Tải bản đầy đủ (.doc) (125 trang)

Nghiên cứu khả năng sinh trưởng và tích lũy oleanolic acid trong tế bào đinh lăng (Polyscias fruticosa L. Harms) nuôi cấy in vitro.

Bạn đang xem bản rút gọn của tài liệu. Xem và tải ngay bản đầy đủ của tài liệu tại đây (7.1 MB, 125 trang )

ĐẠI HỌC HUẾ
TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC

PHAN THỊ Á KIM

NGHIÊN CỨU KHẢ NĂNG SINH TRƯỞNG
VÀ TÍCH LŨY OLEANOLIC ACID CỦA TẾ BÀO
ĐINH LĂNG (POLYSCIAS FRUTICOSA (L.) HARMS)
NUÔI CẤY IN VITRO

LUẬN ÁN TIẾN SĨ SINH HỌC

HUẾ - NĂM 2022


ĐẠI HỌC HUẾ
TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC

PHAN THỊ Á KIM

NGHIÊN CỨU KHẢ NĂNG SINH TRƯỞNG
VÀ TÍCH LŨY OLEANOLIC ACID CỦA TẾ BÀO
ĐINH LĂNG (POLYSCIAS FRUTICOSA (L.) HARMS)
NUÔI CẤY IN VITRO

Ngành: CÔNG NGHỆ SINH HỌC
Mã số: 942.02.01

LUẬN ÁN TIẾN SĨ SINH HỌC

Người hướng dẫn khoa học:


1. TS. LÊ VĂN TƯỜNG HUÂN
2. PGS. TS. VÕ THỊ MAI HƯƠNG


LỜI CẢM ƠN
Trong suốt thời gian học tập và hoàn thành luận án, em đã nhận được rất
nhiều sự quan tâm, giúp đỡ của Phòng đào tạo sau đại học, các Thầy Cô giáo
Khoa Sinh, Bộ môn Công nghệ sinh học - Trường đại học Khoa học Huế, Sở
Khoa học và Công nghệ tỉnh Quảng Nam. Em xin chân thành cảm ơn sự giúp
đỡ quý giá đó.
Em xin gửi lời cảm ơn đến TS. Lê Văn Tường Huân, PGS. TS. Võ Thị
Mai Hương đã tận tình hướng dẫn, giúp đỡ em trong suốt thời gian học tập;
xin cảm ơn các anh chị cơng tác tại Phịng thí nghiệm Bộ mơn Công nghệ
sinh học, Đại học Khoa học Huế; Viện Công nghệ Sinh học, Đại học Huế đã
nhiệt tình giúp đỡ em thực hiện đề tài.
Đặc biệt, em xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành và lời cảm ơn sâu sắc
đến GS. TS. Nguyễn Hoàng Lộc – Người Thầy giáo mẫu mực, tận tình hướng
dẫn và tạo mọi điều kiện thuận lợi nhất cho em trong suốt quá trình thực hiện
luận án này.
Cuối cùng, em xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến những người thân
trong gia đình, bạn bè, đồng nghiệp đã động viên và giúp đỡ em trong suốt
thời gian học tập cho đến khi hoàn thành luận án này.
Một lần nữa, em xin chân thành cảm ơn!
Thừa Thiên Huế, tháng 4 năm 2022
Phan Thị Á Kim


LỜI CAM ĐOAN

Tơi xin cam đoan đây là cơng trình nghiên cứu của riêng tơi. Các số

liệu, kết quả trình bày trong luận án là trung thực, khách quan và nghiêm túc,
tài liệu tham khảo có nguồn gốc rõ ràng.
Nếu có gì sai sót, tơi xin chịu hồn tồn trách nhiệm.

Tác giả luận án


BẢNG CHÚ THÍCH CHỮ VIẾT TẮT
2,4-D

2,4-dichlorophenoxy acetic acid

BAP

6-benzyl aminopurine

CAS

Casamino acids

Cs

Cộng sự

ĐC

Đối chứng

DW


Dry weight (khối lượng khô)

FW

Fresh weight (khối lượng tươi)

GI

Growth index (Chỉ số sinh trưởng)

GPX

Glutathione peroxidase

GSH-px

Gluthatione peroxidase

HCTC

Hợp chất thứ cấp

HepG2

Human hepatocellular carcinoma (tế bào ung thư gan ở
người)

HPLC

High-performance liquid chromatography (Sắc ký lỏng hiệu

năng cao)

IBA

3-indolebutyric acid

IC50

Half maximal inhibitory concentration (nồng độ ức chế tối đa
một nữa)

JA

Jasmonic acid

KIN

Kinetin

KTST

Kích thích sinh trưởng

MDA

Malonaldehyde

MeJA

Methyl jasmonate


MIC

Minimum inhibitory concentration (nồng độ ức chế tối thiểu)

MS

Murashige and Skoog (1962)

MT

Môi trường
1


NAA

Naphthalene acetic acid

OA

Oleanolic acid

PAA

Phenyl acetic acid

PGE2

Prostaglandin E2


ROS

Reactive oxygen species

SA

Salicylic acid

SOD

Superoxide dismutase

TB

Tế bào

TPA

12-O-tetradecanoylphorbol 13-acetate

TRYP

Tryptone

UA

Ursolic acid

YE


Yeast extract (dịch chiết nấm men)


MỤC LỤC
LỜI CAM ĐOAN.........................................................................................iv
MỤC LỤC......................................................................................................i
BẢNG CHÚ THÍCH CHỮ VIẾT TẮT......................................................... i
DANH MỤC CÁC BẢNG..........................................................................vii
DANH MỤC CÁC HÌNH ẢNH................................................................ viii
MỞ ĐẦU.......................................................................................................1
1. TÍNH CẤP THIẾT CỦA ĐỀ TÀI............................................................. 1
2. MỤC TIÊU NGHIÊN CỨU......................................................................3
3. NỘI DUNG VÀ PHẠM VI NGHIÊN CỨU.............................................3
4. ĐÓNG GÓP MỚI CỦA LUẬN ÁN..........................................................3
5. Ý NGHĨA KHOA HỌC VÀ THỰC TIỄN CỦA LUẬN ÁN....................4

Chương 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU............................................................5
1.1. TỔNG QUAN VỀ CÂY ĐINH LĂNG LÁ NHỎ..................................5
1.1.1. Đặc điểm thực vật................................................................................. 5
1.1.2. Thành phần hóa học của cây đinh lăng lá nhỏ.......................................7
1.1.3. Giá trị dược lý của cây đinh lăng lá nhỏ................................................8
1.2. ELICITOR............................................................................................10
1.2.1. Khái niệm............................................................................................10
1.2.2. Phân loại............................................................................................. 10
1.2.3. Cơ chế tác dụng của elicitor.................................................................12
1.2.4. Các yếu tố ảnh hưởng đến q trình kích kháng.................................. 14
1.2.5. Ni cấy tế bào thực vật để sản xuất các hợp chất thứ cấp.................. 17
1.2.6. Một số thành tựu trong sản xuất hợp chất thứ cấp ở thực vật được xử lý


elicitor...........................................................................................................19
1.3. TỔNG QUAN VỀ OLEANOLIC ACID............................................. 25


1.3.1. Vai trị và phân bố............................................................................... 25
1.3.2. Một số cơng dụng của oleanolic acid................................................... 25
1.3.3. Cấu trúc hóa học và tính chất vật lý..................................................... 28
1.3.4. Sinh tổng hợp oleanolic acid................................................................29
1.3.5. Các nghiên cứu sản xuất oleanolic acid bằng nuôi cấy mơ và tế bào thực

vật

31

1.4. TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU NI CẤY IN VITRO VÀ SẢN XUẤT

HỢP CHẤT THỨ CẤP Ở CÂY ĐINH LĂNG...........................................36
1.4.1. Nhân giống in vitro cây đinh lăng lá nhỏ..............................................36
1.4.2. Sản xuất hợp chất thứ cấp từ cây đinh lăng lá nhỏ...............................39
1.4.3. Sản xuất oleanolic acid từ nuôi cấy tế bào đinh lăng lá nhỏ.................40
1.4.4. Xây dựng quy trình thu nhận hợp chất thứ cấp từ cây đinh lăng lá nhỏ

41

Chương 2. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU...............43
2.1. ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU..............................................................43
2.1.1. Đối tượng nghiên cứu..........................................................................43
2.1.2. Nguyên liệu nghiên cứu.......................................................................43
2.2. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU........................................................45
2.2.1. Hóa chất và môi trường nuôi cấy.........................................................45

2.2.2. Nghiên cứu ảnh hưởng của môi trường nuôi cấy lên khả năng sinh

trưởng của callus...........................................................................................46
2.2.3. Nghiên cứu ảnh hưởng của môi trường nuôi cấy lên khả năng sinh

trưởng của tế bào.......................................................................................... 47
2.2.4. Xử lý elicitor....................................................................................... 48
2.2.5. Định lượng oleanolic acid....................................................................49
2.2.6. Xử lý thống kê.....................................................................................50

Chương 3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU........................................................52
3.1.

ẢNH HƯỞNG CỦA MÔI TRƯỜNG NUÔI CẤY ĐẾN SINH

TRƯỞNG CỦA CALLUS.......................................................................... 52


3.1.1. Ảnh hưởng của 2,4-D kết hợp với KIN lên sinh trưởng của callus......52
3.1.2. Ảnh hưởng của nguồn nitơ lên sinh trưởng của callus thân................. 57
3.2. ẢNH HƯỞNG CỦA MÔI TRƯỜNG NI CẤY ĐẾN KHẢ NĂNG

SINH TRƯỞNG VÀ TÍCH LŨY OLEANOLIC ACID CỦA TẾ BÀO.....60
3.2.1. Nuôi cấy tế bào....................................................................................60
3.2.2. Ảnh hưởng của nguồn carbon..............................................................62
3.2.3. Ảnh hưởng của chất điều hòa sinh trưởng............................................63
3.3. ẢNH HƯỞNG CỦA MỘT SỐ ELICITOR LÊN SINH TRƯỞNG VÀ

TÍCH LŨY OLEANOLIC ACID TRONG TẾ BÀO HUYỀN PHÙ..........66
3.3.1. Ảnh hưởng của dịch chiết nấm men.....................................................66

3.3.2. Ảnh hưởng của methyl jasmonate........................................................70

Chương 4. BÀN LUẬN.............................................................................. 75
4.1.

ẢNH HƯỞNG CỦA MÔI TRƯỜNG NUÔI CẤY LÊN SINH

TRƯỞNG CỦA CALLUS.......................................................................... 75
4.1.1. Ảnh hưởng của chất điều hòa sinh trưởng............................................75
4.1.2. Ảnh hưởng của nguồn nitơ.................................................................. 76
4.2.

ẢNH HƯỞNG CỦA MÔI TRƯỜNG NUÔI CẤY ĐẾN SINH

TRƯỞNG CỦA TẾ BÀO VÀ HÀM LƯỢNG OLEANOLIC ACID.........77
4.2.1. Nuôi cấy tế bào huyền phù.................................................................. 77
4.2.2. Ảnh hưởng của nguồn carbon..............................................................78
4.2.3. Ảnh hưởng của chất điều hịa sinh trưởng............................................79
4.2.4. Tích lũy oleanolic acid trong tế bào..................................................... 80
4.3. ẢNH HƯỞNG CỦA MỘT SỐ ELICITOR LÊN SINH TRƯỞNG VÀ

TÍCH LŨY OLEANOLIC ACID TRONG TẾ BÀO HUYỀN PHÙ..........82
4.3.1. Đặc điểm của elicitor...........................................................................82
4.3.2. Ảnh hưởng của một số elicitor lên sinh trưởng tế bào..........................84
4.3.3. Ảnh hưởng của một số elicitor lên tích lũy oleanolic acid....................85

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ.....................................................................90


KẾT LUẬN................................................................................................. 90

KIẾN NGHỊ................................................................................................ 90
CÁC CƠNG TRÌNH CƠNG BỐ LIÊN QUAN ĐẾN LUẬN ÁN..............91
TÀI LIỆU THAM KHẢO...........................................................................92
PHỤ LỤC..................................................................................................108


DANH MỤC CÁC BẢNG
Bảng 1.1. Phân loại elicitor trong sản xuất các hợp chất thứ cấp...................11
Bảng 2.1. Các hóa chất chính sử dụng trong nghiên cứu............................... 45
Bảng 3.1. Ảnh hưởng của 2,4-D kết hợp với KIN lên khả năng sinh trưởng
của callus lá sau 5 tuần nuôi cấy..................................................................... 53
Bảng 3.2. Ảnh hưởng của 2,4-D và KIN lên khả năng sinh trưởng của callus
thân sau 5 tuần nuôi cấy.................................................................................. 54
Bảng 3.3. Ảnh hưởng của 2,4-D và KIN lên khả năng sinh trưởng của callus
rễ sau 5 tuần nuôi cấy......................................................................................56
Bảng 3.4. Ảnh hưởng của TRYP lên khả năng sinh trưởng của callus thân sau
5 tuần nuôi cấy................................................................................................ 58
Bảng 3.5. Ảnh hưởng của CAS lên khả năng sinh trưởng của callus thân sau 5
tuần nuôi cấy................................................................................................... 59
Bảng 3.6. Ảnh hưởng của nguồn carbon lên sự sinh trưởng của tế bào đinh
lăng lá nhỏ....................................................................................................... 62
Bảng 3.7. Ảnh hưởng của KIN và BAP kết hợp với 2,4-D lên khả năng sinh
trưởng của tế bào.............................................................................................64
Bảng 3.8. Hàm lượng oleanolic acid trong các loại mẫu khác nhau...............65
Bảng 3.9. Ảnh hưởng của YE lên sinh trưởng của tế bào đinh lăng lá nhỏ...67
Bảng 3.10. Ảnh hưởng của YE lên tích lũy oleanolic acid của tế bào đinh lăng
lá nhỏ...............................................................................................................69
Bảng 3.11. Ảnh hưởng của MeJA lên sinh trưởng của tế bào đinh lăng lá
nhỏ...................................................................................................................71
Bảng 3.12. Ảnh hưởng của MeJA lên tích lũy oleanolic acid của tế bào đinh

lăng lá nhỏ....................................................................................................... 73


DANH MỤC CÁC HÌNH ẢNH
Hình 1.1. Cấu trúc hóa học của oleanolic acid............................................... 28
Hình 1.2. Sinh tổng hợp cation dammarenyl (I), oleanyl, lupenyl và lupeol từ
squalene...........................................................................................................29
Hình 1.3. Sinh tổng hợp UA (4) và OA (5) từ cation oleanyl.........................30
Hình 1.4. Chu trình tổng hợp oleanolic acid ở thực vật................................. 30
Hình 2.1. Cây đinh lăng lá nhỏ tự nhiên.........................................................43
Hình 2.2. Callus có nguồn gốc từ lá sau 5 tuần ni cấy................................44
Hình 2.3. Callus có nguồn gốc từ thân sau 5 tuần ni cấy............................44
Hình 2.4. Callus có nguồn gốc từ rễ sau 5 tuần ni cấy............................... 44
Hình 2.5. Sơ đồ thí nghiệm.............................................................................51
Hình 3.1. Callus lá sinh trưởng trên mơi trường có bổ sung 1 mg/L 2,4-D kết
hợp với 0,5 mg/L KIN sau 5 tuần ni cấy..................................................... 53
Hình 3.2. Callus thân sinh trưởng trên mơi trường có bổ sung 1 mg/L 2,4-D
và 0,5 mg/L KIN sau 5 tuần ni cấy..............................................................55
Hình 3.3. Callus rễ sinh trưởng trên mơi trường có bổ sung 2 mg/L NAA và
0,5 mg/L KIN sau 5 tuần ni cấy.................................................................. 56
Hình 3.4. Callus thân sinh trưởng trên mơi trường có bổ sung 0,8 g/L TRYP
sau 5 tuần ni cấy.......................................................................................... 58
Hình 3.5. Callus thân sinh trưởng trên mơi trường có bổ sung 0,4 g/L CAS
sau 5 tuần ni cấy.......................................................................................... 60
Hình 3.6. Đường cong sinh trưởng của tế bào huyền phù đinh lăng lá nhỏ
trong môi trường cơ bản MS chứa 1 mg/L 2,4-D và 0,5 mg/L KIN...............61
Hình 3.7. Sinh khối tươi (A) và sinh khối khô (B) của tế bào đinh lăng lá nhỏ
. ....................................................................................................................... 61



Hình 3.8. Sắc ký đồ HPLC phân tích hàm lượng oleanolic acid. A. Chất
chuẩn oleanolic acid, B. Mẫu lá, C. Tế bào trên môi trường cơ bản MS chứa 1
mg/L BAP và 0,5 mg/L 2,4-D, D. Tế bào trên môi trường cơ bản MS chứa
1,25 mg/L KIN và 1 mg/L 2,4-D.....................................................................66
Hình 3.9. Dịch huyền phù tế bào (A), sinh khối tươi (B) và sinh khối khô (C)
của tế bào đinh lăng lá nhỏ trong mơi trường cơ bản MS có 20 g/L sucrose; 1
mg/L BAP; 0,5 mg/L 2,4-D bổ sung YE 3 g/L lúc bắt đầu ni cấy...............70
Hình 3.10. Dịch huyền phù tế bào (A), sinh khối tươi (B) và sinh khối khô
(C) của tế bào huyền phù đinh lăng lá nhỏ trong mơi trường cơ bản MS có 20
g/L sucrose; 1 mg/L BAP; 0,5 mg/L 2,4-D bổ sung YE 1 g/L sau 6 ngày ni
cấy....................................................................................................................70
Hình 3.11. Dịch huyền phù tế bào (A), sinh khối tươi (B) và sinh khối khô
(C) của tế bào huyền phù đinh lăng lá nhỏ trong mơi trường cơ bản MS có 20
g/L sucrose; 1 mg/L BAP; 0,5 mg/L 2,4-D bổ sung MeJA 10 µM lúc bắt đầu
ni cấy............................................................................................................74
Hình 3.12. Dịch huyền phù tế bào (A), sinh khối tươi (B) và sinh khối khô
(C) của tế bào huyền phù đinh lăng lá nhỏ trong môi trường cơ bản MS có 20
g/L sucrose; 1mg/L BAP; 0,5 mg/L 2,4-D bổ sung MeJA 100 µM sau 3 ngày
ni cấy............................................................................................................74


MỞ ĐẦU
1. TÍNH CẤP THIẾT CỦA ĐỀ TÀI

Cùng với sự phát triển của nền y học, việc nghiên cứu chiết xuất các hoạt
chất tự nhiên có hoạt tính sinh học cao để tạo ra những loại thuốc mới phục vụ
sức khỏe con người ngày càng được quan tâm. Nhiều dược liệu có nguồn gốc
thực vật đã và đang được sử dụng rộng rãi như là nguồn cung cấp các loại thuốc
chữa bệnh hoặc thực phẩm chức năng cho đại đa số người dân trên thế giới.
Đinh lăng còn gọi là cây gỏi cá, nam dương sâm, có tên khoa học là

Polyscias spp., thuộc họ Nhân sâm (Araliaceae), là một loài cây thuốc đã
được đưa vào dược điển Việt Nam. Trong số các loài đinh lăng thuộc chi
Polyscias, đinh lăng lá nhỏ (P. fruticosa (L.) Harms) là loài được dân gian sử
dụng rộng rãi làm thuốc tăng cường sức khỏe và hoạt huyết dưỡng não từ rất
lâu [4]. Trong đinh lăng có các loại alkaloid, glycoside, saponin, flavonoid,
tannin, vitamin B1, và amino acid như methionine, lycine, cysteine và các
amino acid thiết yếu khác. Đinh lăng chứa các hợp chất saponin tương tự như
ở nhân sâm. Trong một số trường hợp, rễ củ đinh lăng được thay thế cho nhân
sâm như một nguyên liệu dễ tìm ở Việt Nam [11].
Đặc biệt, trong thành phần của đinh lăng, oleanolic acid là một triterpene
thuộc nhóm saponin có hoạt tính sinh học cao, phổ biến trong nhiều lồi thực
vật. Oleanolic acid khơng chỉ tồn tại như một phân tử tự do ở thực vật, mà
còn là tiền chất aglycone của các saponin triterpenoid. Những tiềm năng to
lớn của oleanolic acid trong y học như khả năng kháng viêm, bảo vệ gan,
chống khối u, điều trị tiểu đường, chống cao huyết áp,... [64, 108] đòi hỏi phải
có những hướng sản xuất phù hợp để thương mại hóa sản phẩm đáp ứng nhu

1


cầu sử dụng.
Hiện nay, nhu cầu về oleanolic acid trong dược phẩm đang tăng cao,
trong khi đó, nguồn nguyên liệu tự nhiên không ổn định do việc nhân trồng
cây đinh lăng, chủ yếu theo phương pháp truyền thống (giâm hom), thời gian
thu hoạch khá lâu, ít nhất từ 3-5 năm trở lên, năng suất thường thấp, phụ
thuộc rất lớn vào điều kiện thời tiết, mùa vụ, đất đai, diện tích canh tác,... nên
trữ lượng của chúng ngày càng giảm, không đáp ứng đủ ngun liệu cho
ngành cơng nghiệp dược. Vì vậy, những nghiên cứu thu nhận oleanolic acid
bằng phương pháp nuôi cấy tế bào thực vật là một hướng rất được quan tâm,
hứa hẹn tiềm năng to lớn.

Bên cạnh đó, nhiều nghiên cứu cho thấy, hàm lượng các chất có hoạt
tính sinh học tích lũy trong tế bào thực vật nuôi cấy in vitro thường là tương
đương hoặc cao hơn nhiều lần so với bộ phận tích lũy chúng ở cây ngồi tự
nhiên [118]. Thành phần mơi trường, điều kiện ni cấy, các tiền chất hoặc
các elicitor (chất kích kháng) trong mơi trường ni cấy tế bào có ảnh hưởng
đến việc tăng hiệu suất tổng hợp các chất chuyển hóa thứ cấp, rút ngắn thời
gian và giảm chi phí sản xuất.
Hiện nay, các nghiên cứu về nhân giống in vitro cây đinh lăng lá nhỏ [5,
101], nuôi cấy tế bào huyền phù [8] và nuôi cấy rễ tơ [3] để sản xuất saponin
từ cây đinh lăng lá nhỏ cũng đang được quan tâm. Tuy nhiên, các nghiên cứu
về sử dụng elicitor trong q trình ni cấy tế bào cây đinh lăng lá nhỏ lại
chưa được thực hiện nhiều. Từ những lý do trên, đề tài: “Nghiên cứu khả
năng sinh trưởng và tích lũy oleanolic acid của tế bào đinh lăng
(Polyscias fruticosa (L.) Harms) nuôi cấy in vitro” được thực hiện nhằm
làm cơ sở cho việc sản xuất một số hợp chất có giá trị dược liệu sau này.


2. MỤC TIÊU NGHIÊN CỨU

Xác định môi trường nuôi cấy và elicitor thích hợp để tăng khả năng tích
lũy oleanolic acid của tế bào cây đinh lăng lá nhỏ.
3. NỘI DUNG VÀ PHẠM VI NGHIÊN CỨU

Nội dung nghiên cứu
- Nghiên cứu ảnh hưởng của môi trường nuôi cấy đến khả năng sinh

trưởng của callus đinh lăng lá nhỏ.
- Nghiên cứu một số yếu tố ảnh hưởng đến khả năng sinh trưởng và tích

lũy oleanolic acid của tế bào huyền phù đinh lăng lá nhỏ, bao gồm:

+ Ảnh hưởng của môi trường ni cấy (nguồn carbon, chất điều hịa sinh
trưởng).
+ Ảnh hưởng của các elicitor (dịch chiết nấm men và methyl jasmonate).
Phạm vi nghiên cứu
- Nghiên cứu nuôi cấy mô và tế bào cây đinh lăng lá nhỏ được thực hiện

tại Phịng thí nghiệm của Bộ mơn Cơng nghệ sinh học, Khoa Sinh học,
Trường Đại học Khoa học, Đại học Huế.
- Phân tích hàm lượng oleanolic acid được thực hiện tại Phịng thí

nghiệm của Trường Đại học Y dược, Đại học Huế và Cơng ty CP Dược TW
Huế.
4. ĐĨNG GĨP MỚI CỦA LUẬN ÁN

Đây là cơng trình đầu tiên sử dụng các elicitor (YE và MeJA) để nghiên
cứu cải thiện khả năng tích lũy oleanolic acid của tế bào cây đinh lăng lá nhỏ.
Nghiên cứu đã xác định được YE ở nồng độ 1 g/L bổ sung sau 6 ngày
nuôi cấy cho hiệu quả tích lũy oleanolic acid cao nhất (164,34 mg/g khối
lượng khô), gấp 6,47 lần so với đối chứng không xử lý elicitor (25,40 mg/g).
Xử lý bằng MeJA cũng cho hiệu quả cao nhưng thấp hơn YE, MeJA ở nồng


độ 100 µM bổ sung sau 3 ngày ni cấy cho hiệu quả tích lũy oleanolic acid
cao gấp gần 5,2 lần so với đối chứng không bổ sung elicitor (131,83 mg/g
khối lượng khô).
5. Ý NGHĨA KHOA HỌC VÀ THỰC TIỄN CỦA LUẬN ÁN

Ý nghĩa khoa học
Kết quả của luận án cung cấp các dẫn liệu khoa học mới về ảnh hưởng
của elicitor lên khả năng tích lũy oleanolic acid trong tế bào cây đinh lăng lá

nhỏ; đồng thời luận án cũng là tài liệu tham khảo hữu ích cho nghiên cứu và
giảng dạy về lĩnh vực sản xuất các hoạt chất sinh học bằng con đường nuôi
cấy tế bào thực vật.
Ý nghĩa thực tiễn
Đây là hướng nghiên cứu có tiềm năng ứng dụng trong lĩnh vực sản xuất
các hoạt chất sinh học dùng làm dược liệu bằng nuôi cấy tế bào thực vật.


Chương 1
TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1. TỔNG QUAN VỀ CÂY ĐINH LĂNG LÁ NHỎ
1.1.1. Đặc điểm thực vật

Cây đinh lăng lá nhỏ có tên khoa học là P. fruticosa (L.) Harms thuộc họ
Nhân sâm (Araliaceae). Ở Việt Nam, lồi này cịn có các tên khác như đinh lăng
hương, đinh lăng lá xẻ, cây gỏi cá, và nam dương sâm [11, 12].
1.1.1.1. Đặc điểm hình thái

Cây đinh lăng lá nhỏ thuộc cây thân bụi có khả năng mọc xanh tốt quanh
năm, chiều cao của cây từ 0,5-2 m. Thân cây có hình trịn, vỏ cây sần sùi
nhưng khơng có gai. Trên thân cây thường có những vết sẹo lồi to do lá rụng,
thân cây thường có màu nâu xám. Cây đinh lăng lá nhỏ sử dụng làm thuốc
chủ yếu là những cây đinh lăng nhỏ hay còn gọi là đinh lăng nếp, có thân gỗ
nhỏ, chiều cao cây thường từ 0,8-1,5 m, thân cây cũng khơng có gai.
Cây đinh lăng lá nhỏ thuộc họ lá mọc cách, kép lông chim 2-3 lần. Chiều
dài lá thường từ 20-40 cm. Những lá chét thường chia thùy nhọn khơng đều,
mặt trên của lá có màu xanh, phần mặt dưới của lá thường bóng hơn. Phần
gốc lá và phiến lá có hình dáng thn nhọn, dài từ 3-5 cm, rộng từ 0,5-1,5 cm.
Gân lá thường có hình lơng chim, phần gân chính thường nổi rõ và có thêm 3

đến 4 cặp gân phụ chia theo từng đường lá. Cuống lá đinh lăng lá nhỏ thường
dài, có hình trịn hoặc màu xanh đậm, đơi khi có xuất hiện những đốm lá hình
nhạt ở trên cuống. Đáy cuống phình to ra thành bẹ lá.
Hoa của cây đinh lăng lá nhỏ thường mọc thành cụm hoa và tụ lại ở phía
đầu của ngọn cành. Hoa đinh lăng lá nhỏ thường là hoa lưỡng tính, mẫu 5.


Kích thước hoa khá nhỏ, cuống hoa có hình trụ màu xanh khoảng 0,3-0,4 cm.
Lá bắc thường mọc ở gốc cuống của hoa và có hình tam giác nhọn.
Bao hoa: đài hoa chỉ có 5 răng và chia đều ra các phía, thường có màu
xanh và có hình bầu dục, phần đỉnh thường thuôn nhọn. Cánh hoa thường
dài từ 0,25-0,3 cm, chiều rộng khoảng 0,1-0,15 cm, ở giữa cánh hoa thường
có gân.
Bộ nhị: có 5 nhị rời và đều, xếp xen kẽ giữa các cánh hoa. Chỉ nhị có
dạng sợi mảnh, thường có màu trắng và chiều dài khoảng 0,1-0,15 cm. Bao
phấn bên ngồi là 2 ơ thn dài màu vàng nứt dọc theo chiều dài và hướng
vào bên trong, phần bao phấn đính với gốc hoa. Hạt phấn tách rời và thường
có hình cầu 3 lỗ, hạt phấn có màu vàng nhạt và có đường kính từ 30-35 cm.
Bộ nhụy: có từ 2-3 lá nỗn. Phần bầu dưới có 2-3 ơ, mỗi ơ chứa một
nỗn. Đỉnh nỗn trung trụ, có tới 2-3 vịi nằm úp sát vào nhau và thẳng đứng,
nỗn thường có màu xanh đậm, dài khoảng 1 cm. Phần đầu nhiều hình điểm.
Quả đinh lăng lá nhỏ thuộc dạng quả hạch, có hình bầu dục với chiều dài
khoảng 4-6 mm, chiều rộng khoảng 3-4 mm. Trên đỉnh quả thường vẫn cịn
lại vịi nhụy mọc chỗi ra, đài vẫn cịn. Quả đinh lăng lá nhỏ thường có màu
xanh đậm, trên vỏ quả xuất hiện những nốt trịn có màu xanh nhạt [11, 12].
1.1.1.2. Đặc điểm phân bố và sinh thái

Chi Polyscias có gần 100 lồi trên thế giới, phân bố rải rác ở các vùng
cận nhiệt đới và nhiệt đới, nhất là một số đảo ở Thái Bình Dương. Ở Việt
Nam, đinh lăng cũng có từ lâu trong nhân dân và được trồng khá phổ biến ở

vườn gia đình, đình chùa, trạm xá… để làm cảnh, làm thuốc và gia vị.
Đinh lăng lá nhỏ là loại cây ưa ẩm và có thể hơi chịu bóng, trồng được
trên nhiều loại đất; thậm chí với một lượng đất rất ít trong chậu nhỏ, cây vẫn
có thể sống được theo kiểu cây cảnh bonsai. Trồng bằng cành sau 2-3 năm có


hoa quả. Đinh lăng lá nhỏ có khả năng tái sinh vơ tính khỏe, thường được
trồng bằng phương pháp giâm cành hay trồng trực tiếp từ đoạn thân hay cành.
Đinh lăng có nhiều lồi khác nhau, tuy nhiên, đinh lăng lá nhỏ là quan trọng
nhất, được sử dụng làm thuốc, làm gia vị và làm cây cảnh [30].
1.1.2. Thành phần hóa học của cây đinh lăng lá nhỏ

Chi Polyscias là chi lớn thứ hai trong họ Nhân sâm, cho đến nay trên thế
giới chỉ có một số lồi của chi Polyscias được nghiên cứu thành phần hóa học
như P. filicifolia Bail., P. scutellaria (Burm. f) Merr., P. amflifolia (Baker)
Harms., P. dichroostachya Baker., P. fulva, P. murayi Harms và Polyscias sp.
Nov. Trong số này, loài P. fructicosa (L.) Harms được quan tâm và nghiên cứu
nhiều nhất [94].
Năm 1998, Huan và cs đã phân lập được 11 saponin triterpen bao gồm
ladyginoside A, zingibroside R1, polysicoside A, polysicoside B, polysicoside
C, 3-O--D-glucopyranosyl-(14)--D-glucuronopyranosyl oleanolic-28-O-

-D-glucopyranosyl ester, polysicoside D, polysicoside E, polysicoside F,
polysicoside G, và polysicoside H [49].
Thai và cs (2016) đã phân lập và xác định cấu trúc của 6 hợp chất, trong
đó có 1 hợp chất mới từ lá cây đinh lăng lá nhỏ. Các hợp chất này gồm 3
saponin

3-O-β-D-glucopyranosyl-(1->4)-β-D-glucuronopyranosyl-oleanolic


acid 28-O-β-D-glucopyranosyl ester, polyscioside D, polyscioside I (chất
mới);



3

flavonoid

glycoside

afzelin,

kaempferol-3-O-α-L-

rhamnopyranosyl-(1->6)-β-D-glucopyranosidevà quercitrin [112].
Lá cây đinh lăng lá nhỏ trồng tại An Giang được thu mẫu, chiết và tách
phân đoạn bằng kỹ thuật chiết ngấm kiệt và chiết lỏng-lỏng. Kết quả phân lập
được 3 hợp chất saponin triterpen bao gồm: Ladyginosid A, acid 3-O-[β-Dglucopyranosyl-(1β4)]- β-D-(6-O-methyl) glucurono-pyranosyloleanolic, 3-


O- β -D-glucuronopyranosy-loleanolic 28-O-β-D-glucopyra-nosyl ester [14].
1.1.3. Giá trị dược lý của cây đinh lăng lá nhỏ

Tăng lực-chống nhược sức
Cao đinh lăng có tác dụng tăng lực ở khoảng liều <180 mg/kg được xác
định bằng hai nghiệm thức thực hiện trên chuột nhắt: chuột bơi kiệt sức của
Brekhman và chuột leo dây của Cabured [12].
Chống xơ vữa động mạch
Cao đinh lăng (90-180 mg/kg thể trọng) làm giảm sự gia tăng cholesterol

máu và lipid toàn phần trong huyết thanh của động vật bị gây xơ vữa động
mạch thực nghiệm bằng chế độ ăn giàu cholesterol (gây tăng cholesterol
ngoại sinh) và bằng Tween 80 (gây tăng cholesterol nội sinh) [12].
Kháng khuẩn
Tác dụng kháng khuẩn của cao đinh lăng trên các chủng Staphylococus
mạnh hơn trên các chủng vi khuẩn và nấm mốc khác [12].
Chống trầm cảm
Cao đinh lăng có tác dụng chống trầm cảm trong thực nghiệm của
Porsolt. Cao đinh lăng ở liều 45 mg/kg khơng có tác dụng chống trầm cảm có
ý nghĩa thống kê khi sử dụng 1 lần liều duy nhất nhưng khi cho uống trong
thời gian 3-7 ngày thể hiện tác dụng chống trầm cảm [12].
Chống stress
Cao đinh lăng làm tăng ngưỡng chịu đựng nhiệt độ nóng của động vật
thử nghiệm trong stress vật lý (stress nhiệt độ 37-42 oC). Trên thực nghiệm
stress tâm lý (stress cơ lập), nhóm đối chứng có những biểu hiện bị stress tâm
lý như: thời gian ngủ bị rút ngắn (giảm 30% thời gian ngủ so với nhóm bình
thường), có hành vi tấn cơng khi tiếp xúc với chuột lạ, trạng thái thụ động
[12].


Chống oxy hóa
Cao lá và saponin lá thể hiện tác dụng ức chế peroxide hóa lipid màng tế
bào não, trong khi cao rễ và saponin rễ thì khơng có tác dụng này. Cao rễ chỉ
thể hiện tác dụng ức chế peroxide hóa lipid trong trường hợp có xúc tác của
hệ Fenton [12].
Kích thích miễn dịch
Nhiều nghiên cứu đã chứng minh tác dụng của đinh lăng trên chức năng
miễn dịch tương tự như bột chiết sâm Việt Nam, thể hiện cả trên cơ địa động
vật bình thường và trên cơ địa động vật bị gây suy giảm miễn dịch bằng
cyclophosphamid, một chất kìm tế bào thuộc nhóm oxazaphosphorin thường

được sử dụng trong liệu pháp chống ung thư [12].
Hạ đường huyết
Luyen và cs (2018) đã đánh giá hiệu quả ức chế α-amylase và αglucosidase của 3-O- [β-d-glucopyranosyl- (1 → 4) -β-d-glucuronopyranosyl]
oleanolic acid 28-O-β-d-glucopyranosyl este (PFS), một saponin được phân
lập từ lá cây đinh lăng (Polyscias fruticosa) và tiềm năng hạ đường huyết sau
bữa ăn trên chuột nhắt trắng. Các tác giả đã nhận thấy, lá đinh lăng và saponin
chính PFS có thể được sử dụng để ngăn ngừa và điều trị bệnh đái tháo đường
và các biến chứng [70].
Các tác dụng phụ của cây đinh lăng
Ngoài các tác dụng kể trên, việc sử dụng đinh lăng khơng đúng cách
cũng có thể gây ra các tác dụng phụ như: hồi hộp, bồn chồn, nơn nao, tim đập
nhanh, hơi đau nhói. Một số trường hợp không nên sử dụng loại cây này như
phụ nữ đang mang thai hay người bị bệnh gan.


1.2. ELICITOR
1.2.1. Khái niệm

Elicitor có thể được định nghĩa là một chất hoặc một hỗn hợp các chất
mà khi đưa một nồng độ phù hợp vào hệ thống tế bào sống sẽ khởi đầu hoặc
cải thiện sự sinh tổng hợp các hợp chất đặc trưng.
Sự kích kháng (elicitation) là quá trình cảm ứng hoặc tăng cường sinh
tổng hợp các chất trao đổi do sự thêm vào một lượng nhỏ elicitor [97].
1.2.2. Phân loại

Elicitor được phân loại hoặc dựa trên bản chất tự nhiên của chúng là
elicitor phi sinh học và elicitor sinh học, hoặc dựa trên nguồn gốc của chúng
là elicitor ngoại sinh và elicitor nội sinh (Bảng 1.1).
Elicitor sinh học là các chất có nguồn gốc sinh vật, bao gồm các
polysaccharide có nguồn gốc từ thành tế bào thực vật (pectin hoặc cellulose),

các vi sinh vật (chitin hoặc glucans) và các glycoprotein, G-protein hay các
protein nội bào có chức năng gắn với các receptor và tác động bằng cách hoạt
hóa hoặc bất hoạt một số các enzyme hoặc các kênh ion. Elicitor phi sinh học
là các chất khơng có nguồn gốc từ sinh vật, chủ yếu là các muối vô cơ và các
tác nhân vật lý như ion Cu2+ và Cd2+, Ca2+ và pH cao. Elicitor ngoại sinh là các
chất có nguồn gốc bên ngồi tế bào như các polysaccharide, polyamine và các
acid béo. Ngược lại, elicitor nội sinh là các chất có nguồn gốc bên trong tế
bào như là galacturonide hoặc hepta-β-glucoside,... [82].


Bảng 1.1. Phân loại elicitor trong sản xuất các hợp chất thứ cấp [43]
Phân loại dựa tính chất tự nhiên của elicitor
Là dạng chiết xuất thơ hoặc tinh sạch có nguồn gốc từ mầm bệnh
(nấm, vi khuẩn, nấm men) hoặc của chính thực vật, có 2 dạng:
Elicitor

Dạng xác

sinh học

định

có thành phần đã biết như polysaccharides,
glycoproteins, glucans, chitin, chitosan, pectin,
alginate, xanthan, elicitin, enzyme bất hoạt, ...

Dạng chưa

có thành phần chưa được xác định như dịch chiết thô


xác định

nấm men, dịch chiết vi khuẩn, dịch nấm,…
Muối và cá
kim

loại

nặng
Hóa học

Stress thẩm
thấu

Elicitor phi
sinh học



nội bào

Mannitol, sorbitol, sodium chloride,
potassium chloride, cadmium chloride,

chất

NO, ethylene, ...

Tia UV, thay đổi trạng thái nhiệt độ, muối, hạn hán,…


Các phân tử
tính

VOSO4, NiSO4, selenium, ...

polyvinyl pyrrolidone, ...

dạng khí
Vật lý

Ag2S2O3, AgNO3, CdCl2, CuCl2, CuSO4,

hiệu

Jasmonic acid, methyl jasmonate, salicylic acid, acetyl
salicylic acid, systemin, …

Phân loại dựa vào nguồn gốc của elicitor
Có nguồn gốc ở bên ngoài tế bào như glucomannose, glucan,
Elicitor

chitosan, monilicolin, polyamine, glycoprotein, polygalacturonase,

ngoại sinh

endopolygalacturonic, acid lyase, cellulose, arachidonic acid,
eicosapentanoic acid, ...

Elicitor nội


Có nguồn gốc ở bên trong tế bào như Jasmonic acid, methyl

sinh

jasmonate, salicylic acid, acetyl salicylic acid, systemin, ….


1.2.3. Cơ chế tác dụng của elicitor

Khi thực vật bị nhiễm bởi các vi sinh vật gây bệnh, sự đáp ứng được
kích hoạt nhanh với các phản ứng phịng thủ được điều hịa cả về khơng gian
và thời gian. Các đáp ứng này bao gồm oxy hóa liên kết chéo của các protein
thành tế bào, sản xuất phytoalexin, các enzyme thủy phân, phenol hóa các
protein thành tế bào và cuối cùng tế bào thực vật chết do mẫn cảm. Vi sinh
vật xâm nhiễm vào thực vật cảm ứng sinh tổng hợp các hợp chất thứ cấp có
hoạt tính kháng sinh theo cách tương tự các nhân tố stress như chiếu tia UV,
sốc thẩm thấu, acid béo, muối vô cơ và ion kim loại nặng. Các phân tử kích
thích sự sản xuất các hợp chất thứ cấp được gọi là elicitor. Cả elicitor sinh học
và phi sinh học cảm ứng tích lũy sản phẩm không chỉ ở cây nguyên vẹn mà cả
ở tế bào nuôi cấy như là kết quả của các phản ứng phịng thủ, bảo vệ hay tấn
cơng [82]. Một lượng lớn các hợp chất thứ cấp được sản xuất ở thực vật cùng
khi có sự xuất hiện của các tác nhân tự nhiên như các vi sinh vật gây bệnh,
động vật ăn cỏ và các thực vật cạnh tranh khác. Các hợp chất đó được biết
như là phytoanticipin, bao gồm saponin, các triterpenoid glycoalkaloid với
hoạt tính kháng khuẩn được tích lũy trong các mơ thực vật khác nhau (ví dụ,
α-tomatine trong lá cây cà chua, avenacine A-1 trong rễ yến mạch) [116].
Một số nghiên cứu chứng minh rằng sự nhận biết đặc hiệu giữa elicitor
là vi sinh vật với các thụ thể thực vật tương ứng gây ra các tín hiệu đặc trưng
làm kích hoạt các phản ứng phòng thủ. Thụ thể của elicitor thực vật được xác
định đặc tính đầu tiên là Arabidopsis FLS2, thụ thể này có thể nhận biết tiên

mao của vi khuẩn. FLS2 được cho là kích hoạt sự đáp ứng phịng thủ khi xử
lý tế bào nuôi cấy cây Arabidopsis với tiên mao hoặc flg22 (một peptide gồm
22 amino acid). Sau đó nhiều thụ thể của các elicitor khác cũng đã được
nghiên cứu [38]. Sự nhận biết các elicitor bởi các thụ thể thường gây ra các


×