Tài liệu KHẢO SÁT HỆ VI KHUẨN Methylobacterium sp. TRÊN LÚA (Oryza sativa L.) Ở TÂY NINH docx

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP. HỒ CHÍ MINH
BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC
* * * * * * *






BIỆN TUẤN AN


KHẢO SÁT HỆ VI KHUẨN Methylobacterium sp. TRÊN LÚA
(Oryza sativa L.) Ở TÂY NINH




LUẬN VĂN KỸ SƢ
CHUYÊN NGÀNH: CÔNG NGHỆ SINH HỌC






Thành phố Hồ Chí Minh
Tháng 8/2006

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP. HỒ CHÍ MINH
BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC
* * * * *





KHẢO SÁT HỆ VI KHUẨN Methylobacterium sp. TRÊN LÚA
(Oryza sativa L.) Ở TÂY NINH



LUẬN VĂN KỸ SƢ
CHUYÊN NGÀNH:CÔNG NGHỆ SINH HỌC




Giáo viên hƣớng dẫn: Sinh viên thực hiện:
PGS.TS BÙI VĂN LỆ BIỆN TUẤN AN
Th.S KIỀU PHƢƠNG NAM KHÓA: 2002 - 2006





Thành phố Hồ Chí Minh
Tháng 8/2006

MINISTRY OF EDUCATION AND TRAINING
NONG LAM UNIVERSITY, HCMC
DEPARTMENT OF BIOTECHNOLOGY
* * * * *





INVESTIGATING Methylobacterium sp. IN RICE (Oryza sativa
L.) AT TAY NINH PROVINCE



GRADUATION OF THESIS
MAJOR: BIOTECHNOLOGY



Professor: Student:
Assoc.Prof.PhD. BUI VAN LE BIEN TUAN AN
MSc. KIEU PHUONG NAM TERM: 2002 - 2006

HCMC, 8/2006


iv
LỜI CẢM ƠN

Em vô cùng biết ơn PGS. TS Bùi Văn Lệ, Th.S. Kiều Phương Nam, cùng toàn thể các
thầy cô, các anh, chị, và các bạn cùng làm việc trong Phòng thí nghiệm Công nghệ
sinh học, Trường Đại học Khoa học Tự nhiên Đại học Quốc Gia thành phố Hồ Chí
Minh đã tận tình chỉ dẫn và giúp đỡ em trong suốt khóa thực tập tốt nghiệp tại trường.
Em xin chân thành cảm ơn sâu sắc đến Ban giám hiệu, cùng toàn thể giáo viên của
trường Đại học Nông Lâm thành phố Hồ Chí Minh đã tận tình chỉ dẫn và dạy dỗ em
trong suốt thời gian em học ở trường.
Em vô cùng biết ơn các thầy cô của Bộ môn Công Nghệ Sinh Học, Trường Đại học
Nông Lâm đã giúp đỡ em trong thời gian em học tại trường và trong khóa thực tập tốt
nghiệp này.
Cảm ơn các thành viên của lớp Công nghệ sinh học khóa 28 mến thương, đã cùng tôi
chia sẽ những kỷ niệm buồn vui trong suốt thời gian học tập.
Cảm ơn Bà Ngoại, cha mẹ và gia đình luôn ở bên con, luôn quan tâm đến con và nuôi
con khôn lớn cho đến ngày hôm nay.
Cảm ơn dì, dượng, cậu, mợ, đã động viên và giúp đỡ cho con.
Cảm ơn toàn thể các thầy cô những người đã dạy dỗ con từ khi con vừa cắp sách đến
trường.




Thành phố Hồ Chí Minh, tháng 8 năm 2006.
Sinh viên thực hiện

Biện Tuấn An




v
TÓM TẮT

Trường Đại học Nông Lâm Tp. Hồ Chí Minh tháng 8 năm 2005, đề tài nghiên cứu:
“Khảo sát hệ vi khuẩn Methylobacterium sp. trên lúa (Oryza sativa L.) ở Tây
Ninh”.
Đề tài do Biện Tuấn An thực hiện dưới sự hướng dẫn của:
PGS.TS Bùi Văn Lệ
Th.S Kiều Phương Nam
Vi khuẩn thuộc chi Methylobacterium là vi khuẩn có sắc tố hồng dinh dưỡng methyl
tuỳ ý (pink pigmented facultative methylotrophic – PPFM) có khả năng sử dụng nhiều
hợp chất khác nhau từ một cacbon đến nhiều cacbon. Là vi khuẩn có tiềm năng ứng
dụng trong nhiều lĩnh vự khác nhau vì chúng có khả năng sinh tổng hợp các hợp chất
thứ cấp có lợi cho thực vật và con người.
Mục đích của đề tài nhằm định danh các loài vi khuẩn Methylobacterium sp. trên lúa
và khảo sát khả năng sinh tổng hợp các hợp chất thứ cấp của vi khuẩn.
Được thực hiện qua các bước sau:
- Phân lập và làm thuần các chủng vi khuẩn Methylobacterium sp. trên ruộng lúa.
- Khảo sát các đặc điểm sinh lý sinh, sinh hóa của các chủng đã phân lập và làm
thuần.
- Định danh vi khuẩn đã khân lập bằng phương pháp PCR và giải trình tự vùng
rDNA 16S nguyên vẹn của các chủng.
- Khảo sát khă năng sinh tổng hợp các hợp chất thứ cấp của các chủng đã định
danh.

Các kết quả đạt được:
- Thu thập, phân lập và làm thuần 26 dòng vi khuẩn khác nhau thuộc chi
Methylobacterium.
- Khảo sát được các đặc điểm sinh lý, sinh hóa của các chủng đã được làm thuần
và phân bốn nhóm theo các đặc điểm sinh lý, sinh hóa.
- Định danh được các chủng đã phân lập thuộc chi Methylobacterium bằng
phương pháp PCR và giải trình tự. Qua đó, kết luận sơ bộ mối quan hệ của các
chủng so với các loài đã công bố.


vi
- Khảo sát được khả năng sinh tổng hợp các hợp chất thứ cấp, trong đó có hai
chủng có khả năng sinh tổng hợp auxin và bốn chủng có khả năng tích lũy
PHB.
Những kết quả trong nghiên cứu này đạt được nhờ sử dụng phối hợp phương pháp cổ
điển và phương pháp hiện đại – là phương pháp phù hợp với những nghiên cứu vi sinh
vật trong thời đại ngày nay.
Kết quả của nghiên cứu này đã góp thúc đẩy những nghiên cứu về vi khuẩn
Methylobacterium có lợi, để có thể ứng dụng tạo chế phẩm vi sinh dùng trong nông
nghiệp, ứng dụng trong công nghệ nuôi cấy mô tế bào và trong các lĩnh vực khác.


vii
MỤC LỤC
TRANG
MỤC LỤC vi
Danh mục các chữ viết tắt x
Dang sách các bảng xi
Dang sách các hình-sơ đồ xii
Phần I: Phần mở đầu 1

1.1. Đặt vấn đề 1
1.2. Mục đích, yêu cầu 2
Phần II: Tổng quan tài liệu 3
2.1. Cây lúa 3
2.1.1. Nguồn gốc phân bố 3
2.1.2. Đặc điểm phân loại 4
2.1.2.1. Đặc điểm chung 4
2.1.2.2. Phân loại 5
2.2. Vi khuẩn 7
2.2.1. Lịch sử phát hiện và phân loại 7
2.2.2. Đặc điểm chung 12
2.2.2.1. Đặc điểm sinh thái và phân bố 12
2.2.2.2. Đặc điểm hình thái, sinh lý, sinh hóa 13
2.3. Sự tương tác giữa thực vật và vi sinh vật 16
2.3.1. Sơ lược sự tương tác giữa vi sinh vật và thực vật 16
2.3.2. Sự tương tác giữa Methylobacterium với thực vật 17
2.3.3. Sự tạo các hợp chất thứ cấp bởi vi khuẩn Methylobacterium 19
2.3.4. Các ứng dụng khác của vi khuẩn Methylobacterium 21
2.4. Phương pháp định danh vi sinh vật 23
2.4.1. Định dang vi sinh vật bằng phương pháp truyền thống 23
2.4.2. Định danh vi sinh vật bằng kỹ thuật sinh học phân tử 24
2.4.2.1. Sơ lược kỹ thuật sinh học phân tử 24
2.4.2.2. Ứng dụng PCR và giải trình tự để định danh vi sinh vật 26
Phần III: Vật liệu và phương pháp 28
3.1. Vật liệu 28


viii
3.1.1. Mẫu thí nghiệm 28
3.1.2. Thiết bị, dụng cụ 28

3.1.3. Hóa chất 28
3.1.3.1. Môi trường phân lập và làm thuần 28
3.1.3.2. Môi trường giử giống vi khuẩn 29
3.1.3.3. Môi trường khảo sát khả năng sử dụng hợp chất cung cấp nguồn cacbon
của
vi khuẩn 29
3.1.3.4. Môi trường nhân sinh khối vi khuẩn 29
3.1.3.5. Bộ thử nghiệm sinh hóa định danh trực khuẩn gram âm IDS 14GNR 29
3.2. Phương pháp tiến hành thí nghiệm 30
3.2.1. Lấy mẫu 30
3.2.2. Tăng sinh vi khuẩn 31
3.2.3. Phân lập vi khuẩn 31
3.2.4. Làm thuần 31
3.2.5. Giữ giống 31
3.2.6. Khảo sát các đặc điểm sinh lý sinh hóa 31
3.2.6.1. Thử nghiệm gram và đo kích thước tế bào 32
3.2.6.2. Mối quan hệ với oxy 33
3.2.6.3. Khả năng di động 34
3.2.6.4. Thử nghiệm khả năng sử dụng nguồn cacbon của vi khuẩn 34
3.2.6.5. Các thử nghiệm trong bộ thử nghiệm IDS 14GNR 34
3.2.6.6. Khảo sát ảnh hưởng của nhiệt độ và pH 37
3.2.6.7. Xác định đường cong tăng trưởng của vi khuẩn 38
3.3. Định danh vi khuẩn 38
3.3.1. Tính hệ số tương đồng di truyền 38
3.3.2. Ly trích DNA vi khuẩn 38
3.3.3. Tiến hành phản ứng PCR 39
3.3.3.1. Thành phần phản ứng PCR 39
3.3.3.2. Các primer sử dụng 39
3.3.3.3. Điện di và xem kết quả 41
3.3.4. Giải trình tự 41

ix
3.3.5. Xử lý kết quả giải trình tự 41
3.4. Khảo sát khả năng sinh tổng hợp các hợp chất thứ cấp 42
3.4.1. Định tính khả năng sinh tổng hợp auxin 42
3.4.2. Định tính khả năng sinh tổng hợp PHB 42
Phần IV: Kết quả và biện luận 44
4.1. Kết quả phân lập và làm thuần 44
4.2. Kết quả khảo sát các đặc điểm sinh lý, sinh hóa 46
4.2.1. Kết quả thử nghiệm gram và đo kích thước tế bào 46
4.2.2. Mối quan hệ với oxy 46
4.2.3. Khă năng di động 47
4.2.4. Khả năng sử dụng chất cung cấp nguồn cacbon 47
4.2.5. Bộ thử nghiệm IDS 14GNR 49
4.2.6. Kết quả thử nghiệm nhiệt độ và pH tối ưu cho sự phát triển của vi khuẩn 50
4.2.7. Đường cong tăng trưởng tế bào 52
4.3. Kết quả định danh vi khuẩn 55
4.3.1. Hệ số tương đồng di truyền 55
4.3.2. Kết quả PCR 56
4.3.2.1. Kết quả định tính vi khuẩn chi Methylobacterium 56
4.3.2.2. Kết quả khuếch đại trình tự 16S rDNA nguyên vẹn 57
4.3.3. Kết quả giải trình tự và so sánh độ tương đồng của các chủng với các loài đã
công bố 58
4.4. Khảo sát khả năng sinh tổng hợp một số hợp chất thứ cấp 61
4.4.1. Định tính auxin 61
4.4.2. Định tính PHB 61
Phần V: Kết luận và đề nghị 62
5.1. Kết luận 62
5.2. Đề nghị 62

Tài liệu tham khảo 63
Phụ luc 76


x
DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT

CMS: môi trường MS bổ sung caseine hydrolase
CP: môi trường cao thịt-peptone
ctv: cộng tác viên
DC: đối chứng
DMHF: 2,5-dimethyl-4-hydroxy-2Hfuran-3-one
IAA: indole-3-acetic acid
MMS:môi trường methanol mineral salts
NCBI: National Center for Biotechnology Imformation
OD: optical density
PCR: polymerase chain reaction
PHB: poly- -hydroxybutyrate
PPFM: pink pigmented facultative methylotrophic
rDNA: trình tự DNA mã hóa cho rRNA
RNA: ribonucleotide
rRNA: RNA ribosome
tRNA: RNA vận chuyển
UV: ultraviolet
Zeatin: 4-hydroxy-3-methyl-trans-2-butenylaminopurine

xi
DANH SÁCH CÁC BẢNG

Bảng 2.1: Kiểu gen và phân bố của một số loài trong chi Oryza 6
Bảng 2.2: Các loài trong chi Methylobacterium được đặt tên 8
Bảng 2.3: Đặc điểm sử dụng các nguồn cacbon các loài trong chi Methylobacterium 24
Bảng 3.1: Hướng dẫn đọc kết quả bộ thử nghiệm sinh hóa IDS 14GNR 36
Bảng 4.1: Danh sách các khuẩn lạc được phân lập và làm thuần 44
Bảng 4.2: Khả năng sử dụng nguồn cacbon của vi khuẩn 47
Bảng 4.3: Kết quả bộ thử nghiệm sinh hóa IDS 14GNR 49
Bảng 4.4: Tổng hợp các đặc điểm hình thái, sinh lý, sinh hóa của vi khuẩn 53
Bảng 4.5: Hệ số tương đồng di truyền Jaccard 55
Bảng 4.6: Hệ số tương đồng của chủng TN10 với các loài đã công bố 58
Bảng 4.7: Hệ số tương đồng của chủng LM2 với các loài đã công bố 59

xii
DANH SÁCH CÁC HÌNH-SƠ ĐỒ

Hình 2.1: Hình thái cây lúa 5
Hình 2.2: Hình dạng khuẩn lạc trên cỏ ba lá và tế bào vi khuẩn Methylobacterium dưới
kính hiển vi điện tử 13
Hình 2.3: sự gắn kết giữa chu trình serine và chu trình PHB
trong quá trình biến dưỡng 15
Hình 2.4: Sự nhiễm của Methylobacterium sp. ở cây dương nuôi cấy mô 22
Hình 3.1: Vị trí bắt cặp của các mồi trên vùng 16S rDNA 40
Hình 3.2: Chu trình nhiệt cho phản ứng với cặp mồi 2F và 2R 40
Hình 3.3: Chu trình nhiệt cho phản ứng với cặp mồi FPGS6 với 2R
và FPGS1509 với 2F 41
Hình 4.1: Hình dạng khuẩn lạc trên môi trường MMS 45
Hình 4.2: Hình dạng tế bào trong thử nghiệm gram với vật kính 100X 46
Hình 4.3: Khả năng sử dụng nguồn cacbon của vi khuẩn 48
Hình 4.4: Đường tương quan tuyến tính giữa OD và mật độ tế bào 50
Hình 4.5: Ảnh hưởng của nhiệt độ đến sự tăng trưởng của vi khuẩn 50
Hình 4.6: Ảnh hưởng của pH đến sự tăng trưởng của vi khuẩn 51

Hình 4.7: Đường cong tăng trưởng của vi khuẩn 52
Hình 4.8: Kết quả điện di trên gel sản phẩm PCR với cặp mồi 2F và 2R 57
Hình 4.9: Kết quả điện di trên gel sản phẩm PCR với cặp mồi FPGS6 với 2R
Và FPGS1509 với 2F 58
Hình 4.10: Cây phát sinh loài 60
Hình 4.11: Kết quả định tính auxin 61
Hình 4.12: Sự bắt sáng của các hạt PHB dưới kính hiển vi huỳnh quang 62




1
Phần I: Phần mở đầu
1.1. Đặt vấn đề
Cây lúa là cây lương thực chủ yếu của các nước châu Á và Việt Nam. Cùng với
sự gia tăng dân số trên toàn thế giới thì nhu cầu về lương thực nói chung và nhu cầu
lúa gạo nói riêng đang ngày một tăng lên. Vì vậy, một nhu cầu cấp thiết đặt ra là phải
gia tăng diện tích gieo trồng và năng suất lúa. Trong đó, việc gia tăng năng suất là chủ
yếu. Để gia tăng năng suất lúa thì việc áp dụng các thành tựu khoa học kỹ thuật, việc
sử dụng hóa chất để khống chế sự phá hại của sinh vật gây bệnh cũng như để gia tăng
sự phát triển của thực vật đem lại những hiệu quả nhất định. Tuy nhiên, biện pháp sử
dụng hóa chất đã và đang làm cho môi trường bị ô nhiễm nghiêm trọng. Bên cạnh đó,
lượng khí methan tạo ra do canh tác lúa nước là nguyên nhân gây ra hiệu ứng nhà
kính. Cho nên, kiến tạo một nền nông nghiệp bền vững là xu hướng chung hiện nay
của thế giới cũng như ở Việt Nam. Phương pháp này là dùng các nguyên liệu có nguồn
gốc từ tự nhiên để kích thích sự phát triển của thực vật cũng như trong phòng trị bệnh
và kiểm soát các tác nhân có hại mà không ảnh hưởng đến môi trường. Một trong
những nguyên liệu có nguồn gốc tự nhiên được sử dụng là vi sinh vật. Vì vi sinh vật
không những có khả năng tạo ra các chất khác nhau, các hormone góp phần điều
chỉnh sự tăng trưởng ở thực vật, mà còn có khả năng tạo ra tính kháng của thực vật với

tác nhân gây hại. Ngoài ra, vi sinh vật còn có khả năng biến dưỡng các chất có hại
trong môi trường thành chất không có hại và thực vật có thể hấp thu dễ dàng. Vi khuẩn
Methylobacterium cũng thuộc nhóm này, đây là nhóm vi khuẩn có sắc tố hồng dinh
dưỡng methyl tùy ý có nhiều ứng dụng trong nhiều lĩnh vực khác nhau và cũng có khả
năng kích thích tính kháng cũng như tạo các chất có lợi, các hormon điều hòa sinh
trưởng của thực vật. Theo Maliti (2000), một số chủng Methylobacterium sp. có khả
năng làm gia tăng tỷ lệ nẩy mầm, gia tăng chiều cao cây lúa non,… trong điều kiện in
vitro. Năm 2004, Madhaiyan và ctv đã tiến hành thí nghiệm xử lý Methylobacterium
bằng cách trộn với hạt và phun trên lá, kết quả làm gia tăng sự đẻ nhánh của cây lúa,
gia tăng năng suất lúa từ 22,1 – 24,1%. Ngoài ra, cũng theo báo cáo này thì các chủng
Methylobacterium sp. còn có vai trò giảm tỷ lệ cây bệnh từ 17,8 – 23,7%. Từ những cơ
sở đó, để có thể hiểu rõ hơn về các chủng vi khuẩn Methylobacterium trên cây lúa và
mối quan hệ của vi khuẩn này với cây lúa. Được sự chấp nhận của Bộ môn Công nghệ


2
Sinh học nên chúng tôi tiến hành đề tài nghiên cứu: “Khảo sát hệ vi khuẩn
Methylobacterium sp. trên lúa (Oryza sativa L.) ở Tây Ninh” với sự hướng dẫn của
PGS.TS Bùi Văn Lệ và ThS. Kiều Phương Nam.
1.2. Mục đích và yêu cầu
Mục đích: Định danh và khảo sát một vài đặc điểm của vi khuẩn
Methylobacterium sp. trên ruộng lúa.
Yêu cầu:
Phân lập, làm thuần và định danh các chủng vi khẩn Methylobacterium sp. bằng
phương pháp phân tích các đặc điểm hình thái, đặc điểm sinh lý, sinh hóa và trình tự
rDNA 16S.
Khảo sát khả năng sinh tổng hợp một vài các hợp chất thứ cấp.


3

Phần II: Tổng quan tài liệu
2.1. Cây lúa
2.1.1. Nguồn gốc và phân bố
Cây lúa là loại thực vật được canh tác từ rất lâu. Tuy nhiên, về nguồn gốc của
cây lúa trồng chưa được hiểu rõ ràng và có nhiều ý kiến khác nhau. Theo một số tác
giả thì O. sativa được trồng đầu tiên ở Đông Nam Á, Ấn Độ và Trung Quốc cách đây
khoảng 8000 – 15000 năm. Và O. glaberrima được trồng cách đây khoảng 1000 năm
trước công nguyên. Trong khi đó, các nhà khảo cổ học Mỹ cho rằng lúa trồng xuất
hiện rất sớm cách đây khoảng hơn 9 – 10 nghìn năm. Nhiều nhà khảo cổ học khác cho
là lúa trồng xuất hiện cách đây 6000 năm, đối với lúa trồng châu Phi (Oryza
glaberrima) đã xuất hiện cách đây 3500 năm. Còn một số tác giả khác cho là lúa trồng
châu Phi xuất hiện rất muộn, chỉ sau công nguyên, cách đây khoảng 1800 – 1900 năm
[1],[23].
Về mặt phân bố thì cây lúa là loài thực vật có diện tích phân bố rộng, loài O.
sativa phân bố kéo dài từ vĩ độ 35 độ Nam đến 50 độ Bắc trên 110 quốc gia. Nhưng
khoảng 90% lượng gạo được sản xuất và tiêu thụ ở châu Á. Diện tích gieo trồng chiếm
khoảng 10% diện tích đất nông nghiệp trên thế giới (144 triệu ha). Lúa gạo được trồng
từ độ cao bằng mực nước biển đến độ cao 3000m so với mực nước biển. Lúa được
trồng từ vùng ôn đới đến vùng nhiệt đới. Lúa gạo có thể được trồng trên nhiều loại đất
khác nhau đất chua, đất kiềm, đất nhiễm phèn [23].
Những dòng lúa có thể được phân chia thành 3 nhóm sinh thái, Indica (ở vùng nhiệt
đới và cận nhiệt đới), Javanica ( được trồng ở Indonesia) và Japonica (vùng ôn đới).
Có hai dòng được canh tác nhiều nhất là Indica và Japonica [1], [2],[23].

4
2.1.2. Đặc điểm và phân loại.
2.1.2.1. Đặc diểm chung
Lúa là loại thực vật cổ xưa, có tính đa dạng di truyền và hình thái hơn một số
loại cây trồng khác. Trong ngân hàng gen lúa thế giới (The International Rice Gene
Bank) đang giữ khoảng 100000 dòng lúa khác nhau, hầu hết thuộc O. sativa [23].
Lúa trồng O. sativa có kích thước genome lưỡng bội (2n = 24) nhỏ (430 triệu
bp). Đây là genome nhỏ nhất trong số tất cả các genome của các cây lương thực khác.
Và xấp xỉ 50% genome bao gồm những trình tự lặp lại. Hầu hết các loài Oryza khác
cũng có nhiễm sắc thể lưỡng bội, tuy nhiên cũng có vài loài là tứ bội (2n= 48) [1],
[23].
Cây lúa trồng châu Á O. Sativa là cây thân thảo, có hệ thống rễ chùm, sống
hằng năm, có thời gian sinh trưởng thay đổi tùy theo giống lúa, vụ trồng, nơi trồng và
các điều kiện sinh thái và kéo dài trong khoảng từ 75 – 250 ngày. Cây lúa mọc thẳng
đứng hay mọc nghiên rồi bò dài (lúa nổi), lúa sống ở cạn, đất cao hay nước ngập chân
hoặc một phần thân hay trong nước sâu 2 – 4m. Thân cao từ 70 – 150cm, một số giống
lúa nổi có thân cao 2 – 3m, hay 5 – 6m (lúa nổi ở Bangladesh). Đốt thân nhẳn và cách
nhau bởi những dóng dài, ngắn khác nhau. Phiến lá thẳng hình đều, đầu lá nhọn, bề
mặt phiến lá và mép lá đều ráp. Bẹ lá có thìa lìa, lá dìa hình mũi mác hay chẻ đôi, các
đầu chẻ đều nhọn. Lúa thường tạo thành nhiều nhánh (dảnh lúa tillers), bao gồm cọng
và lá có hoặc không có bông (panical). Lá mọc liên tiếp trên thân bao gồm bẹ lá bao
lấy thân và phiến lá. Cổ lá nối giữa phiến lá và bẹ lá có một lưỡi bẹ và hai thìa lìa từ cổ
lá. Bông mọc trên đốt trên cùng của thân từ bên trong lá cờ và mang nhiều hoa trong
một bông con. Cụm hoa là một chùm thưa, thẳng, hẹp, đầu hơi cong xuống dài 15 –
30cm hoặc dài hơn. Hoa nhỏ hình thuôn dài, mày hoa thuôn dài hình mũi mác, hoa
màu hồng vàng hay màu tím. Lúa có hoa lưỡng tính, là hoa tự thụ phấn. Hoa có sáu
nhị đực mảnh, bao phấn dài, bầu hoa có vòi, nhụy ngắn và hai đầu nhụy có lông tơ

[1], [2], [23].


5
Hình 2.1: Hình thái cây lúa [23].
Có ba giai đoạn chính trong quá trình sinh trưởng và phát triển của cây lúa theo viện
nghiên cứu lúa quốc tế (International Rice Research Institution, 2002):
- Nẩy mầm và sinh trưởng sinh dưỡng.
- Giai đoạn phát triển cơ quan sinh sản.
- Giai đoạn hạt chín [23]
2.1.2.2. Phân loại.
Chi Oryza thuộc bộ Oryzeae của họ Poaceae. Có 12 giống bên trong bộ
Oryzeae. Chi Oryza bao gồm khoảng 22 loài trong đó có 20 loài lúa hoang và hai loài
lúa trồng là: O. Sativa và O. glaberrima. Oryza sativa được trồng khắp nơi bao gồm
châu Á, Bắc và Nam Mỹ, châu Âu, Trung Đông và châu Phi. Còn O. glaberrima được
trồng chủ yếu ở các nước Tây Phi [23]

6
Bảng 1.1: Kiểu gen và vùng phân bố của một số loài trong chi oryza [23]
Loài oryza
Kiểu gen
châu Phi
Trung và
Nam Mỹ
châu Á
châu Đại
Dương
O. sativa complex.
O. sativa
O. glaberrima
O. barthii
O. glumaepatula.
O. longistaminata
O. meridionalis
O. nivara
O. rufipogon.
O. officinalis complex
O. punctata
O. alampuzhaensis
O. minuta
O. eichingeri
O. officinalis
O. rhizomatis
O. alta
O. grandiglumis
O. latifolia
O. australiensis

O. brachyantha
O. granulata complex.
O. granulata
O. meyeriana
O. ridleyi complex.
O. longiglumis.
O. ridleyi.
O. schlechteri

AA
AA
AA
AA
AA
AA
AA
AA

BB,BBCC
BBCC
BBCC
CC
CC
CC
CCDD
CCDD
CCDD
EE
FF

GG
GG

HHJJ
HHJJ
??

+
+
+

+




+


+






+

+

+



+







+
+
+

+





+
+


+
+
+

+
+






+
+


+

+




+

+



+

+

+





+
+
+

Chú thích: AA, BB, BBCC, CC, CCDD, EE, FF, GG, HHJJ: là các kiểu gen; ??: chưa
biết kiểu gen; +: có phân bố.







7
2.2. Vi khuẩn Methylobacterium
2.2.1. Lịch sử phát hiện và phân loại
Chi Methylobacterium bao gồm nhiều loài vi khuẩn có sắc tố hồng dinh dưỡng
methyl tùy ý (pink – pigmented facultatively methylotrophic; PPFM). Chúng là những
vi khuẩn có khả năng phát triển trên môi trường có chứa hợp chất một cacbon như:
formate, formaldehyde và methanol. Hầu hết các loài có thể phát triển trên môi trường
nutrient agar, một số loài có khả năng phát triển trên môi trường có bổ sung
methylamine. Chỉ một loài M. organophilum được cho là có thể sử dụng methan như

nguồn cacbon chủ yếu [34]
Loài Methylobacterium được mô tả và phân lập đầu tiên do Bassalik năm 1913
từ giun đất và được đặt tên là Baccillus extorquens. Trong giai đoạn trước năm 1960,
nhiều loài vi khuẩn thuộc chi Methylobacterium đã được phân lập nhưng do không có
đầy đủ thông tin nên các loài này được phân loại vào các chi vi khuẩn khác nhau:
Pseudomonas, Flavobacterium, Protaminobacter, Arthrobacter, Corynbacterium,
…[34].
Mãi đến năm 1974, Patt và ctv phân lập được loài vi khuẩn PPFM đầu tiên có
khả năng sử dụng methan, loài này được xếp vào một chi mới là Methylobacterium với
tên loài là M. organophilum. Tuy nhiên, chi này mô tả chỉ dựa trên khả năng sử dụng
methan của một loài vi khuẩn duy nhất là M. organophilum nên đã gây nhiều khó khăn
cho những nghiên cứu phân loại sau này [34].
Đến năm 1982, Green và Bousfield đã nhận thấy rằng loài M. organophilum có
nhiều đặc điểm giống với các loài PPFM đã được công bố trước đây (tuy là chúng
không có khả năng sử dụng methan). Tất cả 149 loài đã được nghiên cứu nhờ 140 đặc
điểm sinh lý, sinh hóa và hình thái của chúng so với loài M. organophilum cho thấy
rằng sự tương đồng giữa chúng là 70%. Từ kết quả này Green và Bousfield đã đề nghị
xếp loài vi khuẩn PPFM vào chi Methylobacterium [34].
Đến ngày 10 tháng 7 năm 2006 đã có 24 loài Methylobacterium sp. được đặt tên
dựa trên các đặc điểm sinh lý, sinh hóa và trình tự rDNA 16S khác biệt giữa các loài
khác nhau. Trong đó có những loài mới có những đặc điểm đặc biệt như M.
chloromethanicum có khả năng sử dụng chloromethane (đặc trưng duy nhất chỉ có ở
loài này), M. thiocianatum có khả năng sử dụng thiocyanate hay cyanase là nguồn
cung cấp nitrogen,…[63], [99], [104].


8
Bảng 2.2: Các loài trong chi Methylobacetrium đã được đặt tên
Số
thứ

tự
Tên loài
Công trình công bố
1
M. adhaesivum
Gallego, Garcia And Ventosa: Methylobacterium
adhaesivum sp. nov., a methylotrophic bacterium isolated
from drinking water. Int. J. Syst. Evol. Microbiol., 2006, 56,
339-342.
2
M. aminovorans
Urakami, Araki, Suzuki And Komagata: Further studies
of the genus Methylobacterium and description of
Methylobacterium aminovorans sp. nov. Int. J. Syst.
Bacteriol., 1993, 43, 504-513.
3
M. aquaticum
Gallego Garcia And Ventosa: Methylobacterium
hispanicum sp. nov. and Methylobacterium aquaticum sp.
nov., isolated from drinking water. Int. J. Syst. Evol.
Microbiol., 2005, 55, 281-287.
4
M. chloromethanicum
McDonald, Doronina, Trotsenko, Mcanulla and Murrell:
Hyphomicrobium chloromethanicum sp. nov. and
Methylobacterium chloromethanicum sp. nov.,
chloromethane-utilizing bacteria isolated from a polluted
environment. Int. J. Syst. Evol. Microbiol., 2001, 51, 119-
122.
5

M. dichloromethanicum
Doronina, Trotsenko , Tourova , Kuznetsov and
Leisinger: Methylopila helvetica sp. nov. and
Methylobacterium dichloromethanicum sp. nov. a novel
aerobic facultatively methylotrophic bacteria utilizing
dichloromethane. Syst. Appl. Microbiol., 2000, 23, 210-218.
6
M. extorquens
Bousfield and Green: Reclassification of bacteria of the
genus Protomonas Urakami and Komagata 1984 in the
genus Methylobacterium (Patt, Cole, and Hanson) emend.
Green and Bousfield 1983. Int. J. Syst. Bacteriol., 1985, 35,
209.
7
M. fujisawaense
Green, Bousfield And Hood: Three new Methylobacterium
species: M. rhodesianum sp. nov., M. zatmanii sp. nov., and


9
M. fujisawaense sp. nov. Int. J. Syst. Bacteriol., 1988, 38,
124-127.
8
M. goesingense
Idris, R., Kuffner, M., Bodrossy, L., Puschenreiter, M.,
Monchy, S., Wenzel, W.W., and Sessitsch, A.
"Characterization of Ni-tolerant methylobacteria associated
with the hyperaccumulating plant Thlaspi goesingense and
description of Methylobacterium goesingense sp. nov." Sys.
Appl. Microbiol. (in press as of 20 February 2006).

9
M. hispanicum
Gallego, Garcia And Ventosa: Methylobacterium
hispanicum sp. nov. and Methylobacterium aquaticum sp.
nov., isolated from drinking water. Int. J. Syst. Evol.
Microbiol., 2005, 55, 281-287.
9
M. isbiliense
Gallego, García And Ventosa: Methylobacterium isbiliense
sp. nov., isolated from the drinking water system of Sevilla,
Spain. Int. J. Syst. Evol. Microbiol., 2005, 55, 2333-2337.
10
M. jeotgali
Aslam,Z. and Lee,S.T. Submitted (02-APR-2006)
Biological Sciences, KAIST, Daejeon. 305-701, S. Korea
11
M. lusitanum
Doronina, Trotsenko, Kuznetsov, Tourova And
Salkinoja-Salonen: Methylobacterium suomiense sp. nov.
and Methylobacterium lusitanum sp. nov., aerobic, pink-
pigmented, facultatively methylotrophic bacteria. Int. J.
Syst. Evol. Microbiol., 2002, 52, 773-776.
12
M. mesophilicum
Green and Bousfield: Emendation of Methylobacterium
Patt, Cole, and Hanson 1976; Methylobacterium rhodinum
(Heumann 1962) comb. nov. corrig.; Methylobacterium
radiotolerans (Ito and Iizuka 1971) comb. nov., corrig.; and
Methylobacterium mesophilicum (Austin and Goodfellow
1979) comb. nov. Int. J. Syst. Bacteriol., 1983, 33, 875-877.

13
M. nodulans
Jourand, Giraud, Béna, Sy, Willems, Gillis , Dreyfus
And De Lajudie: Methylobacterium nodulans sp. nov., for a
group of aerobic, facultatively methylotrophic, legume root-
nodule-forming and nitrogen-fixing bacteria. Int. J. Syst.
Evol. Microbiol., 2004, 54, 2269-2273.
14
M. organophilum
Skerman, Mcgowan And Sneath (editors): Approved Lists


10
of Bacterial Names. Int. J. Syst. Bacteriol., 1980, 30, 225-
420. Patt, Cole and Hanson: Methylobacterium, a new
genus of facultatively methylotrophic bacteria. International
Journal of Systematic Bacteriology, 1976, 26, 226-229.]
15
M. podarium
Anesti, Vohra, Goonetilleka, McDonald, Straubler,
Stackebrandt, Kelly and Wood. Molecular detection and
isolation of facultatively methylotrophic bacteria, including
Methylobacterium podarium sp. nov., from the human foot
microflora. Environ. Microbiol. 6 (8), 820-830 (2004)
16
M. populi
Van Aken, Peres, Lafferty Doty , Yoon And Schnoor:
Methylobacterium populi sp. nov., a novel aerobic, pink-
pigmented, facultatively methylotrophic, methane-utilizing
bacterium isolated from poplar trees (Populus deltoides x

nigra DN34). Int. J. Syst. Evol. Microbiol., 2004, 54, 1191-
1196.
17
M. radiotolerans
Green And Bousfield: Emendation of Methylobacterium
Patt, Cole, and Hanson 1976; Methylobacterium rhodinum
(Heumann 1962) comb. nov. corrig.; Methylobacterium
radiotolerans (Ito and Iizuka 1971) comb. nov., corrig.; and
Methylobacterium mesophilicum (Austin and Goodfellow
1979) comb. nov. Int. J. Syst. Bacteriol., 1983, 33, 875-877.
18
M. rhodesianum
Green, Bousfield And Hood: Three new Methylobacterium
species: M. rhodesianum sp. nov., M. zatmanii sp. nov., and
M. fujisawaense sp. nov. Int. J. Syst. Bacteriol., 1988, 38,
124-127.
19
M. rhodinum
Green And Bousfield: Emendation of Methylobacterium
Patt, Cole, and Hanson 1976; Methylobacterium rhodinum
(Heumann 1962) comb. nov. corrig.; Methylobacterium
radiotolerans (Ito and Iizuka 1971) comb. nov., corrig.; and
Methylobacterium mesophilicum (Austin and Goodfellow
1979) comb. nov. Int. J. Syst. Bacteriol., 1983, 33, 875-877.
20
M. specialis
Chưa xuất bản.
21
M. soumiense
Doronina, N.V., Trotsenko, Y.A., Kuznetsov, B.B.,

Tourova, T.P. and Salkinoja-Salonen, M.S.


11
"Methylobacterium suomiense sp. nov. and
Methylobacterium lusitanum sp. nov., aerobic, pink-
pigmented, facultatively methylotrophic bacteria." Int. J.
Syst. Evol.Microbiol. (2002) 52:773-776.
22
M. thiocyanatum
Wood, Kelly, McDonald, Jordan, Morgan, Khan,
Murrell and Borodina:A novel pink-pigmented facultative
methylotroph, Methylobacterium thiocyanatum sp. nov.,
capable of growth on thiocyanate or cyanate as sole nitrogen
sources. Arch. Microbiol., 1998, 169, 148-158.
23
M. variabile
Gallego, García And Ventosa: Methylobacterium variabile
sp. nov., a methylotrophic bacterium isolated from an
aquatic environment. Int. J. Syst. Evol. Microbiol., 2005, 55,
1429-1433.
24
M. zatmanii
Green, Bousfield And Hood: Three new Methylobacterium
species: M. rhodesianum sp. nov., M. zatmanii sp. nov., and
M. fujisawaense sp. nov. Int. J. Syst. Bacteriol., 1988, 38,
124-127.

Vị trí phân loại chi Methylobacterium trong giới vi sinh vật như sau [41]:
Giới: Bacteria

Ngành: Proteobacterium
Lớp: Alphaproteobacteria
Bộ: Rhizobiales
Họ: Methylobacteriaceae
2.2.2. Đặc điểm chung
2.2.2.1. Đặc điểm sinh thái và phân bố
Vi khuẩn Methylobacterium phân bố rộng trong tự nhiên, hiện hiện ở nhiều
môi trường khác nhau: môi trường đất, nước, không khí, băng ở hai cực, bề mặt lá cây,
nốt sần rễ thực vật, ở hạt, thực phẫm, mỹ phẫm, môi trường bệnh viện, dung dịch
ngâm xác động vật, có ở miệng và bề mặt da người, trong máu bệnh nhân nhiễm HIV
[9], [11], [25], [29], [30], [31], [34],[94].
Sự hiện diện của vi khuẩn PPFM trên thực vật rất đa dạng chúng đã được
phân lập từ hơn 100 loài thực vật khác nhau, từ dương xỉ và các loại rêu đến thực vật


12
hạt trần và thực vật hạt kín. Hirano và Upper (1992), tìm thấy Methylobacterium
chiếm hơn 90% của hệ vi khuẩn hiếu khí trên cây Phaseolus vulgaris trong suốt các
mùa khác nhau. Năm 1978, Austin và Googfellow đã phân lập Methylobacterium từ lá
cây Lolium perenne. Pirttila và ctv (2000), đã chứng minh rằng vi khuẩn
Methylobacterium sp. hiện diện bên trong chồi của cây thông (Pinus sylvestris) hay
nằm trong các bó mạch của cây họ cam chanh (Citrus). Vi khuẩn Methylobacterium
còn hiện diện trên hạt. Vi khuẩn PPFMs định cư trên bề mặt lá ở dạng kết hợp lại và
trong giữa các tế bào biểu bì Omer và ctv (2004). Sự định cư của vi khuẩn
Methylobacterium trên rễ cũng đã được ghi nhận trên nhiều loài thực vật khác nhau
[9], [13], [14], [47], [59], [60], [72], [76], [89].
Vi khuẩn Methylobacterium là những vi khuẩn hiếu khí bắt buộc. Do vậy, vi
khuẩn này được phân lập từ môi trường có oxy hòa tan. Ngoài ra, Methylobacterium
còn có khả năng kháng với Cl
–

nên vi khuẩn này còn hiện hiện trong nước máy [29],
[30], [31], [37].



13
Hình 2.2: Hình dạng khuẩn lạc trên cỏ ba lá (A, C) và tế bào (B) vi khuẩn
Methylobacterium 0.
2.2.2.2. Đặc điểm hình thái, sinh lý, sinh hóa
Hầu hết các loài Methylobacterium sp. thường có hình que kích thước 0,8 –
1 x 1 – 8 m. Tế bào thường có hình dạng phân nhánh hay có những dạng bất thường
khác, đặc biệt thường xuất hiện ở pha cuối của quá trình tăng trưởng. Vi khuẩn
Methylobacterium thường ở dạng tế bào đơn hay kết đôi lại theo dạng hoa hồng
[34],[86].
Hầu hết các chủng Methylobacterium sp. đều có khả năng di động nhờ một
tiêm mao ở cực hay gần cực. Tuy nhiên, vài loài thì không. Đa số các loài vi khuẩn
Methylobacterium sp. là vi khuẩn gram âm, một số có gram biến đổi. Vi khuẩn
Methylobacterium thường tăng sinh chậm, khuẩn lạc có màu hồng đậm hay đỏ cam,
một vài chủng không tăng trưởng trên môi trường nutrient agar. Sắc tố hồng vi khuẩn
Methylobacterium không tan trong nước và là hợp chất carotenoid. Ở môi trường lỏng,
nuôi cấy tỉnh vi khuẩn Methylobacterium tạo thành một lớp mỏng trên bề mặt, đều này
cho thấy hầu hết các chủng đều là hiếu khí bắt buộc. Chúng có phản ứng oxydase
dương tính yếu, catalase âm tính hay dương tính tùy thuộc vào loài vi khuẩn.