực hiện nhằm
làm cơ sở cho việc sản xuất một số hợp chất có giá trị dược liệu sau này.


2. MỤC TIÊU NGHIÊN CỨU
Xác định môi trường nuôi cấy và elicitor thích hợp để tăng khả năng tích lũy
oleanolic acid của tế bào cây đinh lăng lá nhỏ.
3. NỘI DUNG VÀ PHẠM VI NGHIÊN CỨU
Nội dung nghiên cứu
- Nghiên cứu ảnh hưởng của môi trường nuôi cấy đến khả năng sinh
trưởng của callus đinh lăng lá nhỏ.
- Nghiên cứu một số yếu tố ảnh hưởng đến khả năng sinh trưởng và tích
lũy oleanolic acid của tế bào huyền phù đinh lăng lá nhỏ, bao gồm:
+ Ảnh hưởng của môi trường ni cấy (nguồn carbon, chất điều hịa sinh
trưởng).
+ Ảnh hưởng của các elicitor (dịch chiết nấm men và methyl jasmonate).
Phạm vi nghiên cứu
- Nghiên cứu nuôi cấy mô và tế bào cây đinh lăng lá nhỏ được thực hiện
tại Phịng thí nghiệm của Bộ mơn Cơng nghệ sinh học, Khoa Sinh học,
Trường Đại học Khoa học, Đại học Huế.
- Phân tích hàm lượng oleanolic acid được thực hiện tại Phịng thí
nghiệm của Trường Đại học Y dược, Đại học Huế và Cơng ty CP Dược TW
Huế.
4. ĐĨNG GĨP MỚI CỦA LUẬN ÁN
Đây là cơng trình đầu tiên sử dụng các elicitor (YE và MeJA) để nghiên
cứu cải thiện khả năng tích lũy oleanolic acid của tế bào cây đinh lăng lá nhỏ.

Nghiên cứu đã xác định được YE ở nồng độ 1 g/L bổ sung sau 6 ngày nuôi
cấy cho hiệu quả tích lũy oleanolic acid cao nhất (164,34 mg/g khối lượng khô),
gấp 6,47 lần so với đối chứng không xử lý elicitor (25,40 mg/g). Xử lý bằng
MeJA cũng cho hiệu quả cao nhưng thấp hơn YE, MeJA ở nồng


độ 100 µM bổ sung sau 3 ngày ni cấy cho hiệu quả tích lũy oleanolic acid cao
gấp gần 5,2 lần so với đối chứng không bổ sung elicitor (131,83 mg/g khối
lượng khô).
5. Ý NGHĨA KHOA HỌC VÀ THỰC TIỄN CỦA LUẬN ÁN
Ý nghĩa khoa học
Kết quả của luận án cung cấp các dẫn liệu khoa học mới về ảnh hưởng của
elicitor lên khả năng tích lũy oleanolic acid trong tế bào cây đinh lăng lá nhỏ;
đồng thời luận án cũng là tài liệu tham khảo hữu ích cho nghiên cứu và giảng
dạy về lĩnh vực sản xuất các hoạt chất sinh học bằng con đường nuôi cấy tế bào
thực vật.
Ý nghĩa thực tiễn
Đây là hướng nghiên cứu có tiềm năng ứng dụng trong lĩnh vực sản xuất
các hoạt chất sinh học dùng làm dược liệu bằng nuôi cấy tế bào thực vật.


Chương 1
TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1. TỔNG QUAN VỀ CÂY ĐINH LĂNG LÁ NHỎ
1.1.1. Đặc điểm thực vật
Cây đinh lăng lá nhỏ có tên khoa học là P. fruticosa (L.) Harms thuộc họ
Nhân sâm (Araliaceae). Ở Việt Nam, lồi này cịn có các tên khác như đinh lăng
hương, đinh lăng lá xẻ, cây gỏi cá, và nam dương sâm [11, 12].
1.1.1.1. Đặc điểm hình thái

Cây đinh lăng lá nhỏ thuộc cây thân bụi có khả năng mọc xanh tốt quanh
năm, chiều cao của cây từ 0,5-2 m. Thân cây có hình trịn, vỏ cây sần sùi nhưng
khơng có gai. Trên thân cây thường có những vết sẹo lồi to do lá rụng, thân cây
thường có màu nâu xám. Cây đinh lăng lá nhỏ sử dụng làm thuốc chủ yếu là
những cây đinh lăng nhỏ hay còn gọi là đinh lăng nếp, có thân gỗ nhỏ, chiều cao
cây thường từ 0,8-1,5 m, thân cây cũng khơng có gai.
Cây đinh lăng lá nhỏ thuộc họ lá mọc cách, kép lông chim 2-3 lần. Chiều
dài lá thường từ 20-40 cm. Những lá chét thường chia thùy nhọn khơng đều, mặt
trên của lá có màu xanh, phần mặt dưới của lá thường bóng hơn. Phần gốc lá và
phiến lá có hình dáng thn nhọn, dài từ 3-5 cm, rộng từ 0,5-1,5 cm. Gân lá
thường có hình lơng chim, phần gân chính thường nổi rõ và có thêm 3 đến 4 cặp
gân phụ chia theo từng đường lá. Cuống lá đinh lăng lá nhỏ thường dài, có hình
trịn hoặc màu xanh đậm, đơi khi có xuất hiện những đốm lá hình nhạt ở trên
cuống. Đáy cuống phình to ra thành bẹ lá.
Hoa của cây đinh lăng lá nhỏ thường mọc thành cụm hoa và tụ lại ở phía
đầu của ngọn cành. Hoa đinh lăng lá nhỏ thường là hoa lưỡng tính, mẫu 5.


Kích thước hoa khá nhỏ, cuống hoa có hình trụ màu xanh khoảng 0,3-0,4 cm. Lá
bắc thường mọc ở gốc cuống của hoa và có hình tam giác nhọn.
Bao hoa: đài hoa chỉ có 5 răng và chia đều ra các phía, thường có màu
xanh và có hình bầu dục, phần đỉnh thường thuôn nhọn. Cánh hoa thường dài
từ 0,25-0,3 cm, chiều rộng khoảng 0,1-0,15 cm, ở giữa cánh hoa thường có
gân.
Bộ nhị: có 5 nhị rời và đều, xếp xen kẽ giữa các cánh hoa. Chỉ nhị có dạng
sợi mảnh, thường có màu trắng và chiều dài khoảng 0,1-0,15 cm. Bao phấn bên
ngồi là 2 ơ thn dài màu vàng nứt dọc theo chiều dài và hướng vào bên trong,
phần bao phấn đính với gốc hoa. Hạt phấn tách rời và thường có hình cầu 3 lỗ,
hạt phấn có màu vàng nhạt và có đường kính từ 30-35 cm.
Bộ nhụy: có từ 2-3 lá nỗn. Phần bầu dưới có 2-3 ơ, mỗi ơ chứa một nỗn.

Đỉnh nỗn trung trụ, có tới 2-3 vịi nằm úp sát vào nhau và thẳng đứng, nỗn
thường có màu xanh đậm, dài khoảng 1 cm. Phần đầu nhiều hình điểm.
Quả đinh lăng lá nhỏ thuộc dạng quả hạch, có hình bầu dục với chiều dài
khoảng 4-6 mm, chiều rộng khoảng 3-4 mm. Trên đỉnh quả thường vẫn cịn lại
vịi nhụy mọc chỗi ra, đài vẫn cịn. Quả đinh lăng lá nhỏ thường có màu xanh
đậm, trên vỏ quả xuất hiện những nốt trịn có màu xanh nhạt [11, 12].
1.1.1.2. Đặc điểm phân bố và sinh thái
Chi Polyscias có gần 100 lồi trên thế giới, phân bố rải rác ở các vùng cận
nhiệt đới và nhiệt đới, nhất là một số đảo ở Thái Bình Dương. Ở Việt Nam, đinh
lăng cũng có từ lâu trong nhân dân và được trồng khá phổ biến ở vườn gia đình,
đình chùa, trạm xá… để làm cảnh, làm thuốc và gia vị.
Đinh lăng lá nhỏ là loại cây ưa ẩm và có thể hơi chịu bóng, trồng được trên
nhiều loại đất; thậm chí với một lượng đất rất ít trong chậu nhỏ, cây vẫn có thể
sống được theo kiểu cây cảnh bonsai. Trồng bằng cành sau 2-3 năm có


hoa quả. Đinh lăng lá nhỏ có khả năng tái sinh vơ tính khỏe, thường được trồng
bằng phương pháp giâm cành hay trồng trực tiếp từ đoạn thân hay cành. Đinh
lăng có nhiều lồi khác nhau, tuy nhiên, đinh lăng lá nhỏ là quan trọng nhất,
được sử dụng làm thuốc, làm gia vị và làm cây cảnh [30].
1.1.2. Thành phần hóa học của cây đinh lăng lá nhỏ
Chi Polyscias là chi lớn thứ hai trong họ Nhân sâm, cho đến nay trên thế
giới chỉ có một số lồi của chi Polyscias được nghiên cứu thành phần hóa học
như P. filicifolia Bail., P. scutellaria (Burm. f) Merr., P. amflifolia (Baker)
Harms., P. dichroostachya Baker., P. fulva, P. murayi Harms và Polyscias sp.
Nov. Trong số này, loài P. fructicosa (L.) Harms được quan tâm và nghiên cứu
nhiều nhất [94].
Năm 1998, Huan và cs đã phân lập được 11 saponin triterpen bao gồm
ladyginoside A, zingibroside R1, polysicoside A, polysicoside B, polysicoside C,
3-O--D-glucopyranosyl-(14)--D-glucuronopyranosyl oleanolic-28-O-


-D-glucopyranosyl ester, polysicoside D, polysicoside E, polysicoside F,
polysicoside G, và polysicoside H [49].
Thai và cs (2016) đã phân lập và xác định cấu trúc của 6 hợp chất, trong đó
có 1 hợp chất mới từ lá cây đinh lăng lá nhỏ. Các hợp chất này gồm 3 saponin 3O-β-D-glucopyranosyl-(1->4)-β-D-glucuronopyranosyl-oleanolic acid 28-O-βD-glucopyranosyl ester, polyscioside D, polyscioside I (chất mới); và 3
flavonoid glycoside afzelin, kaempferol-3-O-α-L- rhamnopyranosyl-(1->6)-β-Dglucopyranosidevà quercitrin [112].
Lá cây đinh lăng lá nhỏ trồng tại An Giang được thu mẫu, chiết và tách
phân đoạn bằng kỹ thuật chiết ngấm kiệt và chiết lỏng-lỏng. Kết quả phân lập
được 3 hợp chất saponin triterpen bao gồm: Ladyginosid A, acid 3-O-[β-Dglucopyranosyl-(1β4)]- β-D-(6-O-methyl) glucurono-pyranosyloleanolic, 3-


O- β -D-glucuronopyranosy-loleanolic 28-O-β-D-glucopyra-nosyl ester [14].
1.1.3. Giá trị dược lý của cây đinh lăng lá nhỏ
Tăng lực-chống nhược sức
Cao đinh lăng có tác dụng tăng lực ở khoảng liều <180 mg/kg được xác
định bằng hai nghiệm thức thực hiện trên chuột nhắt: chuột bơi kiệt sức của
Brekhman và chuột leo dây của Cabured [12].
Chống xơ vữa động mạch
Cao đinh lăng (90-180 mg/kg thể trọng) làm giảm sự gia tăng cholesterol
máu và lipid toàn phần trong huyết thanh của động vật bị gây xơ vữa động mạch
thực nghiệm bằng chế độ ăn giàu cholesterol (gây tăng cholesterol ngoại sinh)
và bằng Tween 80 (gây tăng cholesterol nội sinh) [12].
Kháng khuẩn
Tác dụng kháng khuẩn của cao đinh lăng trên các chủng Staphylococus
mạnh hơn trên các chủng vi khuẩn và nấm mốc khác [12].
Chống trầm cảm
Cao đinh lăng có tác dụng chống trầm cảm trong thực nghiệm của Porsolt.
Cao đinh lăng ở liều 45 mg/kg khơng có tác dụng chống trầm cảm có ý nghĩa
thống kê khi sử dụng 1 lần liều duy nhất nhưng khi cho uống trong thời gian 3-7
ngày thể hiện tác dụng chống trầm cảm [12].

Chống stress
Cao đinh lăng làm tăng ngưỡng chịu đựng nhiệt độ nóng của động vật thử
nghiệm trong stress vật lý (stress nhiệt độ 37-42 oC). Trên thực nghiệm stress tâm
lý (stress cơ lập), nhóm đối chứng có những biểu hiện bị stress tâm lý như: thời
gian ngủ bị rút ngắn (giảm 30% thời gian ngủ so với nhóm bình thường), có
hành vi tấn cơng khi tiếp xúc với chuột lạ, trạng thái thụ động [12].


Chống oxy hóa
Cao lá và saponin lá thể hiện tác dụng ức chế peroxide hóa lipid màng tế
bào não, trong khi cao rễ và saponin rễ thì khơng có tác dụng này. Cao rễ chỉ thể
hiện tác dụng ức chế peroxide hóa lipid trong trường hợp có xúc tác của hệ
Fenton [12].
Kích thích miễn dịch
Nhiều nghiên cứu đã chứng minh tác dụng của đinh lăng trên chức năng
miễn dịch tương tự như bột chiết sâm Việt Nam, thể hiện cả trên cơ địa động vật
bình thường và trên cơ địa động vật bị gây suy giảm miễn dịch bằng
cyclophosphamid, một chất kìm tế bào thuộc nhóm oxazaphosphorin thường
được sử dụng trong liệu pháp chống ung thư [12].
Hạ đường huyết
Luyen và cs (2018) đã đánh giá hiệu quả ức chế α-amylase và αglucosidase của 3-O- [β-d-glucopyranosyl- (1 → 4) -β-d-glucuronopyranosyl]
oleanolic acid 28-O-β-d-glucopyranosyl este (PFS), một saponin được phân lập
từ lá cây đinh lăng (Polyscias fruticosa) và tiềm năng hạ đường huyết sau bữa ăn
trên chuột nhắt trắng. Các tác giả đã nhận thấy, lá đinh lăng và saponin chính
PFS có thể được sử dụng để ngăn ngừa và điều trị bệnh đái tháo đường và các
biến chứng [70].
Các tác dụng phụ của cây đinh lăng
Ngoài các tác dụng kể trên, việc sử dụng đinh lăng khơng đúng cách cũng
có thể gây ra các tác dụng phụ như: hồi hộp, bồn chồn, nơn nao, tim đập nhanh,
hơi đau nhói. Một số trường hợp không nên sử dụng loại cây này như phụ nữ

đang mang thai hay người bị bệnh gan.


1.2. ELICITOR
1.2.1. Khái niệm
Elicitor có thể được định nghĩa là một chất hoặc một hỗn hợp các chất mà
khi đưa một nồng độ phù hợp vào hệ thống tế bào sống sẽ khởi đầu hoặc cải
thiện sự sinh tổng hợp các hợp chất đặc trưng.
Sự kích kháng (elicitation) là quá trình cảm ứng hoặc tăng cường sinh tổng
hợp các chất trao đổi do sự thêm vào một lượng nhỏ elicitor [97].
1.2.2. Phân loại
Elicitor được phân loại hoặc dựa trên bản chất tự nhiên của chúng là elicitor
phi sinh học và elicitor sinh học, hoặc dựa trên nguồn gốc của chúng là elicitor
ngoại sinh và elicitor nội sinh (Bảng 1.1).
Elicitor sinh học là các chất có nguồn gốc sinh vật, bao gồm các
polysaccharide có nguồn gốc từ thành tế bào thực vật (pectin hoặc cellulose), các
vi sinh vật (chitin hoặc glucans) và các glycoprotein, G-protein hay các protein
nội bào có chức năng gắn với các receptor và tác động bằng cách hoạt hóa hoặc
bất hoạt một số các enzyme hoặc các kênh ion. Elicitor phi sinh học là các chất
khơng có nguồn gốc từ sinh vật, chủ yếu là các muối vô cơ và các tác nhân vật lý
như ion Cu2+ và Cd2+, Ca2+ và pH cao. Elicitor ngoại sinh là các chất có nguồn
gốc bên ngồi tế bào như các polysaccharide, polyamine và các acid béo. Ngược
lại, elicitor nội sinh là các chất có nguồn gốc bên trong tế bào như là
galacturonide hoặc hepta-β-glucoside,... [82].


Bảng 1.1. Phân loại elicitor trong sản xuất các hợp chất thứ cấp [43]
Phân loại dựa tính chất tự nhiên của elicitor
Là dạng chiết xuất thơ hoặc tinh sạch có nguồn gốc từ mầm bệnh
(nấm, vi khuẩn, nấm men) hoặc của chính thực vật, có 2 dạng:

Elicitor

Dạng xác

sinh học

định

có thành phần đã biết như polysaccharides,
glycoproteins, glucans, chitin, chitosan, pectin,
alginate, xanthan, elicitin, enzyme bất hoạt, ...

Dạng chưa

có thành phần chưa được xác định như dịch chiết thô

xác định

nấm men, dịch chiết vi khuẩn, dịch nấm,…
Muối và cá
kim

Ag2S2O3, AgNO3, CdCl2, CuCl2, CuSO4,
VOSO4, NiSO4, selenium, ...

loại nặng
Hóa học
Elicitor phi

Stress thẩm

thấu
chất

dạng khí
Vật lý
Các phân
tử tính

potassium chloride, cadmium chloride,
polyvinyl pyrrolidone, ...

sinh học


Mannitol, sorbitol, sodium chloride,

NO, ethylene, ...

Tia UV, thay đổi trạng thái nhiệt độ, muối, hạn hán,…
Jasmonic acid, methyl jasmonate, salicylic acid, acetyl
salicylic acid, systemin, …

hiệu
nội bào
Phân loại dựa vào nguồn gốc của elicitor
Có nguồn gốc ở bên ngoài tế bào như glucomannose, glucan,
Elicitor

chitosan, monilicolin, polyamine, glycoprotein, polygalacturonase,


ngoại sinh

endopolygalacturonic, acid lyase, cellulose, arachidonic acid,
eicosapentanoic acid, ...

Elicitor nội

Có nguồn gốc ở bên trong tế bào như Jasmonic acid, methyl

sinh

jasmonate, salicylic acid, acetyl salicylic acid, systemin, ….


1.2.3. Cơ chế tác dụng của elicitor
Khi thực vật bị nhiễm bởi các vi sinh vật gây bệnh, sự đáp ứng được kích
hoạt nhanh với các phản ứng phịng thủ được điều hịa cả về khơng gian và thời
gian. Các đáp ứng này bao gồm oxy hóa liên kết chéo của các protein thành tế
bào, sản xuất phytoalexin, các enzyme thủy phân, phenol hóa các protein thành
tế bào và cuối cùng tế bào thực vật chết do mẫn cảm. Vi sinh vật xâm nhiễm vào
thực vật cảm ứng sinh tổng hợp các hợp chất thứ cấp có hoạt tính kháng sinh
theo cách tương tự các nhân tố stress như chiếu tia UV, sốc thẩm thấu, acid béo,
muối vô cơ và ion kim loại nặng. Các phân tử kích thích sự sản xuất các hợp
chất thứ cấp được gọi là elicitor. Cả elicitor sinh học và phi sinh học cảm ứng
tích lũy sản phẩm không chỉ ở cây nguyên vẹn mà cả ở tế bào nuôi cấy như là
kết quả của các phản ứng phịng thủ, bảo vệ hay tấn cơng [82]. Một lượng lớn
các hợp chất thứ cấp được sản xuất ở thực vật cùng khi có sự xuất hiện của các
tác nhân tự nhiên như các vi sinh vật gây bệnh, động vật ăn cỏ và các thực vật
cạnh tranh khác. Các hợp chất đó được biết như là phytoanticipin, bao gồm
saponin, các triterpenoid glycoalkaloid với hoạt tính kháng khuẩn được tích lũy

trong các mơ thực vật khác nhau (ví dụ, α-tomatine trong lá cây cà chua,
avenacine A-1 trong rễ yến mạch) [116].
Một số nghiên cứu chứng minh rằng sự nhận biết đặc hiệu giữa elicitor là
vi sinh vật với các thụ thể thực vật tương ứng gây ra các tín hiệu đặc trưng làm
kích hoạt các phản ứng phòng thủ. Thụ thể của elicitor thực vật được xác định
đặc tính đầu tiên là Arabidopsis FLS2, thụ thể này có thể nhận biết tiên mao của
vi khuẩn. FLS2 được cho là kích hoạt sự đáp ứng phịng thủ khi xử lý tế bào
nuôi cấy cây Arabidopsis với tiên mao hoặc flg22 (một peptide gồm 22 amino
acid). Sau đó nhiều thụ thể của các elicitor khác cũng đã được nghiên cứu [38].
Sự nhận biết các elicitor bởi các thụ thể thường gây ra các


×