Tiểu luận phát hiện và đếm coliforms trong nước uống, các phương pháp hiện thời và phương pháp tiếp cận nổi bật

BỘ CÔNG THƯƠNG
TRƯỜNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHIỆP THỰC PHẨM
THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH
KHOA CƠNG NGHỆ THỰC PHẨM


Mơn : Phân Tích Vi Sinh Thực Phẩm
Đề Tài:

Detection And Enumeration Of Coliforms In Drinking
Water: Current Methods And Emerging Approaches
(Phát Hiện Và Đếm Coliforms Trong Nước Uống: Các
Phương Pháp Hiện Thời Và Phương Pháp Tiếp Cận Nổi
Bậc)
GVGD:

TP.HCM,THÁNG 11-2021


Phân Tích Vi Sinh Thực Phẩm

GVGD: Phan Thị Kim Liên

Trang 2


Phân Tích Vi Sinh Thực Phẩm

MỤC LỤC
TĨM TẮT.................................................................................................................................. 4
1. Giới thiệu............................................................................................................................ 5

1.1. Coliforms là gì?................................................................................................................... 7
2. Mục tiêu............................................................................................................................ 10
3. Phương pháp cổ điển.........................................................................................................10
3.1. Kỹ thuật lên men nhiều ống...............................................................................................10
3.2. Kỹ thuật lọc màng.............................................................................................................12
4. Phương pháp enzyme........................................................................................................15
4.1 Nguyên tắc chung............................................................................................................... 15
4.2. Kỹ thuật có/ khơng có sự hiện diện của vi khuẩn và đếm bằng các kỹ thuật
nhiều ống sử dụng phương pháp enzyme.................................................................................17
4.3. MF kỹ thuật liên hợp với phát hiện enzyme của vi khuẩn.................................................19
4.4. Xác định trực tiếp hoạt tính của enzyme bằng fluorimetry................................................20
4.5. Phát hiện vi khuẩn bằng phương pháp sử dụng enzyme đếm tế bào pha rắn.....................21
4.6. Kết luận về phương pháp enzyme.....................................................................................22
5. Phương pháp phân tử........................................................................................................23
5.1. Phương pháp miễn dịch.....................................................................................................23
5.2. Phương pháp dựa trên axit nucleic....................................................................................27
6. Kết luận............................................................................................................................. 42
LỜI CẢM ƠN.......................................................................................................................... 45

GVGD: Phan Thị Kim Liên

Trang 3


Phân Tích Vi Sinh Thực Phẩm

TĨM TẮT
Nhóm coliform được sử dụng rộng rãi như một chỉ tiêu của chất lượng nước
và về phương diện lịch sử đã dẫn đến khái niệm bảo vệ sức khỏe cộng đồng. Mục
đích của việc xem xét này là để kiểm tra phương pháp hiện đang được sử dụng hoặc

có thể được đề xuất cho việc kiểm tra định lượng coliforms trong nước uống.
Trên thực tế, nhu cầu về các thử nghiệm nhanh hơn, nhạy hơn và cụ thể hơn
là điều cần thiết trong ngành công nghiệp nước. Các kỹ thuật thông thường và được
thừa nhận rộng rãi, đã được thảo luận, như là các phương pháp nổi bậc từ sự phát
triển của các nghiên cứu gần đây.
Phương pháp truyền thống đã được chấp nhận để phát hiện coliform bao gồm
kỹ thuật lên men nhiều ống (MTF) và kỹ thuật màng lọc (MF) sử dụng môi trường
nuôi cấy cụ thể và điều kiện ủ khác nhau. Những phương pháp này vẫn còn những
hạn chế, chẳng hạn như thời gian ủ bệnh, sự can thiệp sinh vật đối kháng, thiếu tính
cụ thể và việc phát hiện kém đối với các vi sinh vật phát triển chậm hoặc có thể phát
triển và tồn tại mà khơng ni cấy. Ngày nay, kỹ thuật màng lọc đơn giản và không
tốn kém là phương pháp được sử dụng rộng rãi nhất cho việc định lượng thông
thường coliforms trong nước uống.
Việc phát hiện coliforms dựa trên hoạt tính enzyme đặc trưng đã cải thiện
được độ nhạy của các phương pháp này. Các enzyme β-D galactosidase và β-D
glucuronidase được sử dụng rộng rãi để phát hiện và định lượng coliforms tổng và
Escherichia coli, tương ứng. Nhiều chất chromogenic và fluorogenic được dùng để
phát hiện cụ thể hoạt tính của các enzyme này và các thử nghiệm mang tính thương
mại khác nhau được dựa trên các chất có sẵn này. Nhiều sự so sánh đã cho thấy
những thử nghiệm này có thể là một thay thế thích hợp cho các kỹ thuật cổ điển.
Tuy nhiên, phương pháp này thì đắt hơn, và thời gian ủ, mặc dù giảm, nhưng vẫn
còn quá dài để cho kết quả cùng ngày.
Các cơng cụ phân tích tinh vi hơn như kỹ thuật đếm tế bào pha rắn có thể
được tận dụng để làm giảm thời gian cần thiết để phát hiện các hoạt động của

GVGD: Phan Thị Kim Liên

Trang 4

Phân Tích Vi Sinh Thực Phẩm

enzyme ở vi khuẩn, với một ngưỡng phát hiện thấp. Phát hiện coliforms bằng
phương pháp phân tử này cũng được đề cập, vì các phương pháp này cho những
phát hiện rất cụ thể và nhanh chóng mà khơng cần ni cấy.
Ba phương pháp phân tử được đánh giá ở đây: các kỹ thuật miễn dịch, phản
ứng chuỗi polymerase (PCR) và lai tại chỗ (ISH). Trong cách phương pháp miễn
dịch, các kháng thể khác nhau chống lại vi khuẩn coliform được tạo ra, nhưng việc
áp dụng kỹ thuật này thường cho thấy kháng thể mang tính đặc hiệu thấp. PCR có
thể được sử dụng để phát hiện vi khuẩn coliform bằng phương pháp khuếch đại tín
hiệu: trình tự DNA mã hóa cho các gen lacZ (gen b-galactosidase) và gen uidA (b –
D gen glucuronidase) đã được sử dụng để phát hiện tổng coliforms và E. coli, tương
ứng. Tuy nhiên, việc định lượng với PCR vẫn thiếu chính xác và địi hỏi phải làm
việc trong phịng thí nghiệm chuyên dụng. Kỹ thuật FISH liên quan đến việc sử
dụng các đầu dị oligonucleotide để phát hiện các trình tự bổ sung bên trong tế bào
cụ thể. Đầu dò oligonucleotide được thiết kế đặc biệt cho phạm vi của các phân tử
RNA 16S của Enterobacteriaceae có thể được sử dụng để kiểm soát chất lượng vi
sinh của các mẫu nước uống. FISH nên là một kỹ thuật cần quan tâm có thể thay thế
cho các phương pháp ni cấy thơng thường để xác định nhóm coliform trong nước
uống, vì nó cung cấp các dữ liệu định lượng trong một khoảng thời gian khá ngắn (6
– 8 tiếng), nhưng vẫn đòi hỏi nỗ lực nghiên cứu.

1. Giới Thiệu
Việc bảo vệ sức khỏe cơng đồng và mơi trường địi hỏi nước uống phải an
tồn, điều đó có nghĩa là khơng chứa VSV gây bệnh. Giữa các VSV phân tán trong
các nguồn nước, VSV gây bệnh ở ruột là những loại dễ bắt gặp nhất. Như một hệ
quả, các nguồn ô nhiễm phân trong nước dành cho hoạt động con người phải được
kiểm soát chặt chẽ. Tác nhân gây bệnh đường ruột, như Escherischia coli O157: H7,
thường hiện diện tại nồng độ rất thấp trong môi trường nước trong một hệ vi thực
vật đa dạng. Các phương pháp phức tạp được đòi hỏi để phát hiện ra chúng, và

những phương pháp này thì vơ cùng tốn thời gian. Hầu hết coliform hiện diện với
số lượng lớn trong hệ thực vật đường ruột của người và động vật máu nóng khác, và

GVGD: Phan Thị Kim Liên

Trang 5


Phân Tích Vi Sinh Thực Phẩm

vì thế nên chúng được tìm thấy trong phân thải. Như một hệ quả, coliforms, được
phát hiện ở nồng độ cao hơn vi khuẩn gây bệnh, được sử dụng như một chỉ số thể
hiện sự hiện diện tiềm ẩn của tác nhân gây bệnh đường ruột trong mơi trường nước.
Việc sử dụng các nhóm coliform, và cụ thể hơn là E. coli, như một chỉ số vi sinh
của chất lượng nước có từ sự phân lập đầu tiên của các vi sinh vật này từ phân vào
cuối thế kỷ thứ 19. Coliforms cũng thường được tìm thấy trong mơi trường tự nhiên
đa dạng, như một vài lồi trong số đó có nguồn gốc từ đất, nhưng nước uống không
phải là một môi trường tự nhiên của chúng. Sự hiện diện của chúng trong nước
uống ít nhất phải được coi là một mối đe dọa hoặc dấu hiệu của vi sinh vật về sự
suy thoái của chất lượng nước. Số mẫu coliform tổng dương tính trong một nguồn
nước đã được xử lý mà thường khơng có coliform thì có thể là chỉ ra việc xử lý
khơng có hiệu quả, mất mát của chất khử trùng, bị chọc thủng (McFeters và các
cộng sự, 1986), sự xâm nhập của nước ô nhiễm vào các nguồn cung cấp nước sinh
hoạt (Geldreich và các cộng sự, 1992; Clark và các cộng sự, 1996) hoặc các vấn đề
tái sử dụng (LeChevallier, 1990) trong hệ thống phân phối, và, như một hệ quả,
khơng được cho phép.
Việc sử dụng các nhóm coliform như một chỉ số về việc có thể hiện diện các
tác nhân gây bệnh đường ruột trong các hệ thống thủy sinh là một đề tài tranh luận
trong nhiều năm. Nhiều tác giả đã báo cáo dịch bệnh qua đường nước trong cuộc
họp quy định coliform trong nước (Payment và các cộng sự, năm 1991; Moore và

các cộng sự, 1994; MacKenzie và các cộng sự, 1994; Gofti và các cộng sự, 1999).
Tuy nhiên, mục đích của bài viết này khơng phải là để thảo luận về các khái niệm
chỉ số, mà là để xác định phương pháp hiện đang được sử dụng hoặc có thể được đề
nghị cho việc theo dõi coliforms trong nước uống. Sự cần thiết của các kiểm
nghiệm nhanh và nhạy hơn là không thay đổi trong ngành cơng nghiệp nước, với
mục đích là theo dõi trực tuyến liên tục của các nhà máy xử lý nước thải.
1.1. Coliforms là gì?
Các nhóm coliform bao gồm một sự đa dạng phong phú về thuật ngữ chi và
lồi, dù có hoặc không thuộc họ Enterobacteriaceae. Hầu hết các định nghĩa

GVGD: Phan Thị Kim Liên

Trang 6


Phân Tích Vi Sinh Thực Phẩm

coliforms là chủ yếu dựa trên các đặc tính sinh hóa thơng thường. Trong các phương
pháp tiêu chuẩn cho việc kiểm tra nước và nước thải (Part 9221 và 9222; APHA và
các cộng sự, 1998),các thành viên nhóm coliform được mơ tả như sau:
1. Tất cả đều kỵ khí và hiếu khí tuỳ ý, gram -, khơng bào tử, vi khuẩn hình
que và lên men lactose sinh khí và tạo axit trong vịng 48h ở 35oC (Kỹ thuật lên
men nhiều ống; Phần 3.1) hoặc
2. Tất cả hiếu khí và kỵ khí nhiều tuỳ ý, gram âm, khơng bào tử, vi khuẩn
hình que phát triển thành một khuẩn lạc màu đỏ ánh kim trong vòng 24h ở 35 oC trên
một mơi trường loại Endo có chứa lactose (màng lọc kỹ thuật; Phần 3.2).
Định nghĩa các thành viên của nhóm coliform gần đây đã được mở rộng bao
gồm các đặc điểm khác, chẳng hạn như phản ứng β-D-galactosidase dương tính
(Part 9223;. APHA et al, 1998) (kiểm tra enzyme nền, phần 4.2). Việc tìm kiếm các
vi sinh vật β-galactosidase dương tính và đệm β-galactoside-dương tính cũng cho

phép một bước xác nhận lên men lactose, khi đó kỹ thuật lên men nhiều ống được
sử dụng. Các thử nghiệm cytochrome oxidase cũng được sử dụng như là một thử
nghiệm khẳng định để loại bỏ một số vi khuẩn của chi Aeromonas hoặc
Pseudomonas mà có thể lên men lactose.
Định nghĩa của vi khuẩn coliform hơi khác tùy thuộc vào quốc gia hoặc các
tổ chức chịu trách nhiệm về các quy định giám sát vi sinh. Tại Canada, định nghĩa
giống như ở Mỹ, và khác với một số nước châu Âu. Ví dụ, Hiệp hội Tiêu chuẩn
Pháp (NFT90-413 và NFT90-414; AFNOR, 1990), nó có thể được xem là một mơ
hình đại diện cho luật pháp châu Âu, xác định coliforms tổng (TC) như:
 Hình que, khơng bào tử, gram âm, oxidase âm tính, hiếu khí hoặc kỵ
khí tuỳ ý. Vi khuẩn có thể phát triển trong sự hiện diện của muối mật hoặc
chất có hoạt tính bề mặt thay thế khác có tác dụng ức chế sự tăng trưởng
tương tự và lên men lactose sinh khí và sinh acid (hoặc aldehyde) trong vòng
48 giờ ở 37 ± 1oC.

GVGD: Phan Thị Kim Liên

Trang 7


Phân Tích Vi Sinh Thực Phẩm

AFNOR (1990) đi xa hơn bằng cách định nghĩa nhóm coliform khác, bao
gồm cả các coliform chịu nhiệt (còn gọi là coliforms phân, FC), và cụ thể hơn, E.
coli là:
 Coliforms chịu nhiệt có cùng đặc tính lên men như coliforms (TC),
nhưng nhiệt độ 44 ± 0,5oC.
 E. coli là một coliform chịu nhiệt, chỉ khác một vài điều, tạo indole từ
tryptophane tại nhiệt độ 44 ± 0.5oC, cho kết quả thử nghiệm methyl đỏ
dương tính, khơng thể tạo ra acetyl-methyl carbinol và khơng sử dụng citrate

làm nguồn carbon duy nhất của nó.
Việc sử dụng các nhóm coliform như một chỉ số ơ nhiễm phân phải phụ
thuộc vào các quy định nghiêm ngặt của chính phủ (Bảng 1). E. coli là coliforms
phổ biến nhất trong hệ thực vật đường ruột của động vật máu nóng động vật và sự
hiện diện của nó có thể liên quan chủ yếu đến ơ nhiễm phân. Do đó khơng được
phép có E. coli trong nước uống.
Cơ quan Bảo vệ Môi trường Hoa Kỳ (EPA) đã phê duyệt một số phương
pháp để phát hiện coliform: các kỹ thuật lên men nhiều ống, kỹ thuật màng lọc và
các thử nghiệm có mặt /khơng có mặt (bao gồm các thử nghiệm ONPG – MUG).
AFNOR (1990) đã phê duyệt kỹ thuật lên men nhiều ống và kỹ thuật màng lọc.
Các phương pháp này có những hạn chế, chẳng hạn như thời gian ủ, sự can
thiệp của sinh vật đối kháng, thiếu tính cụ thể ở các nhóm coliform và độ phát hiện
kém của đối với coliforms phát triển chậm hoặc bị tổn thương. Vì thế, tùy thuộc vào
hệ thống mơi trường, chỉ một phần nhỏ (0,1-15%) trong tổng số quần thể vi khuẩn
có thể được đếm bởi phương pháp nuôi cấy (Amann và các cộng sự, 1990). Tỷ lệ vi
khuẩn không nuôi cấy có thể bị ảnh hưởng bởi điều kiện khơng thuận lợi cho vi
khuẩn phát triển trong suốt q trình ni cấy hoặc bởi khả năng sống sót hoặc hoạt
động của chúng ở trạng thái không nuôi cấy (VBNC hoặc ABNC) (Roszak và
Colwell, 1987; Joux và Lebaron, 2000; Colwell và Grimes, 2000).

GVGD: Phan Thị Kim Liên

Trang 8


Phân Tích Vi Sinh Thực Phẩm

Bảng 1. Một số quy định chống nhiễm khuẩn hiện và hướng dẫn cho
nước uống

Coliform tổng

Yêu cầu giám sát

E.coli

Mật độ

Mẫu/tháng

0/100 ml (95%)
United

một mẫu liên tiếp từ 0/100
cùng vị trí khơng được (100%)

Statesa

ml

≈ 1/1000 sinh
vật

có coliform
0/100 ml (90%)
không nên chứa nhiều
Canada

b

hơn 10 CFU/100 ml

0/100

ml <5000

một mẫu liên tiếp từ (100%)

5000 – 9000

4 mẫu/ tháng
1/1000 sinh vật

cùng một vị trí khơng
được có coliform
Tổ chức y tế
thế giớic

0/100 ml (95%)

0/100

ml

(100%)

>9000

90 + (1/10000
sinh vật)

a. Cơ quan Bảo vệ Môi trường Hoa Kỳ năm 1990.
b Bộ y tế Canada, 1996.
c Tổ chức Y tế Thế giới, 1994.

2. Mục Tiêu
Vì nước uống là chế độ nghèo dinh dưỡng, các phương pháp nuôi cấy kém
nhạy trong việc phát hiện các tế bào vi khuẩn bị tổn thương và sắp chết có thể tạo ra
những hạn chế nghiêm trọng do việc đánh giá q thấp mức độ ơ nhiễm. Có tồn tại
các phương pháp khác mà có thể được sử dụng để phát hiện coliform, và là những
trạng thái khác nhau của sự phát triển và ứng dụng. Đánh giá này mô tả các nguyên

GVGD: Phan Thị Kim Liên

Trang 9


Phân Tích Vi Sinh Thực Phẩm

tắc và các cách thức thông thường của phương pháp cổ điển, cũng như một số các
phương pháp đổi mới và phương pháp tiếp cận mới nổi. Việc ứng dụng các phương
pháp khác nhau để phát hiện coliforms trong một môi trường nghèo chất dinh
dưỡng như nước uống cũng được đánh giá dựa trên những ưu điểm và nhược điểm
của chúng. Các tiêu chí như giới hạn phát hiện và độ nhạy của các phương pháp,
thời gian cần thiết để có được kết quả và các kinh phí của phịng thí nghiệm (bao
gồm cả kỹ năng, lao động và chi phí) cũng được thảo luận.

3. Phương Pháp Cổ Điển
3.1. Kỹ thuật lên men nhiều ống
Kỹ thuật để đếm coliforms bằng phương pháp lên men nhiều ống (MTF) đã

được sử dụng hơn 80 năm như là một phương pháp kiểm tra chất lượng nước.
Phương pháp này bao gồm việc cấy một loạt các ống với dung dịch pha
lỗng thập phân thích hợp của các mẫu nước. Tạo bọt khí, hình thành axit hoặc tăng
trưởng nhiều trong ống nghiệm sau 48 giờ ủ ở 35 oC thì có thể là phản ứng dương
tính. Cả mơi trường dịch thể lactose và lauryl tryptose đều có thể được sử dụng như
một môi trường nuôi cấy giả định, nhưng Seidler và các cộng sự (1981) và Evans và
các cộng sự (1981) đã can thiệp, với số lượng lớn vi khuẩn khơng phải là coliform,
thì sử dụng mơi trường dich lỏng lactose. Tất cả ống có phản ứng dương tính giả
định tiếp sau đó phải thực hiện một thử nghiệm khẳng định. Sự hình thành khí trong
các ống lên men chứa môi trường brilliant green lactose bile tại bất kỳ thời điểm
nào trong vòng 48 giờ ở 35oC tạo thành một thử nghiệm khẳng định dương tính.
Các thử nghiệm coliform phân (sử dụng một mơi trường canh EC) có thể được áp
dụng cho xác định colifom tổng (TC) mà cụ thể là FC (APHA và các cộng sự,
1998): việc tạo khí sau 24 giờ ủ ở 44,5 oC trong canh EC được coi là một kết quả
dương tính.
Các kết quả của kỹ thuật MTF được thể hiện trong điều khoản số lượng có
thể xảy ra nhất (MPN) về sự hiện diện của vi sinh vật. Con số này là một ước lượng
thống kê của trung bình số coliform trong mẫu. Hệ quả là, kỹ thuật này được đưa ra

GVGD: Phan Thị Kim Liên

Trang 10


Phân Tích Vi Sinh Thực Phẩm

để định lượng sơ bộ coliforms. Tuy nhiên, độ chính xác của việc ước lượng thì thấp
và phụ thuộc vào số ống dùng để phân tích: ví dụ, nếu chỉ 1 ml được xem xét trong
một mẫu chứa 1 coliform / ml, khoảng 37% trong các ống 1 ml có thể mong đợi dự
kiến sẽ mang lại kết quả âm tính vì các phân phối ngẫu nhiên của các vi khuẩn trong

mẫu. Nhưng, nếu năm ống, mỗi 1 ml mẫu, được sử dụng, một kết quả âm tính có
thể được dự kiến sẽ ít hơn 1% của thời gian (APHA và các cộng sự, 1998).
Nhiều yếu tố có thể ảnh hưởng đáng kể coliform đến phát hiện vi khuẩn bằng
MTF, đặc biệt là trong suốt giai đoạn giả định. Sự can thiệp của một lượng lớn vi
khuẩn không phải là coliform (Seidler et al, 1981; Evans và các cộng sự, 1981;
Means và Olson, 1981), cũng như bản chất ức chế của môi trường (McFeters và các
cộng sự, 1982), đã được xác định là yếu tố góp phần đánh giá thấp các coliform đa
dạng. Kỹ thuật MTF thiếu chính xác về định tính và định lượng. Thời gian cần thiết
để có được kết quả cao hơn so với các kỹ thuật khác.
Kỹ thuật màng lọc đã thay thế kỹ thuật MTF trong nhiều trường hợp cho việc
kiểm tra hệ thống nước uống. Tuy nhiên, kỹ thuật này vẫn cịn hữu ích, đặc biệt là
khi điều kiện không cho phép sử dụng các kỹ thuật lọc màng, chẳng hạn như các
loại nước đục hoặc có màu.
MTF là dễ thực hiện và có thể được thực hiện bởi một kỹ thuật viên được
đào tạo cơ bản về vi sinh, nhưng phương pháp này có thể trở nên rất dài dịng và
cần nhiều nhân cơng vì nhiều dung dịch pha loãng đã được xử lý cho mỗi mẫu
nước. Tuy nhiên, nó tương đối là khơng tốn kém, vì nó khơng địi hỏi thiết bị phịng
thí nghiệm phức tạp. Tuy nhiên, phương pháp này là cực kỳ tốn thời gian, đòi hỏi
48h cho kết quả giả định, và buộc phải có một giai đoạn ni cấy lại để khẳng định
mà có thể mất lên tới hơn 48h.
3.2. Kỹ thuật màng lọc
Các màng lọc kỹ thuật (MF) đã hoàn toàn được chấp nhận và đã được phê
duyệt như một thủ tục để theo dõi chất lượng vi sinh vật trong nước uống ở nhiều
quốc gia. Phương pháp này bao gồm lọc một mẫu nước trên một màng lọc vô trùng

GVGD: Phan Thị Kim Liên

Trang 11

Phân Tích Vi Sinh Thực Phẩm

với kích thước lỗ 0,45 mm mà vẫn giữ lại vi khuẩn, ủ màng lọc này trên môi trường
chọn lọc và đếm các khuẩn lạc điển hình trên các màng lọc.
Nhiều mơi trường và điều kiện ủ cho phương pháp MF được thử nghiệm cho
việc phục hồi tối ưu của coliformstừ mẫu nước (Grabow và du Preez, 1979; Rice và
các cộng sự, 1987). Trong đó, được sử dụng phổ biến cho phân tích nước uống là
loại môi trường m-Endo ở Bắc Mỹ (APHA và các cộng sự, 1998) và môi trường
Tergitol - TTC ở châu Âu (AFNOR, 1990). Vi khuẩn coliform hình thành khuẩn lạc
màu đỏ ánh kim trên một môi trường loại Endo - loại mơi trường có chứa lactose (ủ
trong 24 giờ ở 35oC đối với TC) hoặc khuẩn lạc màu vàng – cam trên môi trường
Tergitol-TTC (ủ trong 24 và 48 h ở 37 và 44 oC đối với TC và FC, tương ứng). Môi
trường nuôi cấy khác, chẳng hạn như thạch MacConkey và môi trường Teepol, đã
được sử dụng ở Nam Phi và Anh. Tuy nhiên, so sánh giữa các môi trường ni cấy
thì thạch m-Endo mang lại giá trị đếm được cao hơn thạch MacConkey hoặc thạch
Teepol (Grabow và du Preez, 1979). Để đếm các FC, APHA và các cộng sự (1998)
cho rằng màng lọc được ủ trên môi trường làm giàu lactose (m-FC) ở nhiệt độ
44,5oC trong 24 giờ. Bởi vì nhiệt độ ủ tăng cao và việc bổ sung thuốc thử muối acid
rosolic, vài khuẩn lạc không phải coliform phân phát triển trên các môi trường mFC (APHA và các cộng sự, 1998).
Việc đếm TC bằng cách lọc màng thì khơng hồn tồn thiết thực. Khi MF
được kết hợp với môi trường nuôi cấy m-Endo chứa lactose, các khuẩn lạc khơng
điển hình thì có màu đỏ sẫm, nhầy hoặc có nhân và khơng có ánh kim thỉnh thoảng
có thể xuất hiện. Khuẩn lạc khơng điển hình màu xanh, hồng, trắng hoặc khơng màu
thiếu ánh thì khơng được xem trong TC trong kỹ thuật này (APHA và các cộng sự,
1998). Hơn nữa, các khuẩn lạc điển hình với một độ óng ánh đơi khi được tạo ra bởi
vi khuẩn không phải là coliform và ngược lại, các khuẩn lạc khơng điển hình (màu
đỏ sẫm hoặc khuẩn lạc có nhân mà khơng có ánh kim) thường khơng phải là
coliforms. Do đó việc xác nhận Coliform có thể được chấp nhận cho cả hai loại
khuẩn lạc (APHA và các cộng sự, 1998).

GVGD: Phan Thị Kim Liên

Trang 12


Phân Tích Vi Sinh Thực Phẩm

Với việc chấp nhận MF như một kỹ thuật chọn lọc cho việc theo dõi nước
uống (APHA và các cộng sự, 1998; AFNOR, 1990), các câu hỏi liên quan đến việc
phát hiện coliform và tính chính xác của việc định lượng đã tăng lên. Sự hiện diện
của số lượng lớn vi khuẩn dị dưỡng nền làm giảm việc hồi phục của coliform trong
MF (Clark, 1980; Burlingame và các cộng sự, 1984). Các khuẩn lạc tập hợp quá lớn
trên các môi trường m-Endo đã gắn liền với việc làm giảm các khuẩn lạc coliform
tạo ra ánh kim (Hsu và Williams, 1982; Burlingame và các cộng sự, 1984).
Điều đáng quan tâm về MF là nó khơng có khả năng để phục hồi coliforms
bị căng thẳng hoặc bị tổn thương. Một số yếu tố hóa học và vật lý liên quan đến
việc xử lý nước uống, bao gồm việc khử trùng, có thể gây ra thương vong cho vi
khuẩn coliform, kết quả là một tế bào bị hư hỏng thì khơng thể hình thành một
khuẩn lạc trên mơi trường mang tính chọn lọc. Việc phơi sáng của vi khuẩn để tạo
ra sản phẩm như clo có thể dẫn đến tổn thương và tăng tính nhạy cảm với muối mật
hoặc các chất hoạt động bề mặt thay thế (sodium desoxycholate hoặc Tergitol 7)
chứa trong một số môi trường nuôi cấy chọn lọc. Một số cải tiến trong phương pháp
đã tăng độ phát hiện đối với vi khuẩn coliform bị tổn thương, bao gồm cả việc phát
triển các môi trường m-T7 đặc biệt dành cho việc phục hồi của coliforms bị tổn
thương trong nước uống (LeChevallier và các cộng sự, 1983). Đánh giá thường
xuyên về các mẫu nước uống (LeChevallier và các cộng sự, 1983; McFeters et al,
1986) và nước bề mặt. (McFeters và các cộng sự, 1986; Freier và Hartman, 1987)
cho thấy sự phục hồi coliform cao hơn trên môi trường m-T7 so với trên môi trường
m-Endo. Tuy nhiên, m-T7 có thể khơng hiệu quả bằng m-Endo khi các bộ phận bị
tổn thương khác chlorine có liên quan. Rice và các cộng sự (1987) đã đem lại sự

khác biệt khôn đáng kể trong coliform đã phục hồi trên m-T7 so với m-Endo LES từ
mẫu monochloraminated, và Adams và các cộng sự (1989) thấy rằng môi trường mT7 không tốt bằng môi trường m-Endo trong việc điều tra các tế bào E. coli và C.
freundii tiếp xúc với ozone.
Các tác giả khác đã gợi ý rằng việc khử trùng bằng clo ảnh hưởng đến các
chức năng khác nhau về hoạt tính của vi khuẩn coliform, như hoạt tính enzym

GVGD: Phan Thị Kim Liên

Trang 13


Phân Tích Vi Sinh Thực Phẩm

catalase (Calabrese và Bissonnette, 1990; Sartory, 1995). Vi khuẩn hoat động trao
đổi chất tạo ra hydrogen peroxide (H2O2), việc này thường nhanh chóng bị thối hóa
bởi catalase. Coliforms bị thương với hoạt tính của catalase giảm sẽ tích lũy chất
độc hydrogen peroxide, mà chúng thì cực kỳ nhạy. Calabrese và Bissonnette (1990)
báo cáo về sự tăng lên trong việc phục hồi coliform trên môi trường nuôi cấy mEndo và m-T7, cũng như sự gia tăng trong việc phục hồi E. coli trên m-FC khi các
môi trường nuôi cấy được bổ sung catalase, sodium pyruvate hoặc cả hai. Sartory
(1995) cho rằng sodium pyruvate nên được thêm vào ở nồng độ 0,01-0,1% cho bất
kỳ môi trường phát hiện coliform chuẩn nào vì sản phẩm này cho phép cải thiện
việc phục hồi của các coliform chịu áp lực chlorine.
Số lượng lớn môi trường nuôi cấy thay đổi trong sử dụng là một phản ánh
thực tế rằng khơng có môi trường thông dụng nào hiện nay tồn tại cho phép tối ưu
việc đếm các lồi coliform khác nhau có nguồn gốc từ các môi trường khác nhau và
hiện diện ở nhiều trạng thái sinh lý. Những lợi ích đáng kể của kỹ thuật MF nhiều
hơn là phương pháp MTF, việc kiểm tra các thề tích lớn của nước là khả thi, nhạy
hơn và độ tin cậy cao hơn. MF cũng là một điều tra định lượng mang tính tương đối
với việc định lượng sơ bộ các thông tin được ghi nhận bởi phương pháp MTF. MF
là một kỹ thuật hữu ích cho đa số các phịng thí nghiệm về chất lượng nước vì nó là

một phương pháp tương đối đơn giản để sử dụng. Nhiều mẫu có thể được xử lý
trong một ngày với các thiết bị phịng thí nghiệm bị hạn chế bằng một kỹ thuật với
các kỹ năng vi sinh cơ bản . Tuy nhiên, vì phương pháp này thì chưa đủ thiết thực,
một giai đoạn khẳng định là cần thiết, mà nó có thể mất hơn 24 h sau giai đoạn ủ
đầu tiên trên môi trường chọn lọc. Đây là lý do tại sao việc cải tiến phương pháp
MF dựa trên các thuộc tính enzyme của coliforms đã được đề xuất (xem mục 4.3).

4. Phương Pháp Enzyme
4.1 Nguyên tắc chung
Các xét nghiệm sinh hóa được sử dụng để xác định vi khuẩn và liệt kê các
phương pháp nuôi cấy cổ điển thường được dựa trên các phản ứng trao đổi chất. Kết

GVGD: Phan Thị Kim Liên

Trang 14


Phân Tích Vi Sinh Thực Phẩm

luận này, chúng khơng hồn toàn cụ thể, và nhiều xét nghiệm bổ sung này đơi khi
cần thiết để có được xác nhận chính xác. Việc sử dụng các enzyme của vi khuẩn để
phát hiện vi khuẩn là một thay thế hấp dẫn đối với các phương pháp cổ điển. Phản
ứng enzyme có thể là nhóm, chi hoặc lồi cụ thể, tùy thuộc vào enzyme mục
tiêu.Hơn nữa, phản ứng nhanh và nhạy cảm.Như vậy, khả năng phát hiện và liệt kê
coliforms thông qua các hoạt động enzyme cụ thể đã được điều tra nhiều năm nay.
β-D-glucuronidase là một enzyme xúc tác thủy phân dẫn xuất β-Dglucopyranosiduronic vào aglycons tương ứng của chúng và acid D-glucuronic.
Mặc dù enzyme vi khuẩn này được phát hiện đầu tiên trong E. coli, độ đặc hiệu
tương đối của nó để xác định các vi sinh vật này là không rõ ràng cho đến khi
Kilian và Bulow (1976) khảo sát các Enterobacteriaceae và báo cáo rằng hoạt động
glucuronidase chủ yếu là giới hạn E. coli. Sự phổ biến của enzyme này và tiện ích

của nó trong việc phát hiện vi khuẩn E. coli trong nước sau đó đã được xem xét bởi
Hartman (1989). Phản ứng B-D-glucuronidase dương tính đã được quan sát trong
94- 96% của E. coli phân lập được thử nghiệm (Kilian và Bulow, 1976; Feng và
Hartman, 1982; Edberg và Kontnick, 1986;. Kaspar và cộng sự, 1987), trong khi
Chang và cộng al. (1989) tìm thấy một tỷ lệ cao hơn của B-D-glucuronidaseE. coli
âm tính (thời gian trung bình là 15% từ vi khuẩn E. coli phân lập từ mẫu phân của
con người). Ngược lại, hoạt động B-D-glucuronidase là ít phổ biến hơn trong chi
Enterobacteriaceae khác, chẳng hạn như vi khuẩn Shigella (44-58%), Salmonella
(20-29%) và chủng Yersinia và Flavobacteria (Kilian và Bulow, 1976; Massanti et
al ., 1981; Feng và Hartman, 1982; Frampton và Restaino, 1993). B-Dgalactosidase, xúc tác sự phân hủy của lactose thành glucose và galactose và đã
được sử dụng chủ yếu để liệt kê các nhóm coliform trong họ Enterobacteriaceae.
Việc sử dụng B-D-glucuronidase và các hoạt động B-D-galactosidase để phát hiện
và đếm vi khuẩn E. coli và TC tương ứng, được xem xét ở đây.
Chromogenic và chất fluorogenic sản xuất màu và huỳnh quang, tương ứng
khi chia tách bởi một enzyme cụ thể.Các chất đã được sử dụng để phát hiện sự hiện
diện hoặc các hoạt động của enzyme cụ thể trong các hệ thống thủy sản (Chrost,

GVGD: Phan Thị Kim Liên

Trang 15


Phân Tích Vi Sinh Thực Phẩm

1991). Một số tác giả đã xem xét chất fluorogenic và chromogenic được sử dụng để
chẩn đoán vi khuẩn (Bascomb, 1987; Manafi et al, 1991.). Họ lưu ý rằng việc sử
dụng các chất đã dẫn đến cải thiện độ chính xác và phát hiện nhanh hơn.Phương
pháp phát hiện hoặc điều tra có thể được thực hiện trong một mơi trường duy nhất,
do đó bằng cách thông qua sự cần thiết của một thủ tục tốn thời gian cách ly trước
khi xác định. Để phát hiện sự hiện diện của B-D-glucuronidase trong E. coli, các

chất nền chromogenic sau đây được sử dụng:(Brenner và cộng sự, 1993) indoxyl-BD-Glucuronide (IBDG), các phenolphthalein-mono-B-D-glucuronide phức tạp
(Butle và SBS, 1989) và 5-bromo-4-chloro-3-indolyl-B-D-glucuronide (X-Glu)
(Watkins et al, 1988).Thường xuyên nhất, các chất nền fluorogenic 4
methylumbelliferyl-B-D-glucuronide (MUGlu) đã được sử dụng (Dahlen và Linde,
1973; Feng và Hartman, 1982). Chất Chromogenic như o-nitrophenyl-B-Dgalactopyranoside (ONPG), p-nitrophenyl-B-D-galactopyranoside (PNPG), 6bromo-2-naphtyl-B-D-galactopyranoside (burger, 1967) và 5-bromo -4-chloro-3indolyl-BD-galactopyranoside (X-Gal) (Ley et al., 1993) đã được sử dụng để phát
hiện sự hiện diện của B-D-galactosidase sản xuất bởi coliforms, cũng như chất phát
quang bề mặt 4 -methylumbelliferyl-B-D-galactopyranoside (MUGal).
4.2. Kỹ thuật có/ khơng có sự hiện diện của vi khuẩn và đếm bằng
các kỹ thuật nhiều ống sử dụng phương pháp enzyme
Sự kết hợp của MUGlu vào lauryl tryptose broth sử dụng như một mơi
trường ni cấy cho q trình lên men nhiều ống (MTF) kỹ thuật lần đầu tiên được
đề xuất để phát hiện nhanh chóng và xác nhận ngay lập tức E. coli trong thực phẩm
và mẫu nước (Feng và Hartman, 1982). Sự hiện diện của methylumbelliferone do sự
thủy phân của MUGlu (mẫu dương tính) đã được phát hiện bởi sự tiếp xúc với ánh
sáng tia cực tím sóng dài và trực quan của sự phát huỳnh quang màu xanh-trắng.
Một số tác giả đã sử dụng spectrofluorometer hoặc một quang phổ (Park et al,
1995.) (Standridge et al, 1992; Apte et al, 1995) để giảm ngưỡng phát hiện huỳnh
quang và do đó làm giảm thời gian ủ bệnh.

GVGD: Phan Thị Kim Liên

Trang 16


Phân Tích Vi Sinh Thực Phẩm

Dựa vào tính chất enzyme của vi khuẩn, một phương pháp xác định chất nền
được phát triển để khắc phục một số hạn chế của MTF và kỹ thuật MF. Không
giống như các phương pháp này, trong đó loại bỏ sự phát triển của vi khuẩn
khơngphải coliform với hóa chất ức chế, cơng nghệ bề mặt được xác định dựa trên

nguyên tắc rằng chỉ có các vi khuẩn mục tiêu (TC và E. coli) được cung cấp và
không được cung cấp chất nền cho các vi khuẩn khác. Một bề mặt được định nghĩa
được sử dụng như một nguồn dinh dưỡng quan trọng đối với các vi khuẩn mục tiêu.
Trong quá trình sử dụng chất nền, một nhiễm sắc hoặc một fluorochrome được phát
triển từ bề mặt, cho thấy sự hiện diện của các vi sinh vật mục tiêu.
Edberg và Edberg (1988) đề xuất sử dụng công nghệ bề mặt kết hợp với chất
nền ONPG cho các enzyme b-galactosidase có mặt trong tất cả các vi khuẩn và
MUGlu chất nền cho việc phát hiện cụ thể của E. coli. Phương pháp xác định chất
nền cơ bản đã được thành lập như là một kiểm tra sự hiện diện, sự vắng mặt.Các
ống, cái mà sao khi thêm mẫu vẫn khơng màu.Ngồi ra, được ủ ở 35 oC.Bất kỳ màu
vàng trong ống nghiệm (chỉ ra quá trình thủy phân của ONPG) được coi là dương
tính đối với TC. Bất kỳ ống vàng được tiếp xúc với ánh sáng tia cực tím bước sóng
dài, và huỳnh quang màu xanh-trắng thể hiện sự hiện diện của vi khuẩn E. coli.
Khơng có thử nghiệm xác nhận bổ sung cần phải được thực hiện.
Thí nghiệm đầu tiên (Edberg và Edberg, 1988) chứng minh rằng kiểm tra các
chủng môi trường của TC và E. coli cho thấy độ nhạy tương đương với các phương
pháp cổ điển (lên đến 1 CFU / 100 ml) với đặc trưng có khả năng lớn hơn. Dữ liệu
cũng xác nhận khả năng phát hiện vi khuẩn bị thương với thời gian đáp ứng tối đa
24 giờ. Rice et al. (1990, 1991) sử dụng nhiều chủng tinh khiết của vi khuẩn E. coli
để xác định hiệu quả của công nghệ phát hiện chất nền được định nghĩa với B-Dglucuronidase và cho thấy kết quả tích cực (95,5% chủng B-D-glucuronidase dương
tính trong 24 giờ và 99,5% dương tính sau 28 giờ ủ). Khơng có E. coli phân lập
dương (Rice et al., 1990).
Một số xét nghiệm thương mại sau đó được phát triển dựa trên công nghệ bề
mặt được xác định: Colilert (IDEXX phịng thí nghiệm, Portland, ME, Mỹ),

GVGD: Phan Thị Kim Liên

Trang 17

Phân Tích Vi Sinh Thực Phẩm

Colisure (cơng ty Millipore, Bedford, MA, USA), ColiQuick (Hach, Loveland, CO,
USA). Hầu hết trong số này là có sẵn cho một phản ứng sự hiện diện/sự vắng mặt
và đếm bằng kỹ thuật nhiều ống.Sử dụng rộng rãi nhất trong số đó là thử nghiệm
Colilert, trong đó sử dụng các kỹ thuật bề mặt được chỉ rõ tính chất với ONPG và
MUGlu.Rất nhiều và rất rộng rãi so sánh giữa những thử nghiệm thương mại và
MTF cổ điển và phương pháp tiếp cận MF đã được thực hiện để liệt kê TC và E.
coli trong các loại nước (Edberg và cộng sự, 1988, 1989, 1990.Clark và cộng sự,
1991. Olson và cộng sự năm 1991, McCarty và cộng sự, 1992;McFeters et al,
1993;. Palmer và cộng sự, 1993; Clark và ElShaarawi năm 1993; Colquhuon et al,
1995; Fricker và Fricker, 1996). Kết luận chính của các nghiên cứu này là những
thử nghiệm có hiệu quả để phát hiện các vi khuẩn từ nhiều nguồn nước khác nhau,
thường là nhạy cảm như là cách tiếp cận MTF để phát hiện vi khuẩn E. coli và đôi
khi nhạy cảm hơn để phát hiện các TC. Gần đây, QuantiTray (QT) (IDEXX), mà là
một phiên bản mở rộng của MPN kiểm tra Colilert (một phiên bản MPN với một số
giới hạn các ống cũng đã được thương mại hóa ở giai đoạn đầu), được so sánh với
các phương pháp MF, đặc biệt là mẫu nước uống, bởi Fricker et al. (1997), De
Roubin et al. (1997) và Eckner (1998). Tất cả họ đều kết luận khơng có sự khác biệt
đáng kể cho việc đếm E. coli giữa các phương pháp QT và MF, trong khi khả năng
phục hồi của TC lớn hơn với kỹ thuật QT hơn so với phương pháp MF. McFeters et
al. (1997a, b) tham khảo các tiêu chuẩn so sánh với các phương pháp thử nghiệm
Colisure để phát hiện vi khuẩn chịu clo: với Colisure, thu hồi TC và E. coli bị tổn
thương bởi clo được cải thiện hơn các phương pháp tiêu chuẩn, kết quả là một ước
tính thực tế hơn vềchỉ số vi khuẩn trong nguồn cung cấp nước công cộng.
Trong kết luận, kiểm tra dựa trên công nghệ bề mặt được xác định bằng cách
sử dụng chất chromogenic và fluorogenic được áp dụng cho việc phát hiện và định
lượng Coliform và E. coli trong nước uống. Các xét nghiệm này dễ sử dụng và cung
cấp cho một ước tính nhanh hơn và thực tế hơn (đặc biệt là sự hiện diện của Clo dư)
các chỉ số ô nhiễm vi khuẩn trong nước hơn so với trường hợp không có sự hiện

diện cổ điển hay MTF. Những phương pháp này có thể tốn kém hơn so với phương

GVGD: Phan Thị Kim Liên

Trang 18


Phân Tích Vi Sinh Thực Phẩm

pháp cổ điển khi sau này không cần các bước xác nhận bổ sung. Khi bước xác nhận
được yêu cầu, các chi phí phát sinh trong cả hai phương pháp là tương đương.
Trong mọi trường hợp, phương pháp enzyme địi hỏi nhân lực ít hơn và do đó chi
phí của họ về giá trị thương mại thấp hơn.
4.3. MF kỹ thuật liên hợp với phát hiện enzyme của vi khuẩn
Dahlen và Linde (1973) đánh giá sự kết hợp của MUGlu vào môi trường
thạch để phát hiện sự hiện diện của hoạt động B-D-glucuronidase (E. coli). Brenner
et al. (1993) đã phát triển môi trường thạch MI, có chứa các MUGal fluorogenic và
IBDG chromogenic, đồng thời phát hiện TC và E. coli trong nước. Phương pháp
này đã được chứng minh là nhạy cảm, chọn lọc, cụ thể và nhanh chóng (kết quả có
sẵn trong 24 h) (Brenner và cộng sự, 1996.). Gaudet et al. (1996) và Ciebin et al.
(1995) liên quan MUGlu hoặc X-Glu với cổ điển m-TEC và thạch lauryl tryptose và
so sánh với các phương pháp hiện đại thay đổi với các phương pháp cổ điển. Các
môi trường hiện đại thay đổi môi trường thạch thường cho thấy sự phục hồi cao hơn
hoặc tương tự như của TC và E. coli.
Các môi trường nuôi cấy thương mại đang có sẵn để phát hiện các TC và E.
coli. Chúng bao gồm các môi trường nuôi cấy môi trường thạch cổ điển được sử
dụng cho E. coli và Coliform với các chất nền chromogenic và / hoặc fluorogenic cụ
thể để phát hiện các B-D-glucuronidase và / hoặc B-D-galactosidase: thạch
Chromocult Coliform (Merck, Darmstadt, Đức), thạch Fluo-rocult E. coli trực tiếp
(Merck) và m-ColiBlue24 broth (Hach) (Grant, 1997).

Việc sử dụng các phương pháp đếm đĩa, bao gồm cả chất chromogenic và /
hoặc fluorogenic, cho phép nhiều hơn, nhanh chóng, dễ dàng hơn và các ước tính
chính xác hơn về coliform và E.coli rất nhiều trong nước uống hơn so với việc sử
dụng các phương pháp cổ điển. Chúng có thể được sử dụng bởi bất kỳ phịng thí
nghiệm, có thể sử dụng phương pháp nuôi cấy truyền thống. Tuy nhiên, có nhiều
tốn kém và giải quyết khơng thỏa đáng các vấn đề liên quan đến sự hiện diện của vi
khuẩn chỉ thị không nuôi cấy.

GVGD: Phan Thị Kim Liên

Trang 19


Phân Tích Vi Sinh Thực Phẩm

4.4. Xác định trực tiếp hoạt tính của enzyme bằng fluorimetry
Các phương pháp mơ tả ở trên là dựa trên nuôi cấy để kiểm tra và vẫn
thường đòi hỏi từ 18 đến 24 giờ để hồn thành.Gần đây hơn, B-D-galactosidase và
B-D-glucuronidase thuộc tính của TC và E. coli đã được khai thác trên nước ngọt
(Berg và Fiksdal, 1988; George và cộng sự, 2000.)Và mẫu nước biển (Davies và
cộng sự, 1995.) xét nghiệm nhanh chóng mà không cần bất kỳ bước nuôi cấy nào.
George và cộng sự.(2000) hoàn thành một biên bản dựa trên nền fluorogenic
MUGal và MUGlu cho một phát hiện enzyme trực tiếp của FC trong nước ngọt
trong 30 phút. Những phương pháp này cho phép ước tính nhanh chóng và trực tiếp
về mức độ ô nhiễm vi sinh nguồn nước mặt, nhưng giới hạn phát hiện của họ (20
CFU / 100 ml cho FC khoảng 340 CFU / ml cho 100 TC) ngăn cản việc sử dụng
chúng để theo dõi nước uống. Một phân tích tự động (Colifast CA-100 (Colifast
Systems, Oslo, Na Uy)) đã được phát triển trên cơ sở các thuộc tính enzyme của vi
khuẩn (Ofjord et al, 1998; Berg và cộng sự, 1998.). Các mẫu được ủ (sau khi tập
trung bằng cách lọc, nếu cần thiết) ở 37 oC cho TC và 44oC FC trong một mơi trường

phát triển có chọn lọc cho coliforms và chứa MUGal. Nếu số lượng coliform trong
mẫu là đủ, sự gia tăng huỳnh quang do MUGal thủy phân bởi các vi khuẩn hiện nay
có thể được đo trong vịng chưa đầy 2 giờ. Nếu khơng, việc phát hiện một tín hiệu
huỳnh quang quan trọng địi hỏi sự phát triển của vi khuẩn trước. Việc phát hiện
một môi trường nuôi cấy TC mất khoảng 11 giờ.Phương pháp này là như vậy, một
quyết định trực tiếp của các hoạt động enzyme cho mẫu với coliform cao (nước
mặt) và liên quan đến một giai đoạn tăng trưởng cho các mẫu với coliform thấp
(nước uống). Các thử nghiệm Coli nhanh thường khuyến khích nhiều hơn cho nước
tắm, và tiếp tục phân tích được thực hiện trong nước uống với phân tích này và các
phương pháp khác vẫn được yêu cầu nếu kết luận được rút ra. Tuy nhiên, kể từ khi
phân tích nước uống với các phân tích Coli nhanh đòi hỏi một giai đoạn tăng
trưởng, hệ thống này sẽ không thể phát hiện vi khuẩn không nuôi cấy.

GVGD: Phan Thị Kim Liên

Trang 20


Phân Tích Vi Sinh Thực Phẩm

4.5. Phát hiện vi khuẩn bằng phương pháp sử dụng enzyme đếm
tế bào pha rắn
Chỉ tiêu đáng kể gần đây đã tập trung vào sự phát triển của phương pháp
enzyme nhanh chóng áp dụng cho nước uống với mục tiêu đạt kết quả trong lịch
trình một ngày làm việc của Văn Poucke và Nelis (1999) đánh giá phát hiện cơng cụ
tín hiệu huỳnh quang để giảm thời gian phân tích của một màng enzyme kiểm tra
lọc. Họ đã sử dụng một thiết bị quét laser (ScanRDI1-Chemunex, Ivry-sur-Seine,
Paris, Pháp) trong đó phát hiện và liệt kê số lượng thấp của các tế bào huỳnh quang
được kí hiệu bằng một kĩ thuật đếm tế bòa pha rắn (Brails-ford, 1996). Hệ thống
này cung cấp một giới hạn phát hiện định lượng trực tiếp rất thấp cho phép phát

hiện từ 1 đến 1000 tế bào có kí hiệu huỳnh quang phân phối trên màng. Sử dụng hệ
thống này, Văn Poucke và Nelis (1999b) đề xuất một thử nghiệm cho phép phát
hiện vi khuẩn E. coli và TC trong khoảng 3.5 h, về nguyên tắc cũng bao gồm các tế
bào trao đổi chất hoạt động nhưng không nuôi cấy. Nguyên tắc của phương pháp
cho các tế bào vi khuẩn E. coli như sau (Văn Poucke và Nelis, 1999b, 2000a): E.
coli hiện diện trong mẫu nước uống được giữ lại trên một bộ lọc 0.4mm sau khi lọc
chân không. Các tế bào E. coli bị mắc kẹt được điều trị bằng hóa chất để tạo ra các
enzyme B-D-glucuronidase (3 giờ ở 37oC) và có kí hiệu (0,5 giờ ở0 oC) các tế bào
gây ra. Chỉ có B-D-glucuronidase của E. coli có thể được gây ra và do đó chỉ những
vi khuẩn tách các chất nền không huỳnh quang (fluorescein-di-B-D-glucuro-nide),
giữ lại huỳnh quang sản phẩm cuối cùng bên trong tế bào. Sự phát huỳnh quang của
một tế bào đơn lẻ hoặc một khuẩn lạc nhỏ (mà có khả năng phát huỳnh quang) được
phát hiện bởi các thiết bị ScanRDI1: quét laser qua màng cho phép đếm số tế bào
huỳnh quang trong 3 phút. Một xác nhận hình ảnh của phát huỳnh quang được thực
hiện bằng cách chuyển màng đến một kính hiển viepi-fluorescence được gắn với
một giai đoạn cơ giới hóa được điều khiển bởi phần mềm ScanRDI1. Quy trình phát
hiện các TC là tương tự, nhưng fluorescein-di-B-D-galactoside được sử dụng như là
chất nền, cho phép phát hiện các B-D galactosidase (Văn Poucke và Nelis, 2000b).

GVGD: Phan Thị Kim Liên

Trang 21


Phân Tích Vi Sinh Thực Phẩm

Áp dụng các phương pháp đề xuất cho E. coli và TC ô nhiễm một cách tự
nhiên và nước giếng bị ô nhiễm, nước mặt và khai thác các mẫu nước đã chỉ ra hơn
90% vi khuẩn E. coli và hơn 92% lượng TC và tương đương với phương pháp tham
khảo bao gồm thạch MFC (E. coli), thạch m-Endo (TC) và thạch Chromocult

Coliform (E. coli và TC) (Văn Poucke và Nelis, 1999a, b, 2000a, b). Tính so với
trung bình thứ hai, tỷ lệ âm tính giả là 3% đối với E. coli và 3,2% cho TC. Trong
một số lượng hạn chế của mẫu, số lượng thấp (1 -3) của các sinh vật mục tiêu đã
được phát hiện bằng cách quét laser và không phải bởi số lượng đĩa thông thường.
Nếu những kết quả này được xác nhận trong tương lai, phương pháp này chắc chắn
sẽ được quan tâm do thời gian ngắn cần thiết để phân tích một mẫu nước.
4.6. Kết luận về phương pháp enzyme
Bổ sung chất fluorogenic và chromogenic vào môi trường nuôi cấy (agar và
môi trường lỏng) để phát hiện hoạt động enzyme của TC và E. coli đã tăng độ nhạy
và tốc độ nhanh chóng hơn các phương pháp cổ điển để ước lượng vi sinh vật trong
nước uống. Mặc dù một số các xét nghiệm này có thể phát hiện vi khuẩn bịtổn
thương, nhưng chúng không phù hợp để giải quyết vấn đề của việc phát hiện các tế
bào không nuôi cấy.Việc phát hiện vi khuẩn huỳnh quang của đếm tế bào pha rắn là
một cách đáng quan tâm để giảm lượng thời gian cần thiết đểđạt được kết quả,
nhưng phương pháp này đòi hỏi một tế bào kế pha rắn.

5. Phương Pháp Phân Tử
Phương pháp phân tử đã được phát triển để tăng nhanh chóng tốc độ của phân
tích. Phương pháp nàycó thể đạt được một mức độ cao của độ nhạy và độ đặc hiệu
mà không cần một canh tác phức tạp và bổ sung thêm các bước xác nhận. Do đó,
những phương pháp này cho phép phát hiện các vi khuẩn có( khả năng và/ hoặc
khơng ni cấy) cụ thể trong vịng vài giờ, thay vì vài ngày vớiyêu cầu các phương
pháp truyền thống. Một số phương pháp phân tử áp dụng cho việc phát hiện cụ thể
của Coliform trong nước và nước uống sẽ được thảo luận ở đây.

GVGD: Phan Thị Kim Liên

Trang 22

Phân Tích Vi Sinh Thực Phẩm

5.1. Phương pháp miễn dịch
Phương pháp miễn dịch dựa trên ghi nhận cụ thể giữa kháng thể và kháng
nguyên và các mối quan hệ cao, đó là đặc trưng của phản ứng cơng nhận này. Tùy
thuộc vào mức độ phân loại các kháng nguyên mục tiêu, phương pháp miễn dịch
cho phép phát hiện các kháng nguyên ở phân loài, chi, loài hoặc mức type huyết
thanh. Có hai loại kháng thể có thể được sản xuất: kháng thể đơn dòng và đa dòng,
nào là cụ thể hơn để các sinh vật mục tiêu. Các đặc tính của phức kháng nguyên kháng thể có thể được sử dụng:
 Để thực hiện một miễn dịch bắt cặp( immunocapture) của các tế bào
hoặc các kháng nguyên bởi liên kết enzyme xét nghiệm miễn dịch
(IMS hoặc ELISA), hoặc
 Để phát hiện các tế bào mục tiêu của thử nghiệm miễn dịch huỳnh
quang (IFA) hoặc miễn dịch enzyme khảo nghiệm (IEA).
Hơn 10 năm qua, phương pháp miễn dịch đã được nỗ lực thực hiện để sử
dụng để phát hiện các chỉ tiêu chất lượng nước trong nước uống.Obst et al. (1989)
đã phát triển một phương pháp ELISA sử dụng kháng thể đơn dòng chống lại các
kháng nguyên enterobacterial chung (ECA), mộtloạilipopolysaccharide , được liên
kết trong màng ngoài của Enterobacteriaceae. Phương pháp này khơng đủ nhạy , tuy
nhiên, do đóni cấy mẫu trước trong một canh chọn lọc trong 24 giờ là cần thiết
để định giới hạn phát hiện của phương pháp ELISA (100.000 tế bào / ml) có thể đạt
được. Hubner et al. (1992) tìm ra ELISA với kháng thể đơn dòng ECA để phát hiện
thường xuyên của Enterobacteriaceae và cho thấy một mức độ tương tự 98% với
phương pháp tiêu chuẩnTC (lên men nhiều ống). Levasseur et al. (1992) đã phân
tích thấu đáo tính đặc hiệu của kháng thể đơn dòng ECA sau khi sàng lọc 259 chủng
Enterobacteriaceae và 125 vi khuẩn Gram âm khác. Họ phát hiện ra phản ứng chéo
(cross-reactivity) với những nhóm khác, chủng khác nhau của AeroMonas, đó là đối
thủ cạnh tranh quan trọng để vi khuẩn Coliform phát triển trên môi trường nuôi cấy
m-Endo .Phản ứng dương tính giảcùng đã được báo cáo bởi Hubner et al. (1992),
người đã đề cập đến phản ứng chéo với một số vi khuẩn Gram âm(Pseudomonas và

GVGD: Phan Thị Kim Liên

Trang 23


Phân Tích Vi Sinh Thực Phẩm

Aeromomas) và vi khuẩn Gram dương(Bacillus) , khi kháng thể đơn dòng ECA
được sử dụng để phát hiện Enterobacteriaceae.
ELISA là một thử nghiệm nhanh chóng, đơn giản và khá nhạy cảm, cho phép
phát hiện ít hơn 10

-9

g protein kháng nguyên (Stryer, 1988). Tuy nhiên, khảo

nghiệm có giới thường phụthuộc vào tính đặc hiệu của kháng thể được sử dụng,
nồng độ của cả hai kháng thể và kháng nguyên và các loại dung dịch phản ứng được
sử dụng.Ngoài ra, chất nền mẫuthường dẫn đến liên kết không đặc hiệu của kháng
nguyên hoặc kháng thể thứ hai (Kfir và Genthe, 1993). Phương pháp này rất hữu ích
để kiểm tra kháng thể đơn dòng hoặc phát hiện vi sinh vật tăng vọt. Tuy nhiên, ứng
dụng của nó để phát hiện các tế bào cụ thể từ một mẫu bị ô nhiễm tự nhiên bị giới
hạn (Hanai et al, 1997.).Mức độ của các đặc trưng của phương pháp ELISA có thể
can thiệpmức độ cao của hệ vi và thợ lặn tài liệu khơng có mục tiêu liên quan đến
mẫu .
Khảo nghiệm miễn dịch huỳnh quang cho phép xác định và đếm một tế bào
cụ thể duy nhất trong một mẫu tự nhiên (Campbell, 1993).Xét nghiệm có thể được
thực hiện bằng cách trực tiếp hoặc gián tiếp .Trong phương pháp miễn dịch huỳnh
quang trực tiếp, các kháng thể đặc biệt là liên hợp trực tiếp với một

fluorochrome.Phương pháp gián tiếp liên quan đến sự liên kết của các kháng thể
chính cụ thể đối với kháng nguyên mục tiêu tiếp theo là việc bổ sung một kháng thể
được đánh dấu fluorochrome trực tiếp chống lại các kháng thể đầu tiên. Ưu điểm
của cách làm này là các kháng thể thứ cấp có thể dễ dàng được lấy từ một nhà cung
cấp thương mại với một loạt các fluorochromes liên hợp (Hoff, 1993). Phương pháp
xác định huỳnh quang tế bào nhanh chóng có thể đạt được bằng cách sử dụng kính
hiển vi epifluorescence hoặc pha rắn đếm tế bào sau khi lọc của mẫu nước, hoặc bởi
dòng cytometry. Zaccone et al. (1995) áp dụng một xét nghiệm miễn dịch huỳnh
quang trực tiếp trên màng cho việc đánh giá ô nhiễm phân trong các mẫu từ vùng
nước ven biển và hồ. Họ so sánh FC phục hồi efficien- các chính IFA đạt được bằng
cách epifluorescence kính hiển vi và phương pháp MF và cho thấy cao hơn IFA
CFU tính 2 bậc độ lớn. Tuy nhiên, họ đã báo cáo sự tồn tại của một ngưỡng dưới

GVGD: Phan Thị Kim Liên

Trang 24


Phân Tích Vi Sinh Thực Phẩm

đây mà các phương pháp IFA không thể được áp dụng (khi vi khuẩn cụ thể là dưới
1% tổng dân số) và chủ yếu liên quan đến các hạt can thiệp nội dung, khi khối
lượng lớn được lọc.
Trong khi IFA cho phép xác định cụ thể và phát hiện ở mức độ đơn bào, nó
khơng cung cấp những thơng tin về tình trạng sinh lý của tế bào, hoặc cho dù Vi
sinh vật đang sống hay đã chết. Một sáng tạo xét nghiệmmiễn dịch huỳnh quang
được phát triển bởi Rockabrand et al. (1999), trong đó xác định tình trạng sinh lý
của tế bào bằng proteinđịnh hình trong giai đoạntăng trưởng cụ thể. Sự khác biệt
của giai đoạn phát triển coliform được dựa trên sự hiện diện của baprotein nội
bào( protein cytosolic): DnaK, một loại protein trao đổi chất ổn định; Dps, một

protein quan trọng trong phaổn định hoặc các tế bào không tạm nghỉ ,Dpstương
quan nghịch với tốc độ tăng trưởng; và Fis, mà đóng một vai trò quan trọng trong
việc điều phối tổng hợp rRNA với tăng trưởng. Định lượng protein
nộibào( cytosolicprotein)được thực hiện bằng cách sử dụng Enterobacteria
fluorochrome nhãn kháng thể đơn dòng (kháng DnaK, kháng Dps và kháng Fis).
Các đặc trưng của kháng thể thử nghiệm đã được kiểm tra bằng cách so sánh kết
quả với những người thu được từ thử nghiệm 16S rRNA cụ thể với
Enterobacteriaceae (Mittelman et al, 1997.) Trên các môi trườngthuần túy của sáu
Enterobacteriaceae và một thành viên khác của phân gamma của lớp con
Proteobacteria. Đồng thời thăm dò các mẫu nước thải với các kháng thể và
DnaKOligonucleotide 16S rRNA cho thấy cả phương phápđã cho kết quả tương tự.
Theo hiểu biết của chúng tôi, những kháng thể đặc hiệu chưa được áp dụng để phát
hiện các vi khuẩn trong nước uống.
Hạn chế chính của phương pháp miễn dịch áp dụng cho giám sát chất lượng
nước uống được liên hệ với số lượng rất thấp của các tế bào mục tiêu trong các
mẫu. Phân tích thực hiện trên số lượng lớn các mẫu nước lọc có giới hạn, tùy thuộc
vào dung tích(Faude và Hofle năm 1997; Hanai và cộng sự, 1997). Tuy nhiên,Định
lượngcác tế bào cụ thể pha lỗng có thể thu được bằng phương pháp tách
immunomagnetic (IMS, Dynal). Phương pháp này sử dụng hạt từ tính được phủ các

GVGD: Phan Thị Kim Liên

Trang 25