Nghiên cứu tạo vật liệu khởi đầu và cảm ứng tạo protocorm của loài lan hải yến (rhynchostyis coelestis)

1
TRƢỜNG ĐẠI HỌC HÙNG VƢƠNG
KHOA KHOA HỌC TỰ NHIÊN
-----------------------

PHẠM QUỲNH TRANG
CÁC TỪ VIẾT TẮT

BAP
Benzylaminopurine
NGHIÊN CỨU TẠO
VẬT
LIỆU KHỞI ĐẦU VÀ CẢM ỨNG
CT
Cơng
thứcLỒI LAN HẢI YẾN
TẠO PROTOCORM
CỦA
coelestis)
KC(Rhynchostylis
mơi trƣờng Knudson
C
KN

Kinetin

MS
Mơi trƣờng Murashige and Skoog
KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC
NAA Ngành:
Naphthalene

Acetichọc
Acid
Sƣ phạm Sinh
NXB

Nhà xuất bản

MT

Mơi trƣờng

½ MS

Mơi trƣờng ½ Murashige & Skoog

Phú Thọ, năm 2017


2

TRƢỜNG ĐẠI HỌC HÙNG VƢƠNG
KHOA KHOA HỌC TỰ NHIÊN

----------------------DANH MỤC BẢNG
PHẠM QUỲNH TRANG
Trang

Bảng

Thống kê số lƣợng bình nhiễm mẫu theo các công thức

khử

trùng

khác

NGHIÊN CỨU
TẠO VẬT LIỆU KHỞI ĐẦU VÀ CẢM ỨNG
nhau............................................................
TẠO PROTOCORM CỦA LỒI LAN HẢI YẾN
(Rhynchostylis coelestis)

KHĨA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC
Ngành: Sƣ phạm Sinh học

NGƢỜI HƢỚNG DẪN: TS. TRẦN TRUNG KIÊN

Phú Thọ, năm 2017


i
LỜI CẢM ƠN

Trong thời gian nghiên cứu và hoàn thành khóa luận, em đã nhận đƣợc sự giúp
đỡ của ban lãnh đạo trƣờng Đại học Hùng Vƣơng, các thầy cô trong Trung tâm nghiên
cứu Công nghệ sinh học trƣờng Đại học Hùng Vƣơng cùng tồn thể các thầy cơ giáo
trong khoa Khoa học Tự nhiên đã tạo điều kiện giúp đỡ để em thực hiện và hồn thành
khóa luận này. Đặc biệt, em xin gửi lời cảm ơn chân thành nhất tới thầy giáo hƣớng
dẫn TS.Trần Trung Kiên đã hƣớng dẫn tận tình, quan tâm và động viên em hồn thành
khóa luận.

Cuối cùng, em xin gửi lời cảm ơn đến gia đình, bạn bè, những ngƣời đã ln
bên cạnh động viên, giúp đỡ em trong suốt quá trình thực hiện và hồn thành khóa luận
tốt nghiệp này.
Em xin chân thành cảm ơn!
Phú Thọ, tháng 05 năm 2017
Sinh viên

Phạm Quỳnh Trang


ii
CÁC TỪ VIẾT TẮT

BAP: Benzylaminopurine
CT: Công thức
KC: Môi trƣờng Knudson C
KN: Kinetin
MS: Môi trƣờng Murashige and Skoog
NAA: Naphthalene Acetic Acid
NXB: Nhà xuất bản
MT: Mơi trƣờng
½ MS: Mơi trƣờng ½ Murashige & Skoog


iii
DANH MỤC HÌNH

Hình 1.1.

Lan Hải Yến (Rhynchostylis coelestis)...................................

4

Hình 1.2.

Sơ đồ q trình phân hóa và phản phân hóa tế bào…………

9

Hình 3.1.

Biểu đồ thể hiện mẫu nhiễm trong các công thức khử trùng
khác nhau................................................................................

24

Hình 3.2.

Hình ảnh so sánh giữa mẫu bình thƣờng và mẫu nhiễm ……

25

Hình 3.3.

Biểu đồ tỉ lệ các mẫu phát sinh protocorm............................... 30

Hình 3.4.

Một số hình ảnh các giai đoạn phát sinh protocorm………… 33

Hình 3.5.

Biểu đồ đặc điểm chiều cao lan Hải Yến trong giai đoạn tạo
chồi.........................................................................................

35

Hình 3.6.

Biểu đồ số lá lan Hải Yến trong giai đoạn tạo chồi................

37

Hình 3.7.

Biểu đồ số rễ lan Hải Yến trong giai đoạn tạo chồi ...............

39

Hình 3.8.

Một số hình ảnh mẫu qua các cơng thức mơi trƣờng ............

40

Hình 3.9.

Các mẫu thu đƣợc qua 3 công thức môi trƣờng khác nhau....

40

iv
DANH MỤC BẢNG
Bảng 3.1.

Số lƣợng mẫu nhiễm trong công thức khử trùng 1...................

21

Bảng 3.2.

Số lƣợng mẫu nhiễm trong công thức khử trùng 2...................

21

Bảng 3.3.

Số lƣợng mẫu nhiễm trong công thức khử trùng 3...................

22

Bảng 3.4.

Số lƣợng mẫu nhiễm trong công thức khử trùng 4...................

22

Bảng 3.5.

Ảnh hƣởng của hóa chất khử trùng đến tỉ lệ số sống của hạt
lan Hải Yến sau 30 ngày nuôi cấy............................................

Bảng 3.6.

Đặc điểm về màu sắc và hình thái protocorm lan Hải Yến trên
cơng thức mơi trƣờng MT1......................................................

Bảng 3.7.

Đặc điểm về màu sắc và hình thái protocorm lan Hải Yến trên
công thức môi trƣờng MT2......................................................

Bảng 3.8.

Đặc điểm về màu sắc và hình thái protocorm lan Hải Yến trên
công thức môi trƣờng MT3......................................................

Bảng 3.9.

Đặc điểm về màu sắc và hình thái protocorm lan Hải Yến trên
cơng thức mơi trƣờng MT4......................................................

Bảng 3.10.

Đặc điểm về màu sắc và hình thái protocorm lan Hải Yến trên
công thức môi trƣờng MT5......................................................

Bảng 3.11.

Đặc điểm về màu sắc và hình thái protocorm lan Hải Yến trên
công thức môi trƣờng MT6......................................................

Bảng 3.12.

Ảnh hƣởng của môi trƣờng nuôi cấy đến tỉ lệ phát sinh
protocorm...................................................................................

23

26

26

27

27

28

29

29

Bảng 3.13.

Đặc điểm chiều cao lan Hải Yến trong giai đoạn tạo chồi.......

34

Bảng 3.14.

Số lá lan Hải Yến trong giai đoạn tạo chồi...............................

36

Bảng 3.15.

Số rễ lan Hải Yến trong giai đoạn tạo chồi ...........................

38


v

MỤC LỤC
Trang
PHẦN 1: MỞ ĐẦU

1

1. Tính cấp thiết của đề tài…………….…………………………..

1

2. Mục tiêu nghiên cứu……………….…………………………….

2

3. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn……..……….………………….

2

3.1. Ý nghĩa khoa học……………………………………………

2

3.2. Ý nghĩa thực tiễn……………………………….……………

2

PHẦN 2: NỘI DUNG NGHIÊN CỨU

3

CHƢƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU................................................

3

1.1 .Giới thiệu về chi lan Ngọc Điểm……….…………..………….

3

1.1.1. Phân loại học thực vật……………………………………

3

1.1.2. Đặc điểm sinh học…………………………………………

3

1.2. Giới thiệu về loài lan Hải Yến…………………………………

4

1.2.1. Phân loại học thực vật……………….……………………

4

1.2.2. Đặc điểm hình thái – giải phẫu…………………………..

5

1.2.3. Đặc điểm sinh thái…………………………………………

5

1.3. Khái quát chung về nuôi cấy mô tế bào thực vật ………….

6

1.3.1. Lịch sử phát triển của kỹ thuật nuôi cấy mơ và tế bào thực
vật ……………………………………………………………….

7

1.3.2. Cơ sở sinh lí của công nghệ nuôi cấy tế bào thực vật in
vitro………………………………………………………………

8

1.3.3. Nuôi cấy mô tế bào thực vật in vitro………………..………

10


vi
1.3.4. Lợi ích của cơng nghệ ni cấy mơ tế bào thực vật in
vitro………………………………………………………………

12

1.4. Tình hình nghiên cứu trong và ngồi nƣớc về ni cấy mơ tế
bào thực vật ………….………………….…………………………..

13

1.4.1. Tình hình nghiên cứu trong nước..........................................

13

1.4.2. Tình hình nghiên cứu trên thế giới........................................

14

CHƢƠNG 2: ĐỐI TƢỢNG, PHẠM VI VÀ PHƢƠNG PHÁP
NGHIÊN CỨU......................................................................................

16

2.1. Đối tƣợng và phạm vi nghiên cứu……...……………...............

16

2.1.1. Đối tượng nghiên cứu…………………………….…………..

16

2.1.2. Phạm vi nghiên cứu…………………………………………….

16

2.2. Phƣơng pháp nghiên cứu………………..…………………….

16

2.2.1. Phương pháp nghiên cứu lý thuyết…………………………….

17

2.2.2. Phương pháp luận………………………………………………..

17

3.2.3. Phương pháp bố trí thí nghiệm.............................................

17

2.2.4. Phương pháp phân tích và xử lí số liệu................................

19

CHƢƠNG 3: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN..............

21

3.1. Xác định hóa chất khử trùng tối ƣu nhất trong giai đoạn tạo
vật liệu khởi đầu.................................................................................

21

3.2. Kết quả nghiên cứu ảnh hƣởng của môi trƣờng nuôi cấy đến
khả năng tạo protocorm của lan Hải Yến........................................

25

3.3. Nghiên cứu mơi trƣờng có bổ sung chất điều hịa sinh
trƣởng với nồng độ khác nhau trong giai đoạn tạo chồi...............
PHẦN 3: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ

34
41


vii
1. Kết luận...........................................................................................

41

2. Kiến nghị..........................................................................................

41

TÀI LIỆU THAM KHẢO......................................................................
PHỤ LỤC
PHỤ BIỂU

42


1
PHẦN 1: MỞ ĐẦU
1. Tính cấp thiết của đề tài
Hoa lan là một loài hoarất đẹp, đƣợc biết đến đầu tiên ở phƣơng Đông bởi
Khổng Tử(551 – 479 trƣớc Công nguyên) sau đó đƣợc biết đến rộng rãi ở các nƣớc
phƣơng Tây và Địa Trung Hải. Trong đời sống hiện nay, hoa lan ngày càng khẳng
định giá trị của mình trong thẩm mỹ và y học, việc nhân giống các loài lan ngày
càng mang lại hiệu quả kinh tế cao cho con ngƣời. Do đó Hoa lan đang đƣợc xem là
một loại hoa trang trí quan trọng và có giá trị kinh tế cao, là mặt hàng xuất khẩu
chiến lƣợc của nhiều quốc gia.Phong lan đƣợc biết đến là loài hoa có hình thái
đẹp, hƣơng thơm ngọt ngào, sang trọng, dễ chăm sóc, mang nhiều ý nghĩa đƣợc
mọi ngƣời ƣa chuộng. Đặc biệt trong đó, lồi Lan Hải Yến (Rhynchostylis
coelestis) là loàithuộc một trong 6 loài của chi lan Ngọc Điểm (Rhynchostylis),
họ

Lan

(Orchideaceae),

bộ

Lan

(Orchidales),

lớpMột

lá

mầm

(Monocotyledoneae). Ngoài tên lan Hải Yến ra loài lan này còn đƣợc gọi với cái
tên là lan Hải Âu [7].
Hoa có đặc điểm phát hoa đứng thẳng, mọc thành chùm cụm, hoa màu
trắng, ở phần cuối vịi hoa có màu xanh lam hoặc hồng nhạt, mơi hoa màu xanh
tím nhạt. Hoa có hƣơng rất thơm, hƣơng thơm đài các [11].
Nhìn tổng thể, hoa lan Hải Yến mang vẻ đẹp kiêu sa rất nữ tính. Chính
nhờ những đặc điểm đó mà hiện nay nhu cầu sử dụng lan Hải Yến ngày càng
cao. Tuy nhiên do nạn khai thác bừa bãi của con ngƣời nên số lƣợng lan Hải Yến
ngoài tự nhiên ngày càng suy giảm. Để hạn chế việc khai thác quá mức lan Hải
Yến ngoài tự nhiên, việc nhân giống lồi lan này bằng cơng nghệ ni cấy mơ tế
bào thực vật (in vitro) đƣợc quan tâm. Hiện nay hầu nhƣ vẫn chƣa có cơng trình
nghiên cứu cụ thể nào về tạo vật liệu khởi đầu và cảm ứng tạo protocorm trên
môi trƣờng tối ƣu cây hoa lan Hải Yến (Rhynchostylis coelestis) từ quả, đến giai
đoạn tạo protocorm.


2
Nghiên cứu tạo vật liệu khởi đầu (khử trùng) và cảm ứng tạo protocorm(mô
sẹo) trong các môi trƣờng khác nhau của lồi lan Hải Yến (Rhynchostylis

coelestis) có ý nghĩa lớn, cung cấp các thơng tin khoa học bổ ích, đồng thời giúp
con ngƣời đề ra các biện pháp kĩ thuật ni cấy cây một cách có hiệu quả, có tỷ
lệ sống cao.
Xuất phát từ những lý do trên, tôi xin tiến hành nghiên cứu đề tài:
“Nghiêncứu tạo vật liệu khởi đầu và cảm ứng tạo protocorm của loài lan
Hải Yến (Rhynchostylis coelestis)”.
2. Mục tiêu nghiên cứu
- Trong giai đoạn tạo vật liệu khởi đầu, tìm ra hóa chất khử trùng tối ƣu nhất.
- Nghiên cứu môi trƣờng nuôi cấy phù hợp nhất với đối tƣợng cây lan Hải
Yến trong giai đoạn tạo protocorm.
3. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn
3.1. Ý nghĩa khoa học
Kết quả nghiên cứu cung cấp các dẫn liệu khoa học về phƣơng pháp khử
trùng và tìm ra môi trƣờng tối ƣu nhất trong giai đoạn tạo protocorm của loài lan
Hải Yến (Rhynchostylis coelestis).
3.2. Ý nghĩa thực tiễn
Kết quả nghiên cứu là tài liệu phục vụ cho các nhà nghiên cứu, giáo viên,
sinh viên ngành Sinh học, nông nghiệp và các đơn vị sản xuất kinh doanh hoa
lan góp phần xây dựng quy trình và hóa chất khử trùng tối ƣu cho loài lan Hải
Yến trong giai đoạn tạo vật liệu khởi đầu.Đồng thời kết quả bƣớc đầu đƣa ra mơi
trƣờng ni cấy phù hợp cho lồi lan Hải Yến trong giai đoạn phát sinh
protocorm và tạo chồi nhằm nhân giống bảo tồn, phát triển rộng rãi hơn lồi lan
có giá trị kinh tế cao cũng nhƣ giá trị về mặt sinh học này.


3
PHẦN 2: NỘI DUNG NGHIÊN CỨU
CHƢƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1. Giới thiệu chungvề chi lan Ngọc Điểm
1.1.1. Phân loại học thực vật

Chi lan Ngọc Điểm Rhynchostylis, viết tắt là Rhy trong ngành kinh doanh
cây cảnh, là một thành viên của họ Lan(Orchideaceae), bao gồm 6 loài đặc
hữu ở Ấn Độ, Malaysia, Indonesia và Philippines.
Chi lan Ngọc Điểm là một chi gồm nhiều loài lan rừng rất đƣợc ƣa chuộng
và đƣợc trồng phổ biến nhất hiện nay, do mùa hoa của loài này nở vào dịp Tết
nên cũng đƣợc mọi ngƣời gọi với cái tên Nghinh Xuân. Một số tên khác nhƣ:
Lan Đai Châu, lan Tai Trâu, lan Đại Châu, lan Me (trƣớc năm 1975 thƣờng mọc
trên những cây me trên một số đƣờng ở Sài Gòn).
Chi lan Ngọc Điểm là một chi lan rừng có nhiều ở Việt Nam phân bố ở
các vùng cao nguyên Nam Trung Bộ, đặc biệt các vùng giáp biên giới Lào và
Campuchia, ở vùng nóng chi này xuất hiện nhiều hơn cả.
Chi này gồm các cây thuộc nhóm đơn thân khơng giả hành tăng trƣởng
theo chiều đứng, rất nhiều rễ, mọc thẳng từ thân. Hạt chi lan Ngọc Điểm nảy
mầm trong điều kiện tự nhiên rất mạnh.
Các lồi trong chi lan Ngọc Điểm có thể nói là hoa lan của tết cổ truyền
dân tộc, mùa hoa nở luôn luôn vào khoảng tháng 12 âm lịch, trừ những năm
nhuận có thể nở sớm hơn. Chi này gồm các loại lan có mùi thơm thoang thoảng,
rất đƣợc ƣa chuộng, có giá trị về kinh tế và tâm linh cao.
1.1.2. Đặc điểm sinh học
Chi lan Ngọc Điểm gồm các loại lan chịu nóng, nhiệt độ thích hợp từ 26 –
30oC. Chi lan Ngọc Điểm đƣợc bán khắp nơi tại các nhà vƣờn và các cửa hàng
Phong Lan. Hiện nay các loài thuộc chi lan Ngọc Điểm thƣờng đƣợc khai thác từ
các vùng bên nƣớc bạn Campuchia, Lào và ở Việt Nam nhƣ vùng Đông Nam bộ


4
và miền cao nguyên Nam Trung Bộ, với cao độ trung bình <600m, nhƣ các vùng
Nha Trang, Bình Thuận.
Các lồi thuộc chi Ngọc Điểm chịu hạn khá tốt, nhƣng thích ẩm, ẩm độ
càng cao, rễmọc nhanh và phát triển rất tốt, ẩm độ lý tƣởng khoảng 40 – 70%.

Chi Ngọc Điểm hầu hết gồm các loại lan ƣa sáng khoảng 60%, ánh sáng
trực tiếp dễ làm cây bị bỏng lá, cƣờng độ ánh sáng thay đổi từ 15.000 – 20.000
1m/m2. Tuy nhiên, nếu cây lan đƣợc trồng trong điều kiện quá rợp, cây tăng
trƣởng chậm và yếu ớt, bộ rễ phát triển kém, cây khó ra hoa.
1.2. Giới thiệu về lồi lan Hải Yến
1.2.1. Phân loại học thực vật

Hình 1.1. Lan Hải Yến (Rhynchostylis coelestis)

Lan Hải yến (Rhynchostylis coelestis) là một loài thuộc chi Ngọc Điểm
(Rhynchostylis) là một chi lớn trong họ Phong lan. Hiện nay, chi này bao gồm 6
lồi đƣợc chia thành các nhóm khác nhau thuộc dịngRhynchostylis.
Chi Rhynchostylis đƣợc phân bố rộng rãi nhiều ở vùng Đông Nam Á và có thể
đƣợc tìm thấy ở Thái Lan, Ấn Độ và Miến Điện.


5
Lan Hải Yến (Rhynchostylis coelestis) là loàithuộc một trong 6 loài của
chi lan Ngọc Điểm (Rhynchostylis), họ Lan (Orchideaceae), bộ Lan
(Orchidales), lớpMột lá mầm (Monocotyledoneae), ngành Ngọc Lan:
Mangoliophyta.
Ngoài tên lan Hải Yến ra lồi lan này cịn đƣợc gọi với cái tên là lan Hải
Âu, Lƣỡi Bò, Cờ Lao[7].
1.2.2. Đặc điểm hình thái – giải phẫu
Lan Hải yến (Rhynchostylis coelestis) có đặc điểm hình thái thân hình ống,
hóa gỗ nơi phần gốc, cao chừng 20 cm mang 10-12 lá hình mũi giáo. Lá dày, dai
và mọng dài từ 10-20 cm, gân lá nhỏ, màu xanh mƣớt, lá xếp theo rãnh, lá có
chiều hƣớng cong xuống, hai thùy lá khơng đều nhau.
Phát hoa đứng thẳng, mọc thành chùm cụm, chùm hoa mọc dày đặc (có
thể đến 50 chiếc) trên cần hoa ngắn. Hoa bóng, có mùi thơm, hoa to khoảng 2

cm, cánh hoa màu trắng, phần đỉnh cánh màu lam hoạc tím, cánh đai và cánh hoa
dạng thn hoạc hình cầu cỡ 0.7 cm, hai cánh bên hơi to hơn. Cánh môi cũng
dạng trứng, dày và mọng hơi congxuống, hoa màu trắng, ở phần cuối vịi hoa có
màu xanh lam hoạc hồng nhạt, mơi màu xanh tím nhạt (Hình 1.1). Hoa có hƣơng
rất thơm, hƣơng thơm đài các. Nhìn tổng thể, hoa lan Hải yến mang vẻ đẹp kiêu
sa rất nữ tính[7].
1.2.3. Đặc điểm sinh thái
Cây nở hoa vào mùa hè và mùa thu khoảng tháng 3 đến tháng 5. Cây đƣợc
tìm thấy ở Thái Lan, Campuchia và Việt Nam trong các khu rừng đất thấp và
rừng cây savan giống nhƣ nửa rụng lá và rụng lá khô ở độ cao khoảng 700m so
với mặt nƣớc biển [7].


6
Các điều kiện sinh thái:
Ánh sáng: 60%. Ánh sáng trung bình từ 2.000 đến 4.000 foot candles (Là
lƣợng ánh sáng sinh ra cách nó 1 foot, nó tƣơng đồng với dpi hoặc inch). Những
tháng mùa hè nên để ở cửa sổ hƣớng Đông là tốt và cửa sổ hƣớng Nam là tốt
nhất trong những tháng mùa đông. Số lƣợng của ánh sáng phát ra từ đèn đƣợc đo
bằng lumen. Đối với vào ban đêm thì cần khoảng 5-20 foot candles có thể là đủ.
Nhiệt độ: 20-25°C.Lan hải yến phát triển tốt khi nhiệt độ ấm áp, mùa đông
với mức thấp nhất vào ban đêm của 58 – 64 độ F vào ban ngày và cao 70 – 80 độ
F.
Độ ẩm: 40-70%. Độ ẩm 50% hoặc 60% là lý tƣởng.Lan hải yến có thể
chịu đƣợc độ ẩm thấp hơn một chút trong những tháng mùa đông. Việc sử dụng
các khay độ ẩm hoặc độ ẩm phịng là có lợi.
Nƣớc:Cách tốt nhất là sử dụng nƣớc mƣa, nƣớc cất. Nƣớc máy với độ pH
là 7,5 hoặc thấp hơn cũng có thể đƣợc sử dụng. Nƣớc khi kết hợp các phƣơng
pháp tiếp cận khơ trong q trình ra hoa hoặc đỉnh đầu.Khi khơng có hoa, cho
phép hỗn hợp trở nên chỉ khơ giữa tƣới nƣớc. Tƣới quá nhiều nƣớc có thể gây ra

vấn đề nhƣ thối rễ và vi khuẩn truyền nhiễm nấm trong môi trƣờng bầu [7].
1.3. Khái quát chung về nuôi cấy mô tế bào thực vật
Nuôi cấy mô tế bào thực vật in vitro đã đƣợc tiến hành ở Việt Nam từ giữa
những năm 70.Hiện nay, trong cả nƣớc đã có khá nhiều phịng thí nghiệm ni
cấy mơ và tế bào. Phần lớn các phịng thí nghiệm đang tiến hành nghiên cứu ứng
dụng: chủ yếu là vi nhân giống trong ống nghiệm. Ni cấy mơ và tế bào thực vật
cịn có những khả năng đóng góp cho những nghiên cứu và ứng dụng xa hơn thế
nữa, đặc biệt là trong cải biến di truyền (chọn dòng tế bào, đột biến tế bào, nuôi
cấy bao/hạt phấn, lai tế bào, chuyển gen) và trong cơng nghệ thu nhận các hoạt
tính sinh học [9].


7
1.3.1. Lịch sử phát triển của kỹ thuật nuôi cấy mô và tế bào thực vật
Năm 1902, Haberlandt lần đầu tiên đƣa ra ý tƣởng cấy mô của sinh vật ra
ngồi cơ thể nhƣng những thí nghiệm của Haberlandt khi đó với các tế bào mơ
mềmbiểu bì đã bị thất bại do chúng không thể phân chia đƣợc[3].
Năm 1922, Kotte là học trò của Haberlandt cùng với Robbins đã lặp lại thí
nghiệm của Haberlandt với đỉnh sinh trƣởng tách từ đầu rễ cây ngô. Hai tác giả
đã nuôi đƣợc trong một thời gian ngắn (12 ngày) trên môi trƣờng lỏng có chứa
đƣờng glucose và muối khống thu đƣợc hệ rễ nhỏ. Từ đó đầu rễ đƣợc ni và
hồn thiện mơi trƣờng nuôi cấy[10].
Năm 1934, bắt đầu giai đoạn thứ 2 của lịch sử nuôi cấy mô tế bào thực vật
White đã thành công trong việc phát hiện ra sự sống vô hạn của việc nuôi cấy tế
bào rễ cà chua.
Trong thời gian 1941-1952, nhiều chất điều kích thích sinh trƣởng thuộc
nhóm Auxin đƣợc ni cấy và tổng hợp thành cơng: axit napthalen axetic
(NAA), axit 2,4 D- dichlorophenoxy axetic (2,4 D)…
Năm 1951, Skoog và Miller đã phát hiện ra các hợp chất có thể điều khiển
sự nhân chồi.Năm 1962, Murashige và Skoog đã cải tiến môi trƣờng nuôi cấy,

đánh dấu một bƣớc tiến trong kỹ thuật nuôi cấy mô.Môi trƣờng của họ đã đƣợc
dùng làm cơ sở cho việc nuôi cấy nhiều loại cây và vẫn còn đƣợc sử dụng rộng
rãi cho đến nay[3].
Năm 1954, Skoog phát hiện chế phẩm thuỷ phân của tinh dịch cá bẹ kích
thích sinh trƣởng rõ rệt trong nuôi cấy các mảnh mô thân cây thuốc lá.Một năm
sau, chất đó đƣợc tổng hợp thành cơng và đƣợc Skoog gọi là Kinetin có tác dụng
kích thích sự phân bào.
Trong khoảng thời gian từ 1954 -1959, kỹ thuật ni cấy tế bào đơn đã
đƣợc phát triển và hồn thiện dần. Melcher và Beckman đã nuôi cấy các tế bào
đơn trong các bình dung tích lớn có sục khí và bổ sung chất dinh dƣỡng định kỳ.


8
Khả năng nuôi cấy các tế bào thực vật và tái tạo đƣợc cây hoàn chỉnh từ tế bào
đã mở ra những triển vọng mới cho chọn dòng đột biến, sản xuất các chất trao
đổi thứ cấp.
Năm 1960 – 1964, Morel cho rằng có thể nhân giống vơ tính địa lan bằng
ni cấy đỉnh sinh trƣởng. Từ kết quả đó, lan đƣợc xem là cây nuôi cấy mô đầu
tiên đƣợc thƣơng mại hóa.
Năm 1966, Guha & cộng sự đã tạo đƣợc cây đơn bội từ nuôi cấy túi phấn
cây cà độc dƣợc.Sau đó Bourin & Nitsch (1967) cũng thành cơng với cây thuốc
lá. Việc tạo cây đơn bội thành công ở nhiều lồi thực vật thơng qua ni cấy bao
phấn và hạt phấn đóng góp rất lớn cho các nghiên cứu di truyền và lai tạo giống.
Từ những năm 1970 trở đi, các nhà khoa học đã chú ý vào triển vọng của
kỹ thuật nuôi cấy protoplast, khi 2 tác giả ngƣời Nhật là Nagata và Takebe đã
thành công trong việc làm cho protoplast thuốc lá tái tạo đƣợc cellulose.
Melchers và cộng sự (1978) đã lai tạo thành công protoplast của cà chua với
protoplast của khoai tây, mở ra một triển vọng mới trong lai xa ở thực vật. Ngoài
ra, trong những điều kiện nhất định, các protoplast có khả năng hấp thụ các phân
tử lớn, hoặc các cơ quan tử từ bên ngồi, do đó chúng là những đối tƣợng lý

tƣởng cho các nghiên cứu về di truyền thực vật[3].
Từ đó đến nay, cơng nghệ ni cấy mơ và tế bào thực vật đã đƣợc phát
triển với tốc độ nhanh trên nhiều cây khác và đƣợc ứng dụng rộng rãi trong nhân
giống nhiều lồi thực vật, chọn dịng chống chịu, lai xa, chuyển gen ở thực vật…
1.3.2. Cơ sở sinh lí của cơng nghệ ni cấy tế bào thực vật in vitro
- Tính tồn năng:
Tất cả mọi tế bào của cơ thể thực vật đều chứa bộ gen y hệt nhau, do đó tất
cả các tế bào của một cơ thể có tiềm năng tổng hợp đƣợc những kiểu proteinenzyme y hệt nhau và khi tế bào đƣợc nuôi trong mơi trƣờng thích hợp đều có thể


9
sinh trƣởng và phát triển thành cây nguyên vẹn đặc trƣng cho lồi cụ thể và ra
hoa, kết trái bình thƣờng.
- Tế bào thực vật có khả năng phân hóa và mất phân hóa:
Tế bào thực vật phân hóa thành các mơ, các cơ quan chun hóa nhƣng
cũng có khả năng mất phân hóa và chuyển sang trạng thái phân chia [2]. Hai quá
trình trên đƣợc biểu thị bằng sơ đồ sau:
Phân hố
tế bào

Tế bào
phơi sinh

Tế bào giãn

Tế bào
chun hố

Phản phân
hố tế bào

Hình 1.2. Sơ đồ q trình phân hóa và phản phân hóa tế bào
Về bản chất thì sự phân hóa và phản phân hóa là một q trình điều hồ
hoạt hóa gen. Tại một thời điểm nào đó trong q trình phát triển của cá thể có
một số gen đƣợc hoạt hóa (mà vốn trƣớc đây bị hạn chế) để tạo ra tính trạng mới,
một số gen khác lại bị đình chỉ hoạt động. Điều này xảy ra theo một chƣơng trình
đã đƣợc mã hóa trong cấu trúc của phân tử DNA ở mỗi tế bào.
Mặt khác khi cho tế bào nằm trong một khối mô của cơ thể thƣờng bị ức
chế bởi các tế bào xung quanh. Khi tách riêng từng tế bào hoặc giảm kích thƣớc
của khối mô sẽ tạo điều kiện thuận lợi cho sự hoạt hóa các gen của tế bào, q
trình hoạt hóa sẽ đƣợc xảy ra theo một cấu trúc nhất định sẵn có trong bộ gen đó.
- Sự trẻ hóa:
Khả năng ra chồi, rễ ở các thành phần khác nhau là rất khác nhau. Vì vậy
để chọn mẫu cấy phù hợp phải căn cứ vào trạng thái sinh lý hay tuổi mẫu. Trong


10
ni cấy in vitro, các mẫu non trẻ có sự phản ứng với các điều kiện và môi
trƣờng nuôi cấy nhanh, dễ tái sinh, đặc biệt trong nuôi cấy mô sẹo, phơi. Ngồi
ra, mơ non trẻ mới đƣợc hình thành thƣờng sinh trƣởng mạnh, mức độ nhiễm
mầm bệnh ít hơn so với các mô già.
1.3.3. Nuôi cấy mô tế bào thực vật in vitro
Ni cấy mơ callus chƣa phân hóa thành cơ quan, đã đƣợc tiến hành lần
đầu năm 1939 do các nhà sinh lí học thực vật White và Gautheret. Lần đầu nuôi
cấy các mảnh nhỏ của các khối u (đó là phản ứng ở chỗ thƣơng tổn, nơi bị nhiễm
khuẩn), nuôi cấy nhƣ thế thƣờng đƣợc tiến hàn trong các ống nghiệm lớn từ các
mảnh mô đƣợc tách ra từ các củ, thân, cuống hay những cành non. Tiến hành trên
các môi trƣờng dinh dƣỡng; thƣờng cấy chuyền hai tháng một lần [2].
1.3.3.1. Các điều kiện nuôi cấy in vitro
- Điều kiện vô trùng

Đây là điều kiện tiên quyết đối với thành cơng của q trình ni cấy in
vitro.Nếu trong q trình ni cấy khơng đảm bảo điều kiện vơ trùng thì mẫu sẽ
bị nhiễm nấm, khuẩn.
Vơ trùng dụng cụ và môi trƣờng:Để vô trùng dụng cụ và mơi trƣờng
ni cấy, có thể sử dụng một trong các phƣơng pháp sau:
- Khử trùng khô: phƣơng pháp này chỉ dùng cho các dụng cụ bằng kim
loại, thuỷ tinh, các dụng cụ có tính chịu nhiệt. Thiết bị dùng khử trùng khơ là lị
sấy, tủ sấy, nhiệt độ thƣờng dùng là 1210C – 1800C, trong 90-120 phút.
- Khử trùng ƣớt: là phƣơng pháp áp dụng hiệu quả và phổ biến trong vô
trùng môi trƣờng và các dụng cụ nuôi cấy. Thiết bị sử dụng là nồi hấp vô trùng,
nhiệt độ thƣờng dùng ở 1210C.
- Màng lọc: dùng để loại bỏ các tác nhân gây nhiễm có kích thƣớc 0,02510µm khỏi môi trƣờng nuôi cấy, nƣớc cất... Đây là phƣơng pháp phù hợp với các
mơi trƣờng mà thành phần của nó bị phân huỷ ở nhiệt độ cao.


11
Vô trùng mẫu cấy:Với các loại mẫu cấy khác nhau hoặc cùng loại mẫu
cấy nhƣng ở các vị trí khác nhau... thì phƣơng pháp khử trùng mẫu cấy là khác
nhau.Phƣơng pháp phổ biến trong vô trùng mẫu cấy hiện nay là sử dụng hóa chất
có khả năng tiêu diệt vi sinh vật nhƣ cồn 700 , các chất làm giảm sức căng bề mặt
nhƣ Tween 20, Tween 80, fotoflo, teepol, thủy ngân hoặc các chất kháng
sinh,…Hiệu quả khử trùng phụ thuộc vào loại, nồng độ, thời gian xử lý hóa chất
khử trùng. Một hóa chất đƣợc lựa chọn để vơ trùng phải đảm bảo 2 thuộc tính:
có khả năng diệt vi sinh vật tốt và khơng hoặc ít ảnh hƣởng mẫu thực vật.
- Ánh sáng và nhiệt độ.
Các mẫu nuôi cấy thƣờng đƣợc đặt trong những phịng ni ổn định về ánh
sáng và nhiệt độ. Tất cả các trƣờng hợp ni cấy đều cần có ánh sáng trừ một số
trƣờng hợp ni cấy tạo mơ sẹo, nhƣng q trình nhân giống của chúng cũng cần
có ánh sáng. Nhiệt độ của các phịng ni cây thƣờng đƣợc duy trì từ 25-28 0C
nhờ các máy điều hoà nhiệt độ [11].

1.3.3.2. Các chất điều hoà sinh trưởng
Các chất điều hoà sinh trƣởng là thành phần không thể thiếu đƣợc trong
môi trƣờng nuôi cấy, có vai trị quan trọng trong phát sinh hình thái thực vật in
vitro.Hiệu quả tác động của chất điều hoà sinh trƣởng phụ thuộc vào loại và
nồng độ chất điều hồ sinh trƣởng sử dụng trong ni cấy.
- Nhóm Auxin: Đƣợc đƣa vào môi trƣờng nuôi cấy nhằm thúc đẩy sự sinh
trƣởng và giãn nở tế bào, tăng cƣờng các q trình sinh tổng hợp và trao đổi chất,
kích thích sự hình thành rễ và tham gia cảm ứng phát sinh phơi vơ
tính...(Epstein&cs, 1989).
Các loại auxin thƣờng sử dụng cho nuôi cấy:
+ IAA (Indole acetic acid)
+ IBA (Indole butyric acid)
+ NOA (Naphthoxy acetic acid)


12
+ α- NAA (α- Naphthaleneacetic acid)
+ 2.4 D (2.4 diclorophenolxy acetic acid)...
IAA ít sử dụng do kém bền với nhiệt và ánh sáng, nếu dùng thì ở hàm lƣợng
cao 1,0 - 3,0 mg/l (Dodds & Robert, 1999). Các auxin khác có hàm lƣợng sử
dụng từ 0,1 – 2,0 mg/l.
- Nhóm Cytokinin: Kích thích sự phân chia tế bào, sự hình thành và sinh
trƣởng của chồi in vitro (Miller, 1962). Các cytokinin có biểu hiện ức chế sự tạo
rễ và sinh trƣởng của mơ sẹo nhƣng có ảnh hƣởng dƣơng tính rõ rệt đến sự phát
sinh phơi vơ tính của mẫu nuôi cấy. Các loại cytokinin thƣờng dùng trong nuôi
cấy mô là:
+ Zeatin (6-[4-hydroxy-3-metyl-but-2-enylamino] purine).
+ Kinetin (6-furfurylamino purine).
+ BAP (Bezylamino purine).
+ TDZ (Thidiazuzon).

Hàm lƣợng sử dụng của các Cytokinin dao động từ 0,1-2,0 mg/l. Ở những
nồng độ cao hơn, nó có tác dụng kích thích rõ rệt đến sự hình thành chồi nách,
đồng thời ức chế mạnh sự tạo rễ của chồi ni cấy. Trong các loại cytokinin nói
trên, Kinetin và BAP là hai loại đƣợc sử dụng rộng rãi hơn cả.Đa số các trƣờng
hợp phải sử dụng phối hợp cả auxin và cytokinin ở những tỷ lệ khác nhau.
- Nhóm Gibberellin: Ngồi hai nhóm chính là auxin và cytokinin, trong ni
cấy mơ ngƣời ta cịn sử dụng thêm Gibberellin để kích thích kéo dài tế bào, qua
đó làm tăng kích thƣớc của chồi nuôi cấy... GA3 là loại Gibberellin đƣợc sử dụng
thƣờng xuyên nhất. Tuy nhiên do mẫn cảm với nhiệt độ nên phải lọc qua màng
lọc vô trùng rồi mới đƣa vào mơi trƣờng.
1.3.4. Lợi ích của cơng nghệ nuôi cấy mô tế bào thực vật in vitro
- Tạo ra đƣợc hàng loạt cá thể phù hợp, giữ nguyên tính trạng cây mẹ.


13
- Rút ngắn rõ rệt thời gian chọn giống.
- Tái sinh, phục chế đƣợc các giống cây quý bị nhiễm bệnh virut, bị thối hóa.
Tạo đƣợc các giống sạch bệnh, có phẩm chất tốt mong muốn.
- Giá thành cây giống rẻ nhờ giảm mặt bằng sản xuất.
- Tạo đƣợc nhanh chóng thế hệ các cây đồng hợp tử, sẽ rất cần cho phân tích di
truyền và ứng dụng thực tiễn [2].
Phƣơng pháp này có ý nghĩa vơ cùng to lớn đối với việc nghiên cứu lý luận
sinh học cơ bản, đồng thời có giá trị đóng góp trực tiếp cho thực tiễn sản xuất và đời
sống.
1.4. Tình hình nghiên cứu trong và ngồi nƣớc về ni cấy mơ tế bào thực
vật
1.4.1. Tình hình nghiên cứu trong nước
Ở Việt Nam, nhân giống bằng phƣơng pháp nuôi cấy mô tế bào thực vật
ngày càng đƣợc áp dụng rộng rãi đối với nhiều lồi cây trồng nói chung và cây
hoa lan nói riêng.

Nguyễn Tiến Thăng (2004) đã nghiên cứu ứng dụng nuôi cấy mô tế bào để
nhân giống Lan nhập ngoại ở Tỉnh Sơn La [3].
Tháng 9 năm 2004, Tiến sĩ Dƣơng Tất Nhựt đã nhân giống vơ tính thành
cơng lồi lan Hải Hồng, đây là một trong những loài đặc hữu của Việt Nam [6].
Năm 2006 đến 2008, trƣờng Đại học An Giang thực hiện đề tài với 2 quy
trình vi nhân giống lan Dendrobium Anosmum và Dendrobium Mini, thử nghiệm
ra cây lan Dendrobium Mini trên nhiều loại giá thể khác nhau [12].
Năm 2011, Nguyễn Văn Song và cộng sự đã nghiên cứu nhân giống in vitro
lan Kim Điệp (Dendrobium Chrysotoxum). Kết quả cho thấy nguyên liệu sử
dụng là hạt của quả lan 3 tháng tuổi, mơi trƣờng thích hợp cho nảy mầm và phát
sinh protocorm của hạt là MS cơ bản có bổ sung 20 g/l sucrose, 8 g/l agar, 15%
nƣớc dừa và 2,0mg/l BAP; môi trƣờng nhân nhanh protocorm tốt nhất là MS cơ


14
bản có 20 g/l sucrose, 8 g/l agar, 15% nƣớc dừa và 2,0 mg/l BAP; mơi trƣờng
MS cơ bản có 30g/l sucrose, 8 g/l agar, 1g/l than hoạt tính, 15% nƣớc dừa, 2,0
mg/l BAP và 1,0 mg/l NAA thích hợp nhất cho tái sinh chồi từ protocorm và
sinh trƣởng của chồi in vitro [8].
Năm 2012, Nguyễn Thị Lài đã nghiên cứu ảnh hƣởng của một số chất khử
trùng (H2O2, NaOCl..) đến loài lan Kim Tuyến (Anoectochilus roxburghii (wall.)
Lindl.) [4].
Năm 2013, Vũ Ngọc Lan và Nguyễn Thị Lý Anh nghiên cứu Mơi trƣờng
nhân nhanh protocorm lồi lan Thạch hộc (Dendrobium nobile Lindl.). Kết quả
cho thấy môi trƣờng nhân nhanh protocorm tối ƣu là KC + (100ml Nƣớc dừa +
10g saccharose + 6,0g agar)/lít [5].
1.4.2. Tình hình nghiên cứu trên thế giới
Việc nhân giống vơ tính cây hoa lan với số lƣợng lớn bằng hình thức sinh
sản vơ tính thơng thƣờng (ƣơm, giâm cây keiki) rất ít đƣợc áp dụng, đặc biệt với
các loại lan đơn thân nhƣ lan Hải Yến. Phƣơng pháp nhân giống vơ tính cây hoa

lan bằng ni cấy mô tế bào ra đời, môi trƣờng dinh dƣỡng sử dụng cho việc
nuôi cấy mô hoa lan đƣợc sử dụng chủ yếu là môi trƣờng MS (Murashige –
Shoog, 1962), 1/2 MS, V.W (Vacine – Went, 1949), KC (Knudsone)...[6;4].
Đến nay đã có một số nghiên cứu gần đây về ni cấy từ hạt quả lan đến
giai đoạn tạo protocorm (mô sẹo) của một số loài lan nhƣ lan Ngọc Điểm
(Rhynchostylis) [17], lan Hồ Điệp (Phalaenopsis Orchids) [14], lan Sơn Thủy
Tiên (Dendrobium Chrysotoxum)...[16].
Năm 1902 Haberlandt là ngƣời đầu tiên đề xuất phƣơng pháp ni cấy mơ
tế bào thực vật.Ơng đã tìm cách ni cấy tế bào đã phân hóa tách từ lá một số
cây một lá mầm nhƣng không thành công.Hơn thế, ông lại dùng tế bào đã mất
hết khả năng tái sinh [14].


15
Năm 1922, Knudson ngƣời Mỹ lại thành công trong việc thay thế nấm bằng
đƣờng ở môi trƣờng thạch để gieo hạt. Theo nghiên cứu của Knudson thì hạt của
các lồi Cattleya, Epidendrum và nhiều lồi lan khác có khả năng nảy mầm
không cộng sinh với nấm trong nuôi cấy in vitro [14].
Năm 1997, Nayka và cộng sự đã thực hiện cơng trình nghiên cứu sự nhân
nhanh chồi khi kết hợp cytokinin và auxin trên 2 đối tƣợng Dendrobium
Aphyllum và Dendrobium Moschatum đã cho kết quả tần số tái sinh chồi tối ƣu ở
nồng độ 9,91mg/l BA [1].
Năm 2003, Nasiruddin và cộng sự đã thử nghiệm nuôi cấy lá của giống
lanDendrobium Formosum trên mơi trƣờng có bổ sung BAP và NAA. Kết quả
thu đƣợc sau 60 ngày nuôi cấy tại nồng độ BAP = 2.5mg/l và NAA = 1mg/l cho
số chồi cao nhất là 2.68. Cũng vào năm 2003, Taluker, Nasiruddin và cộng sự đã
nuôi cấy từ chồi trên môi trƣờng có bổ sung BAP và NAA. Sau 40 ngày ni cấy
đã thu đƣợc số chồi cao nhất 1.9 tại nồng độ BAP = 2.5mg/l và NAA = 0.5mg/l.
Đây chỉ là khởi đầu cho quá trình nhân giống in vitro và cũng là tiền đề cho
những nghiên cứu sau này trên giống lan Dendrobium [1].

Gần đây nhất (2015) một bài báo tổng quan về nuôi cấy in vitro từ hạt quả
của chi hoa lan Hoàng Thảo (Dendrobium) từ hạt quả, đã chỉ ra rằng môi trƣờng
để khử trùng quả lan đƣợc sử dụng nhiều nhất là: EtOH 70ovà HgCl2 0,11,0%(28,3%), EtOH 70o và NaOCl 1,0-10% (15.1%), và EtOH 70ovà chất kháng
sinh (9.4%) [18].
Cùng với đó, nghiên cứu cũng chỉ ra một số môi trƣờng nuôi cấy hạt lan
đƣợc sử dụng nhiều nhất trong các nghiên cứu là: MS (30,2%), ½ MS (13,2%),
KC(11,3%) [13].


16
CHƢƠNG 2: ĐỐI TƢỢNG, PHẠM VI VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1. Đối tƣợng và phạm vi nghiên cứu
2.1.1. Đối tượng nghiên cứu
Lan Hải Yến (Rhynchostylis coelestis) là loàithuộc một trong 6 loài của
chi lan Ngọc Điểm (Rhynchostylis), họ Lan (Orchideaceae), bộ Lan
(Orchidales), lớpMột lá mầm (Monocotyledoneae). Ngoài tên lan Hải Yến ra
lồi lan này cịn đƣợc gọi với cái tên là lan Hải Âu [7].
2.1.2. Phạm vi nghiên cứu
-

Phạm vi: nghiên cứu độ nhiễm mẫu và sự nảy mầm của cây lan Hải Yến
(Rhynchostylis coelestis) thông qua các môi trƣờng nuôi cấy khác nhau đến
giai đoạn tạo protocorm.

-

Thời gian nghiên cứu: từ tháng 10/2016 đến tháng 05/2017.

-

Địa điểm nghiên cứu: Trung tâm nghiên cứu Cơng nghệ sinh học và Phịng
thực hành Sinh học của Khoa học Tự nhiên, Trƣờng Đại học Hùng Vƣơng –
Thị xã Phú Thọ - Tỉnh Phú Thọ.

2.2. Phƣơng pháp nghiên cứu
*Nguyên vật liệu, thiết bị
Nguyên vật liệu:
- Quả lan Hải Yến (chất lƣợng nhƣ nhau, đã đến độ tuổi thu hoạch là 5 tháng).
- Hóa chất: cồn 70 , NaOCl (3%, 5%), HgCl2 0,1%, chất kháng sinh (Rifampicin,
polymicin, vancomycin),..
- Phytohormone: BAP, KN, NAA.
Thiết bị
- Phịng thí nghiệm Cơng nghệ Sinh học
- Máy móc: Nồi hấp khử trùng, tủ sấy, máy đo pH, Box cấy,..