Tài liệu Tuyển chọn chủng bacillus đa hoạt tính trong sản xuất phân bón vi sinh vật chức năng cho cây khoai tây doc

TUYN CHN CHNG Bacillus A HOT TNH
TRONG SN XUT PHN BểN VI SINH VT CHC NNG
CHO CY KHOAI TY
o Vn Thụng, Nguyn Thu H,
Phm Vn Ton, Phm Thu Thy
SUMMARY
Selection of bacillus has multi bioactivity using production functional biofertilizer for potato
Selection Bacillus has multi bioactivity will play an important role in the production and application
of functional biofertilizer. This paper showed that Bacillus B16 was selected. It can be antagonize
bacterial wilt caused by Ralstonia solanacerum and produce plant growth promoting substance
(IAA). By colony characteristic, cell morphology, and sequencing of DNA fragment of 16S rRNA
gene the B16 strain was determined as Bacillus subtilis. According to European Community,
species are selected have high biosafety and they are permission to apply in common. The Bacillus
subtilis B16 will be continuous research to apply for production of functional biofertilizer.
Keywords: Bacillus subtilis, Ralstonia solanacerum, bacterial wilt, antagonize, potato.
I. ĐặT VấN Đề
Khoai tõy l cõy lng thc, cõy thc
phNm cú giỏ tr. nhiu nc thuc chõu
u, chõu M, khoai tõy c coi l mt loi
lng thc chớnh sau lỳa mỡ, ngụ. Din tớch
trng khoai tõy Vit Nam cú khong
35.000 - 37.000 ha v sn lng t 420.000
- 450.000 tn. Mt trong nhng nguyờn nhõn
lm gim nng sut, cht lng khoai tõy l
bnh hộo xanh do vi khuNn Ralstonia
solanacearum gõy nờn. Tuy nhiờn, cho n
nay cha cú bin phỏp hu hiu no cú th
ngn chn v phũng tr bnh ny.
Nghiờn cu trc õy cho thy nhiu
loi thuc chi Bacillus cú nhiu hot tớnh
sinh hc nh c ch vi sinh vt gõy bnh v

sinh tng hp hot cht kớch thớch sinh
trng thc vt.
Bi bỏo trỡnh by kt qu nghiờn cu
tuyn chn chng vi khuNn Bacillus sn
xut phõn bún sinh hc cho khoai tõy cú
kh nng hn ch bnh hộo xanh vi khuNn
II. VậT LIệU Và PHƯƠNG PHáP NGHIÊN CứU
1. Vt liu nghiờn cu
- Chng vi sinh vt: Gm 15 chng
Bacillus v 01 chng Ralstonia solanacearum
(gõy bnh hộo xanh cõy khoai tõy, ký hiu
VKHX) do Qu gen Vi sinh vt trng trt -
Vin Th nhng Nụng hoỏ cung cp.
- Ging khoai tõy: Ging khoai tõy
Solana, l ging mn cm vi bnh hộo
xanh vi khuNn do Trung tõm nghiờn cu cõy
cú c - Vin Cõy lng thc v Cõy thc
phNm cung cp.
2. Phng phỏp nghiờn cu
- Xỏc nh c im hỡnh thỏi khuNn
lc, t bo ca chng vi sinh vt bng cỏc
phng phỏp nghiờn cu vi sinh vt hc
thụng dng.
- Xỏc nh mt vi sinh vt theo
phng phỏp nuụi cy trờn mụi trng
thch a theo TCVN 4884 - 2005.
- Xỏc nh kh nng c ch vi khuNn
gõy bnh hộo xanh bng phng phỏp
khuych tỏn trờn mụi trng thch theo 10
TCN 714 - 2006.

- Xác nh kh năng sinh tng hp IAA
thô theo phương pháp Salkowsky ci tin:
Xác nh hàm lưng IAA to ra trong môi
trưng nuôi cy có b sung 0,1%
triptophan; so màu trên máy quang ph 
bưc sóng 530 nm vi  th IAA chuNn.
- Xác nh tên và mc  an toàn sinh
hc ca các chng Bacillus bng phương
pháp phân loi sinh hc phân t, da trên
cơ s gii trình t gen 16s ARN ribosome,
so sánh vi các trình t có sn trong ngân
hàng gen quc t EMBL bng phương pháp
FASTA 33 và xây dng cây phát sinh
chng loi. Tên vi sinh vt ưc xác nh
vi xác xut tương ng cao nht.
- Thí nghim ánh giá hot tính i kháng
vi khuNn gây bnh héo xanh vi khuNn trên cây
khoai tây: t trng cây thí nghim là loi t
phù sa sông Hng ã ưc kh trùng. Thí
nghim ưc trng trong nhà lưi, b trí ngu
nhiên, 3 ln nhc li, 18 cây/ln nhc.
Công thức thí nghiệm:
CT1: Nhim VKHX (10
8
CFU/c ging).
CT2: Nhim B05 và VKHX (10
8
CFU/c ging, t l nhim 1:1).
CT3: Nhim B08 và VKHX (10
8

CFU/c ging, t l nhim 1:1).
CT4: Nhim B16 và VKHX (10
8
CFU/c ging, t l nhim 1:1).
CT5: Nhim B18 và VKHX (10
8
CFU/c ging, t l nhim 1:1).
Ch tiêu theo dõi: T l cây nhim bnh
(%) sau trng 30 ngày.
- Thí nghim ánh giá nh hưng ca
Bacillus n sinh trưng ca cây khoai tây:
t trng cây thí nghim là loi t phù sa
sông Hng ã ưc kh trùng. Thí nghim
ưc trng trong nhà lưi, b trí ngu
nhiên, 3 ln nhc li, 10 cây/ln nhc.
Công thc thí nghim:
CT1: i chng (không nhim vi sinh
vt).
CT2: Nhim Bacillus (10
7
CFU/c ging).
Ch tiêu theo dõi: Chiu cao cây, trng
lưng tươi thân lá, trng lưng khô thân lá
ca cây khoai tây sau trng 30 ngày.
III. KÕT QU¶ Vµ TH¶O LUËN
1. Tuyển chọn chủng Bacillus
T các chng Bacillus do ngun gen vi
sinh vt nông nghip ã xác nh hot tính
i kháng vi sinh vt gây bnh héo xanh vi
khuNn i vi cây khoai tây và hot tính

sinh tng hp hot cht kích thích sinh
trưng thc vt (IAA). Kt qu ưc tp
hp ti bng 1.
Bảng 1. Hoạt tính sinh học của các chủng Bacillus
TT
Ký hiệu chủng
Bacillus
Khả năng đối kháng VK gây bệnh héo xanh
(Đường kính vòng ức chế vi khuẩn D - d, mm)

Khả năng sinh tổng hợp IAA thô
(Hàm lượng IAA thô, µ
µµ
µg/ml)
1 B01 - -
2 B03.2 6 71
3 B05 15 185
4 B06 3 49
5 B07 - 157
6 B08 15 186
7 B09 6 <10
8 B10 - 257
9 B11 - -
10 B12 - -
11 B13.1 - 14
12 B13.2 - 71
13 B15 - 22
14 B16 22 133
15 B18 15 263
Ghi chú: “ - ” Không có hot tính

Kt qu bng 1 cho thy:
- 7/15 chng Bacillus nghiên cu có hot
tính i kháng vi khuNn gây bnh héo xanh
khoai tây. Trong ó bn chng có ưng kính
c ch vi khuNn gây bnh héo xanh trên 15
mm (B18, B16, B08 và B05); c bit chng
B16 có ưng kính c ch vi khuNn gây bnh
héo xanh cao nht (t 22 mm).
- 12/15 chng Bacillus nghiên cu có
hot tính sinh tng hp IAA. Trong ó 5
chng có hàm lưng IAA hình thành t
trên 100 µg/ml (B18, B16, B10, B08, B07
và B05).
- T kt qu trên, 4 chng B18, B16,
B08 và B05 ã ưc la chn cho các
nghiên cu tip theo.
Vi mc ính s dng chng Bacillus
trong kim soát bnh héo xanh vi khuNn i
vi cây khoai tây, tip tc ánh giá hot
tính i kháng vi khuNn gây bnh héo xanh
ca các chng Bacillus la chn trên cây
trng. Kt qu ưc th hin trong bng 2.
Bảng 2. Khả năng đối kháng VKHX của các chủng Bacillus tuyển chọn trên cây khoai tây
Chỉ tiêu theo dõi

Công thức
Cây bị bệnh
(%)
Cây bị bệnh so với đối
chứng (%)

Mức độ hoạt tính đối
kháng
CT1 (ĐC nhiễm VKHX) 66,6 - -
CT2 (B05 + VKHX) 25,7 38,6 Khá
CT3 (B08 + VKHX) 28,9 43,4 Khá
CT4 (B16 + VKHX) 16,7 25,1 Cao
CT5 (B18 + VKHX) 20,5 30,8 Khá

Kt qu bng 2 cho thy, 4 chng
Bacillus nghiên cu u có kh năng c ch
VKHX, t l cây b bnh so vi i chng
t 25,1 n 38,6 %. Da theo 10 TCN 714 -
2006, chng B16 có mc  hot tính i
kháng cao (t l cây b bnh so vi i
chng < 30 %).
Da vào kt quá ánh giá hot tính i
kháng VKHX cây khoai tây ca các chng
Bacillus trong iu kin phòng thí nghim
và trên cây trng, ã tuyn chn ưc
chng B16 có hot tính i kháng VKHX
cây khoai tây cao. Ngoài ra, chng B16 còn
có hot tính sinh tng hp hot cht kích
thích sinh trưng thc vt. Tính a chc
năng ca chng B16 có ý nghĩa trong vic
nghiên cu s dng  sn xut phân bón vi
sinh vt chc năng cho cây khoai tây.
2. Xác định tên, mức độ an toàn sinh
học của chủng B16
2.1. Phân loại dựa trên đặc điểm
hình thái khuẩn lạc và tế bào

Bảng 3. Đặc điểm hình thái khun lạc, tế
bào của chủng B16
Đặc điểm Chủng B16
Gram (+)
Đặc điểm khuẩn
lạc
Dạng mép răng cưa, bẹt, hơi
nhăn, trắng đục, kích thước
khuẩn lạc 1,2 - 1,5 cm
Đặc điểm tế bào Dạng hình que, bào tử hình elip
Khả năng di động Chuyển động chậm
Da vào c im khuNn lc và t bào
cho thy chng B16 có nhiu c im
ging Bacillus subtilis.
2.2. Phân loại dựa trên giải trình tự đoạn ADN 16S riboxom
Kt qu gii trình t on 16S ADN riboxom ca chng B16 có 99,3% tương ng vi
Bacillus subtilis. Trình t nucleotid on ADN 16S ribosome ca chng B16 như sau:


Hình 1. Cây phát sinh chủng loại được hình thành trên cơ sở so sánh trình tự nucleotid
đoạn AD 16S ribosome của chủng B16 với trình tự nucleotid đoạn AD 16S ribosome
của Bacillus subtilis phân lập ở các nước khác nhau trên thế giới. DE: CHLB Đức; KR:
Hàn Quốc; QT: Bacillus subtilis chủng Quốc tế, được các nước hợp tác giải mã toàn bộ
genom; JP: hật Bản. Độ an toàn sinh học của chủng Bacillus subtilic.
T¹p chÝ khoa häc vµ c«ng nghÖ n«ng nghiÖp ViÖt Nam
5
2.3. Độ an toàn sinh học của chủng Bacillus subtilis
 an toàn sinh hc ca các chng vi sinh vt s dng trong i sng có ý nghĩa c bit quan
trng. Theo hưng dn s 90/679/EWG ngày 26 thàng 11 năm 1990 ca Cng ng châu Âu v an
toàn sinh hc, nhóm tác nhân sinh hc “Vi khuNn” ưc phân làm 4 cp  an toàn, trong ó ch

các vi khuNn  cp  1 và 2 ưc ng dng trong sn xut  iu kin bình thưng.
- Cp  1 (Risiko gruppe 1) là các vi khuNn không th gây bt c mt nguy him nào i
vi ngưi và ng vt
- Cp  2 (Risiko gruppe 2) là các vi khuNn có th gây bnh i vi ngưi, ng vt  mc
 thp, không có kh năng lan truyn và có th phòng, chng và loi tr d dàng trong iu kin
bình thưng.
- Cp  3 (Risiko gruppe 3) là các vi khuNn có nguy cơ gây bnh nng i vi ngưi, ng
vt và có kh năng lan truyn rng, song vn có th phòng chng và loi tr ưc.
- Cp  4 (Risiko gruppe 4) là các vi khuNn có th gây bnh nng i vi ngưi, ng vt,
có nguy cơ ln v mc  lan truyn rng và không th phòng, chng hoc loi tr.
Kt qu so sánh vi danh mc các vi khuNn an toàn ca CHLB c và Cng ng Châu Âu
cho thy chng Bacillus subtilis B16 thuc nhóm vi khuNn có  an toàn cao (cp  1). Như
vy, chng B16 la chn là chng vi sinh vt bo m an toàn sinh hc; có th s dng trong sn
xut phân bón vi sinh vt.
3. Đánh giá ảnh hưởng chủng B16 đến sinh trưởng và phát triển của cây khoai tây
Kt qu ánh giá nh hưng ca chng B16 n sinh trưng ca cây khoai tây sau 30 ngày
trng ưc th hin trong bng 4.
Bảng 4. Ảnh hưởng của chủng B16 đến sinh trưởng và phát triển của cây khoai tây
Công thức Chiều cao cây (cm)
Trọng lượng tươi thân lá
(g)
Trọng lượng khô thân lá
(g)
CT1 (ĐC) 39,70 40,80 3,92
CT2
(nhiễm B16)
43,20 44,95 4,43
CV%
LSD
0,05

4,10
3,867
4,20
4,097
4,40
0,419
Kt qu bng 4 cho thy,  công thc nhim B16 (CT 2), chiu cao cây, trng lưng tươi và
trng lưng khô thân lá u cao hơn so vi i chng. iu này cho thy, chng B16 có nh
hưng tích cc n sinh trưng và phát trin ca cây khoai tây.
Như vy, t các kt qu trên cho thy chng Bacillus subtilis B16 có kh năng kim soát
bnh héo xanh vi khuNn và có nh hưng tích cc n sinh trưng, phát trin ca cây khoai tây.
Chng Bacillus subtilis B16 s ưc gii thiu cho sn xut phân bón vi sinh vt chc năng cho
cây khoai tây.
IV. KÕT LUËN
- T 15 chng Bacillus nghiên cu ã tuyn chn ưc chng Bacillus subtilis B16 có hot
tính i kháng vi khuNn gây bnh héo xanh cho cây khoai tây cao, có kh năng sinh tng hp
cht kích thích sinh trưng thc vt (IAA); ng thi là chng vi sinh vt có mc  an toàn sinh
T¹p chÝ khoa häc vµ c«ng nghÖ n«ng nghiÖp ViÖt Nam
6
hc cao (cp  1). ây là chng vi sinh vt có giá tr s dng trong sn xut phân bón vi sinh
vt chc năng.
- Th nghim trên cây khoai tây cho thy, chng Bacillus subtilis B16 có kh năng hn ch
bnh héo xanh vi khuNn, tăng kh năng sinh trưng và phát trin i vi cây khoai tây.
TÀI LIỆU THAM KHẢO
1. 10 TCN 714:2006 Phương pháp ánh giá hot tính i kháng ca vi sinh vt có kh năng i
kháng vi khuNn Ralstonia solanacearum gây bnh héo xanh cây trng cn.
2. Bais HP, Fall R and Vivanco JM (2004), Biocontrol of Bacillus subtilis against infection of
Arabidopsis roots by Pseudomonas syringae is facilitated by biofilm formation and surfactin
production. Plant Physiol. 134, 307 - 319.
3. Borriss R (2002), Extracellular phytase activity of Bacillus amyloliquefaciens FZB45

contributes to its plant - growth - promoting effect. Microbiol. 148, 2097 - 2109.
4. Danielsson J, Reva O and Meijer J (2007), Protection of oilseed rape (Brassica napus)
toward fungal pathogens by strains of plant - associated Bacillus amyloliquefaciens. Microb.
Ecol. 54, 134 - 140.
5. Idriss EE, Makarewicz O, Farouk A, Rosner K, Greiner R, Bochow H, Richter T and
Jacobsen B, Zidack N and Larson B (2004), The role of Bacillus based biological control
agents in integrated pest management systems: Plant diseases. Phytopathology 94, 1272 -
1275.
Người phản biện
GS. TSKH. Trần Duy Quý