Phân lập tuyển chọn chủng nẫm men để lên men vang từ quả bần chua (Sonneratia caseolaris)

KỈ YẾU HỘI NGHỊ SINH VIÊN NGHIÊN CỨU KHOA HỌC NĂM HỌC 2013-2014

PHÂN LẬP TUYỂN CHỌN CHỦNG NẪM MEN ĐỂ LÊN MEN VANG
TỪ QUẢ BẦN CHUA (SONNERATIA CASEOLARIS)
Phạm Thị Thanh Hường, Lớp K60A, Khoa Sinh học
GVHD: TS. Đồn Văn Thược
Tóm tắt: Từ mẫu dịch quả bần chua lên men tự nhiên chúng tôi đã phân lập được 80 chủng nấm men.
Chủng nấm men (kí hiệu NM2*) có khả năng lên men rượu mạnh (tạo được lượng rượu lên đến 17%)
đã được chúng tôi tuyển chọn từ 80 chủng nấm men này. Chúng tôi đã tiến hành nghiên cứu ảnh
hưởng của một số yếu tố đến khả năng sinh trưởng và lên men của chủng này như nhiệt độ, pH ban
đầu, hàm lượng đường, hàm lượng men giống. Khả năng lên men của NM2* cao nhất khi ở trong môi
trường dịch quả có hàm lượng đường 220g/l, hàm lượng giống 10%, mơi trường có pH = 3,5 và
được duy trì ở nhiệt độ 30oC. Chúng tôi đã xây dựng được quy trình lên men và tiến hành sản xuất
rượu vang từ dịch quả bần chua ở quy mơ phịng thí nghiệm, sản phẩm rượu vang thu được có giá trị
cảm quan và giá trị dinh dưỡng cao.
Từ khóa: Bần chua, Sonneratia caseolaris, lên men, rượu vang.

I. MỞ ĐẦU
Rừng ngập mặn là hệ sinh thái quan trọng đối với môi trƣờng và có ý nghĩa lớn trong
cơng tác phịng hộ. So với diện tích rừng ngập mặn trƣớc năm 1945 thì diện tích này đã bị
suy giảm nghiêm trọng, nguyên nhân trƣớc kia là do chiến tranh tàn phá, khi xã hội phát
triển, sức ép về dân số và kinh tế đã khiến diện tích rừng ngập mặn bị suy giảm.
Cây bần chua (Sonneratia caseolaris) đƣợc trồng và mọc tự nhiên ở các rừng ngâp
măn trải dài từ Bắc vào Nam nƣớc ta. Cùng với việc diện tích rừng ngập mặn bị suy giảm
thì diện tích đất trồng lồi cây này cũng bị thu hẹp. Nguyên nhân chính về phía con ngƣời
là do ngƣời dân chƣa nhận thức đƣợc giá trị kinh tế mà cây bần chua mang lại, vì thế lồi
cây này vẫn đang tiếp tục bị đe dọa nghiêm trọng. Hàng năm, cây bần chua cho một sản
lƣợng quả rất lớn nhƣng chƣa đƣợc tận dụng vào mục đích kinh tế. Nhiều nghiên cứu đã
chỉ ra rằng trái bần có rất nhiều cơng dụng hữu ích. Hiện nay, một số nƣớc trên thế giới đã
sử dụng loại quả này để tạo một số sản phẩm đồ uống nhƣng mới chỉ dừng lại ở phƣơng
pháp thủ công truyền thống, trên quy mơ hộ gia đình nhỏ hẹp [6, 7, 13].

Xuất phát từ mục đích tận dụng nguồn nguyên liệu dồi dào có sẵn là quả bần chua,
đồng thời giúp ngƣời dân vùng ven biển nhận thức đúng đắn về giá trị của cây bần chua,
tránh hiện tƣợng chặt phá rừng ngập mặn. Căn cứ vào điều kiện nghiên cứu chúng tôi tiến
hành thực hiện đề tài: “Phân lập tuyển chọn chủng nấm men có khả năng lên men vang
từ quả bần chua (Sonneratia caseolaris)”.
II. NỘI DUNG
1. Mục tiêu của đề tài
Phân lập và tuyển chọn đƣợc chủng nấm men có khả năng chuyển hóa dịch quả bần
chua thành rƣợu vang.
2. Nội dung nghiên cứu
- Phân lập và tuyển chọn đƣợc chủng nấm men có khả năng lên men cồn cao.
- Khảo sát ảnh hƣởng của một số yếu tố (nhiệt độ, pH, hàm lƣợng đƣờng và hàm
lƣợng giống) tới khả năng lên men của chủng nấm men đƣợc chọn.
108


KỈ YẾU HỘI NGHỊ SINH VIÊN NGHIÊN CỨU KHOA HỌC NĂM HỌC 2013-2014

- Xây dựng quy trình lên men, tiến hành lên men rƣợu vang ở quy mơ phịng thí
nghiệm nhằm tạo sản phẩm rƣợu vang có giá trị dinh dƣỡng và giá trị cảm quan cao.
2. Phƣơng pháp nghiên cứu
2.1. Phương pháp phân lập [1, 4, 6]
Nghiền nhỏ quả bần chua, để dịch nghiên lên men tự nhiên trong 3 ngày sau đó tiến
hành pha lỗng với nồng độ từ 10-6- 10-2, hút 10 µl cho vào các đĩa petri có chứa mơi
trƣờng Hansen đặc, dùng que trang dàn đều trên bề mặt đĩa petri. Gói lại bằng giấy báo và
giữ ở nhiệt độ 300C trong 2 ngày. Lấy ra quan sát khuẩn lạc, dựa vào các đặc điểm hình
dạng, màu sắc, trạng thái khuẩn lạc để chọn những khuẩn lạc nấm men to, riêng rẽ để cấy
ria giữ giống vào các đĩa petri hoặc ống nghiệm chứa môi trƣờng Hansen đặc.
2.2. Phương pháp tuyển chọn chủng [5, 6]
Tiến hành tuyển chọn chủng có khả năng lên men tốt bằng việc xác định thơng qua

khối lƣợng CO2 thốt ra và hàm lƣợng rƣợu tao ra khi tiến hành lên trong bình Smith.
2.3. Phương pháp xác định độ rượu
Chƣng cất một lƣợng dịch lên men (V1), thu đƣợc V2 (mL) rƣợu. Tiến hành đo độ
rƣợu tạo ra trong V2 bằng cồn kế thu đƣợc giá trị a. Từ đó tính đƣợc độ rƣợu tạo ra (b) theo
tỉ lệ % (v/v) theo công thức:
b = (a x V2):V1
2.4. Xác định đường tổng
Xác định hàm lƣợng đƣờng tổng bằng khúc xạ kế.
2.5. Định lượng tannin theo phương pháp Leventhal
2.6. Phương pháp khuếch đại gen để giải trình tự đoạn ITS
Ni cấy chủng tuyển chọn trên môi trƣờng Hansen lỏng, tốc độ lắc 180 vịng/phút ở
nhiệt độ 300C sau đó li tâm, thu sinh khối tế bào. Tiến hành tascg chiết AND tổng số.
Khuếch đại đoạn AND bằng phản ứng PCR chuẩn, sử dụng cặp mồi gồm mồi xuôi: ITS4
(5‟-CCTCCGCTTATTGATATGC-3‟) và mồi ngƣợc: ITS5 (5‟-GGAAGTAAAAGTCGT
AACAAGG-3‟). Đặt chu trình nhiệt cho phản ứng: biến tính ở 950C trong 3 phút; giai đoạn
khuếch đại trình tự ADN với 30 chu kỳ, mỗi chu kỳ xảy ra trong điều kiện: 950C trong 30s,
550C trong 30s, 720C trong 60s; giai đoạn kéo dài ở 720C trong 10 phút và 40C - ∞. Sản
phẩm PCR đƣợc gửi sang Hàn Quốc để giải trình tự. Trình tự gen sau đó đƣợc so sánh với
ngân hàng gen để xác định chủng loại phát sinh của chủng nấm men đƣợc tuyển chọn.
2.7. Phương pháp khảo sát ảnh hưởng của một số nhân tố tới khả năng lên men
của chủng nấm men
Khảo sát sự ảnh hƣởng của các nhân tố: nhiệt độ; pH ban đầu; hàm lƣợng đƣờng;
hàm lƣợng men giống tới khả năng lên men của chủng nấm men giống dựa vào khối lƣợng
CO2 thốt ra khỏi bình lên men và lƣợng rƣợu tạo thành theo một số phƣơng pháp đã đƣợc
mơ tả trƣớc đó [3, 11, 12].

109


KỈ YẾU HỘI NGHỊ SINH VIÊN NGHIÊN CỨU KHOA HỌC NĂM HỌC 2013-2014

3. Kết quả nghiên cứu
3.1. Xác định hàm lượng một số chất trong dịch quả
Sau khi thu quả, chúng tơi tiến hành nghiền nhỏ, sau đó phân tích hàm lƣợng đƣờng
và hàm lƣợng tannin trong dịch quả [3]. Kết quả thu đƣợc: hàm lƣợng đƣờng tổng là 3% và
hàm lƣợng tanin là 7,215%.
3.2. Phân lập, tuyển chọn chủng nấm men có khả năng lên men tốt từ dịch lên
men quả bần chua
3.2.1. Phân lập, tuyển chọn

Hình 1. Khả năng lên men của một số chủng nấm men phân lập được
Chúng tôi đã tiến hành phân lập vi sinh vật từ dịch quả bần chua lên men, kết quả thu
đƣợc 80 chủng. Dựa vào hình thái khuẩn lạc chúng tơi chọn ra 20 chủng. Sau đó tiến hành
kiểm tra khả năng lên men của 20 chủng này, dựa vào khối lƣợng CO2 thốt ra khỏi bình
lên men, chúng tơi chọn đƣợc 3 chủng có khả năng lên men tốt: NM2*; NM3*; NM15*.
3.2.2. Kết quả tuyển chọn
Chúng tôi tiến hành q trình lên men của 3 chủng trên trong mơi trƣờng dịch quả
nghiền có bổ sung 220g/l đƣờng saccharose. Sau 14 ngày, lấy dịch lên men đem chƣng cất
thu đƣợc kết quả đƣợc trình bày ở bảng 1.
Bảng 1. Khả năng lên men của 3 chủng NM2*, NM3*, NM15*
trên môi trường dịch quả
Kí hiệu chủng

V dịch lên men (mL)

Thể tích rƣợu thu đƣợc (mL)

NM2*

100

17.3

NM3*

100

16

NM15*

100

16.01

Kết quả trên cho thấy chủng NM2* là chủng có khả năng lên men tốt, so sánh với
các nghiên cứu ở Việt Nam và trên thế giới cho tới nay thì NM2* là chủng nấm men q,
có ý nghĩa lớn về khoa học và ứng dụng [4, 5, 10, 11]
3.3. Nghiên cứu định tên chủng NM2*
Chúng tôi đã tiến hành nuôi cấy chủng NM2* trên môi trƣờng Hansen đặc, sau 24 48h nuôi cấy chúng tôi quan sát đƣợc những khuẩn lạc có hình trịn, màu trắng đục, bề mặt
bóng, viền xung quanh nhẵn (Hình 2).
110


KỈ YẾU HỘI NGHỊ SINH VIÊN NGHIÊN CỨU KHOA HỌC NĂM HỌC 2013-2014

Hình 2. Hình thái khuẩn lạc NM2*

Hình 3. Hình thái tế bào NM2*
dưới kính hiển vi quang học

Dƣới kính hiển vi quang học và kính hiển vi điện tử, tế bào chủng NM2* có hình
ovan (hoặc hình trứng), kích thƣớc trung bình: 1.5-4 x 4-7 µm, sinh sản theo hình thức nảy
chồi. Bên cạnh đó cịn có những tế bào dị hình có dạng dài. Chúng tơi cho rằng, những tế
bào này có ảnh hƣởng tích cực tới khả năng lên men.

Hình 4. Hình thái tế bào NM2* dưới kính hiển vi điện tử
Chúng tơi tiến hành tách ADN tổng số của chủng NM2* sau đó kiểm tra kết quả
bằng chạy điện di (Hình 5). ADN tổng số này sau đó đƣợc sử dụng làm khn để tiến hành
phản ứng PCR với tình tự mồi ITS4, ITS5. Sau đó cũng kiểm tra kết quả PCR bằng điện di.
Kết quả cho thấy, chúng tôi đã tách đƣợc một đoạn ADN có kích thƣớc khoảng trên 500
bp. Đoạn gen này đạt đƣợc chúng tôi đã gửi sang Hàn Quốc để giải trình tự. Kết quả giải
trình tự cho thấy chủng NM2* thuộc lồi nấm men Candida tropicalis.

(1)

(2)

(1)
(2)
Chú thích:
(1):Marker
(2): NM2*

Hình 5. Kết quả điện di
sản phẩm genome

Hình 6. Kết quả điện di
sản phẩm PCR
111

KỈ YẾU HỘI NGHỊ SINH VIÊN NGHIÊN CỨU KHOA HỌC NĂM HỌC 2013-2014

3.4. Ảnh hƣởng của nhiệt độ tới khả năng sinh trƣởng và lên men của chủng NM2*
Khảo sát khả năng sinh trƣởng và lên men của NM2* trong khoảng nhiệt từ 250C 450C, chúng tôi nhận thấy trên môi trƣờng nuôi cấy ở 30 -350C, NM2* sinh trƣởng tốt
nhất. Trong môi trƣờng lên men, sự ảnh hƣởng của nhiệt độ tới quá trình lên men của
NM2* đƣợc thể hiện trong Hình 7.

Hình 7. Ảnh hưởng của nhiệt độ tới khả năng lên men của NM2*
Từ đó chúng tơi đƣa ra kết luận: 30 - 350C là nhiệt độ tối ƣu cho quá trình sinh
trƣởng và lên men của chủng NM2*.
3.5. Ảnh hưởng của pH tới khả năng sinh trưởng và lên men của chủng NM2*
Bằng phƣơng pháp xác định mật độ quang học của dịch nuôi cấy NM2* ở các mơi
trƣờng có pH khác nhau, chúng tơi thu đƣợc kết quả trình bày ở Hình 8.

Hình 8. Ảnh hưởng của pH tới khả năng sinh trưởng của NM2*
Có thể thấy rằng, ở pH = 4, mật độ quang học đo đƣợc lớn nhất. Chứng tỏ trong bình
mơi trƣờng có ban đầu là pH = 4 có số lƣợng tế bào lớn nhất. Vì vậy chúng tơi kết luận:
chủng NM2* sinh trƣởng tốt nhất ở pH bằng 4.
Bên cạnh đó, chúng tơi khảo sát ảnh hƣởng của pH tới khả năng lên men của chủng
này, kết quả nhƣ sau đƣợc trình bày ở Hình 9.

Hình 9. Ảnh hưởng của pH tới khả năng lên men của NM2*

112


KỈ YẾU HỘI NGHỊ SINH VIÊN NGHIÊN CỨU KHOA HỌC NĂM HỌC 2013-2014

Chúng tôi nhận thấy rằng ở pH = 3.5, khả năng lên men của NM2* là lớn nhất.
3.6. Khả năng lên men của chủng NM2* trong các môi trường khác nhau
Chúng tôi đã tiến hành thử nghiệm khả năng lên men của NM2* trong các môi
trƣờng khác nhau. Sau thời gian lên men 14 ngày chúng tôi tiến hành chƣng cất và thu
đƣợc lƣợng rƣợu nhƣ sau:

Bảng 2. Khả năng lên men của NM2* trong các môi trường khác nhau
Môi trƣờng

Hansen

Môi trƣờng khảo
sát lên men

Dịch quả ngâm

Dịch quả ngâm +
dịch quả đun

Độ rƣợu
(%, v/v)

8,36

4,55

14,95

10,7

Dựa vào quan sát lƣợng bọt khí xuất hiện trong mỗi bình và kết quả trên, chúng tơi
thấy rằng trong mơi trƣờng có chứa dịch quả ngâm chủng NM2* có khả năng lên men tốt
nhất với độ rƣợu thu đƣợc là 14,95% v/v.
3.7. Ảnh hưởng của hàm lượng đường trong dịch lên men tới khả năng lên men
của chủng NM2*
Để xác định nồng độ đƣờng tối ƣu cho sự lên men của NM2*, chúng tôi đã tiến hành
lên men trong các bình chứa 300 mL dịch quả với hàm lƣợng đƣờng saccharose bổ sung
khác nhau. Sau lên men ở nhiệt độ 300C trong 14 ngày, tiến hành chƣng cất, thu rƣợu. Kết
quả đƣợc trình bày dƣới đây:

Hình 10. Ảnh hưởng của hàm lượng đường tới khả năng lên men của NM2*
Kết quả trên cho thấy tại môi trƣờng dịch quả đƣợc bổ sung 220g/l đƣờng saccharose
nồng độ rƣợu thu đƣợc là lớn nhất (16,2 %v/v). Vì vậy chúng tơi quyết định sử dụng hàm
lƣợng đƣờng bổ sung là 220g/l cho các thí nghiệm tiếp theo.
3.8. Ảnh hưởng của hàm lượng men giống tới khả năng lên men của chủng NM2*
Hình 11 trình bày kết quả về lƣợng rƣợu thu đƣợc sau chƣng cất dịch ở các bình lên
men có hàm lƣợng giống khác nhau.

113


KỈ YẾU HỘI NGHỊ SINH VIÊN NGHIÊN CỨU KHOA HỌC NĂM HỌC 2013-2014

Hình 11. Ảnh hưởng của hàm lượng men giống tới khả năng lên men của NM2*
Từ kết quả trên chúng tôi kết luận rằng: hàm lƣợng giống bổ sung 7,5 – 10% (v/v) là
hàm lƣợng giống thích hợp cho quá trình sản xuất rƣợu vang của NM2*.
3.9. Xây dựng quy trình sản xuất vang bần chua
Chúng tơi đã tiến hành sản xuất thử nghiệm và bƣớc đầu đề xuất quy trình sản xuất
gồm các bƣớc sau:

Lên men chính

114


KỈ YẾU HỘI NGHỊ SINH VIÊN NGHIÊN CỨU KHOA HỌC NĂM HỌC 2013-2014

3.10. Đánh giá cảm quan sản phẩm
Sau khi kết thúc quy trình lên men thu đƣợc sản phẩm rƣợu vang bần chua (Hình 12),
chúng tơi tiến hành đánh giá chất lƣợng cảm quan của sản phẩm dựa vào các chỉ tiêu nhƣ
TCVN 7045 : 2002 quy định [8].

Hình 12. Rượu vang bần chua thành phẩm
Tên chỉ tiêu

Yêu cầu

Điểm

1. Màu sắc

Đặc trƣng cho từng loại vang

4,5

2. Mùi

Thơm đặc trƣng của ngun liệu và sản phẩm lên men,
khơng có mùi lạ

5,0

3. Vị

Chua chát, có hoặc khơng có vị ngọt, khơng có vị lạ

4,5

4. Trạng thái

Trong, khơng vẩn đục

3,5

Đánh giá cảm quan theo hình thức cho điểm các chỉ tiêu với mức tổng điểm tối đa là
20 điểm, chúng tôi đánh giá sản phẩm rƣợu vang bần chua đạt tổng điểm là 17,5 điểm.
III. KẾT LUẬN
1. Kết luận
Từ dịch quả bần chua lên men tự nhiên chúng tôi đã phân lập đƣợc 80 chủng nấm
men, trong số các chủng này chúng tơi đã tuyển chọn đƣợc chủng NM2* có khả năng lên
men tạo ra 17% rƣợu.
Nhiệt độ và pH thích hợp cho sự sinh trƣởng và lên men của chủng nấm men NM2*
lần lƣợt là 30-35 oC và pH = 3,5-4. Hàm lƣợng đƣờng bổ sung và giống bổ sung thích hợp
nhất cho quá trình lên men lần lƣợt là 22% (w/v) và 7,5-10% (v/v).
Chúng tôi đã xây dựng thành công quy trình lên men rƣợu vang bần chua ở quy mơ
phịng thí nghiệm, sản phẩm rƣợu vang đƣợc đánh giá cảm quan tốt.
2. Đề nghị
Phát triển sản xuất trên quy mô lớn hơn đồng thời tiếp tục nghiên cứu hàm lƣợng các
chất dinh dƣỡng có trong rƣợu vang thành phẩm.
115

KỈ YẾU HỘI NGHỊ SINH VIÊN NGHIÊN CỨU KHOA HỌC NĂM HỌC 2013-2014

TÀI LIỆU THAM KHẢO
[1]

Hoàng Thị Lệ Thƣơng, Nghiên cứu tuyển chọn chủng nấm men sản xuất vang từ giống
nho Syrah, Luận văn Thạc sĩ, Trƣờng Đại học Sƣ Phạm Hà Nội, 2010.

[2]

Hoàng Văn Hải, Nghiên cứu nấm men lên men vang táo mèo, Luận văn Thạc sĩ,
Trƣờng Đại học Sƣ phạm Hà Nội, 2006.

[3]

Lê Thanh Mai, Nguyễn Thị Hiền, Phạm Thu Thủy, Nguyễn Thanh Hằng, Lê Thị Lan
Chi, Các phương pháp phân tích ngành cơng nghệ lên men, NXB Khoa học - Kĩ
thuật, 2006.

[4]

Lƣờng Thị Hiển, Nghiên cứu tuyển chọn chủng nấm men có khả năng lên men vang
tốt, Khóa luận tốt nghiệp, Trƣờng Đại học Sƣ phạm Hà Nội, 2012.

[5]

Nguyễn Văn Thành, Nguyễn Minh Thủy, Trần Thị Quế, Nguyễn Thị Mỷ Tuyền,
Phân lập, tuyển chọn và định danh nấm men trong lên men rượu vang khóm, Tạp chí

khoa học Trƣờng Đại học Cần Thơ, 2011.

[6]

Phan Nguyên Hồng, Hồng Thị Sản, Nguyễn Hồng Trí, Tần Văn Ba, Rừng ngập
mặn của chúng ta, Trung tâm Nghiên cứu hệ sinh thái rừng ngập mặn (MERC),
NXB Giáo dục, 1995.

[7]

Phan Nguyên Hồng, Rừng ngập mặn Việt Nam, Trung tâm Nghiên cứu Tài nguyên
và Môi trƣờng Đại học Quốc gia Hà Nội, NXB Nông nghiệp, 1999.

[8]

TCVN. 7045 – 2002, Rượu vang – quy định kĩ thuật.

[9]

Amerine MA, Kunkee RE, Microbiogogy of winemaking, Annual Review of
Microbiology, Vol. 22, 323-352, 1968.

[10] Baba S, Chan HT, Aksornkoae S, Useful products from mangrove and other coastal
plants, ISME Mangrove Educational Book Series, No.3, 46- 47, 2013.
[11] Gong G-L, Ma L-Y, Chen X-F, Isolation and improvement of Saccharomyces
cerevisiae for producing the distilled liquor, Journal of Chemical and Pharmaceutical
Research, Vol. 6, 283-288, 2014.
[12] Mateo J., J. Jiménez, M. Pastor, A. Huerta. T, Yeast starter cultures affecting wine
fermentation and volatiles. Food Research International, Vol.34, 307-314, 2001.
[13] Yansong G, Min Q, Quan Z, Zhengmao Z, Guoqiang C, Hyperproduction of Alcohol

Using Yeast Fermentation in Highly Concentrated Molasses Medium, Tsinghua
Science and Technology, Vol. 6, 225-230, 2001.

116