Tải bản đầy đủ (.docx) (17 trang)

LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC: NGHIÊN CỨU VÀ XÁC ĐỊNH KHẢ NĂNG HÌNH THÀNH BIOFIM CỦA VI KHUẨN PHÂN LẬP TỪ SỮA BÒ TƯƠI Ở CẦN THƠ VÀ ĐỒNG THÁP

Bạn đang xem bản rút gọn của tài liệu. Xem và tải ngay bản đầy đủ của tài liệu tại đây (91.03 KB, 17 trang )

KHOA KHOA HỌC TỰ NHIÊN

LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC
NGÀNH SINH HỌC

NGHIÊN CỨU VÀ XÁC ĐỊNH KHẢ NĂNG HÌNH
THÀNH BIOFIM CỦA VI KHUẨN PHÂN LẬP TỪ
SỮA BÒ TƯƠI Ở CẦN THƠ VÀ ĐỒNG THÁP

CÁN BỘ HƯỚNG DẪN

SINH VIÊN THỰC HIỆN

P

MSSV:
LỚP: SINH HỌC K43

Cần Thơ, 2021


LỜI CẢM ƠN
Để thực hiện được luận văn một cách thuận lợi và hoàn thiện một cách tốt nhất.
Với tấm lịng biết ơn sâu sắc tơi xin chân thành cảm ơn PGS.TS. Ngô Thanh Phong đã
tận tâm chỉ báo hướng dẫn tơi trong suốt q trình thực hiện luận văn.
Tơi xin gửi lời cảm ơn đến cố vấn học tập Trần Thanh Mến quan tâm tơi trong q
trình học tập.
Tơi xin gửi lời cảm ơn đến tất cả thầy cô giảng viên, cán bộ thuộc bộ môn Sinh
học – Khoa Khoa học Tự nhiên đã tận trình giảng dạy, giúp đỡ tơi trong q trình học tập.
Tơi xin cảm ơn các anh/chị lớp Cao học, các anh/chị lớp Sinh học Khóa 42 và các
bạn Khóa 43 cùng nghiên cứu ở phịng thí nghiệm Sinh học tế bào và phân tử - bộ mơn


Sinh học đã tận tình giúp đỡ tơi trong suốt q trình làm thí nghiệm.
Cuối cùng, tơi xin tỏ lịng biết ơn đến gia đình, bạn bè đã ln bên cạnh động viên,
khích lệ và tạo điều kiện tốt nhất cho tơi trong suốt q trình học tập.
Cần Thơ, ngày tháng năm 2021
Người viết


CAM KẾT KẾT QUẢ
Tôi xin cam kết luận văn này được hoàn thành dựa trên kết quả nghiên cứu của tôi
dưới sự hướng dẫn của PGS.TS. Ngô Thanh Phong và các kết quả trình bài trong luận
văn là trung thực và chưa cơng bố trong bất kì cơng trình nghiên cứu hay luận văn nào
khác.
Cần Thơ, ngày tháng năm 2021

Cán bộ hướng dẫn


Người viết

PGS.TS. Ngơ Thanh Phong

TĨM LƯỢC
Đề tài "Nghiên cứu và xác định khả năng hình thành biofilm của vi khuẩn phân
lập từ sữa bò tươi ở thành phố Cần Thơ và Đồng Tháp" được thực hiện nhằm tìm ra các
đặc điểm hình thái, sinh hóa, khả năng hình thành biofilm của vi khuẩn phân lập từ sữa
bò tươi nguyên liệu ở thành phố Cần Thơ và Tỉnh Đồng Tháp.
Từ 10 mẫu sữa bò tươi nguyên liệu thu nhận từ các trại ni bị sữa ở thành phố
Cần Thơ và tỉnh Đồng Tháp đã phân lập được 40 dòng vi khuẩn. Sau đó tiến hành khảo
sát khả năng hình thành biofilm cho thấy có 20 dịng có khả năng sản sinh biofilm. Trong
đó dịng vi khuẩn BT28 ở Cần Thơ và DDT15 ở Đồng Tháp có khả năng hình thành

biofilm mạnh nhất. Tiến hành khảo sát các đặc điểm sinh hóa của dòng vi khuẩn BT28 và
ĐT15 cho thấy dòng vi khuẩn này có hình que, Gram (-), Catalase (+), Oxidase (-),
Gelatin (+), Citrate (+), Urease (-),Glucose(+),Gelatin (+). Sau 72 giờ ni cấy, dịng vi
khuẩn CT412 có khả năng sinh ra enzyme ngoại bào protease.
Từ khóa: biofilm, Thành phố Cần Thơ, sữa bò tươi, vi khuẩn
Chương 1: GIỚI THIỆU
1.1 Đặt vấn đề
Sữa là loại thức uống đặc biệt, mềm, dễ tiêu hóa và dễ hấp thu, cung cấp nhiều chất dinh
dưỡng, vitamin, khống chất và có mùi vị thơm ngon. Ngành sữa đóng vai trị quan trọng


trong trong hệ thống thực phẩm toàn cầu và cả trong sự phát triển bền vững của các khu
vực nông thơn. Thực tế, ngành sữa đang đóng góp tích cực vào nền kinh tế của nhiều
cộng đồng, khu vực và đất nước. Hiện nay, cầu về sữa ở thế giới đang có xu hướng tăng,
thêm vào đó là nền cơng nghiệp đang có xu hướng tồn cầu hóa dẫn đến sự gia tăng về
phạm vi và mức độ của giao dịch sữa toàn cầu.Ở khu vực Châu Á, Việt Nam đang nổi lên
là một trong những quốc gia có ngành công nghiệp sản xuất, chế biến sữa phát triển năng
động, đặc biệt là trong những năm gần đây. Về công nghệ sản xuất, sản phẩm sữa nước
của Việt Nam hiện nay được chế biến và đóng gói dưới hai dạng là thanh trùng và tiệt
trùng. Công nghệ tiệt trùng được hiểu đơn giản là tiến trình xử lý nhiệt cho sữa ở nhiệt độ
cao (130-150oC) trong thời gian rất ngắn (3-15 giây) trong mơi trường vơ trùng khép kín.
Nhờ cơng nghệ này mà sữa tiệt trùng vẫn giữ được nhiều chất dinh dưỡng, có thể bảo
quản ở nhiệt độ thường và thời hạn sử dụng có thể kéo dài từ 6 tháng đến 1 năm. Sữa tươi
thanh trùng được đun nóng ở nhiệt độ 85-90oC trong thời gian ngắn (30 giây – 1 phút) rồi
làm lạnh ngay.
Cũng giống như bất kỳ một loại thực phẩm nào, trong sữa cũng có thế chứa các thành
phần gây hại, các chât hóa học có tính độc, tác nhân gây dị ứng hoặc chính trong sữa lại
có chất khó dung nạp cho cơ thể. Bên cạnh đó khơng thể khơng kể đến sự tồn tại của các
loại vi sinh vật có mặt trong sữa, những vi sinh vật này gây thay đổi chất lượng sữa, tạo
ra những sản phẩm thứ cấp làm ảnh hưởng đến sức khỏe của con người và sau đó là hiệu

quả kinh tế. Trong đó nhóm vi khuẩn ưa lạnh có mặt trong sữa tươi được xem là vấn đề
lớn trong ngành cơng nghiệp sữa hiện nay vì liên quan đến q trình làm hư hỏng sản
phẩm.
Bên cạnh đó có một số hình thành màng biofilm. Trong suốt quá trình tồn trữ sữa tươi
nguyên liệu, chúng sản sinh ra nhiều enzyme ngoại bào chịu nhiệt thủy phân protein, chất
béo làm sữa bị tủa,
có vị đắng và mùi ơi làm giảm chất lượng sản phẩm, gây mất uy tín và thiệt hại kinh tế
đáng kể cho các nhà sản xuất (Downey, 1980).


1.2 Mục tiêu nghiên cứu
Trên cơ sở tham khảo tài liệu và các nghiên cứu, đề tài hướng đến việc "tìm hiểu
các đặc tính hình thái, sinh hóa và khả năng hình thành biofilm của vi khuẩn phân lập
từ sữa bò tươi nguyên liệu tại Thành phố Cần Thơ và Đồng Tháp". Mục tiêu của đề tài
này là phân lậpcác dịng vi khuẩn có trong sữa bị tươi ngun liệu và tiến hành khảo sát
một số đặctính sinh học (hình thái, sinh hóa), khả năng hình thành biofilm, khả năng sản
sinh enzyme ngoại bào của các dòng vi khuẩn này. Từ đó có thể đưa ra các biện pháp
phịng ngừa nguyên nhân gây hư hỏng sản phẩm sữa do các dòng vi khuẩn gây ra.

CHƯƠNG 2: TÀI LIỆU THAM KHẢO
2.1 Sơ lược về vị trí thu mẫu
2.1.1 Thành Phố cần Thơ
Thành phố Cần Thơ nằm tồn bộ trên đất có nguồn gốc phù sa sông Mê Kông bồi
đắp và được bồi lắng thường xuyên qua nguồn nước có phù sa của dịng sơng Hậu. Địa
chất trong thành phố được hình thành chủ yếu qua q trình bồi lắng trầm tích biển và
phù sa của sông Cửu Long.


Cần Thơ nằm trong vùng khí hậu nhiệt đới gió mùa, ít bão, quanh năm nóng ẩm,
khơng có mùa lạnh. Nhiệt độ trung bình năm khoảng 28°C.

Một số khu vực ở địa bàn Thành phố Cần Thơ trong những năm gần đây chăn ni bị
sữa phát triển mạnh như là: Long Hồ, Bình Thủy, Cái Răng, Tân Phú,…
2.1.2 Tỉnh Đồng Tháp
Đồng Tháp là một trong 13 tỉnh của vùng Đồng bằng sơng Cửu Long và là tỉnh
duy nhất có địa bàn ở cả hai bờ sơng Tiền.
Địa hình Đồng Tháp tương đối bằng phẳng với độ cao phổ biến 1–2 mét so với
mặt biển. Địa hình được chia thành 2 vùng lớn là vùng phía bắc sơng Tiền và vùng phía
nam sơng Tiền. Đồng Tháp nằm trong vùng khí hậu nhiệt đới, đồng nhất trên địa giới
tồn tỉnh, khí hậu ở đây được chia làm 2 mùa rõ rệt là mùa mưa và mùa khơ. Những đặc
điểm về khí hậu như trên tương đối thuận lợi cho phát triển nông nghiệp tồn diện.
Chăn ni bị sữa tập trung chủ yếu ở huyện Lai Vung.
2.2 Sơ lược về sữa tươi
Sữa tươi là các loại sữa động vật ở dạng nguyên liệu thô, dạng nước, chưa qua chế
biến hoặc chỉ mới qua sơ chế và chưa được tiệt trùng hay khử trùng triệt để bởi các thiết
bị xử lý nhiệt vi lọc, sữa tươi được bảo quản và vận chuyển trong điều kiện lạnh trước và
trong khi sử dụng. Loại sữa tươi thơng dụng nhất là sữa bị tươi do tính phổ biến của sản
lượng sữa bò. Theo nghiên cứu về thành phần, một ly sữa tươi cung cấp gần 30% lượng
canxi hàng ngày và hơn 23% lượng photpho.
Ở các nước phát triển, sữa tươi được coi là thực phẩm rất bổ dưỡng, giàu vitamin
và khoáng chất từ thiên nhiên, rất tốt cho cơ thể. Sữa tươi không chỉ được sử dụng
thường xun như một thức uống hàng ngày mà cịn có nhiều hình thức khác nhau từ pha
chế, trộn với trái cây, làm bánh và thêm vào các món ăn.


Các bác sĩ, chun gia dinh dưỡng ln khuyến khích người tiêu dùng nên uống
sữa tươi 100% thiên nhiên vì không chỉ dễ uống, mùi vị thơm ngon, sữa tươi cịn dễ hấp
thu và có thể uống thường xun, liên tục.
2.2.1 Thành phần của sữa tươi
Các thành phần dưỡng chất có trong sữa bị tươi ngun chất : Protein trong sữa
bò tươi lượng protein và calories (cal) khá cao khoảng 67Kcal/100ml sữa ,thành phần

protein trong sữa chủ yếu là nước và casein.bên cạnh đó cịn có canxi ,magie,photpho,….
Chất béo sữa tươi nguyên chất có khoảng hơn 4% chất béo.Vitamin trong sữa có lượng
vitamin khá phong phú và đa dạng đó là các nhóm vitamin A, vitamin B,
vitaminB2,vitamin B12, vitamin D,… Các loại khống chất khác.
Thành phần của sữa khơng giống nhau phụ thuộc vào nhiều yếu tố như: loại giống,
điều kiện khí hậu ni, chế độ thức ăn, điều kiện chăm sóc, điều chỉnh dinh dưỡng của
sữa thơng qua điều chỉnh thức ăn, và nhiều yếu tố khác. Bảng phân tích thành phần hóa
học của sữa từ các loại động vật khác nhau và được dùng làm thực phẩm.
2.2.2 Hệ vi sinh vật trong sữa
Các vi khuẩn có lợi:
- Vi khuẩn lactic: là nhóm vi sinh vật quan trọng đối với sữa, có thể lên men
lactic điển hình (Streptococus lactic, S. bulgaricum, L. acidophilum, ...) và lên men
lactic không điển hình (S. paracitrovorus, S. diacetilactic, trực khuẩn Betabacteri, ...).
- Nấm men:
• Nấm men rượu (Sacharomyces): có thể lên men được đường lactoza, có giá
trị lớn trong việc làm sữa chua.
• Một số chủng giống Torulopsis có tác dụng làm rắn bơ.
Bên cạnh các vi khuẩn có lợi, trong sữa tươi ngun liệu cịn chứa các vi khuẩn
có hại, điển hình là:
- Streprococcus liquefaciens phát triển trong sữa và các sản phẩm sữa gây


q trình pepton hóa do đó tạo vị đắng khó chịu cho sản phẩm.
- Vi khuẩn gây thối: Pseudomonas, Brevibacterium, Achromobacter, Bacillus
putrificus, Bacillus subtilis, ...

CHƯƠNG 3: PHƯƠNG PHÁP VÀ PHƯƠNG TIỆN NGHIÊN CỨU
3.1 Thời gian và địa điểm tiến hành thí nghiệm
 Thời gian: tháng 9 năm 2020 đến tháng 6 năm 2021.
 Địa điểm: Phịng thí nghiệm sinh học phân tử - bộ môn Sinh – Khoa Khoa

học Tự Nhiên – Đại học Cần Thơ
3.2 Phương tiện


3.2.1 Vật liệu
Các mẫu sữa tươi nguyên liệu được thu từ các hộ chăn ni bị sữa tại Cần Thơ và Đồng
Tháp.
3.3.2 Dụng cụ và thiết bị
 Dụng cụ:
Đĩa petri, kim cấy, đèn cồn
Ống nghiệm nắp đen
Ống đong, ống hút
Giá ống nghiệm
Túi nilon, găng tay y tế, viết lông, sổ tay ghi chép.
Micropipette (10-100, 100-1000 và 1000-5000).
Đĩa nhựa 96 giếng vô trùng.
Lame, lamemlle.
Đầu cone.
 Thiết bị:
Nồi khử trùng nhiệt ước ( Hirayama, Nhật)
Tủ cấy vô trùng (ESCO class II BSC)
Tủ sấy (Memment, Đức)
Tủ ủ (Memment, Đức)
Tủ lạnh (Sharp, Nhật)
Máy lắc (Stuart, Anh)
Máy khuấy từ (Stuart, Anh)


Máy đo quang phổ (Ultrospec Plus Spectrophotometer-Pharmacia LKB của
Mỹ)

Kính hiển vi (Olympus PX51, Nhật Bản)
Cân phân tích (Mettler Toler, Thụy Sĩ)
Máy Vortex (VELP Scientifica, Slovenia)
Và thiết bị khác trong phòng thí nghiệm.
3.3 Hóa chất
3.3.1 Mơi trường phân lập, ni cấy và trữ mẫu rịng
• Mơi trường Cetrimide Agar (CA) (Flint và Hartley, 1996): 45,3 g/L CA;
10 ml/L glycerol; 3,4 g/L agar.
3.3.2 Mơi trường kiểm tra khả năng hình thành biofilm
Mơi trường Tryptone Soya Broth bổ sung Yeast Extract (TSB + Y): 30 g/L
TSB; 5 g/L Yeast Extract.
Dung dịch Phosphate Buffer Saline (PBS 1X): 8 g/L NaCL; 0,2 g/L KCL; 1,44
g/L Na2HPO4; 0,24 g/L KH2PO4.
Methanol.
Dung dịch tím kết tinh (Crystal violet) 1%.
Ethanol 95%.
3.3.3 Mơi trường khảo sát các đặc tính sinh hóa của dịng vi khuẩn hình thành màng
biofilm mạnh nhất.
Mơi trường thử nghiệm khả năng hóa lỏng Gelatin (Gelatin Broth): 120
g/L Gelatin; 5 g/L Peptone; 3 g/L Yeast Extract


Môi trường thử nghiệm Urease: 10 g/L Urea; 0,1 g/L Yeast; 9,5 g/L
Na2HPO4; 9,1 g/L K2HPO4; 0,01 g/L Phenol Red.
3.3.4 Môi trường kiểm tra khả năng thủy phân enzyme của dịng vi khuẩn hình
thành màng bioflm mạnh nhất.
Mơi trường kiểm tra hoạt tính protease (Skim Milk Agar (SM agar)): 100
g/L skim milk; 5 g/L peptone; 5 g/L NaCl; 3 g/L Yearst Extract; 15 g/L agar.
Mơi trường kiểm tra hoạt tính Lipase có bổ sung Tween 80: 10 g/L
peptone; 5 g/L NaCl; 0,1 g/L CaCl2.2H2O; 20 g/L agar; 10 ml/L tween 80.

3.4 Phương pháp nghiên cứu
3.4.1 Thu mẫu sữa
Mẫu sữa được thu ở các trang trại ni bị sữa của các hộ gia đình vắt vào ống ly
tâm 15mL, được làm lạnh và chuyển về phịng thí nghiệm trong vịng 4 tiếng và bảo quản
ở ngăn mát tủ lạnh trong 24h và tiến hành trải mẫu.
3.4.2 Phân lập vi khuẩn
Phân lập là khâu quan trọng trong quá trình nghiên cứu vi khuẩn. Mục đích của
phân lập là tách riêng các vi khuẩn từ quần thể ban đầu tạo thành các dòng thuần khiết để
nghiên cứu về các đặc tính sinh lí, sinh hóa.
Các bước tiến hành thí nghiệm:
Thí nghiệm được tiến hành qua các bước: pha loãng và trải mẫu trên môi
trường Cetrimide Agar (CA) (Flint and Hartley, 1996) . Sau đó tiến hành
làm thuần, quan sát hình dạng, khả năng chuyển động và mơ tả đặc điểm hình dạng
khuẩn lạc của vi khuẩn phân lập được. Qui trình phân lập, quan sát vi khuẩn, khuẩn lạc
vi khuẩn, trữ mẫu vi khuẩn rịng được thực hiện theo quy trình của Cao Ngọc Điệp và


Nguyễn Hữu Hiệp (2002); Nguyễn Đức Lượng và cộng sự, (2003); Trần Linh Thước,
(2007).
❖ Phân lập vi khuẩn:
Phương pháp pha lỗng mẫu: dùng pipet vơ trùng hút 1 ml sữa từ ống đựng sữa
cho vào ống nghiệm có nắp chứa sẵn 9 ml nước cất vô trùng rồi khuấy mạnh bằng máy
khuấy mẫu, dung dịch mẫu đạt tỉ lệ 10-1
. Theo cách pha loãng liên tiếp đạt được tỉ lệ 10-2, 10-3, 10-4. Hút lần lượt 100 μl dung dịch
đã pha lỗng nhỏ lên đĩa petri có mơi trường phân lập CA, dùng que trải mẫu đều khắp
mặt thạch, mở nắp đĩa để khô trong khoảng 5 - 10 phút với ngọn lửa đèn cồn trong tủ cấy.
Đĩa môi trường đã trải mẫu được ủ ở 32ᴏC trong 24 - 48 giờ để vi khuẩn phát triển thành
khuẩn lạc. Chọn và cấy chuyền nhiều lần từ các khuẩn lạc riêng lẻ để tách ròng (làm
thuần) các dòng vi sinh vật.
Chỉ tiêu theo dõi: hình dạng, màu sắc, kích thước, dạng bìa, độ nổi của khuẩn lạc,

đặc điểm tế bào dưới kính hiển vi.

- Trong phân lập, vi khuẩn cần phải được tách rời từng tế bào và phát triển thành khuẩn
lạc độc lập. Tế bào vi khuẩn được tách ròng bằng kĩ thuật cấy ria tách ròng.
Sau khi cấy ria, chọn những khuẩn lạc rời khác nhau từ đĩa môi trường trên tiến
hành cấy chuyển nhiều lần sang đĩa môi trường cùng loại cho đến khi các khuẩn lạc rời
rạc, đồng nhất.


Quan sát và kiểm tra độ ròng của mẫu. Nếu mẫu ròng (xem như 1 dòng) đồng thời tiến
hành quan sát hình dạng, khả năng chuyển động của vi khuẩn. Sau đó trữ mẫu đã rịng
vào các ống eppendorf chứa mơi trường trên để tiến hành các thí nghiệm tiếp theo.
- Trữ mẫu vi khuẩn ròng: Các dòng vi khuẩn đã thuần (xem như một dòng) đem cấy trữ
giống trong eppendorf có chứa mơi trường phân lập vi khuẩn (trữ 3 ống), trữ trong tủ lạnh
(có thể trữ được 3 tháng, sau đó tiếp tục cấy chuyền). Các chủng vi khuẩn đã phân lập
ròng được cất trữ trong glycerol 20% ở nhiệt độ -70ᴏC có thể trữ được trong thời gian 2
đến 3 năm (Maniatis et al., 1982; Cao Ngọc Điệp và Nguyễn Hữu Hiệp 2002;
Nguyễn Đức Lượng và cộng sự, 2006).

❖ Mơ tả đặc điểm hình dạng khuẩn lạc của vi khuẩn
Khi cấy chuyển vi khuẩn trên đĩa môi trường thạch đồng thời tiến hành đo kích
thước và quan sát các hình thái khuẩn lạc bao gồm các chỉ tiêu: màu sắc, hình dạng, độ
nổi và dạng bìa của khuẩn lạc bằng mắt. Các khuẩn lạc được đo kích thước bằng thước
milimet (mm).
3.4.3 Quan sát hình dạng vi khuẩn, mơ tả đặc điểm khuẩn lạc của các dịng
vi khuẩn phân lập được
Các mẫu vi khuẩn ròng phân lập từ thí nghiệm 1 được cấy trở lại trên đĩa mơi
trường CA để tiến hành mô tả đặc điểm khuẩn lạc sau 48 giờ ủ ở nhiệt độ 37ᴏC trong tủ ủ.
Chỉ tiêu theo dõi: kích thước, hình dáng, độ mơ, màu sắc của khuẩn lạc, khả năng
di chuyển, nhuộm Gram.

Phương pháp nhuộm Gram: được thực hiện theo phương pháp Hucker cải tiến:
Các bước tiến hành:


Chuẩn bị vết bôi: dùng que cấy vô trùng lấy một ít khuẩn lạc (sau khi cấy 24 giờ)
hồ vào 1 giọt nước cất ở giữa phiến kính, làm khơ trong khơng khí.
Cố định tế bào: hơ nhanh vết bơi trên ngọn lửa đèn cồn 2 - 3 lần.
Nhuộm bằng dung dịch tím kết tinh trong 1 phút, rửa nước, thấm khô.
Nhuộm lại bằng dung dịch Iod trong 1 phút, rửa nước, thấm khô.
Nhỏ dịch tẩy màu, giữ khoảng 30 giây (cho đến khi vừa thấy mất màu), rửa nước,
thấm khô.
Nhuộm bổ sung bằng dung dịch Safranin trong 2 - 3 phút, rửa nước, để khơ trong
khơng khí.
Soi kính: dùng vật kính có độ phóng đại 100 lần.
Kết quả: Vi khuẩn Gram (+) bắt màu tím, Gram (-) bắt màu đỏ (Nguyễn Lân Dũng
và Đinh Thúy Hằng, 2006).
3.4.4 Kiểm tra khả năng hình thành biofilm
Phương pháp định lượng khả năng sản biofilm trên đĩa 96 giếng được thực hiện
theo mô tả của Stepanovic et al. (2007) và Fallah et al. (2017) với các bước thực hiện như
sau:
Bước 1: Nuôi cấy vi khuẩn bằng môi trường lỏng:
Nuôi cấy vi khuẩn trong 4 ml dung dịch TSB+Y vơ trùng. Lắc 200 vịng/12 tiếng.
Bước 2: Chuẩn bị huyễn dịch vi khuẩn 1/10:
Chuyển 1 ml vi khuẩn sau nuôi cấy 12 giờ trong môi trường TSB+Y vào ống
nghiệm chứa 9 ml môi trường TSB+Y mới, vơ trùng. Trộn đều bằng máy vortex.
Lắc 200 vịng/12 tiếng.
Bước 3: Nuôi cấy tĩnh


Chuyển 100 μl huyễn dịch vi khuẩn vào mỗi giếng có sẵn 100 μl mơi trường

TSB+Y của đĩa nhựa vơ trùng 96 giếng. Mỗi mẫu được lặp lại 3 lần. Ni cấy tĩnh ở 37 oC
trong vịng 48 giờ.
Bước 4: Rửa trôi vi khuẩn không bám vào thành/ đáy đĩa:
Loại bỏ hồn tồn vi khuẩn khơng nằm trong biofilm bằng cách rửa mỗi giếng
bằng 200 μl PBS 1x; lặp lại 3 lần sau đó thấm khơ hồn tồn giếng.
Bước 5: Cố định biofilm:
Cố định vi khuẩn bám vào thành/ đáy đĩa bằng 200 μl methanol.
Giữ đĩa ở nhiệt độ phòng trong 20 phút.
Loại bỏ hoàn toàn methanol trong giếng bằng cách vẩy và thấm khô.
Bước 6: Nhuộm biofilm:
Bổ sung vào mỗi giếng 200 μl dung dịch tím kết tinh (crystal violet) 1%.
Giữ đĩa ở nhiệt độ phòng trong 15 phút.
Loại bỏ hồn tồn dung dịch tím kết tinh bằng cách vẩy và thấm khơ.
Loại bỏ hồn tồn thuốc nhuộm thừa (không thấm vào lớp biofilm) bằng cách rửa
mỗi giếng bằng 200 μl PBS 1x; lặp lại ít nhất 3 lần cho đến khi khơng cịn màu của thuốc
nhuộm sau khi thấm khơ giếng.
Bước 7: Đo mật độ quang:
Hịa tan thuốc nhuộm tím kết tinh thấm vào biofilm bằng cách bổ sung vào mỗi
giếng 200 μl dung dịch ethanol 95%.
Giữ ở nhiệt độ phịng trong ít nhất 20 phút.
Đo giá trị OD ở bước sóng 570 nm.
3.4.5 Khảo sát một số đặc điểm sinh hóa của các dịng vi khuẩn có khả năng hình
thành biofilm mạnh nhất.




×