Động học enzyme, Enzyme tái tổ hợp

MỤC LỤC
MỞ ĐẦU
NỘI DUNG
I. GIỚI THIỆU
II. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
III. TẠO ENZYME TÁI TỔ HỢP
IV. KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN
V. KẾT LUẬN
Tài liệu tham khảo

1
Vũ Thu Hằng


MỞ ĐẦU
Ngày nay khơng ai có thể phủ nhận được tầm quan trọng của công nghệ sinh học đối với nền
kinh tế quốc dân nước ta nói riêng và thế giới nói chung.
Thế kỷ 21 được coi là thế kỷ của ngành công nghệ sinh học, được coi là thời điểm lịch sử mà
con tầu vũ trụ mang tên “công nghệ sinh học” đã rời khỏi bệ phóng để bay đến tầm cao mới.
Công nghệ sinh học Việt Nam đang được coi là một hướng phát triển mũi nhọn của nhiều nước.
Trong đó có sự chú trọng đầu tư cho lĩnh vực cơng nghệ enzyme. Trong đó cơng nghệ enzyme tái tổ
hợp là một hướng đi mới. Có rất nhiều loại enzyme tái tổ hợp đã được nghiên cứu để đưa vào ứng
trong thực tiễn. Các enzyme xúc tác phản ứng thủy phân Hydrolase là một trong những enzyme được
ứng dụng rất nhiều trong mọi lĩnh vực, đặc biệt là ngành công nghiệp thực phẩm, tiêu biểu như: αamylase, β-amylase, protease, lipase,... Các enzyme này đã có những đóng góp rất to lớn trong việc
phục vụ, nâng cao đời sống của con người. Vì vậy nhu cầu cải tiến tạo ra enzyme tái tổ hợp mang
những đặc tính ưu việt hơn rất được quan tâm.

Xuất phát từ những thực tế trên, em đã lựa chọn và xin trình bày nội dung tiểu luận về
nghiên cứu “α-Amylase from B. amyloliquefaciens: purification, characterization, raw starch
degradation and expression in E.coli ”. Nghiên cứu trên được công bố, xuất bản vào năm
2004 trên Elsevier Ltd, do Elif Sarikaya Demirkan đến từ khoa Sinh học, Đại học Ankara

(Thổ Nhĩ Kỳ) và Bunzo Mikami, Motoyasu Adachi, Takahiko Higasa, Shigeru Utsumi đến từ
Học viện Khoa học Thực phẩm, Đại học Kyoto (Nhật Bản) hợp tác thực hiện.

2
Vũ Thu Hằng


NỘI DUNG
I. GIỚI THIỆU
1.1. Mục đích của nghiên cứu
Nghiên cứu báo cáo quy trình tinh sạch, phân loại và khả năng thủy phân trên tinh
bột thô của α-amylase từ B.amyloliquefaciens sp. kiểu dại và kiểu đột biến. Cùng đó là các
bước thực hiện biểu hiện ở E. coli của chủng enzyme kiểu dại.
1.2. Khái niệm và vai trò của α-Amylase
α-Amylase (E.C 3.2.1.1) là một enzym ngoại bào phổ biến trong các loài thực vật,
động vật bậc cao và vi sinh vật. Nó xúc tác q trình thủy phân liên kết α-δ- (1,4) glycosidic
trong các thành phần tinh bột và các cacbohydrat khác.

Hình 1.
Phản
ứng thủy phân của tinh bột tạo glucose dưới chất xúc tác là enzyme α-Amylase.
Enzyme này được sử dụng trong khử cặn vải, công nghiệp làm bánh, dược
phẩm và chất tẩy rửa. Các amylase có thể điều nhiệt rất quan trọng đối với công nghiệp sử
dụng. Đặc biệt, B. amyloliquefaciens, B. licheniformis, B. sterothermophilus và một số chủng
B. subtilis amylase và B. amylolifuefaciens và B. licheniformis tạo ra các enzym này ở dạng
lỏng [1]. Từ đó, các amylases ở một số Bacillus sp. đã được tinh chế và phân loại [2,3].
1.3. α-Amylase tái tổ hợp từ Bacillus sp. trên E. coli
Dey và cộng sự đã đưa ra nghiên cứu về một α-amylase chịu nhiệt mới từ Bacillus
sp. N-1 [4]. Gen α-amylase đã được biểu hiện từ nhiều loại Bacillus sp. trong E. coli để tăng
sản xuất amylase. Một số sản phẩm gen cũng đã được báo cáo là tiết vào môi trường nuôi cấy

bởi E. coli., chẳng hạn như penicillinase và xylanase của Bacillus sp. Một α-amylase chịu
nhiệt từ B. stearothermophilus đã được nhân bản trong E. coli và tăng sinh sản phẩm enzyme
3
Vũ Thu Hằng


ngoại bào [59]. Sự phân lập và phân loại đoạn 2,2 kb DNA ngược dòng của gen amylase từ B.
amyloliquefaciens cũng đã được báo cáo [6].
Enzyme amylase không hiệu quả trên các hạt tinh bột thơ bởi vì các hạt này chống
lại sự tiêu hóa ly giải tinh bột [7]. Vùng liên kết đầu C-terminal đóng một vai trị trong liên
kết tinh bột thô. Glucoamylase của nấm như Aspergillus spp. và Rhizopus spp. rất hiệu quả
với tinh bột thô, bởi vì chúng dường như có một vùng liên kết tinh bột COOH-terminal. Các
enzym từ vi khuẩn như β-amylase của B.polymyxa và cylodextrin glucanotransferase của B.
macerans cũng chứa miền này [8, 9].

4
Vũ Thu Hằng


II. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1. Đối tượng nghiên cứu và các bước tinh sạch enzyme
Một dòng B. amyloliqefaciens mới đã được phân lập từ đất của Thổ Nhĩ Kỳ và được
định danh bởi nhà máy ORBA Biochemicals (Istanbul, Thổ Nhĩ Kỳ).
Từ đó, một dịng đột biến được tạo ra bằng phương pháp xử lý với ethidium bromide/
UV [10]. Vi khuẩn được phát triển trên một môi trường xác định trong 72 h [11].
Tiếp theo, enzyme vi khuẩn có trong bề mặt ni cấy được tinh chế bằng một loạt bốn
bước:
+ Đầu tiên, 80% amoni sunfat được thêm vào phần nổi phía trên, ta thu được kết tủa.
Đem kết tủa này hòa tan trong dung dịch đệm Tris – HCl 20 mM (pH 7,6) và được thẩm tách
qua đêm.

+ Sau khi thẩm tách, dung dịch này được nạp vào cột Q Sepharose và tách rửa với
dung dịch đệm trên thu chứa 0,5 M NaCl.
+ Các phân đoạn được thu thập, thẩm tách với đệm Na-acetate 20 mM (pH 5,0) và
được cô đặc bằng siêu lọc thông qua bộ cô đặc Centriprep-10 (Amicon).
+ Các mẫu cô đặc được áp dụng cho cột SP Sepharose và tách rửa với dung dịch đệm
axetat Na 50 mM (pH 5,4) có chứa NaCl 1 M. Các phân đoạn được thu thập và tập trung bởi
siêu lọc trên máy cô đặc Centricon-10 (Amicon). Dung dịch đệm chứa 1 mM CaCl và 0,5 mM
PMFS.
2.2. Phân tích enzyme
α-Amylase hoạt động được phân tích bằng phương pháp tinh bột-iod [12]. Một đơn vị
enzyme (đơn vị/ml) được xác định bằng lượng enzyme tham gia thủy phân 1mg tinh bột
(0,1%) trong 10 phút ở 37oC và pH 5,9. Sự cơ đặc protein được tính tốn bằng phương pháp
Bradford [13] với albumin huyết thanh bò như một tiêu chuẩn.
2.3. Xác định khối lượng phân tử
Điện di được tiến hành trong dung dịch đệm sodium dodecyl sulphate và trên gel
polyacrylamide (SDS-PAGE) theo Laemmli [14].
2.4. Phân tích nguyên tố canxi
Sau khi thẩm tách các enzym đã được tinh sạch, nguyên tố canxi liên kết với αamylase được xác định bằng cách hấp thụ nguyên tử ở bước sóng 239,9 nm với máy đo quang
phổ nguyên tử Zeimman.
2.5. Ảnh hưởng của nhiệt độ và pH
Các mẫu enzyme được ủ trong 10 phút trong khoảng tăng nhiệt 30 và 90 oC. Để đánh
giá độ ổn định, các enzym được giữ trong 4 h và các hoạt độ còn lại được xác định. Giá trị pH
tối ưu cho các enzym được xác định trong hệ đệm Britton và Robinson từ pH 4 đến 9. Độ ổn
định pH của enzyme được xác định bằng cách ủ 2 giờ trong cùng một chất đệm (pH 5 và 8).
5
Vũ Thu Hằng


2.6. Ảnh hưởng của một số ion kim loại
Các mẫu enzyme được ủ với một số ion kim loại 1 và 5 mM. Các hoạt động tương đối

được thể hiện dưới dạng phần trăm hoạt động kiểm soát chưa được xử lý được coi là 100%.
2.7. Tính chất động học của enzym
Hằng số động học là Km và Vmax được đo bằng cách ước tính q trình thủy phân
với phương pháp tinh bột – iod và sử dụng một số nồng độ tinh bột. Giá trị Km và Vmax
được xác định bằng cách sử dụng phương trình Michaelis-Menten.
2.8. Độ đặc hiệu của cơ chất
Tính đặc hiệu của cơ chất với các enzym tinh khiết đã được nghiên cứu, đó là sự hiện
diện của các chất nền khác nhau. Các nồng độ đường khử được tạo ra đã được xác định bằng
phương pháp axit dinitrosalicylic [15] với maltose là tiêu chuẩn.
2.9. Thủy phân tinh bột hịa tan
Sản phẩm của q trình thủy phân tinh bột bằng α-amylase được hiển thị trên các tấm
silica gel (dày 0,5 mm và 20 cm x20 cm) bằng phương pháp sắc ký lớp mỏng (TLC).
2.10. Sự suy thối hạt tinh bột thơ
Các loại hạt tinh bột thơ bao gồm khoai tây, khoai lang, lúa mì, gạo và ngô được rửa 5
lần bằng nước Milli-Q. Các ngũ cốc được làm khô và 5% mỗi loại hạt tinh bột lơ lửng trong
400 mL dung dịch đệm axetat 50 mM (pH 5,5) chứa 10 mM 2-ME (mercaptoethanol) và 5
mMCaCl2. Phản ứng được bắt đầu bằng cách thêm 100 ml enzym dung dịch. Hỗn hợp cơ
chất enzyme được ủ trong 12,18 và 24 giờ, sau đó ly tâm và các chất nổi được sử dụng đểxác
định đường giải phóng bằng axit dinitrosalicylic phương pháp với maltose làm tiêu chuẩn. Tất
cả các loại hạt tinh bột được rửa hai lần bằng etanol nguyên chất và t-butylbrượu bia.
Sau khi đông khô, chúng được kiểm tra bằng cách quét kính hiển vi điện tử [16].

6
Vũ Thu Hằng


III. TẠO ENZYME TÁI TỔ HỢP
3.1. Khuếch đại gen α-Amylase
Trình tự DNA bộ gen của B. amyloliquefaciens sp. kiểu dại được chuẩn bị theo các
quy trình của Maeda et al. [17] và Silhavy et al. [18]. Gen α-amylase mã hóa enzyme trưởng

thành được khuếch đại bằng PCR sử dụng cặp mồi (Pharmacia Amersham Biochem):
N-5’GAATTCCATGGTAAATGGCACGCTGATGCAGTA TTTTG3’
và C-5’TTTCTGCAGTTATTTCTGAACATAA ATGGAGACGG3’
Phản ứng PCR được thực hiện với ExTaq polymerase và chất xúc tác từ Takara (Nhật
Bản, Kyoto) với chu kỳ có chương trình: biến tính ở 95 oC trong 20 giây, ủ ở 60oC trong 20s,
độ giãn dài ở 72oC trong 30s, tổng cộng 35 chu kỳ.
3.2. Chèn đoạn gen vào vector nhân bản
Sản phẩm PCR được cắt bởi 2 loại enzym cắt giới hạn PstI và NcoI. Sau đó sản phẩm
được tinh sạch bằng điện di trên Gel agarose 1,2% và sử dụng bộ lọc microcon 50 (Amicon).
Đoạn DNA sản phẩm này sau khi được tinh sạch sẽ chèn vào đoạn PstI-NcoI của vectơ
pKK233-2 (Pharmacia Amersham Biochem.), cuối cùng tạo ra plasmid sản phẩm là pKKAM.
Plasmid pKKAM được biến nạp thành E. coli JM109.
3.3. Giải trình tự sản phẩm PCR
Trình tự DNA được xác định bằng máy phân tích giải trình tự DNA (model 377 A,
Perkin-Elmer).
3.4. Đưa gen nhân bản vào vectơ biểu hiện
Để tạo một plasmid biểu hiện khác, gen của enzyme trưởng thành được chèn vào
plasmid pET21d (Novagen) có chứa promoter T7.
Đầu tiên, pKKAM được cắt bởi PstI và được điền vào bằng phân đoạn Klenow trước
khi cắt bằng NcoI.
Đoạn DNA được gắn vào vectơ pET21d giữa NcoI và vị trí EcoRI. Kết quả tạo
plasmid biểu hiện được đặt tên là pETAM.
3.5. Biến nạp plasmid biểu hiện vào E. coli
Plasmid pETAM được chuyển vào E. coli HB101 và sau đó là chuyển vào HMS174
(DE3) và BL21 (DE3).
3.6. Tối ưu hóa và biểu hiện α-amylase
Vi khuẩn được phát triển ở 37oC trong môi trường chứa 2L LB-broth bổ sung 50
mg/ml ampicillin trên máy quay lắc ở 200 vòng/phút trong 3 giờ.
Isopropyl-β-δ thiogalactopyranoside (IPTG) đã được thêm vào nồng độ cuối cùng là 1
mM để cảm ứng sự biểu hiện của α-amylase.

7
Vũ Thu Hằng


Vi khuẩn phát triển ở 200 vòng/phút ở 18 oC trong 2 ngày. Môi trường nuôi cấy được
ly tâm và phần nổi phía trên bị loại bỏ.
Các tế bào bị treo trong 50 mM Tris (pH 8,0), 50 mM NaCl và 1 mM EDTA và được
ly giải với 0,1 mg/ml enzyme lysozyme ở 30oC trong 1 giờ.
Các huyền phù hình cầu được tách bằng ly tâm (15.000 vòng/phút, 15 phút) và phần
nổi phía trên được sử dụng làm mẫu α-amylase.

8
Vũ Thu Hằng


Hình 2. Cấu trúc của plasmid pET21d, pKKAM, pETAM với các vị trí cắt giới hạn. Đoạn gen
amylase gồm 1,4kb được chèn vào plasmid pKK232-2. Plasmid này tạo ra pKKAM. Plasmid
pET21d có một promoter lac và pKKAM được nhân bản trong pET21d, tạo pETAM.
IV. KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN
9
Vũ Thu Hằng


4.1. Kết quả đặc tính của α-amylase từ B. amyloliquefaciens
Các α-amylase thu được từ B. amyloliquefaciens chủng dại và chủng đột biến đã được
tinh sạch qua bốn bước như phần 2.1 ở trên. Sản lượng của enzyme rất thấp. Có thể một số
protease đã liên kết với enzyme. Do đó, một chất ức chế protease là phenyl methlysulphonyl
fluoride (PMFS) đã được sử dụng.
Sau khi tinh sạch, mỗi enzyme cho thấy một dải đơn trên gel điện di SDSpolyacrylamide.

Bảng 1. Các chỉ số đặc tính của α-amylase từ B. amyloliquefaciens
Đặc tính
pH cao nhất
Tính ổn định pH
o
C cao nhất
Tính bền nhiệt
Km (mg/ml)
Vmax (U/ml)
Phân tử khối
Sản phẩm sau ly giải
Số nguyên tử Ca liên
kết với enzyme
Ion kim loại hoạt hóa
Chất nền đặc hiệu

Chủng dại
6.0
5.0-8.0, 1h
55
69%, 40oC, 4h
1.92
351
52 kDa
Glucose, maltose, maltotriose,…
1

Chủng đột biến
6.0
5.0-8.0, 2h

55
70%, 50oC, 4h
3.74
401
52 kDa
Glucose, maltose, maltotriose,…
2

Mg, Ba
Maltopentaose

Mg
Maltopentaose

4.1.1. Ảnh hưởng của nhiệt độ và pH lên hoạt động của α-amylase từ B. amyloliquefaciens
Một số chỉ số của 2 loại enzym tinh sạch được thống kê cho thấy α-amylase đột biến
có phạm vi pH và nhiệt độ khác để kết thúc hoạt động ổn định hơn trong khoảng từ 5 đến pH
8 sau 2 h so với chủng dại (Bảng 1, hình 3). Độ pH tối ưu và nhiệt độ tối ưu của cả hai enzym
là 6,0 và 55oC. Enzyme đột biến cũng ổn định nhiệt hơn (70% ở 50 oC trong 4 giờ) so với loại
tự nhiên.
Enzyme đột biến có độ ổn định cao hơn so với loại tự nhiên về pH và điều kiện nhiệt
độ. Người ta cũng thấy rằng cả hai amylase đều hoạt động mạnh hơn ở pH kiềm hơn là pH
axit.

10
Vũ Thu Hằng


Hình 3. Ảnh hưởng của nhiệt độ và pH
lên hoạt động của enzyme.

4.1.2. Kết quả động học của enzyme
Enzyme cho thấy động học kiểu Michaelis khi thủy phân tinh bột hịa tan. Các loại
amylase hoang dã và đột biến có Km và Vmax khác nhau (Bảng1).
4.1.3. Các sản phẩm từ phản ứng thủy phân của α-amylase
Các sản phẩm chính sau phản ứng của một α-amylase từ tinh bột hòa tan là
maltooligosaccharides [23]. Tác dụng của enzym đối với tinh bột hòa tan chỉ ra rằng hai
enzyme tuân theo cùng một mơ hình hoạt động, kể từ khi sản phẩm thủy phân của tinh bột
hịa tan bởi cả hai amylase thì maltose là sản phẩm chính, các oligosaccharid malto nhỏ và
một lượng nhỏ glucose (Hình 4). Enzyme đường hóa từ B. subtilis tạo ra phần lớn glucose và
maltose từ tinh bột trong khi amylase dạng lỏng từ B. amyloliquefaciens tạo ra chủ yếu là
maltosaccharid [24]. Một số nhà nghiên cứu cũng đã thu được kết quả tương tự với các chủng
Bacillus khác [25,26].
Hình 4. Phân tích sắc ký lớp mỏng của các sản
phẩm chính từ phản ứng thủy phân tinh bột hòa
tan bằng amylase chủng dại và đột biến.
Glucose (G1), maltose (G2), maltotriose (G3),
maltotetraose (G4), maltopentaose (G5),
maltohexaose (G6) và maltoheptaose (G7).
4.1.4. Phân tử khối của enzyme
Trọng lượng phân tử của các enzym được ước tính vào khoảng 52 kDa bằng điện di
trên gel SDS-polyacrylamide.
4.1.5. Số lượng nguyên tử Canxi trong cấu trúc của enzyme α-amylase
Tất cả các amylase đều là canxi metalloenzyme [27]. Các nguyên tử Canxi liên kết
chặt chẽ với phân tử enzyme, chúng có ảnh hưởng lớn đến cấu tạo và tính ổn định enzyme
[28]. Người ta thấy rằng amylase của B. amyloliquefaciens chủng dại chứa một ion Ca2+ trong
khi enzyme đột biến tiếp nhận hai ion. Đây có thể là lý do giải thích cho việc enzym từ chủng
11
Vũ Thu Hằng

đột biến chịu được nhiệt độ cao hơn so với chủng dại. Vì canxi có ảnh hưởng đến sự ổn định
của enzyme.
4.1.6. Cơ chất tạo độ đặc hiệu tốt nhất
Độ đặc hiệu của cơ chất amylase cho thấy maltopentaose là chất nền tốt nhất. αAmylase của chủng đột biến cho thấy sự khác biệt với loại hoang dã và amylase này hoạt
động tích cực hơn đối với các chất nền lớn như amylopectin và tinh bột hòa tan chứa các mối
liên kết α-1,6 và 1,4 glycosidic.
4.1.7. Ion hoạt hóa và ion ức chế
Hoạt động của amylase được tăng tốc bởi một số kim loại các ion (Bảng 2). 1 mM ion
kim loại hiệu quả hơn 5 mM. Mg, Ba và Cu kích thích hoạt động của chủng dại, nhưng chỉ có
Mg là có hiệu quả với chủng đột biến. Hg, Fe, Zn và Ag là những chất ức chế mạnh trên hoạt
động của cả hai loại enzym.
Bảng 2. Hiệu quả của các ion kim loại khác nhau trên hoạt động của của α-amylase từ
B.amyloliquefaciens (% hoạt động)
Chủng dại
None
MgSO4
CaCl2
LiSO4
CuSO4
Ba(C2H3O2)2
HgCl2
MnSO4
AgNO3
FeCl2
ZnSO4

1mM
100
101
95

98
104
104
6
98
26
11
12

5mM
100
109
103
97
95
103
0.0
100
12
10
12

Chủng đột biến
1mM
5mM
100
100
100
103
85

105
71
103
69
78
77
104
0.0
0.0
85
103
25
20
7
0.0
10
8

4.2. Kết quả biểu hiện α-amylase từ B. amyloliquefaciens trên E. coli
Gen α-amylase của B. amyloliquefaciens chủng dại được biểu hiện ở E. coli. Plasmid
pKKAM được khuếch đại bằng PCR và trình tự nucleotide của DNA đoạn 1452 cặp bazơ có
chứa amylase trưởng thành gen xác định.
Kết quả cho thấy gen α-amylase của chủng dại từ B. amyloliquefeciens tương tự với
gen α-amylase tái tổ hợp của B. amyloliquefaciens.
Hai plasmid biểu hiện pKKAM và pETAM được xây dựng thành cơng (Hình 2). Để
thu được một hệ thống biểu hiện mức độ cao tạo ra protein tái tổ hợp đồng nhất, vùng peptit
tín hiệu là đã được xóa.
Enzyme tái tổ hợp được biểu hiện trên E. coli. Hoạt động của enzyme được điều hòa
bởi Lac Zpo. Plasmid pETAM được chuyển vào trong cả chủng vi khuẩn HMS174 (DE3) và
12

Vũ Thu Hằng


BL21 (DE3). Ba chủng E. coli được sử dụng cho hệ thống biểu hiện và được so sánh với
nhau.
Vi khuẩn được nuôi trong môi trường LB. IPTG được sử dụng làm chất cảm ứng để
thể hiện α-amylase gen dưới promoter trc trong pKKAM hoặc promoter T7 trong pETAM. Vi
khuẩn tạo ra α-amylase hiệu quả sau giai đoạn tăng trưởng tĩnh.
Hoạt động của enzym được xác định sau khi ly giải các chủng E. coli bằng lysozyme.
Bảng 3. So sánh lượng enzyme α-amylase và protn biểu hiện trên các dịng E.coli khác nhau
ở 18oC.
Chủng gốc
HB101
HMS174
BL21
JM109

Hoạt động enzyme (U/ml)
30100
11195
8500
4857
6774

Protein (mg/ml)
0.96
1.2
1.8
0.61
1.5

Hoạt độ đặc hiệu (U/mg)
31354
9329
4722
7962
4496

Bảng 3 cho thấy các hoạt động cụ thể của JM109 và HMS174 chủng thấp hơn các
chủng khác. Chủng HB101 tạo ra lượng enzyme và protein nhiều hơn khoảng 2,5 lần so với
Chủng BL21, nhưng hoạt tính cụ thể không cao hơn.
Vi khuẩn cũng được phát triển ở 30oC, nhưng nhiệt độ này khơng hiệu quả cho q
trình sản xuất enzyme. Hoạt động của enzym là 95% ít hơn sản xuất ở 18oC. Vì lý do này,
chủng HB101 chủng được nuôi ở 18oC để sản xuất enzyme.
Sau ly giải vi khuẩn, hoạt động của enzym tái tổ hợp ít hơn nhiều lần so với chủng
gốc. Hoạt động enzyme của chủng gốc cao hơn 70% so với chủng HB101. Tại hoạt động của
enzym biểu hiện vừa phải đối với HB101 không được phát hiện. Mức độ biểu hiện trong
chủng JM103 (pUC-8) thấp hơn nhưng ở nhiệt độ cao (ở 42 8C) [5].

13
Vũ Thu Hằng


KẾT LUẬN
Nghiên cứu trên đã thành công tạo ra và tinh sạch một chủng B.
Amyloliquefaciens đột biến mà α-amylase của nó có các đặc điểm khác biệt với
chủng dại như: pH, nhiệt độ, độ ổn định, Km và Vmax và sự liên kết với ion Canxi,
các khả năng thủy phân trên các hạt tinh bột từ các nguồn thực vật khác nhau (khoai
tây, khoai lang, ngơ, lúa mì và gạo) là được thử nghiệm có kết quả ban đầu.


Một enzyme tái tổ hợp được tạo thành công thông qua khuếch đại bằng PCR
và biểu hiện trên các dòng E. Coli khác nhau dưới promoter trc và T7.


14
Vũ Thu Hằng


Tài liệu tham khảo
Elif Sarikaya Demirkan, Bunzo Mikami, Motoyasu Adachi, Takahiko Higasa, Shigeru Utsumi. α-Amylase
from B. amyloliquefaciens: Purification, characterization, raw starch degradation and expression in E. coli.
Process Biochemistry, Volume 40, Issue 8, July 2005, Pages 2629-2636.
1] Uhling H, Industrial enzymes and their applications. Translated and update by Elfried M. Linsmaier-bednar, Ph.D. New
York; 1998.
[2] Uguru GC, Robb DD, Akinyanju JA, Sani A. Purification, characterization and mutagenic enhancenment of a termoactive
alpha-amylase from Bacillus subtilis. J Indust Microbiol Biotech 1997;19:273–9.
[3] Bolton DJ, Kelly CT, Fogarty WM. Purification and characterization of the alpha-amylase of Bacillus flavothermus.
Enzyme Microbial Technol 1997;20:340–3.
[4] Dey N, Soni R, Soni SK. A novel thermostable alpha-amylase from thermophilic Bacillus sp. SN-1 and its application in
the liquefaction of sorghum starch for ethanol fermentation. Asian J Microbiol Biotech Environ Sci 2002;4:59–164.
[5] Suominen I, Karp M, Lahde M, Kopio A, Glumoff T, Meyer P, et al. Extracellular production of cloned a-amylase by
E.coli. Gene 1987; 61:165–76.
[6] Kallio P, Ulmanen I, Palva. Isolation and characterization of a 2.2-kb operon preceding the a-amylase gene of B.
amyloliquefaciens. Eur J Biochem 1986;158:497–504.
[7] Hyun HH, Zekius JG. Biochemical characterization of thermostable extracellular b-amylase from Clostridium
thermosulfurogenes. Appl Environ Microbiol 1985;49:1162–7.
[8] Jespersen HM, MacGregor EA, Sierks MR, Svensson B. Comparison of the domain-level organisation of starch
hydrolyses and related enzymes. Biochem J 1991;280:51–5.
[9] Friedman RB. Biotechnology of amylodextrin oligosaccharides. In: Priest FG, Stark JR, editors. Starch-hydrolyzing

enzymes with novel properties. 1991 [chapter 6].
[10] Sarikaya E. Obtaining a-amylase producing mutants from some bacillus strains using mutagenic agents. Biotechnology
1999;22:27– 34 [in Turkish].
[11] Sarikaya E, Gurgun V. Investigation of relationship between amylase and protease production and production of Bacillus
a-amylase in the rich media of carbon/nitrogen. Kukem J 1998;21:49–54 [in Turkish].
[12] Yoo YJ, Hong J, Hatch RT. Comparison of a-amylase activities from different assay methods. Biotechnol Bioeng
1987;147–51.
[13] Bradford MM. A rapid and sensitive method for quantitation of microgram quantities of protein utilising the principle of
proteindye binding. Anal Biochem 1976;72:248–54.
[14] Laemmli UK. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4. Nature
1970;227:680–5 [London].
[15] Berfeld P. Amylases a and b. Methods Enzymol 1955;1:149–58.
[16] Sarikaya E, Higasa T, Adachi M, Mikami B. Comparison of the abilities of a-and b- amylases to degrade raw starch
granules. Process Biochem 2000;35:711–5.
[17] Maeda HM, Long SR, Ruvkun CB, Brown SE, Ausulbel FM. Physical and genetic characterization of symbiotic and
auxotrophic mutants of Rhiobium meliloti induced by transposon Tn5 mutagenesis. J Bacteriol 1982;149:114–22.
[18] Silhavy TJ, Berman ML, Enquist LW. Experiments with gene fusion. Cold Spring Harbor Laboratory. NY: Cold spring
Harbor, 1984.
[19] Yuuki T, Nomura T, Tezuka H, Tsuboi A, Yamagata H, Tsukagoshi N, et al. Complete nucleotide sequence of a gene
coding for heat and pHstable a-amylase of B. licheniformis: comparison of the amino acid sequences of three bacterial
liquefying a-amylase deduced from the DNA sequences. J Biochem 1985;98:1147–56.
[20] Dobreva E, Ivanova V, Emanuliova E. Effect of temperature on some characteristics of the thermostable a-amylase from
B. licheniformis. World J Microbiol Biotechnol 1994;10:547–50.
[21] Saito N. A thermophilic extracellular from B. licheniformis. Arch Biochem Biophys 1973;15:290–8.
[22] Ogasahara K, Imanishi A, Isemura T. Studies on thermophilic aamylase from B. stearothermophilus. I. Some general and
physiochemcal properties of thermophilic a-amylase. J Biochem 1970;67:65–75.
[23] Matsuzaki H, Yamane K, Yamaguchi K, Nagata Y, Maruo B. Hybrid a-amylases produced by transformants of Bacillus
subtilis. I. Purification and characterization of extracellular amylases produced by the parental strains and transformants.
Biochim Biophys Acta 1974; 365:235–47.
[24] Morgan FJ, Priest FG. Characterization of a thermostable a-amylase from Bacillus licheniformis NCIB 6346. J Appl

Bacteriol 1981;50:107–14.
[25] Kanno MA. Bacillus acidocaldorius a-amylase that is highly stable to heat under acidic conditions. Agric Biol Chem
1986;50:23–31.
[26] Takasaki Y. An amylase producing maltotriose from B. subtilis. Agric Biol Chem 1985;49:1091–7.
[27] Priest FG. Extracellular enzyme synthesis in the genus Bacillus. Bacteriol Rev 1977;41:71153.
[28] Vihinen M, Maăntsaălaă P. Characterization of a thermostable B. stearothermophilus a-amylase. Biotechnol Appl
Biochem 1990;12:427–35.

15
Vũ Thu Hằng