Tài liệu Tổng hợp hóa học và sử dụng các đoạn oligonucleotit doc

Tổng hợp hóa học và sử dụng các đoạn oligonucleotit
Các đoạn ADN có trình tự xác định kích thước ngắn được sử dụng nhiều
trong các nghiên cứu khác nhau của di truyền học phân tử, chẳng hạn như sử
dụng làm mồi trong các phản ứng PCR, hay dùng làm mẫu dò trong các
phương pháp lai phân tử.
Các đoạn trình tự này thường được tổng hợp theo phương pháp hóa học và
được gọi là các đoạn oligonucleotit. Phương pháp hóa học được sử dụng phổ
biến nhất được tiến hành trên bề mặt cứng sử dụng máy tự động. Tiền chất để
tạo nên các nucleotit lần lượt gắn với đoạn oligonucleotit theo trật tự nhất
định được gọi là các hợp chất phosphoamidine (xem hình minh họa ). Phản
ứng kéo dài chuỗi oligonucleotit diễn ra bằng việc gắn thêm tiền chất
nucleotit mới vào phía đầu 5’, như vậy ngược chiều với phản ứng kéo dài
chuỗi ADN sử dụng enzym ADN polymerase.

Phương pháp tổng hợp hóa học có hiệu quả và độ chính xác cao khi tiến hành
tổng hợp các phân tử ADN mạch đơn có độ dài tới 30 nucleotit. Với các thiết
bị tổng hợp oligonucleotit hiện nay, một người nghiên cứu có thể dễ dàng
tổng hợp bất cứ một trình tự ADN ngắn nào đơn giản bằng cách gõ và nhập
trình tự nucleotit mong muốn vào phần mềm máy tính điều khiển máy tổng
hợp tự động. Tuy vậy, khi phân tử ADN được tổng hợp có kích thước lớn thì
độ chính xác của trình tự và độ đồng đều của sản phẩm tạo thành giảm đi do
các lỗi cố hữu mang tính kỹ thuật. Thực tế, các phân tử ADN có trình tự dài
hơn 100 nucleotit khó có thể được tổng hợp bằng các phương pháp hóa học
mà đảm bảo được số lượng và chất lượng mong muốn.

Các đoạn oligonucleotit kích thước ngắn ngoài các ứng dụng làm mồi phản
ứng PCR hay làm mẫu dò như được nêu ở trên, còn có thể được sử dụng cho
nhiều mục đích khác trong nghiên cứu di truyền học phân tử. Chẳng hạn như
các đoạn oligonucleotit kết cặp sai với một đoạn ADN được tách dòng có thể
được dùng để tạo ra một đột biến định vị trí. Phương pháp này, gọi là phương
pháp gây đột biến định vị trí, được thực hiện như sau: một trình tự nucleotit

nhất định được tiến hành lai với một phân đoạn ADN, ở đây đoạn
oligonucleotit được sử dụng làm mồi còn phân đoạn ADN đích được dùng
làm khuôn. Trong đoạn ADN sợi kép hình thành sẽ có một vị trí kết cặp sai,
và theo nguyên tắc PCR, các phân đoạn ADN được tạo ra trong các phản ứng
về sau đều mang đột biến tại vị trí kết cặp sai.

Các đoạn oligonucleotit cũng có thể được sử dụng theo cách tương tự như
vậy để tạo nên một điểm cắt giới hạn mới trong một phân tử ADN, để rồi sau
đó điểm cắt giới hạn này được sử dụng để cài đoạn ADN đích vào giữa một
trình tự mã hóa và một trình tự không mã hóa, hoặc sau một trình tự promoter
hay vị trí gắn của ribosom, v.v

Như vậy, rõ ràng trong các nghiên cứu di truyền học phân tử, việc các đoạn
oligonucleotit có thể được tổng hợp theo một trình tự bất kỳ có nhiều ý nghĩa
ứng dụng quan trọng trong việc xác định và khuếch đại các đoạn ADN đặc
hiệu, để giải mã trình tự ADN, cũng như trong các nghiên cứu tạo đột biến
điểm xác định vị trí, hay sử dụng cho công nghệ ADN tái tổ hợp.



Phản ứng PCR
Ngoài các kỹ thuật tách dòng và khuếch đại gen sử dụng các loại tế bào chủ,
một phương pháp khuếch đại gen có hiệu quả cao giờ đây đã trở thành một
kỹ thuật phổ biến trong hầu hết các nghiên cứu di truyền học phân tử là kỹ
thuật phản ứng chuỗi trùng hợp PCR (polymerase chain reaction).
Đây là một kỹ thuật hóa sinh invitro thuần túy. Kỹ thuật PCR sử dụng enzym
ADN polymerase để tổng hợp nên các phân tử ADN mới từ trình tự của phân
tử ADN làm khuôn với tiền chất là các deoxyribonucleotit. Các enzym ADN
polymerase tổng hợp ADN theo chiều 5’-> 3’ và có thể xúc tác gắn nucleotit
tiếp theo vào phía đầu 3’ của một trình tự oligonucleotit có sẵn. Nghĩa là, nếu

ta có một đoạn trình tự oligonucleotit đã gắn vào một mạch ADN làm khuôn
có trình tự bổ sung với trình tự của đoạn oligonucleotit, thì enzym ADN
polymerase có thể sử dụng đoạn oligonucleotit đó làm đoạn mồi và tiếp tục
kéo dài chuỗi ADN về phía đầu 3’ dựa trên trình tự của mạch ADN làm
khuôn.

Vậy, bằng cách nào người ta có thể sử dụng phản ứng PCR và enzym ADN
polymerase để khuếch đại một đoạn trình tự ADN đặc hiệu ? Người ta sẽ
tổng hợp và sử dụng hai đoạn oligonuleotit. Đoạn thứ nhất có trình tự bổ
sung với đầu 5’ của một mạch phân đoạn ADN cần khuếch đại (đoạn này gọi
là mồi xuôi), còn đoạn trình tự thứ hai bổ sung với đầu 5’ của mạch đối diện
(mồi ngược). Phân tử ADN làm khuôn sẽ được làm biến tính (bởi nhiệt) và
các mồi xuôi và môi ngược sẽ gắn vào trình tự bổ sung ở hai đầu đoạn ADN
cần khuếch đại. Với sự có mặt của các cơ chất là các deoxyribonucleotit,
enzym ADN polymerase sẽ tổng hợp và kéo dài một mạch phân tử ADN bắt
đầu từ hai đoạn mồi.

Trong chu kỳ tiếp theo, phân tử ADN lại được gây biến tính và quá trình tổng
hợp ADN được lặp lại với cùng cặp mồi. Kết quả của chu kỳ thứ hai tạo ra 4
bản sao của phân đoạn gen mong muốn. Theo cơ chế đó, chu kỳ biến tính và
tổng hợp ADN diễn ra lặp đi lặp lại sẽ làm khuếch đại phân đoạn ADN nằm
giữa 2 trình tự mồi theo cấp số nhân (số bản sao tương ứng qua các chu kỳ sẽ
lần lượt là 2, 4, 8, 16, 32, 64, v.v.). Như vậy, chỉ cần từ một bản sao ADN
duy nhất có mặt trong một lượng mẫu nhỏ, chúng ta có thể thu được một
lượng lớn bản sao xuất phát từ bản sao đầu tiên.

Xét về một khía cạnh nào đó, kỹ thuật tách dòng ADN và PCR đều được
dùng để khuếch đại một phân đoạn ADN đặc thù lên một số lượng lớn.
Nhưng điểm khác biệt là ở chỗ, trong kỹ thuật tách dòng, chúng ta thường sử
dụng một hóa chất chọn lọc hay một thiết bị nào đó để định vị được trình tự

ADN đã được khuếch đại trong một thư viện ADN đã có sẵn gồm nhiều dòng
tế bào khác nhau, trong khi ở kỹ thuật PCR, hóa chất chọn lọc chính là cặp
mồi sẽ giúp hạn chế phản ứng khuếch đại chỉ tập trung vào đoạn ADN được
quan tâm ngay từ đầu.