phản ứng ngưng kết KN KT

9. PHẢN ỨNG KẾT HỢP KN – KT
Một trong những hạn chế của các thử nghiệm sinh hoá là vi sinh vật phải phát triển
trên một vài môi trường nào đó và thời gian cần ít nhất là 12 - 24 giờ để đọc kết quả. Trên
thực tế, các chủng thử nghiệm có thể bị đột biến cho nên khơng thực hiện được chuyển
hố bình thường như chủng chuẩn khác, ví dụ hầu hết các lồi E.coli có khả năng sử dụng
lactose như 1 nguồn carbon, tuy nhiên những E.coli phân lập được lại khơng có khả năng
sử dụng lactose. Mặt khác, trong một số trường hợp nuôi cấy phân lập vi khuẩn có thể bị
thất bại do việc sử dụng kháng sinh để điều trị. Để khắc phục những nhược điểm này, các
kỹ thuật phát hiện kháng nguyên, kháng thể và vật liệu di truyền của vi khuẩn là những
công cụ hữư hiệu nhất ngày càng được sử dụng rộng rãi.
Sự kết hợp giữa phân tử kháng nguyên và kháng thể xảy ra nhờ các lực: (1) lực
liên kết ion (lực tĩnh điện Coulomb) giữa các nguyên tử hoặc các nhóm hố học mang
điện trái dấu, ví dụ giữa NH3 + và COO-; (2) lực liên kết của các cầu nối hydro giữa các
nguyên tử hydro mang điện tích dương với các nguyên tử mang điện tích âm; (3) lực Van
der Walls (lực hấp dẫn liên phân tử) giữa hai phân tử phụ thuộc vào tương tác giữa các
lớp mây điện tử ở mặt ngoài (Pauling, 1948).
Mục địch sử dụng các phản ứng kháng nguyên – kháng thể: Nghiên cứu dịch tễ
học bệnh nhiễm trùng; Định loại vi sinh vật; Nghiên cứu sự đáp ứng của cơ thể đối với
KN VSV: Đánh giá hiệu lực bảo vệ của vaccine, Xác định hiệu đáp ứng miễn dịch bảo
vệ.
Căn cứ cách nhân định kết quả chia làm 3 nhóm:
- Các phản ứng tạo thành hạt: phản ứng ngưng kết, phản ứng kết tủa
- Các phản ứng dựa vào hoạt động sinh học của kháng thể: phản ứng trung hòa, kết hợp
bổ thể
- Các phản ứng dùng KN-KT đánh dấu: MDHQ, MD phóng xạ, ELISA, MD sắc ký


9.1. Phản ứng ngưng kết hạt (Partical Agglutination).
9.1.1.Nguyên lý
Là phản ứng kết hợp giữa KN hữu hình (tế bào hoặc tầm vóc tế bào) và KT đặc
hiệu tạo thành phức hợp KN-KT dưới dạng hạt ngưng kết có thể quan sát được bằng mắt

thường
9.1.2. Điều kiện hình thành hạt ngưng kết
Ngồi tính đặc hiệu giưa KN và KT, phải có thêm 2 điều kiện:
+ KN và KT đa giá (có nhiều vị trí kết hợp)
+ KN và KT có nồng độ tương đương

9.1.3. Các loại phản ứng ngưng kết
 • Ngưng kết trực tiếp (NK chủ động):
KN ngưng kết trực tiếp với KT đặc hiệu tạo thành mạng lưới ngưng kết

- Phản ứng ngưng kết trực tiếp trên phiến kính:


Phiến kính sạch:

Dùng que cấy lấy VK cần xác định hịa vào 2 giọt mẫu trên phiến kính, sau 30 giây đến 1
phút đọc kết quả.

- Phản ứng ngưng kết trong ống nghiệm

+ Huyết thanh được pha với nồng độ giảm dần vào các ống nghiệm.
+ Cho thêm vào một lượng bằng nhau của KN đã biết tên vào các ống nghiệm.
+ Phản ứng dương tính khi có các hạt ngưng kết lắng xuống đáy ống nghiệm.
 • Ngưng kết gián tiếp
KN hòa tan được gắn lên nền mượn hữu hình (hồng cầu, hạt latex) khi gặp KT đặc hiệu
xảy ra phản ứng ngưng kết trên nền mượn đó


 a. Phản ứng TPHA
KN giang mai được gắn lên hồng cầu (cừu, ngỗng, gà…)

b. Phản ứng RPR
Phản ứng RPR định tính
- Để sinh phẩm ở nhiệt độ phịng trước khi tiên hành phản ứng
- Nhỏ mẫu (Huyết thanh) vào một vịng trịn trên bìa phản ứng, để giọt rơi tự do. Chứng
dương, chứng âm tương ứng theo hướng dẫn của nhà sản xuất.- Dàn đều mẫu trong giới
hạn vòng tròn
- Lắc nhẹ lọ kháng nguyên
- Nhỏ 1 giọt kháng ngun vào vịng trịn đã có mẫu
- Khơng khuấy trộn. Để tấm phản ứng lên máy lắc và lắc ở tốc độ 100 vòng/phút trong 8
phút theo hướng dẫn của nhà sản xuất.


- Đọc kết quả trực tiếp ở nơi có đủ ánh sáng
Phản ứng RPR định lượng:
- Thực hiện phản ứng bằng huyết thanh được pha loãng dần tới độ pha lỗng lớn nhất cịn
cho kết quả dương tính. Pha lỗng huyết thanh tiến hành với lượng gấp đôi: 1/2, 1/4, 1/8,
1/16...
- Để sinh phẩm ở nhiệt độ phòng trước khi làm phản ứng.
- Nhỏ 50 µl NaCL 90/00 vào vịng trịn trên bìa phản ứng từ số 2-5
- Nhỏ 50 µl mẫu vào vịng trịn 1và 2
- Pha lỗng bậc hai từ vòng tròn 2
- Dàn đều mẫu trong giới hạn vòng tròn.
- Nhỏ kháng nguyên vào vòng tròn đã có mẫu
- Để tấm phản ứng lên máy lắc và lắc ở tốc độ 100 vòng/phút trong 8 phút
- Đọc kết quả trực tiếp ở nói có đủ ánh sáng
NHẬN ĐỊNH KẾT QUẢ
Phản ứng dương tính: Có các hạt kết cụm màu đen (hiện tượng lên bông) trên khắp mặt
hoặc trung tâm vịng trịn của bìa phản ứng.
Phản ứng dương tính yếu: Có ít các hạt kết cụm màu đen bao quanh rìa vịng trịn bìa

phản ứng.
Kết quả âm tính: đám than hoạt tập trung ở giữa vòng tròn, màu xám đồng nhất.
Nhận định kết quả RPR định lượng

c. Phản ứng SFD
KN HIV được gắn trên hạt Gelatin



9.2. Phản ứng kết tủa (Precipilin Tests).
9.2.1. Nguyên lý:
- Phản ứng kết tủa là sự kết hợp giữa kháng nguyên hòa tan (KN ở tầm phân tử) lúc gặp
kháng thể tương ứng, tạo thành tủa có thể quan sát trực tiếp bằng mắt thường hoặc nhờ
soi kính lúp.
- Phản ứng có thể thực hiện ở mơi trường lỏng hoặc mơi trường gel.
9.2.2. Các loại phản ứng
 • Phản ứng kết tủa trong môi trường lỏng
Khi dung dịch KN và dung dịch KT được trộn với nhau theo một tỷ lệ thích hợp,
phức hợp KN-KT sẽ được hình thành dưới dạng những hạt kết tủa
Lượng tủa phụ thuộc vào số lượng tuyết đối của KN, KT và mối tương quan về
lượng giữa KN, KT

 Phản ứng RPR:
KN là chất cardiolipin lấy từ tim bị có cấu trúc giống chất lipoid của VK giang
mai
-Phản ứng âm tính: đám đen mịn tập trung ở giữa vòng tròn hoặc màu xám đồng nhất.
-Phản ứng dương tính: hạt kết tủa màu đen ở rìa vịng tròn phản ứng hoặc khắp mặt vòng
tròn.

 • Phản ứng kết tủa trong gel thạch
- Kỹ thuật khuếch tán đơn: chỉ có KN hoặc KT khuếch tán trong thạch
+ Khuếch tán trong ống nghiệm (Oudin)
Cho thạch đã hòa đều KT vào đoạn dưới ống nghiệm rồi cho dung dịch KN lên trên. KN
sẽ khuếch tán xuống thạch. Càng xuống sâu, nồng độ KN càng thấp. Tại vùng KN và KT
tương đương sẽ xuất hiện đường tủa
+ Khuếch tán trên phiến kính hoặc đĩa Petri (Mancini)
Phủ một lớp mỏng thạch đã hịa đều KT lên phiến kính hoặc cho vào đĩa Petri. Khi thạch
đông, đục các lỗ đựng KN theo nồng độ giảm dần. Quanh các lỗ sẽ xuất hiện vòng kết tủa
tại nơi lượng KN và KT tương đương. Nồng độ KN càng cao, vòng càng rộng

- Kỹ thuật khuếch tán kép: cả KN và KT đều khuếch tán trong thạch
+ Khuếch tán trong ống nghiệm


Trong ống nghiệm, giữa KN và KT có một lớp gel thạch. Cả KN và KT đều khuếch tán
vào lớp gel này. Tại vùng KN, KT tương đương sẽ xuất hiện đường tủa
+ Khuếch tán trên phiến kính hoặc đĩa Petri (Ouchterlony)
Phủ một lớp thạch mỏng lên phiến kính hoặc đĩa petri. Sau khi thạch đông, đục 2 lỗ, 1 lỗ
đựng KN và một lỗ đựng KT. KN và KT sẽ khuếch tán ra xung quanh. Nơi KN, KT gặp
nhau với nồng độ tương đương sẽ tạo thành đường tủa.


9.3. Phản ứng trung hịa
9.3.1. Ngun lý
KT đặc hiệu có khả năng trung hòa độc tố, độc lực của VSV hoặc làm mất đi một
tính chất nào đó của VSV hoặc sản phẩm của nó
9.3.2. Các loại phản ứng
a) Phản ứng trung hịa in vitro (trên dụng cụ thí nghiệm):
Phản ứng ASLO, ngăn ngưng kết hồng cầu, trung hòa virus

Phản ứng ASLO: Chẩn đoán thấp tim do Liên cầu A
KN Steptolysin O (SLO) + Hồng cầu →tan HC
Cho huyết thanh bệnh nhân (nghi ngờ có KT chống lại Streptplysin O (Antistreptolysin O
(ASLO)) + SLO, ủ 370 C/30ph. Sau đó cho thêm hỗn dịch hồng cầu, ủ 37℃/45ph.
Nếu HC tan: không có KT ASLO
Nếu HC khơng tan: có KT ASLO đã trung hòa KN SLO, làm mất khả năng gây tan hồng
cầu của KN này

b) Phản ứng ngăn ngưng kết hồng cầu


Phản ứng ngăn ngưng kết hồng cầu chẩn đoán virus (cúm, sởi, Dengue…).
 Nguyên lý:
Virus + HC → HC bị ngưng kết
(Virus + KT mẫu) + HC
Nếu HC bị ngưng kết, virus không cùng tên với KT mẫu.
Nếu HC không bị ngưng kết, virus cùng tên với KT mẫu.

Phản ứng ngưng kết hồng cầu


Phản ứng ngăn ngưng kết hồng cầu phát hiện KT
b) Phản ứng trung hoà invivo:

Phản ứng trung hoà trên chuột lang xác định ngoại độc tố bạch hầu
 Phản ứng Schick
•Xác định tình trạng cảm nhiễm bạch hầu
•Tiêm vào trong da độc tố bạch hầu:

Phản ứng (+): nơi tiêm nổi quầng đỏ ≥ 10mm → cơ thể chưa có KT kháng bạch hầu
Phản ứng (-): nơi tiêm không nổi quầng đỏ hoặc quầng đỏ < 10mm → cơ thể có KT
kháng bạch hầu

9.4. Phản ứng kết hợp bổ thể
• Nguyên lý: Kháng thể đặc hiệu với sự tham gia của bổ thể gây ly giải tế bào
• Các thành phần của phản ứng:
- Hệ thống phản ứng:
+ KN đã biết và được chuẩn độ
+ Huyết thanh bệnh nhân (KT?)
- Hệ thống phát hiện:
+ Hồng cầu cừu (HC)
+ Kháng thể kháng hồng cầu cừu (KHC)
- Bổ thể (C’): được chuẩn độ trước và hoạt động tự do, có thể tham gia vào hệ thống phản
ứng hoặc hệ thống phát hiện. Nếu tham gia vào hệ thống phát hiện:
C’+HC+KHC → tan HC
• Tiến hành phản ứng:
- Bước 1: Cho KN, huyết thanh cần xét nghiệm và bổ thể ủ 37 ℃ /30 phút
- Bước 2: Cho thêm HC + KHC vào hỗn hợp trên, ủ 37℃ /30 phút.
• Kết quả:


- HC không tan chứng tỏ bổ thể đã được sử dụng ở bước 1 → huyết thanh bệnh nhân có
KT đặc hiệu với KN → Phản ứng (+)
- HC tan chứng tỏ huyết thanh bệnh nhân khơng có KT đặc hiệu với KN và bổ thể hoạt
động ở hệ thống phát hiện làm tan HC → Phản ứng(-)

9.5. Phản ứng miễn dịch huỳnh quang
Chất đánh dấu là chất màu huỳnh quang. Phức hợp KN-KT-HQ được phát hiện dưới kính
hiển vi huỳnh quang.

9.5.1. Phản ứng MDHQ trực tiếp
Dùng KT gắn huỳnh quang (HQ) phát hiện KN
• Nguyên lý: KN được phát hiện nhờ KT mẫu gắn HQ
• Các bước tiến hành:


9.5.2. Phản ứng MDHQ gián tiếp
Dùng kháng kháng thể (KKT) gắn chất màu HQ để phát hiện KT.
• Nguyên lý: KT được phát hiện nhờ KN mẫu và KKT mẫu gắn HQ.
• Các bước tiến hành:

KTMDHQ trực tiếp, gián tiếp , sandwich


9.6. Phản ứng miễn dịch phóng xạ
9.6.1. Nguyên lý
KT được gắn chất đồng vị phóng xạ khi gặp KN tương ứng tạo thành phức hợp
miễn dịch được phát hiện do chất phóng xạ phát ra các tia xạ, đọc trên máy đếm phóng
xạ.
9.6.2. Các phản ứng:
Định lượng MDPX một KN
• Nguyên tắc: dùng KT đã biết gắn chất đồng vị phóng xạ để phát hiện KN.
• Tiến hành:
- Ủ KT đã biết vào các giếng của tấm thử
- Cho dịch cần tìm KN vào các giếng của tấm thử, ủ, rửa tấm thử
- Cho KT đặc hiệu đã biết gắn chất phóng xạ I125 , ủ, rửa tấm thử.
- Đếm độ phóng xạ đo ở các giếng. Mức phóng xạ tỷ lệ thuận với nồng độ KN
Định lượng phóng xạ một KT
• Nguyên tắc: dùng KKT gắn chất đồng vị phát hiện KT
• Cách tiến hành:

- Cố định KN đã biết vào các giếng của tấm thử.
- Cho dịch cần tìm KT vào tấm thử, ủ, rửa tấm thử.
- Cho KKT đã biết và đã gắn chất đồng vị phóng xạ.
- Đếm độ phóng xạ đo ở các giếng. Mức phóng xạ tỷ lệ thuận với nồng độ KT.
9.7. Phản ứng miễn dịch enzym (elisa)
9.7.1. Nguyên lý
Phức hợp miễn dịch KN-KT được phát hiện nhờ enzym gắn trên KT hoặc kháng
kháng thể tác động lên cơ chất đặc hiệu làm thay đổi màu cơ chất, được đọc bằng máy
quang kế đo mật độ quang học (OD).
9.7.2. Các loại phản ứng:
9.7.2.1. ELISA gián tiếp
• Phát hiện KT


• KT trong máu bệnh nhân kết hợp đặc hiệu với KN đã được cố định sẵn trên các giếng
của phiến nhựa. Phức hợp KN-KT này được nhận biết bởi kháng kháng thể người gắn
enzym và sẽ cho phản ứng màu với cơ chất. Giá trị mật độ quang của phản ứng màu
(OD) tỷ lệ thuận với lượng KT có trong mẫu thử.
 Các bước tiến hành

KT (bệnh nhân)

Kháng KT người
gắn E

KN-KT-KKT-E

9.7.2.2. ELISA cạnh tranh
• Phát hiện KT
• Nguyên tắc của kỹ thuật dựa trên sự cạnh tranh của KT có trong huyết thanh bệnh nhân

và KT mẫu đã gắn enzym để được gắn lên các KN đã cố định trên giếng. Giá trị mật độ
quang (OD) tỷ lệ nghịch với lượng KT có trong mẫu thử.
 Các bước tiến hành
- KN đã được gắn lên giếng của phiến nhựa
- Huyết thanh bệnh nhân (chứa KT cần tìm) được cho cùng KT mẫu có gắn enzym rồi
đem ủ.
- Đọc kết quả.
9.7.2.3. ELISA Sandwich
• Phát hiện KN hoặc KT.


• Phát hiện KN: KN có trong mẫu thử sẽ kết hợp đặc hiệu với KT đặc hiệu gắn sẵn trong
các giếng của phiến nhựa. Phức hợp này được phát hiện bởi KT mẫu có gắn enzym cho
phản ứng màu với cơ chất. Giá trị OD tỷ lệ thuận với lượng KN có trong mẫu thử.
 Các bước tiến hành:

• Phát hiện KT: KT trong mẫu thử sẽ kết hợp đặc hiệu với KN cố định trên giếng và được
phát hiện bởi KN gắn enzym. Giá trị OD tỷ lệ thuận với lượng KT có trong mẫu thử.
 Các bước tiến hành


ELISA test