Quy trình khảo sát sơ bộ hóa thực vật cây trái nổ

QUY TRÌNH KHẢO SÁT SƠ BỘ HĨA THỰC VẬT TRÁI NỔ (Ruellia tuberosa)
Nguyên tắc:
Chiết tách hỗn hợp nguyên vật liệu thực vật thành 3 phân đoạn theo độ phân cực tăng dần:
kém phân cực, phân cực trung bình và phân cực mạnh bằng cách chiết nguyên liệu lần lượt
với các dung mơi: CHCl3, ethanol và nước.Xác định các nhóm hợp chất trong từng dịch
chiết bằng các phản ứng.

1 Cách tiến hành:
1.1 Chuẩn bị dịch chiết
Dịch chiết
Chloroform

Bột cây Trái Nổ
Chiết 15g bột vỏ cây trái nổ bằng
CHCl3 (lượng CHCl3 cho ngập
dược liệu 1 cm) trong bình nón đun
cách thủy trong 30p, đến khi dịch
chiết sau khi bốc hơi khơng cịn để
lại lớp cắn mờ trên mặt kính đồng
hồ. Gộp dịch chiết,lọc và cơ lại trên
bếp cách thủy đến khi cịn khoảng
50ml dịch chiết CHCl3.
Bã cây trái nổ được chiết tiếp bằng
cồn cao độ trong bình nón (lượng
cồn cho ngập dược liệu 1 cm) đun
trên bếp cách thủy 30p, thực hiện 2-3
lần, gộp dịch chiết, lọc và cơ cách
thủy đến khi cịn khoảng 50ml.

Cồn cao độ

Nước

Bã dược liệu sau khi chiết cồn được
đem chiết nóng với nước trong bình
nón (lượng nước cho ngập mặt dược
liệu khoảng1cm) trên bếp cách thủy
trong 30p. Gộp dịch chiết, lọc và cơ
cách thủy đến khi cịn khoảng 50ml.

Cao cây Trái Nổ
Tán đều 5g cao cây trái nổ với 5g
cát sạch ( tỉ lệ 1:1 hoặc 1:1.5) cho
vào bình nón với 100ml CHCl3,
lắc đều. Đun cách thủy trong 30
phút. Lọc, thu dịch chiết CHCl3.
(Nếu dịch chiết ít hơn 50ml, thêm
lượng CHCl3 vừa đủ 50ml.)
Trong bình nón cịn lượng cát và
phần không tan trong CHCl3.
Thêm 100ml cồn cao độ vào bình
nón, lắc đều và đun cách thủy
trong 30 phút. Sau đó lọc thu dịch
chiết cồn. (Nếu dịch chiết ít hơn
50ml, thêm lượng cồn vừa đủ
50ml.)
Trong bình nón cịn lượng cát và
phần không tan trong cồn. Thêm
vào 100ml nước vào bình nón, lắc
đều và đun cách thủy trong 30
phút. Sau đó lọc thu dịch chiết

nước. (Nếu dịch chiết ít hơn 50ml,
thêm lượng nước vừa đủ 50ml.)

Sơ đồ tóm tắt
15g bột cây trái nổ hoặc 5g cao chiết / 15g
cao chiết cồn + 5g cát
Cách thủy 30 phút, lắc đều

Định tính
Dịch
chiết
CHCl
Nước/cách
thủy 30
phútchiết
3 tính
Bã dược
liệu
Dịch
Dịch
chiếtnước
cồn Định
Định tính

lắc đều

Alkaloid
Alkaloid

Tannin

Flavonoid

Coumarin
Flavonoid

Saponin
Tannin

Anthrocyanosid
Anthrocyanosid

Acid hữu cơ
Saponin

Proanthrocyanosid
Proanthrocyanosid
Chất béo

Acid
Polyuronid
hữu cơ
Alkaloid

Tinh dầu

Coumarin

Carotenoid

Anthraquinon

Flavonoid


Ethanol 96%/cách thủy 30 phút
lắc đều

1.2 Xác định các nhóm hợp chất: (dịch chiết từ cao trái nổ được làm
tương tự như dịch chiết từ bột trái nổ)
1.2.1 Xác định trong các chất tan trong dịch chiết chloroform:

1.2.1.1

Xác định tinh dầu:

Lấy 5ml dịch CHCl3 cho vào chén sứ, cô đến cắn trên bếp. Nếu cắn có mùi thơm nhẹ, thêm
một ít cồn cao độ vào rồi lại cho bốc hơi đến cắn. Cắn có mùi thơm nhẹ đặc trưng  có tinh
dầu.
1.2.1.2

Xác định chất béo:

Lấy vài dịch chiết CHCl3 nhỏ lên cùng một chỗ trên miếng giấy mỏng, hơ hoặc sấy nhẹ cho
bay hết dung môi (và hết mùi tinh dầu nếu dịch chiết có tinh dầu). Nếu tại nơi nhỏ dịch chiết
có vết trong mờ  có chất béo
1.2.1.3

Định tính carotenoid

Lấy khoảng 5ml dịch chiết CHCl3 vào chén sứ, bốc hơi nhẹ đến cắn (và hết mùi tinh dầu
nếu dịch chiết có tinh dầu). Thêm vào cắn vài giọt dung dịch SbCl3 (khan) bão hòa trong

chloroform (thuốc thử Carr-Price). Dung dịch có màu xanh chuyển thành màu đỏ  có
carotenoid.
1.2.1.4

Định tính triterpenoid:

Lấy khoảng 5ml dịch chiết CHCl3 cho vào chén sứ, bốc hơi đến cắn. Hòa tan cắn với 0,5ml
anhydrid acetic rồi thêm vào dd 1ml CHCl3. Chuyển dd vào một ống nghiệm sạch khô. Để
nghiêng ống nghiệm trên giá đỡ, cho từ từ 1-2ml dd H2SO4 đậm đặc lên thành ống nghiệm.
Quan sát nơi tiếp xúc giữa 2 lớp dung dịch có màu đỏ nâu hay đỏ đến tím, lớp dung dịch
phía trên dần dần chuyển thành màu xanh lục hay tím  có triterpenoid dạng tự do
1.2.1.5

Định tính alkaloid:

Lấy khoảng 10ml dịch chiết CHCl3 cho vào chén sứ, cơ tới cắn. Hịa cắn trong 2-4 ml dung
dịch acid hydroclorid 1%. Chia dd acid vào 5 ống nghiệm nhỏ, định tính alkaloid bằng các
thuốc thử:
Thuốc thử
Cách tiến hành
Mayer
Nhỏ từng giọt thuốc thử vào
ống nghiệm đến khi xuất
Bertrand
hiện tủa. Lưu ý: thuốc thử
Bouchardat
dư có thể hịa tan tủa.
Dragendoff

Hager
So sánh kết quả với ống chứng khơng có thuốc thử. Nếu

Hiện tượng
tủa trắng – vàng nhạt
tủa trắng
tủa đỏ nâu
tủa đỏ cam
Tủa vàng cam
dung dịch đục hơn so với ống

chứng hoặc có tủa  có alkaloid
1.2.1.6

Định tính coumarin

Nhỏ vài giọt dịch chiết CHCl3 lên 1 miếng giấy lọc. Để CHCl3 bay hơi tới khô, nhỏ lên vết
từ 2 giọt dung dịch KOH 10% /cồn và sấy nhẹ đến khô. Che nửa vết dịch chiết bằng miếng
kim loại và soi dưới đèn tử ngoại 365nm. Sau vài phút, lấy miếng kim loại che nửa vết dịch
chiết ra. Nếu phần bị che có cường độ phát quang yếu hơn, nhưng sau đó sáng dần lên cho
tới khi có cường độ tương đương  có coumarin
1.2.1.7

Định tính anthraquinon (Phản ứng Borntrager)

Lấy 5ml dịch chiết CHCl3 cho vào ống nghiệm + 1ml dd NaOH 10% và lắc kỹ. Nếu lớp
kiềm có màu hồng tới đỏ  có anthraquinon ở dạng tự do
1.2.1.8
-

Định tính flavonoid:

Định tính các dẫn chất có nhân -pyron hoặc -dihydropyron)

Lấy 10ml dịch chiết CHCl3 cho vào chén sứ, cô đến cắn trên bếp cách thủy. Hòa cắn với
2ml cồn và gạn dịch cồn cho vào ống nghiệm. Thêm vào dung dịch một ít bột Mg và thêm
từ từ 0,5ml HCl đậm đặc. Nếu sau phản ứng, dd có màu từ màu hồng tới đỏ  có flavonoid.


1.2.2 Xác định trong các chất tan trong dịch chiết cồn:

1.2.2.1

Định tính alkaloid:

Lấy khoảng 5ml dịch chiết cồn cho vào chén sứ, cơ tới cắn. Hịa cắn trong 2-4 ml dung dịch
acid hydroclorid 5%. Chia dung dịch acid vào 5 ống nghiệm nhỏ, định tính alkaloid bằng
các thuốc thử:
Thuốc thử
Cách tiến hành
Mayer
Nhỏ từng giọt thuốc thử vào
ống nghiệm đến khi xuất
Bertrand
hiện tủa. Lưu ý: thuốc thử
Bouchardat
dư có thể hịa tan tủa.
Dragendoff
Hager
So sánh kết quả với ống chứng khơng có thuốc thử. Nếu

Hiện tượng
tủa trắng – vàng nhạt
tủa trắng
tủa đỏ nâu
tủa đỏ cam
Tủa vàng cam
dung dịch đục hơn so với ống

chứng hoặc có tủa  có alkaloid
1.2.2.2

Định tính coumarin:

Nhỏ vài giọt dịch chiết cồn lên 1 miếng giấy lọc. Để cồn bay hơi tới khô, nhỏ lên vết dịch
chiết 1 – 2 giọt dung dịch KOH 10%/ cồn và sấy nhẹ đến khô. Che nửa vết dịch chiết bằng
miếng kim loại và soi dưới đèn tử ngoại 365nm. Sau vài phút, lấy miếng kim loại che nửa
vết dịch chiết ra. Nếu phần bị che có cường độ phát quang yếu hơn, nhưng sau đó sáng dần
lên cho tới khi có cường độ tương đương  có coumarin
1.2.2.3
-

Định tính flavonoid:

Định tính các dẫn chất có nhân -pyron hoặc -dihydropyron)

Lấy 5ml dịch chiết cồn cho vào chén sứ, cô đến cắn trên bếp cách thủy. Hòa cắn với 2ml
cồn và gạn dịch cồn cho vào 1 ống nghiệm. Thêm vào dung dịch một ít bột Mg và thêm từ
từ 0,5ml HCl đậm đặc. Nếu sau phản ứng, dd có màu từ màu hồng tới đỏ  có flavonoid
1.2.2.4

Định tính anthocyanosid

Lấy 1ml dịch chiết cồn cho vào 1 ống nghiệm nhỏ, thêm 2-3 giọt dd acid hydrocloric 10%.
Nếu dd có màu hồng đỏ tới đỏ và chuyển sang màu xanh khi kiềm hóa bằng dung dịch natri
hydroxid 10%  có anthocyanosid
1.2.2.5

Định tính proanthocyanidin

Lấy 5ml dịch chiết cồn cho vào ống nghiệm, thêm 2ml dd acid hydrocloric 10% và đun trên
bếp cách thủy 10p. Nếu dd có màu hồng tới đỏ  có proanthocyanidin.
1.2.2.6

Định tính tannin:

Lấy 2ml dịch chiết cho vào chén sứ, cô đến cắn. Hòa tan cắn với 4ml nước trên bếp cách
thủy. Lọc, chia dịch vào 2 ống nghiệm


-

Ống 1: pha loãng 0,5ml dịch chiết với nước cất, thêm 2-3 giọt thuốc thử FeCl3 5%,

-

lắc đều. Nếu dung dịch có màu xanh đen hay xanh rêu  có polyphenol
Ống 2: Thêm vào dịch lọc 5 giọt dung dịch gelatin muối, lắc đều, so sánh với ống
chứng chứa dịch chiết ban đầu. Nếu có tủa bơng trắng  có tanin

1.2.2.7

Định tính saponin:

Lấy 5ml dịch chiết cồn cho vào chén sứ, cơ đến cắn. Hịa cắn trong 5ml cồn 25% trên bếp
cách thủy, lọc vào ống nghiệm. Thêm 5ml nước và lắc mạnh theo chiều dọc ống. Nếu có bọt
bền  có saponin.
1.2.2.8

Định tính các acid hữu cơ

Lấy 2ml dịch chiết cồn cho vào một ống nghiệm. Pha loãng với 1ml nước và thêm vào dung
dịch 1 ít tinh thể natri carbonat. Nếu có các bọt khí sủi lên từ các tinh thể Na2CO3  có acid
hữu cơ.
1.2.3 Xác định trong các chất tan trong dịch chiết nước:

1.2.3.1

Định tính alkaloid:

Lấy khoảng 10ml dịch chiết nước cho vào bình lắng gạn 50ml, kiềm hóa dịch chiết tới pH
10 bằng dung dịch NH4OH 10%và chiết bằng CHCl3 (10mlx 3 lần) gộp chung và rửa lớp
dung môi hữu cơ với 10ml nước cất. Lắc lớp CHCl3 với dung dịch acid hydrocloric 5%
(2ml x 3 lần). Chia dung dịch acid vào 5 ống nghiệm nhỏ. Định tính alkaloid bằng các thuốc
thử:
Thuốc thử
Mayer
Bertrand
Bouchardat
Dragendoff

Hager
1.2.3.2
-

Cách tiến hành
Nhỏ từng giọt thuốc thử vào
ống nghiệm đến khi xuất
hiện tủa. Lưu ý: cho vừa đủ
lượng thuốc thử tránh dư

Hiện tượng
tủa trắng – vàng nhạt
tủa trắng
tủa đỏ nâu
tủa đỏ cam
Tủa vàng cam

Định tính flavonoid :

Định tính các dẫn chất có nhân -pyron hoặc -dihydropyron)

Lấy 10ml dịch chiết nước cho vào chén sứ, cơ đến cắn trên bếp cách thủy. Hịa cắn với 2ml
cồn và gạn dịch cồn cho vào 1 ống nghiệm. Thêm vào dung dịch một ít bột Mg và thêm từ
từ 0,5ml HCl đậm đặc. Nếu sau phản ứng, dd có màu từ màu hồng tới đỏ  có flavonoid.


1.2.3.3

Định tính anthocyanosid:

Lấy 1ml dịch chiết nước cho vào 1 ống nghiệm nhỏ, thêm 2-3 giọt dd acid hydrocloric 10%.
Nếu dd có màu hồng đỏ tới đỏ và chuyển sang màu xanh khi kiềm hóa bằng dung dịch natri
hydroxid 10%  có anthocyanosid
1.2.3.4

Định tính proanthocyanidin:

Lấy 5ml dịch chiết nước cho vào ống nghiệm, thêm 2ml dd acid hydrocloric 10% và đun
trên bếp cách thủy 10p. Nếu dd có màu hồng tới đỏ  có proanthocyanidin.
1.2.3.5

Định tính tannin

-

Ống 1: Lấy 0,5ml dịch chiết với nước, thêm 2-3 giọt thuốc thử FeCl3 5%, lắc đều.

-

Nếu dung dịch có màu xanh đen hay xanh rêu  có polyphenol
Ống 2: Lấy 2ml dịch chiết, thêm vào dịch lọc 5 giọt dung dịch gelatin muối, lắc đều,
so sánh với ống chứng chứa dịch chiết ban đầu. Nếu có tủa bơng trắng  có tanin

1.2.3.6

Định tính saponin

Lấy 5ml dịch chiết nước cho vào chén sứ, cô đến cắn. Hòa cắn trong 5ml cồn 96% trên bếp
cách thủy, lọc vào ống nghiệm. Cơ bớt rồi pha lỗng với 10ml nước, lắc mạnh theo chiều
dọc ống trong 15 giây. Nếu có bọt bền trong 15 phút  có saponin.

1.2.3.7

Định tính các acid hữu cơ

Lấy 2ml dịch chiết nước cho vào ống nghiệm. Pha loãng với 1ml nước và thêm vào dung
dịch 1 ít tinh thể natri carbonat. Nếu có các bọt khí sủi lên từ các tinh thể Na2CO3  có acid
hữu cơ.
1.2.3.8

Định tính polyuronid:

Nhỏ từng giọt 2ml dịch chiết nước vào một ống nghiệm có chứa 10ml cồn 95%. Nếu có
nhiều tủa bơng được tạo thành  có các polyuronid

2 Tóm tắt kết quả phân tích


Nhóm hợp chất
Chất béo

Thuốc thử
Cách thực hiện

Phản ứng dương tính

Nhỏ dung dịch lên Vết trong mờ
giấy
Carotenoid
H2SO4
Xanh dương hay xanh lục ngả

sang xanh dương
Tinh dầu
Bốc hơi tới cắn
Có mùi thơm
Triterpenoid tự LiebermannĐỏ nâu- tím, lớp trên có màu
do
Burchard
xanh lục
Alkaloid
Thuốc thử chung Kết tủa
Alkaloid
Courmarin
Phát quang trong Phát quang mạnh hơn
kiềm
Anthraglycosid
KOH 10%
Dung dịch kiềm có màu hồng
tới đỏ
Flavonoid
Mg/HClđđ
Dung dịch có màu hồng tới đỏ
Anthocyanosid
HCl
Đỏ
KOH
Xanh
O
Proanthocyanidi HCl/t
Đỏ
n

Tanin
DD FeCl3
Xanh rêu hay xanh đen
(Polyphenol)
Dung dịch Gelatin Tủa bông trắng ( Tanin)
muối
Saponin
Lắc mạnh dung dịch Bột bền
nước

Kết quả định tính trên các dịch chiết
Dịch chiết Dịch chiết Dịch chiết
CHCl3
cồn
nước

Kết quả
định tính
chung


Aicd hữu cơ
Na2CO3
Sủi bọt
Hợp
chất Pha lỗng với cồn Tủa bơng trắng – vàng nâu
polyuric
96%
Có thể đánh giá theo các mức sau: (+) có; (-) khơng; (±)nghi ngờ
Chú thích

Y Có thể có phản ứng khơng thực hiện
X Khơng có mặt của nhóm hoạt chất trong dịch chiết

Bảng 1. Bảng tóm tắt kết quả phân tích sơ bộ thành thần hóa thực vật từ bột cây trái nổ

Nhóm hợp chất
Chất béo
Carotenoid
Tinh dầu
Triterpenoid
do
Alkaloid

Thuốc thử
Cách thực hiện

Phản ứng dương tính

Nhỏ dung dịch lên Vết trong mờ
giấy
H2SO4
Xanh dương hay xanh lục ngả
sang xanh dương
Bốc hơi tới cắn
Có mùi thơm
tự LiebermannĐỏ nâu- tím, lớp trên có màu
Burchard
xanh lục
Thuốc thử chung Kết tủa

Kết quả định tính trên các dịch chiết
Dịch chiết Dịch chiết Dịch chiết
CHCl3
cồn
nước

Kết quả
định tính
chung


Courmarin
Anthraglycosid
Flavonoid
Anthocyanosid
Proanthocyanidi
n
Tanin

Alkaloid
Phát quang
kiềm
KOH 10%
Mg/HClđđ
HCl
KOH
HCl/tO

trong Phát quang mạnh hơn
Dung dịch kiềm có màu hồng

tới đỏ
Dung dịch có màu hồng tới đỏ
Đỏ
Xanh
Đỏ

DD FeCl3

Xanh rêu hay xanh đen
(Polyphenol)
Dung dịch Gelatin Tủa bông trắng ( Tanin)
muối
Saponin
Lắc mạnh dung dịch Bột bền
nước
Aicd hữu cơ
Na2CO3
Sủi bọt
Hợp
chất Pha lỗng với cồn Tủa bơng trắng – vàng nâu
polyuric
96%
Có thể đánh giá theo các mức sau: (+) có; (-) khơng; (±)nghi ngờ
Chú thích
Y Có thể có phản ứng khơng thực hiện
X Khơng có mặt của nhóm hoạt chất trong dịch chiết

Bảng 2. Bảng tóm tắc kết quả phân tích sơ bộ thành thần hóa thực vật từ cao trái nổ

3 TÀI LIỆU THAM KHẢO
-

Giáo trình phương pháp nghiên cứu dược liệu, Đại học Y dược Thành phố Hồ Chí Minh, Trần Hùng 2016.
Khảo sát sơ bộ thành phần hóa thực vật, độc tính cấp và tác động giảm đau của cao chiết quả cây chuối hột rừng Musa acuminata

-

Colla., Musaceae : Khóa luận tốt nghiệp Dược sĩ Đại học / Nguyễn Trần Hưng Yên; Võ Thị Thu Hà hướng dẫn.
Giáo trình thực hành Dược liệu 1, 2, trường Đại học Nguyễn Tất Thành, Phan Thiện Vy.