Bài giảng Vi sinh vật ứng dụng trong chăn nuôi: Chương 2 - TS. Nguyễn Thị Tuyết Lê

9/24/2018

Chương II

ỨNG DỤNG VSV TRONG SINH TỔNG HỢP
CÁC SẢN PHẨM DÙNG TRONG CHĂN NUÔI

Nội dung của chương:
Cơ sở của việc sử dụng vi sinh vật để sản xuất
các sản phẩm sinh tổng hợp
Các sản phẩm của công nghệ vi sinh
 Sản xuất sinh khối vi sinh vật
Sản xuất một số enzyme sử dụng trong chăn
nuôi

2.1. CƠ SỞ CỦA VIỆC SỬ DỤNG VSV TRONG SẢN XUẤT
CÁC SẢN PHẨM SINH TỔNG HỢP

2.1.1. Tốc độ sinh trưởng cực kỳ nhanh chóng

Khơng chỉ sinh trưởng nhanh chóng mà vi sinh
vật cịn có khả năng tổng hợp protein cao hơn rất
nhiều so với các sinh vật khác.

Tốc độ sinh tổng hợp các hợp chất là rất lớn. Thời gian thế
hệ ngắn
Loại sinh vật
Vi khuẩn và nấm men

Thời gian tăng gấp đôi khối lượng
10 – 120 phút

Nấm mốc và Tảo

2 – 6 giờ

Cỏ và một số thực vật

1 – 2 tuần

Gà

2 – 4 tuần

Lợn

4 – 6 tuần

Trâu, bò

1 – 2 tháng

Người

0,2 – 0,5 năm
(Israelidis, 2003)

2.2.1. TB VSV có hàm lượng protein cao. Giá trị sinh học của
protein VSV không thua kém protein từ TV và ĐV

Hàm lượng N và protein của VSV so sánh với

một số thức ăn khác (Karatyan, 1978)

Thành phần dinh dưỡng của một số nhóm VSV tính theo VCK

(Miller và cs. 1976)

1


9/24/2018

2.2.3. Có khả năng thích ứng cao, biến dị lớn: ứng dụng trong
gây đột biến cảm ứng để chọn lọc các giống vi sinh vật có năng
suất cao như các vi sinh vật sử dụng để sản xuất kháng sinh…
2.2.4. Chủng loại lớn và đa dạng: cho phép lựa chọn vi sinh vật
thích hợp cho sản xuất các sản phẩm khơng tổng hợp được
bằng phương pháp hố học.
2.2.5. Có thể phát triển trên nhiều nguồn dinh dưỡng khác nhau
• Hữu cơ hoặc vơ cơ
• Chất phi thực phẩm - phụ phẩm cơng, nơng nghiệp.
2.2.6. Có thể sinh trưởng phát triển ở các điều kiện sống khác
nhau: Điều kiện nuôi cấy và lên men của VSV đơn giản. Có
thể ni cấy liên tục, khơng phụ thuộc vào thời tiết khí hậu,
khơng cần diện tích đất lớn.
 Khả năng cơng nghiệp hố trong sản xuất cao: Cho phép tiết
kiệm được diện tích, thời gian và chủ động trong sản xuất.

Protein đơn bào (SCP-single cell protein)
• Thuật ngữ “Protein đơn bào” được sử dụng đầu tiên bởi giáo sư
Carol Wilson năm 1966 để mơ tả nguồn protein thu được từ VSV

• Năm 2003, Israelidis đã đưa ra khái niệm protein đơn bào là các tế
bào đã chết và được sấy khô của một số nhóm VSV như tảo, nấm,
vi khuẩn thu được sau khi nuối cấy trên các nguồn carbon khác
nhau.
• Protein đơn bào được sử dụng trong dinh dưỡng ĐV như một
nguyên liệu cung cấp protein: sử dụng trong chăn nuôi lợn, gia
cầm, trâu bị, ni trồng thủy sản và đặc biệt bổ sung các axit
amin, vitamin cho thú ni cảnh
• Một số nhóm VSV chủ yếu sử dụng để sản xuất protein đơn bào:
- Nấm men: một số loài Candida và Saccharomyces cerevisiae
- Nấm sợi (Aspergillus niger, Aspergillus oryzae…)
- Vi khuẩn (Bacillus subtilis, Bacillus megaterium, Lactobacillus sp.)
- Vi tảo/vi khuẩn lam (Spirulina, Chlorella, Scenedesmus..)

2.2.2. CÁC SẢN PHẨM TĐC
 Là các sản phẩm khác thu được cùng với tế bào sau quá trình
lên men, theo sự biến đổi cơ chất của mơi trường như sau:

Cơ chất  sản phẩm + tế bào
Các sản phẩm TĐC bao gồm các loại:
a. Sản phẩm TĐC sơ cấp/bậc 1 (primary metabolites):
*Các sản phẩm của quá trình phân giải các hợp chất hữu cơ: rượu,
axit hữu cơ (a. acetic, a. lactic, a. citric…), các chất khí.
phân giải
Cơ chất enzyme
ngoại bào Sản phẩm
*Thành phần cấu trúc tế bào : lipid, vitamins, polysaccharides
* Các enzyme ngoại bào: Cellulase, amylase, protease…
* Các chất trung gian trong quá trình tổng hợp thành phần TB:
nucleoid, amino acids

Đặc điểm: Hình thành trong pha sinh trưởng logarith; cần thiết cho
quá trình sinh trưởng, phát triển và sinh sản của TB

2.2. SẢN PHẨM CỦA CÔNG NGHỆ VI SINH
2.2.1. SINH KHỐI
Là khối lượng tế bào VSV thu được sau quá trình lên men.
Các chất dinh dưỡng được chuyển hoá thành vật chất của tế bào
để tăng nhanh số lượng tế bào theo sự biến đổi sau:

Cơ chất  tế bào.
Sinh khối gồm có hai dạng:
- Khối lượng vật chất chủ yếu của các tế bào chết (Protein
đơn bào -SCP-Single cell protein): thu được từ quá trình nuôi
cấy vi sinh vật như nấm men hoặc vi khuẩn và được sử dụng để
thay thế các thực phẩm giàu protein trong TA chăn nuôi hoặc để
bổ sung vào trong khẩu phần ăn cho người.
- Khối lượng các tế bào sống có hoạt tính: Sinh khối sau khi
ni cấy gồm các TB vi sinh vật còn sống, tiếp tục sinh trưởng
và thể hiện vai trò khi được sử dụng. (giống khởi động, chế
phẩm probiotics, phân bón cố định đạm, thuốc trừ sâu vi sinh,
men bánh mì, vaccine...

Giống khởi động (Starter culture)
• Giống khởi động là những VSV được chọn lọc để hỗ trợ quá
trình lên men hay tăng hiệu quả của q trình ni cấy vi
sinh vật.
• Giống khởi động có thể là dung dịch ni cấy thuần hoặc các
sản phẩm thương mại.
• Các vi sinh vật sử dụng làm giống khởi động thường là vi
khuẩn, nấm men hoặc nấm sợi. Có thể là đơn chủng hoặc đa

chủng
• Chọn lọc các chủng giống khởi động dựa trên các tiêu chí:
khả năng lên men sản sinh axit lactic tốt; chịu được pH thấp;
sinh trưởng tốt ở các điều kiện nhiệt độ khác nhau; sản sinh
các enzyme ngoại bào tốt; sản sinh các sản phẩm trao đổi chất
có lợi như hợp chất kháng khuẩn, các hợp chất tạo hương vị
của sản phẩm…

b. Sản phẩm TĐC thứ cấp/bậc 2 (secondary
metabolites):
• Gồm kháng sinh (penicillin…), các chất kích thích hoặc kìm
hãm sinh trưởng, các độc tố, ergot alkaloids, naphtalenes, ....
• Đặc điểm của các sản phẩm TĐC bậc hai:
- Các chất này được hình thành sau khi sinh trưởng kết thúc
(cuối pha logarith hoặc ở đầu pha cân bằng) hoặc khi môi
trường thiếu dinh dưỡng, các điều kiện sống khơng thích hợp
cho sự phát triển của vi sinh vật
- Không cần thiết cho sự sinh trưởng, phát triển, sinh sản của
tế bào vi sinh vật. Tuy nhiên, trong một số trường hợp, ĐTC
bậc 2 tạo ra các sản phẩm với mục đích giúp bảo vệ sự tồn tại
của tế bào như các hợp chất kháng khuẩn, các độc tố.
 Quá trình TĐC bậc 2 ở vi sinh vật cung cấp nhiều sản
phẩm dược phẩm quan trọng trong đời sống như các kháng
sinh, kháng nấm, kháng côn trùng…

2


9/24/2018

2.3. Các q trình lên men VSV

-Ưu điểm: Tốn ít mặt bằng trong xây dựng và lắp đặt dây
chuyền; chi phí điện năng, nhân lực và các khoản phụ cho
một đơn vị sản phẩm thấp; Các thiết bị lên men chìm dễ cơ
khí, tự động hóa; Dễ tổ chức và sản xuất với quy mô lớn

- Phân loại theo nguyên lý hoạt động của thiết bị lên men:
+ Nuôi cấy mẻ (Lên men tĩnh)
+ Ni cấy mẻ có bổ sung cơ chất (Fed-batch culture)

+ Đòi hỏi trang bị kỹ thuật cao, dễ bị nhiễm trùng tồn bộ
mơi trường. Vì vậy, phương pháp này địi hỏi điều kiện vơ
trùng cao.

+ Lên men liên tục
- Phân loại theo điều kiện lên men:
+ Lên men hiếu khí: cung cấp oxy nhờ sục khí (SX sinh khối)
+ Lên men yếm khí: sản xuất rượu, bia

2.3.3. Phương pháp nuôi cấy bề mặt/Lên men xốp
Là phương pháp nuôi cấy mà VSV sẽ sinh trưởng trên bề mặt của môi
trường.
Cơ chất sử dụng để lên men như cám, bột ngô, bột sắn, bột sữa…… Thực tế
thường dùng chủ yếu dùng cám gạo loại I, vì cám có đủ các chất dinh dưỡng
và cấu trúc xốp ẩm, thích hợp cho sự phát triển của nấm men.
Môi trường phải đạt độ ẩm 58-60%, điều chỉnh ở độ pH thích hợp ; sau khi
khử trùng ở 1-1,5 atm trong 45-60 phút, trải mỏng với độ dày 2-2,5 cm vào
các khay. Thời gian nuôi cấy: 36-60 giờ, tùy thuộc vào chủng giống

-Nhược điểm:

+ Phương pháp lên men chìm địi hỏi phải khuấy đảo và sục
khí liên tục vì vi sinh vật chỉ sử dụng được oxy hịa tan trong
mơi trường. Khí được nén qua một hệ thống lọc sạch tạp
khuẩn. Hệ thống này khá phức tạp và dễ gây nhiễm trùng
cho môi trường lên men.

2.4. SẢN XUẤT SINH KHỐI VI SINH VẬT
2.4.1. Sản xuất sinh khối vi tảo và vi khuẩn lam
a. Ưu điểm và nhược điểm của vi tảo, vi khuẩn lam
*Ưu điểm:
• Có hàm lượng dầu, carbohydrate và protein cao nên được ứng dụng
nhiều trong các lĩnh vực: sản xuất thực phẩm, thức ăn cho người, vật
nuôi; sản xuất dầu sinh học, các sản phẩm dược….

Ưu điểm: Chế phẩm dễ sấy khơ, ít bị giảm hoạt tính, dễ vận chuyển và sử
dụng.
- Không cần các thiết bị phức tạp, tiêu thụ năng lượng ít nên thích hợp với
nhiều vùng sản xuất.
- Trong q trình ni cấy nếu bị tạp nhiễm thì chỉ cần loại bỏ cục bộ từng
phần.

• Chủng loại đa dạng, phổ biến rộng rãi

Nhược điểm: Thu sinh tế bào khối khó, vì phải thu cả cơ chất. Thường sử
dụng để sản xuất chế phẩm sinh học hoặc sản xuất enzyme.

• Khơng bị virus tấn cơng; Khơng sản sinh các độc tố nguy hiểm.

Cần mặt bằng lớn và chi phí lao động cao, khó cơ giới hố trong sản xuất

-

2.3.2. Phương pháp ni cấy chìm

2.3.1. Phân loại các quá trình lên men:
- Phân loại theo sự phát triển của vi sinh vật trong mơi trường:
+ Lên men chìm: lên men ở bề sâu của môi trường lỏng lỏng
+ Lên men bề mặt: Lên men nổi trên bề mặt của mơi trường
rắn hoặc lỏng

Tuy nhiên, chúng cũng có một số nhược điểm như:
Nhiều chất diệp lục không được khuyến cáo sử dụng cho người;
Tốn diện tích nếu ni ngồi tự nhiên và bị ảnh hưởng bởi điều kiện ngoại
cảnh. Nếu ni trong nhà thì tốn năng lượng cho q trình điều khiển mơi
trường (điện chiếu sáng, nhiệt độ, chế độ thổi khí…)

• Có tốc độ sinh trưởng nhanh chóng: vịng đời ngắn (vài ngày). Kích
thước tế bào lớn, thu sinh khối lớn
• Nhu cầu dinh dưỡng đơn giản: ánh sáng, nước, CO2 và một số chất vơ
cơ
• Có thể tận dụng nguồn nước thải, hoặc phát triển được trong các
mương, rãnh nước thải, ao ni… để ni trồng tảo.

Tóm tắt quy trình sx

Quy trình sản xuất:
1. Chọn giống
3. Ni trồng qui mô pilot

5. Thu hoạch -Tách nước

2. Chuẩn bị môi trường nuôi cấy
4. Nuôi trồng ở qui mô sản xuất
6. Xử lý/chế biến 7. Thành phẩm

3


9/24/2018

a. Chọn giống
- Tùy vào mục đích sx để lựa chọn các loài phù hợp: VD:
vi tảo thường được lựa chọn để sx dầu sinh học (sinh
trưởng nhanh chóng, hàm lượng lipid cao, có thể tận dụng
nguồn nước thải…)
- Sử dụng kỹ thuật gen để nâng cao chất lượng/năng suất
của giống sx
 Một số giống tảo được sản xuất chủ yếu:
Chlorella vulgaris, Chlorella pyrenoidosa, Scenedesmus
quadricauda, Haematococcus pluvialis, Dunaliella salina…
 Giống vi khuẩn lam: Spirulina platensis, Spirulina
maxima; Synechococcus

Tảo, vi khuẩn lam giống được lựa chọn làm giống phải đạt
các tiêu chí sau:
- Có thành phần dinh dưỡng đáp ứng mục đích/u cầu
của sản xuất: Ví dụ: tảo ni để sản xuất dầu phải có hàm
lượng triacylglycerols, lipid cao; Tảo, vi khuẩn lam sư
dụng để sản xuất thực phẩm, thức ăn gia súc… phải có

thành phần dinh dưỡng chứa nhiều axít amin thiết yếu,
giàu protein, vitamin, khoáng chất…
- Sinh trưởng nhanh (1 vài ngày), tạo sinh khối lớn, mật độ
cao (>5 triệu tb/ml); Dễ thu hoạch
- Thích nghi tốt với điều kiện khí hậu/mơi trường, chịu
nhiệt, chịu mặn…
- Khơng hấp phụ các độc tố: pb, asen…

Một số giống tảo, vi khuẩn lam được sử dụng để sản
xuất sinh khối

b. Chuẩn bị môi trường
* Nguồn nước: Có thể dùng nhiều nguồn nước khác nhau để ni
tảo như nước giếng khoan (có chứa nhiều chất vơ cơ có ích,
nhưng cần phải loại bỏ các chất độc như chì, arsen,…); nước máy
(có nhiều khống tốt nhưng đắt); Nước biển, suối nước khống
(có chứa nhiều dưỡng chất tốt cho tảo phát triển)
Các phương pháp khử trùng:
- Hấp tiệt trùng (ở 120oC/15-45 phút tùy vào thể tích nước);
- Khử trùng Pasteur (80oC/1-2 giờ);
- Sử dụng tia UV để khử mơi trường ni trong ống nghiệm,
bình tam giác, thùng….
- Với thể tích ni cấy >20 lít có thể sử dụng phương pháp lọc
với đường kính lỗ lọc 1µm hoặc xử lý với axit HCl ở pH 3,
trung hòa axit sau 24 giờ với sodium cacbonate Na2CO3.

Môi trường Walne (cải tiến từ môi trường của Laing, 1991)

* Yêu cầu về dinh dưỡng:
-

Khoáng đa lượng: Nitrate (NO3-) NH3, muối amon; Phosphat,
Ca, Na, K, silicate…

-

Khoáng vi lượng: Cu, Zn, Mn, Co…

- Vitamins: thiamin (B1), cyanocobalamin (B12), Biotin…
Hai môi trường được sử dụng rộng rãi và phù hợp với sự phát
triển của phần lớn các lồi tảo là mơi trường Walne (cải tiến từ
môi trường của Laing, 1991) và môi trường Guillard’s F/2 (cải
tiến từ mơi trường của Smith và cs.,1993).
Ngồi ra, có thể kết hợp các mơi trường trên với các loại phân
bón dưới đây cho sản xuất sinh khối vi tảo ở quy mô công nghiệp

4


9/24/2018

* Các điều kiện sinh trưởng của tảo:

Các loại phân bón sử dụng trong ni trồng tảo ở quy
mơ cơng nghiệp (cải tiến từ Palanisamy và cs., 1991)

- Ánh sáng: nguồn năng lượng chủ yếu. Ánh sáng mặt trời chiếu trực tiếp
hoặc nhân tạo (đèn huỳnh quang; tối thiểu 18 giờ/ngày). Cường độ chiếu
sang từ 1000-10.000 lux tùy thuộc vào thể tích bể và mật độ ni trồng
(thích hợp từ 2500-5000 lux)

- Độ pH: phần lớn các lồi tảo có thể sinh trưởng ở mơi trường kiềm pH
7-9,5. Khoảng thích hợp cho sprirulina từ 8,5-9, tảo chlorella cần MT
trung tính 8,2-8,7
- Sục khí: liên tục hoặc 24/24h
- Khuấy đảo: cần thiết để tránh hiện tượng sa lắng tảo, tăng cường trao đổi
khí; tảo tiếp cận tốt với dinh dưỡng, ánh sáng, tránh hiện tượng phân
tầng. Tùy thuộc vào mơ hình ni trồng mà có phương pháp khuấy đảo
khác nhau.
• Nhiệt độ: Nhiệt độ thích hợp cho các lồi tảo phù du từ 20-24oC (Mức
tối thiểu không <20oC và mức tối đa khơng >38oC). Đối với Sprirulina
nhiệt độ thích hợp 35oC.
- Độ mặn: Nồng độ muối giao động 12-40g/l, thích hợp từ 20-24g/l

c. Nuôi trồng tảo
* Các hệ thống nuôi trồng tảo:
-Ni trong nhà/ngồi trời (Indoor/outdoor)
-Hệ thống hở/kín (Open/closed)
-Hệ thống vơ trùng/không vô trùng (Anxenic/Xenic)
-Nuôi cấy mẻ/đợt/lứa, nuôi cấy liên tục và bán liên tục (Batch,
continuous, semi-continuous)
SX quy mô công nghiệp: thường sử dụng hệ thống nuôi cấy vô
trùng, liên tục hoặc bán liên tục như phytobioreactor để kiểm soát
tốt năng suất, chất lượng
*Lựa chọn địa điểm nuôi tảo
- Nơi nuôi tảo phải có lượng chiếu sáng thích hợp giúp tảo sinh
trưởng bình thường, giảm chi phí chiếu sáng
- Chủ động nguồn nước nuôi tảo, nước không bị ô nhiễm
- Giao thông thuận tiện cho việc vận chuyển nguyên liệu đầu vào
và sản phẩm sau thu hoạch.
- Nơi có hệ thống điện lưới tốt

Hệ thống mở (open system)

Hệ thống kín (closed system)

HT nuôi đợt (batch culture)

HT nuôi liên tục (continuous
culture)

Production scheme for batch culture of algae (Lee and
Tamaru, 1993)

Các hồ nuôi tảo Spirulina ở Bình Thuận của
Cơng ty Tảo Vĩnh Hảo.

5


9/24/2018

d. Các phương pháp thu hồi sinh khối

e. Tách nước:
- Sinh khối tảo chỉ chiếm từ 0,1-1% khối lượng nuôi
trồng còn lại đến 99% là nước cần phải loại bỏ.

-Thời điểm thu hoạch:
+ Khi mật độ TB đạt từ 1-10g/l thì có thể thu hoạch.
+ Hoặc sử dụng đĩa Secchi (đo độ trong của nước): độ

sâu nhìn thấy đĩa từ 1,5-2cm thì thu hoạch, thu đến độ sâu 4cm
thì dừng và bổ sung hóa chất để tiếp tục ni và thu hoạch.

- Có 3 phương pháp loại nước:
+ Ly tâm (centrifugation): ly tâm tốc độ cao 
loại bỏ nước một cách hiệu quả
+ Lọc (membrane filtration): lọc qua màng lọc
polyester, lỗ lọc 30µm hoặc lọc áp lực chân khơng
+ Kết bơng (flocculation): Sử dụng hóa chất để
kết các TB tảo thành khối nổi trên bề mặt (chitosan,
polyacrylamides). Có thể sử dụng bọt khí CO2 sục
xuống đáy bể đẩy tảo nổi lên (chỉ sd hệ thống kín)

Nên thu hoạch vào buổi sáng:
- Hàm lượng protein của tảo thu buổi sáng cao hơn các thời
điểm khác trong ngày
- Có thời gian để phơi khô sản phẩm
- Nhiệt độ buổi sáng mát  đỡ mệt mỏi

f. Chế biến tảo:
SX sinh khối tảo: tảo sau khi tách nước được sấy khô/phơi khô
Phơi khô: phơi trực tiếp dưới nắng mặt trời  phương pháp này
không phải chi phí nhiên liệu nhưng có một số nhược điểm: phụ
thuộc vào thời tiết; dễ gây biến tính một số hợp chất hữu cơ của
tảo; địi hỏi diện tích lớn 1m2 bề mặt/100g tảo khô
Các phương pháp sấy phổ biến: sấy phun (spray drying), sấy trống
quay (roller drum drying), sấy thăng hoa (freeze drying)
- Tảo Spirulina sau khi tách nước được sấy khơ bằng khí nóng ở
60oC/7h độ ẩm cịn 5-7%
- Hoặc Tảo được đun nóng đến 60oC sau đó được sấy trong buồng

sấy có nhiệt độ đầu vào từ 120-140oC, nhiệt độ đầu ra là 85oC.
Thời gian sấy 6-8 giây
- Sinh khối tảo Chlorella vulgaris được sấy phun đến độ ẩm 4-6%
Ưu điểm: đảm bảo tổn thất chất dinh dưỡng thấp; đạt được độ ẩm
thấp
Nhược điểm: chi phí giá thành cao

2.4.2 Sản xuất sinh khối nấm men
a. Ưu điểm của nấm men
- Giàu dinh dưỡng: protein <60%, giàu aa thiết yếu (lysine 6-9%, tryptophan,
threonine), một lượng nhỏ aa chứa S (methionine, cysteine); giàu VTM nhóm
B; a. nucleic từ 4-10%
- Sinh trưởng nhanh chóng; năng suất chất lượng sản phẩm cao

Quy trình sản xuất sinh khối nấm men
1.

Chuẩn bị nguyên liệu/MT dinh dưỡng

5. Ly tâm, làm sạch  Kem nấm

2.

Nhân giống phịng thí nghiệm

6. Lọc chân khơng  nấm men tươi

3.

Nhân giống sản xuất

4.

Lên men -Thu sinh khối (dịch thể)

7. Sấy khô nấm men khô

- Sử dụng được nhiều nguồn dinh dưỡng khác nhau: Tận dụng các nguồn
nguyên liệu rẻ tiền, sẵn có, dễ kiếm như các nguồn phụ phẩm nông nghiệp
(ngô, sắn, cám gạo…); công nghiệp (bống/bã rượu, bã mía, rỉ mật đường, phụ
phẩm sản xuất dầu mỏ…)
-

Dễ dàng cơng nghiệp hóa: Hồn tồn có thể sản xuất theo quy mơ cơng
nghiệp (sản xuất hàng loạt, có thể kiểm soát và chất lượng sản phẩm đồng
nhất).

Nguồn protein từ sinh khối nấm men vẫn cịn có một số hạn chế như: hàm
lượng các axit amin chứa lưu huỳnh (S) cịn thấp; Khả năng tiêu hóa protein
của nấm men cịn bị hạn chế do protein nấm men có chứa một tỷ lệ đáng kể
thành phần phi protein như axit nucleic, peptid của tế bào hay cấu trúc vỏ tế
bào nấm men ảnh hưởng tới hiệu quả tác động của enzyme.

6


9/24/2018

Quy trình sx sinh khối nấm men từ rỉ mật đường

a. Bước 1: Chuẩn bị nguyên vật liệu và môi trường
* Giống nấm men được sử dụng để sản xuất sinh khối

*Các cơ chất sử dụng sản xuất sinh khối nấm men:
- Nguồn carbohydrates:

Xử lý rỉ mật đường

+ Đường và các phụ phẩm của sản xuất đường (rỉ mật đường);
+ Ngũ cốc, bột sắn, khoai và các phụ phẩm của chúng
+ Nguyên liệu giàu xơ như rơm, rạ…), phụ phẩm của ngành sản xuất giấy,
chế biến rau quả, (bã mía, bã dứa, vỏ chuối, vỏ các loại hạt…)
+ Các nguyên liệu khác: whey, lignocellulose từ thực vật
- Nguồn hydrocarbons: n-alkanes, n-paraffins, methanol, ethanol (phụ phẩm của
ngành dầu khí), axit béo, triglycerites, dầu … (dầu đậu nành, dầu hướng dương)
- Rỉ mật đường: là nguyên liệu được sử dụng chủ yếu nhất để SX sinh khối nấm
men do: rẻ tiền, dễ kiếm, giàu dinh dưỡng, có hàm lượng đường cao; chứa nhiều
vitamin, khống chất và các chất điều hịa sinh trưởng như biotin (vitamin H)
Yêu cầu của rỉ đường dung trong sản xuất sinh khối nấm men: Hàm lượng chất
khô không dưới 75%; hàm lượng đường từ 40-50%; N tổng số không dưới 1,4%.
Số lượng VSV tạp nhiễm không quá15.000TB/g rỉ đường
Rỉ mật đường cần được xử lý trước khi sử dụng ni cấy nấm men

* Nguồn nước:
- Nước sạch: Có độ cứng từ 4-8o (1o cứng ≈10mg CaO/lit); không màu, không
mùi, không vị
- Các chất sau không được vượt quá mức cho phép: Cl- <0,5 mg/l; SO42<80mg/l; As<0,05mg/l; Zn<5mg/l; Cu<3mg/l; FeO<3mg/l
- Số lượng TB E. coli <20 TB/ml
*Khơng khí: Cần phải sục khí liên tục vào dịch men để đảm bảo hiệu quả lên
men. Sử dụng dầu phá bọt như acid oleic, dầu lạc, dầu thầu dầu, dầu cám với

nồng độ 0,005-0,01% so với dung dịch giúp làm giảm sức căng bề mặt dung
dịch, áp suất khí CO2 làm vỡ tan bọt khí
* Tiệt trùng trang thiết bị
- Tiệt trùng thiết bị, hệ thống đường ống, nhà xưởng bằng tia cực tím U.V, xơng
formol, hóa chất tẩy rửa…
- Trường hợp khơng cần vơ trùng thì khơng cần thanh trùng hơi nước cao áp, chỉ
cần đun nóng hoặc ozon hố, lọc khử khuẩn, clo hoá, xử lý qua với focmalin
v..v..

7


9/24/2018

Bước 2: Nhân giống
- Nhân giống phịng thí nghiệm: giống ống nghiệm được cấy chuyền vào
bình tam giác có 1 lít mơi trường vơ trùng và được ni cấy ở 25 –
30oC/24-48 giờ. Lắc ở tốc độ 130-200 vòng/phút. Giống khởi động cần
đạt số lượng tối thiểu 2-5x106TB/ml.
- Nhân giống cấp 1: Các bình tam giác lên men đạt tiêu chuẩn sẽ được
cấy chuyển tiếp vào các bình lên men kín có sục khí đến khi đạt được
3,5 – 5g sinh khối/1lít dịch ni. Q trình kết thúc sau 12 – 15 giờ.
- Nhân giống cấp 2,3…: giống cấp 2 sẽ được cấy chuyển tiếp vào các
nồi lên men có dung tích từ 4 – 5 m3. Tỉ lệ tiếp giống 1:10. Trong quá
trình nhân giống dùng nước amoniac để giữ pH 4,5-5,5 và thổi khí liên
tục.
- Nhân giống sản xuất: Từ nồi 4 – 5 m3 sẽ được chuyển sang thùng 12 –
15 m3 tới vài chục m3 hoặc lớn hơn.

Yêu cầu về giống: Giống nấm men sử dụng nhân giống sản xuất phải là giống

khỏe, trẻ, không nhiễm tạp; tế bào chết khơng q 5%. Q trình nhân giống
phịng thí nghiệm phải đảm bảo 10% thể tích dịch men để đủ cung cấp cho các nồi
lên men. Số lượng TB trong dịch men đạt 100-120 triệu TB/ml.

Bước 3: Lên men
Lên men công nghiệp: giống được cấy chuyển vào các nồi lên men kín hoặc hở,
thể tích từ vài chục mét khối tới 500m3. Sử dụng phương pháp lên men liên tục
hoặc ni cấy mẻ có bổ sung dinh dưỡng cho hiệu quả kinh tế cao.
* Nuôi cấy mẻ:
- Môi trường giống như môi trường nhân giống
- Giống khởi động: 2-5x106TB/ml, tỷ lệ giống cấy 1-3%v/v
- Hàm lượng đường từ 2-3%; pH môi trường từ 4,2-4,5
- Cung cấp oxy:
+ ở giai đoạn tiềm phát thường kéo dài 0,5-1 giờ, sục khí với lượng 50m3/giờ/m3
mơi trường
+ Giai đoạn sinh trưởng logarithm: kéo dài từ 7-14 giờ, là giai đoạn cần nhiều oxy
nhất để tăng cường trao đổi chất. Lượng khí sục từ 80-100m3/giờ/m3 môi trường
+ Giai đoạn cân bằng: quá trình TĐC giảm mạnh, thường kéo dài từ 1-2 giờ.
Lượng khí sục giảm từ 20-50m3/giờ/m3 mơi trường

Nhân giống nấm men trong sx sinh khối men bánh mì

*Phương thức ni bán liên tục (ni cấy mẻ có bổ sung chất dinh
dưỡng): Phương thức ni cấy mẻ có nhược điểm là: Khó xác định thời
điểm thu sinh khối; Sinh khối nấm men thu nhận gồm cả TB già và TB
trẻ, ảnh hưởng đến chất lượng sinh khối; Đòi hỏi mất thời gian vệ sinh
thiết bị; TB bị tác động mạnh bởi hàm lượng chất dinh dưỡng cao ngay từ
ban đầu. Vì vậy, để khắc phục nhược điểm này, chất dinh dưỡng được
đưa vào môi trường thành nhiều đợt để giúp TB nấm men không bị tác
động bởi áp suất thẩm thấu cao.

* Phương thức nuôi cấy liên tục: là phương thức lên men áp dụng phổ
biến cho các quy mô sản xuất lớn, công nghiệp.
-

Giống: Giống khởi động: 2-5x106TB/ml, tỷ lệ giống cấy 1-3%v/v

-

Sục khí: liên tục với lượng 80-100m3/giờ/m3 mơi trường

-

pH: pH thích hợp cho nấm men từ 4 - 4,5

-

Hàm lượng đường: Không quá 4%.

-

Thời gian nuôi từ 18 – 36 giờ.

-

Nhiệt độ nuôi cấy 28 – 30oC.

- Nhiệt độ nuôi cấy: 28-30oC. Thời gian nuôi 16 giờ

Bước 4. Thu hồi sản phẩm

* Thu nhận nấm men tươi dạng paste:
-Thu hồi ngay sau khi kết thúc lên men
-Ly tâm: 2000-5000v/p  nấm men dạng nhão (paste), hàm lượng nước
cao  ép bằng máy ép khung bản  Miếng có độ ẩm 70-75%  đóng gói
 bảo quản lạnh 0-4oC, độ ẩm 82-95%
* Thu nhận nấm men khô:
-Từ nấm men dạng paste  sấy khơ  nấm men có độ ẩm <10%
- Quá trình này gồm 2 giai đoạn: + Ép nấm men tươi thành sợi có độ dài,
độ dày, độ chắc đồng nhất; + Giai đoạn 2: Khử nước, làm khô sợi nấm
men
- Phương pháp sấy thăng hoa (đông khô):Nấm men được đặt trong bình
chân khơng có áp suất gần với áp suất chân không tuyệt đối. Nhiệt độ
được hạ thấp xuống dưới điểm đơng lạnh -10oC tách nước thốt khỏi sản
phẩm. Phương pháp này giảm thời gian sấy xuống 3 lần và không ảnh
hưởng tới chất lượng sản phẩm. Tuy nhiên, chi phí năng lượng cao hơn
phương pháp sấy tới 50%.

8


9/24/2018

* Sinh khơi nấm men khơ:

2.5. CƠNG NGHỆ SẢN XUẤT ENZYME

-Từ nấm men dạng paste sau khi sấy khô thu được nấm men khơ, có
độ ẩm <10%. Q trình này gồm 2 giai đoạn:
+ Ép nấm men tươi thành sợi dài có độ dày và độ chắc đồng nhất:
sử dụng máy nghiền có đường kính lỗ là 0,3cm

+ Khử nước, làm khô sợi nấm men để thu được sinh khối khô: trải
sợi nấm men lên khay sấy, cho vào máy khử nước, dung luồng khí
thổi qua với cơng suất 27000m3/phút để tạo ra tốc độ gió
1,2m/giây. Nhiệt độ luồng khí duy trì ở 31oC/1 giờ đầu và 32oC
trong 3 giờ sau.
- Sấy thăng hoa (đông khô) để sản xuất sinh khối nấm men khô.
Phương pháp này giảm thời gian sấy xuống 3 lần và không ảnh hưởng
tới chất lượng sản phẩm. Tuy nhiên, chi phí năng lượng cao hơn
phương pháp sấy tới 50%.

2.5.1. Một số enzyme vi sinh vật chủ yếu
Enzyme amylase
- amylase: - amylase là men dịch hoá thuỷ phân tinh bột thành
dextrin phân tử lượng thấp và mantose.
Glucoamylase: thuỷ phân tinh bột, polysacarit thành thành glucose.
enzime này không có trong thóc mầm
 -glucozidase (mantase): thuỷ phân mantose thành glucose.
 Dextrinase: thuỷ phân isomantose và dextrin thành những đường
có thể lên men được.
Enzyme protease: Protease thuỷ phân protein hoặc polypeptide cho ra các
axit amin.
Cellulolytic enzymes: nhóm phân giải xơ gồm các enzyme cellulase, xylanase
có vai trị thủy phân các lignocellulose thành đường
Pectinolytic enzyme: gồm các enzyme Pectin acetylesterase,
Rhamnogalacturonase, Polygalactorunase và Pectinesterase
Là nhóm men thuỷ phân pectin tạo thành axit galacturonic, glucose, galactose,
arabinose, metanol... làm mất tính keo, làm giảm độ nhớt, tăng độ axit và các
chất khử.

Ngày nay VSV là đối tượng chính dùng để sản xuất enzyme do:

VSV có thể tổng hợp một lượng lớn các enzyme ngoại bào khác
nhau, vượt xa nhu cầu bản thân do chúng có khả năng sinh
enzyme thích ứng.
Do tốc độ sinh trưởng nhanh nên tốc độ tổng hợp enzyme nhanh
.
VSV có thể sử dụng được nhiều dạng dinh dưỡng khó đồng hố
và rẻ tiền khác do chúng có hệ enzyme đa dạng và hoạt tính là vơ
cùng đặc biệt .
Quy trình cơng nghệ sản xuất enzime dễ thực hiện, hiệu suất thu
hồi cao
Enzyme thu được từ VSV có hoạt tính rất cao, đáp ứng được yêu
cầu của con người

2.5.2. Quy trình sản xuất enzyme từ vi sinh vật
Quy trình sản xuất enzyme từ vi sinh vật được tiến
hành theo các bước sau:
1. Chọn giống vi sinh vật
2. Chuẩn bị môi trường, nguyên vật liệu
3. Nuôi cấy thu enzyme
4. Tách sản phẩm và tinh chế thu nhận enzyme

a. Giống vi sinh vật

Sử dụng một số biện pháp làm tăng khả năng sinh enzyme có hoạt tính

Giống VSV được lựa chọn để sản xuất enzyme dựa trên các tiêu chí:

cao của VSV:

-

Có khả năng sinh tổng hợp enzyme mạnh, hoạt tính enzyme cao

- Phân lập chọn lọc trong tự nhiên.

-

Có khả năng sinh trưởng tốt trên các nguồn cơ chất khác nhau và thích nghi
tốt với các điều kiện nuôi cấy khác nhau

- Phương pháp gây đột biến: gây đột biến bằng các tác nhân vật lý, hố

-

Dễ dàng tách khỏi mơi trường ni cấy lỏng để thu enzyme ngoại bào và dễ
phá vỡ tế bào để thu enzyme nội bào

- Phương pháp nuôi cấy với các chất cảm ứng

học đối với các chủng phân lập chọn lọc được.
- Phương pháp cấy chuyển gen

Giữ giống:
- Bảo quản giống đông khô
-

-

Bảo quản đông sâu: Giống được bảo quản trong phụ gia như glycerol 15 20% và được giữ trong tủ lạnh âm có nhiệt độ từ -15oC đến -70oC. Giống
được bảo quản từ 6 - 120 tháng tùy theo nhiệt độ bảo quản

Giữ giống trên thạch nghiêng: giống được ria cấy trên môi trường thạch
ống. Phương pháp này thời gian bảo quản ngắn từ 15-30 ngày tùy từng
giống.

Sinh tổng hợp enzyme nhờ chất cảm ứng
Aspergillus
oryzae 53

Sản xuất
amylase

Có tinh bột

Tăng hoạt lực 100%

Maltose

Tăng hoạt lực 200%

Aspergillus
niger

Sản xuất
Proteinase

có NaNO3
protein đậu

2%
125%

Trichoderma

Sản xuất
Cellulase

có xơ (bã củ cải, giấy lọc)

100%

9


9/24/2018

b. Chuẩn bị môi trường, nguyên vật liệu
- Cơ chất sử dụng: cám gạo, bột ngô, bột khoai tây…
- Nếu sử dụng cám gạo là cơ chất chính thì cần bổ sung 20-25% trấu để tạo độ xốp,
tăng lượng oxy hịa tan trong mơi trường, giúp vi sinh vật phát triển tốt hơn.
-Hoặc tận dụng phụ phẩm của ngành công, nơng nghiệp: bã mía, rơm lúa, mùn
cưa, lõi ngơ, xơ dừa, vỏ chuối, bã chè, vỏ dứa, cam….
Môi trường nuôi cấy
- Ni cấy giống sinh amylase: mơi trường cần có chất cảm ứng là tinh bột hoặc
dextrin với nồng độ 0,7-6% tuỳ theo từng loại VSV và có sự phối hợp với thành phần
có chứa N là NaNO3 hoặc NH4NO3, có bổ sung thêm các nguyên tố vi lượng như: S,
Mn, Mg, K, P...
- Nuôi cấy giống sinh protease: môi trường cần có chất cảm ứng là peptone,
gluten, bột đậu tương, bột mì, cám mì, hoặc mầm mạch, có thể phối hợp thêm N vô cơ
như (NH4)2HPO4 sẽ tốt hơn. Nguồn C là đường mono/disaccharide (glucose, fructose,
maltose...) và tinh bột (0,5-2%) nếu nuôi cấy vi khuẩn và xạ khuẩn.

- Nuôi cấy giống sinh cellulase: cần chất cảm ứng là cellulose (giấy lọc, bã củ cải
hay lõi ngơ...) hoặc có thể là tinh bột 1%. Nguồn N chủ yếu là N vơ cơ (muối nitrat) có
bổ sung thêm N hữu cơ và yếu tố sinh trưởng (cao nấm men, cao ngô...).

Phương pháp ni cấy chìm
 Phối chế mơi trường thành dịch thể, điều chỉnh độ pH thích hợp, khử
trùng trong thiết bị chịu áp lực ở 118 - 125oC/45-60 phút.

 Phương pháp ni cấy:
• Tiến hành nhân giống từ ống nghiệm qua bình tam giác có lắc đảo, nhân
tiếp từ bình sang thùng có thể tích bằng 5-10 thể tích thùng lên men chính
trong 24-36h, sau đó cấy chuyển sang thùng lên men chính với tỷ lệ cấy
giống 2-5%.
• Q trình ni cấy phải thổi khí và khuấy liên tục, thời gian kéo dài 2-4
ngày. Trong q trình ni cấy dùng NaOH và H2SO4 để điều chỉnh độ pH.

 Ưu điểm:
• Dễ cơ giới hóa, tốn ít nhân cơng, có thể sản xuất ở quy mơ cơng nghiệp;
• Thu hồi sản phẩm đơn giản hơn chủ yếu nhờ phương pháp lọc hoặc ly tâm,
hiệu suất thu hồi cao.
• Tuy nhiên, khi nuôi cấy bằng phương pháp này cần đảm bảo điều kiện vô
trùng nghiêm ngặt tránh tạp nhiễm và đầu tư trang thiết bị ban đầu cao.

c. Phương pháp nuôi cấy
Phương pháp nuôi cấy bề mặt/ Lên men xốp
Cơ chất thường dùng: cám vì cám có đủ các chất dinh dưỡng và cấu trúc xốp
ẩm, thích hợp cho sự phát triển của VSV.
Môi trường phải đạt độ ẩm 58-60%, điều chỉnh ở độ pH thích hợp ; sau khi
khử trùng ở 1-1,5 atm trong 45-60 phút, trải mỏng với độ dày 2-2,5 cm vào
các khay.

Thời gian nuôi cấy: 36-60h, tùy thuộc vào chủng giống
Ưu điểm:
- Nồng độ và hoạt tính enzyme cao.
- Chế phẩm dễ sấy khơ, ít bị giảm hoạt tính, dễ vận chuyển và sử dụng.
- Khơng cần các thiết bị phức tạp, tiêu thụ năng lượng ít nên thích hợp với
nhiều vùng sản xuất.
- Trong q trình ni cấy nếu bị tạp nhiễm thì chỉ cần loại bỏ cục bộ từng
phần
Nhược điểm:
- Cần mặt bằng lớn và chi phí lao động cao
- Khó khăn trong cơ giới hố trong sản xuất

d. Phương pháp tách và làm sạch chế phẩm enzyme
Tách từ môi trường rắn (nuôi cấy bề mặt)
Nghiền nhỏ → chiết tách → lọc → kết tủa → lọc ép → sấy khô
→ pha trộn → thành phẩm.
 Tách enzyme : khuếch tán bằng nước hay dung dịch NaCl 1%.
Ngâm môi trường trong dung dịch (lượng dung dịch cao gấp 3 lần)/30
phút sau đó đem lọc, nhiệt độ cần 25-28oC Chiết được 90-95%
enzyme, khơng có tạp chất hồ tan. Dịch thu được có mầu nâu xẫm
chứa 10-15% chất khô sẽ được bổ sung 0,1% Nabenzoat và làm lạnh
ngay xuống 10-12oC để bảo quản.
Dịch chiết có thể cơ đặc tới 50-55% chất khơ hồ tanđưa vào
máy sấy phun chế phẩm dạng bột.

 Kết tủa:
- Phương pháp kết tủa enzyme bằng dung môi hữu cơ (rượu, axeton...)
- Phương pháp kết tủa bằng muối trung tính: dùng (NH4)2SO4 vì tan
tốt trong nước và khơng ảnh hưởng hoạt tính enzyme.

Câu hỏi ơn tập

Tách từ dịch ni cấy chìm
• Lọc dịch ni cấy sẽ thu được dung dịch chứa 1-3% chất khô, Dịch lọc
cần cơ để giảm thể tích 4-10 lần trong chân khơng ở 25-30oC rồi sau đó
chiết tách enzyme như các phương pháp trên.
• Để cơ đặc và phun sấy ngồi việc sử dụng phương pháp cơ chân khơng
cịn có thể dùng phương pháp hấp thụ qua nhựa trao đổi ion hoặc các
chất có hoạt tính bề mặt sau đó lại tiến hành phản hấp phụ. Ví dụ: Dịch
chứa -amylase của nấm mốc, vi khuẩn có thể được hấp phụ lại bằng
tinh bột khoai tây hoặc ngô đã xử lý sơ bộ bằng nhiệt (các enzyme khác
không được hấp phụ). Tinh bột hấp phụ được sấy khô.

e. Tinh sạch enzyme
Enzyme thô sẽ được tinh sạch bằng 3 phương pháp: Phương pháp
kết tinh; Phương pháp điện di và Phương pháp sắc ký (Sắc ký lọc gel;
Sắc ký trao đổi ion và Sắc kí ái lực)

1.
2.
3.
4.
5.
6.
7.
8.
9.
10.
11.
12.

13.
14.
15.
16.

Vì sao VSV được ứng dụng rộng rãi trong sản xuất sinh khối và các sản phẩm trao đổi
chất?
Sinh khối vi sinh vật là gì? Ưu và nhược điểm của sinh khối vi sinh vật? Ứng dụng của
sinh khối VSV trong thực tiễn sản xuất và đời sống?
Phân biệt phương pháp lên men chìm và lên men bề mặt. Cho biết ứng dụng thực tiễn
của hai phương pháp này?
Phương pháp lên men chìm là gì? Ưu nhược điểm và ứng dụng trong sản xuất?
Phương pháp lên men bề mặt là gì? Ưu, nhược điểm và ứng dụng trong sản xuất
Thế nào là nuôi cấy liên tục, bán liên tục và nuôi cấy mẻ? Ưu, nhược điểm và ứng dụng
của các phương thức nuôi cấy này trong sản xuất?
Lên men cơng nghiệp là gì? có đặc điểm gì khác với lên men truyền thống? Cho ví dụ cụ
thể
Trình bày phương pháp sản xuất sinh khối nấm men? Ứng dụng của sinh khối nấm men
trong chăn nuôi và đời sống? Cho ví dụ
Trình bày phương pháp sản xuất sinh khối tảo, vi khuẩn lam? Ứng dụng sinh khối
tảo,Vk lam trong chăn ni và đời sống? Cho ví dụ
Trình bày phương pháp sản xuất sinh khối vi khuẩn lactic? Ứng dụng sinh khối VK
lactic trong chăn nuôi, trong đời sống? Cho ví dụ cụ thể
Trình bày tóm tắt quy trình kỹ thuật chung trong sản xuất enzyme từ vi sinh
vật?
Cho biết vi sinh vật được lựa chọn làm giống để sản xuất sinh khối, sản xuất
enzyme cần phải đạt các tiêu chuẩn gì?

10