Giáo trình Vi sinh đại cương (Nghề: Bảo vệ thực vật - Cao đẳng): Phần 2 - Trường Cao đẳng cộng đồng Đồng Tháp

Chương 3

QUAN SÁT VI SINH VẬT
Mỗi loại vi sinh vật khác nhau phát triển trên môi trường dinh dưỡng sẽ tạo ra
những hình dạng khác nhau, hoặc thay đổi mơi trường dinh dưỡng thì vi sinh vật cũng
có những dạng khác nhau. Dựa vào những dạng đặc biệt này chúng ta có thể đốn biết
chúng thuộc nhóm nào và có thể kiểm tra hình dạng chúng qua kính hiển vi quang học.
3.1. Mục đích – yêu cầu
- Giúp sinh viên quan sát sự hiện diện của vi sinh vật xung quanh phát triển trên
môi trường dinh dưỡng .
-

Nhận diện các nhóm vi sinh vật nầy bằng mắt thường và bằng kính hiển vi.

3.2. Nguyên, vật liệu thực hành
- Đĩa petri, ống nghiệm và bình tam giác chứa mơi trường dinh dưỡng đặc hoặc
lỏng có chứa vi sinh vật.
- Kính hiển vi quang học
- Kính mang vật (lame) phẳng và kính đậy vật (lamelle)
- Đèn cồn, kim cấy…
3.3. Thực hành quan sát vi sinh vật bằng mắt
1. Trên môi trƣờng đặc
Mỗi tế bào vi sinh vật khi mọc trên môi trường dinh dưỡng đặc, sẽ phát triển
thành những dạng đặc biệt gọi là khuẩn lạc (colony). Khuẩn lạc là tập đoàn vi sinh vật
sinh ra từ 1 tế bào hay 1 bào tử có trước. Tùy theo cách phát triển của từng nhóm vi
sinh vật mà khuẩn lạc có hình dạng, dạng bìa, độ nổi, màu sắc, độ nhớt… khác nhau.
Quan sát mô tả khuẩn lạc là một trong những tiêu chuẩn để định danh, phân loại vi
khuẩn.
- Dựa vào hình dạng, khuẩn lạc có 5 loại: dạng điểm, dạng trịn, dạng khơng đều,
dạng rễ cây và dạng hình thoi.

16


●

Điểm

Trịn

khơng đều

rễ cây

Thoi

- Bìa của khuẩn lạc, có 5 loại bìa: ngun, gợn sóng, chia thùy, răng cưa và sợi

Bìa nguyên

Gợn sóng

chia thùy

răng cưa

Dạng sợi

- Độ nổi của khuẩn lạc có 4 loại: phẳng, lài, mơ và cầu chồng

Phẳng

lài

mơ

cầu chồng

- Màu sắc của khuẩn lạc: màu trắng đục, trắng trong, mà vàng, màu cam, màu
xám, màu đen, xanh rêu, nâu đen…
- Kích thước của khuẩn lạc: tùy thuộc vào độ tuổi của khuẩn lạc, kích thứơc
biến động từ bằng đầu kim cho đến đường kính của đĩa petri.
Quan sát bằng mắt ta có thể phân biệt được 2 loại khuẩn lạc rất khác biệt nhau:
- Khuẩn lạc vi khuẩn, nấm men: khuẩn lạc của vi khuẩn là do nhiều tế bào cấu
tạo đơn bào nên chúng tạo ra các khuẩn lạc trên mơi trường đặc có những đặc trưng
như: hình dạng khuẩn lạc thường trịn, khơng đều, hình thoi; bìa của khuẩn lạc là bìa
ngun, gợn sóng, hoặc chia thùy hay răng cưa.

17


- Khuẩn lạc nấm mốc: do cấu tạo bởi nhiều sợi nấm nên khuẩn lạc trên mơi
trường đặc có hình dạng rễ cây, bìa của khuẩn lạc là các sợi, nhìn kỹ ta thấy như là các
sợi gịn thật mịn, màu trắng hoặc xám và khi sinh bào tử (có màu sắc khác nhau) phát
xuất từ giữa khuẩn lạc.
2. Môi trƣờng lỏng
Vi sinh vật khi sinh trưởng trên môi trường lỏng tùy thuộc nhóm hiếu khí hay kỵ
khí mà chúng có thể làm đục mơi trường, tạo váng (màng), tạo cặn (tích tụ) hay tạo kết
tủa.
- Nếu làm đục mơi trường thì xem làm đục đều hay tạo dạng bơng hay sóng lụa.
- Nếu tạo màng thì cần nêu rõ đặc điểm của màng (mỏng hay dầy, phẳng hay

gấp nếp).
- Nếu tạo cặn hay kết tủa phải nêu đặc tính ít hay nhiều, xốp hay đặc dạng
bông, dạng hạt hay dạng nhầy.
3.4. Thực hành quan sát vi sinh vật bằng kính hiển vi
Quan sát trên kính hiển vi bằng 2 phương pháp sau đây:
1. Phƣơng pháp giọt ép: giúp sinh viên quan sát vi sinh vật trong không gian 2
chiều để thấy chuyển động của chúng bằng cách:
Nhỏ 1 giọt nước cất tiệt trùng lên kính mang vật (phẳng)
Khử trùng kim cấy trên ngọn đèn cồn và để nguội
Châm đầu kim cấy vịng lên mơi trường đặc ni cấy vi khuẩn hoặc nấm men,
lấy 1 ít vi khuẩn hoặc vi nấm rồi chấm vào giọt nước trên kính mang vật và trải mỏng
ra.
Dùng kính đậy vật đậy lên giọt nước (sao cho khơng có bọt khí)
Quan sát dưới kính hiển vi x10, x40 để thấy sự chuyển động thật và chuyển
động brown (nếu khơng có roi thì khơng có chuyển động thật).
2. Phƣơng pháp giọt treo: giúp sinh viên quan sát vi sinh vật trong không gian 3
chiều, vi sinh vật chuyển động theo nhiều hướng bằng cách:
Nhỏ 1 giọt nước hoặc mơi trường lỏng tiệt trùng lên kính đậy vật.

18


Dùng kim cấy đã khử trùng bằng nhiệt để chuyển vi khuẩn từ đĩa petri vào
giọt nước trên kính đậy vật.
Thoa vaseline theo cạnh của kính đậy vật.
Lật ngược và úp kính đậy vật lên lame lõm sao cho giọt nước ở giữa lõm.
Quan sát sự chuyển động của vi khuẩn nơi lame lõm.

CÂU HỎI

1. Tại sao khi quan sát vi sinh vật trên kính hiển vi phải nhỏ giọt nước cất lên lam
kính?
2. Tại sao có màu sắc của các khuẩn lạc khác nhau trên cùng môi trường?
3. Sinh viên quan sát khuẩn lạc trên đĩa petri chứa môi trường đặc, mơ tả và vẽ
hình khuẩn lạc nấm men, nấm mốc và vi khuẩn.
4. Quan sát và vẽ hình vi khuẩn trong giọt ép
5. Quan sát trên kính hiển vi, hãy cho biết sự di chuyển của các vi khuẩn, nấm men
trong các mẫu?

19


Chương 4

KỸ THUẬT GIEO CẤY VÀ PHÂN LẬP VI KHUẨN THUẦN KHIẾT
Cấy vi khuẩn là công việc đưa vi khuẩn vào các môi trường nuôi cấy đã được
khử trùng.
Yêu cầu của việc ni cấy vi khuẩn là đảm bảo tính thuần khiết của một dịng vi
khuẩn cần ni cấy. Muốn vậy, chúng ta phải thực hiện q trình ni cấy vi khuẩn
trong điều kiện vô trùng, không để cho bất kỳ một vi khuẩn nào từ môi trường xung
quanh nhiễm bẩn vào. Chúng ta đã biết thế giới xung quanh ta từ khơng khí đến bề mặt
các đồ vật, ngay cả quần áo, chân tay…đều ln có một số lượng lớn vi sinh vật, và
các vi sinh vật này luôn sẵn sàng gây nhiễm các môi trường nuôi cấy khi ta thực hiện
việc nuôi cấy vi khuẩn.
Các vi khuẩn thường được cấy trên các môi trường dinh dưỡng lỏng hoặc đặc
đựng trong các ống nghiệm hoặc các hộp đĩa petri. Tất cả các dụng cụ thủy tinh và môi
trường dinh dưỡng đều đã được khử trùng trước khi thực hành.
4.1. Mục đích yêu cầu
- Trang bị cho sinh viên biết một số phương pháp gieo cấy, phân lập và cấy truyền
vi khuẩn từ các loại mẫu khác nhau phục vụ cho cơng tác chẩn đốn, xét nghiệm .

- u cầu sinh viên biết cách lấy mẫu, bảo quản và vận chuyển mẫu dùng cho
việc cấy và phân lập vi khuẩn.
-

Sinh viên biết cách nhận biết một số dạng khuẩn lạc

- Sinh viên phải nắm vững nguyên tắc làm cạn dần mầm cấy và mục đích của việc
cấy phân lập và cấy truyền
4.2. Vật liệu thực hành:
-

Kim cấy loại cứng và loại mềm (kim nhọn và kim tròn)

-

Dĩa petri và ống nghiệm chứa mơi trường có vi sinh vật phát triển

-

Dĩa petri và ống nghiệm chứa môi trường dinh dưỡng

-

Pipette, đèn cồn, bơng gịn thấm, cồn khử trùng, dao mổ

20


Kim cấy vòng đầu cứng

Kim cấy vòng đầu mềm

Dao mổ trong y tế

Kim cấy vi khuẩn

Kim cấy có móc

Kim cấy dẹp

Hình 2. Các dụng cụ chuyên dùng để cấy, chuyển vi sinh vật từ môi trƣờng
này sang môi trƣờng khác.
Kim cấy nhọn hoặc kim cấy vòng bằng sợi dây kim khí (platin hay nickel
chrome) chóng nóng, chóng nguội và sẽ tránh bị rỉ sét khi đốt đỏ ở nhiệt độ cao lúc khử
trùng. Kim cấy vòng dùng để cấy lướt trên mặt thạch.
Kim cấy thẳng dùng để cấy đâm sâu vào thạch (cấy vi khuẩn kỵ khí) hay vào
thạch mềm (xem di động) hay dùng để ly trích vi khuẩn trên các khuẩn lạc mọc gần
nhau.
Kim cấy dẹp và kim cấy có móc hình thước thợ để cấy nấm.
4.3. Phƣơng pháp gieo cấy vi khuẩn
Gieo cấy vi khuẩn từ nốt rễ cây họ đậu
Phịng cấy hoặc tủ cấy phải vơ trùng có trang bị hệ thống lọc khơng khí và đèn
cực tím để bảo đảm vơ trùng.

21


- Thu nốt rễ từ cây đậu nành hoặc đậu nành hoang, rửa sạch đất, chọn nốt rễ ở gần
cổ rễ (rễ chính) nốt to, chắc, mang về phịng thí nghiệm, nếu chưa sử dụng thì cho nốt
rễ vào bọc nilon cột chặt trữ trong tủ lạnh (ngăn đá).

- Xử lý nốt rễ: Cho nốt rễ (đã rửa sạch đất) vào cốc sứ, thêm cồn 70oC cho ngập
nốt rễ ngâm 1 phút, rồi rửa lại bằng nước cất.
+ Cho oxy già 3% vào cốc (ngập nốt rễ) để yên 3 phút, rồi rửa lại bằng nước cất
(3 lần).
+ Dùng kẹp đã khử trùng gấp nốt rễ để lên giấy thấm sạch.
-

Các thao tác cấy lên đĩa petri:

+ Đĩa petri chứa môi trường KIA hoặc TSA, dùng bút lông dầu đánh dấu (dưới
đáy đĩa petri) những điểm định cấy vi khuẩn.
+ Sử dụng kim cấy đầu nhọn đã khử trùng qua ngọn lửa đèn cồn, đâm thẳng
vào giữa nốt rễ (nơi có vi khuẩn phát triển mạnh)
+ Mở hé nắp đĩa petri, đưa kim cấy vào mặt agar rồi đâm thủng mặt thạch theo
những điểm đã đánh dấu, đậy nắp đĩa petri lại, hơ kim cấy lên ngọn lửa đèn cồn trước
khi để kim cấy lên giá.
+ Lật ngược đĩa petri đã cấy, ghi tên vi khuẩn đã cấy, ngày cấy, tên người cấy
rồi cho vào tủ ủ ở 30-34oC/24 giờ. Theo dõi sự phát triển của vi khuẩn.
4.4. Phƣơng pháp cấy phân lập vi khuẩn
Cấy phân lập (tách ròng) là phương pháp tách rời vi khuẩn từ một hổn hợp dựa
trên nguyên tắc làm cạn dần mầm cấy. Trong thủ thuật này, ta cần làm cho vi khuẩn
tách rời từng tế bào và chúng sẽ phát triển lên thành khuẩn lạc độc lập (thuần khiết)
phục vụ cho việc nghiên cứu chúng, xác định vi khuẩn cộng sinh, vi khuẩn tạp
nhiễm…. Tùy theo nhóm vi sinh vật ta có nhiều phương pháp phân lập, có thể phân lập
bằng que cấy vịng hoặc bằng que trang…
4.4.1. Nguyên tắc
Phương pháp phân lập dựa trên nguyên tắc là mỗi một tế bào vi sinh vật sau một
thời gian nuôi cấy (24 giờ) trên môi trường thạch dinh dưỡng thích hợp sẽ phát triển
thành một quần thể vi sinh vật đồng nhất, thuần khiết. Khi phát triển riêng biệt trên môi
trường thạch các tế bào vi sinh vật sẽ tạo thành một nhóm vi sinh vật và được gọi là

22


khuẩn lạc. Như vậy mỗi khuẩn lạc có thể được tính như là một tế bào vi sinh vật.
Khuẩn lạc thường có kích thước từ 0,5x 4-5mm và có thể nhìn thấy được bằng mắt
thường. Trong khi đó muốn thấy được các tế bào vi sinh vật chúng ta phải dùng kính
hiển vi. Các tế bào vi sinh vật càng được tách rời nhau, những khuẩn lạc tạo nên sẽ
càng riêng biệt, rõ nét, càng giúp cho việc chọn lựa các dòng thuần được dễ dàng hơn.
4.4.2. Phương pháp phân lập vi khuẩn hoặc nấm men
Hai phương pháp phân lập vi khuẩn hoặc nấm men bằng que cấy vòng thường
dùng:
Cách 1: Dùng kim cấy mềm lấy 1 ít vi sinh vật từ các khuẩn lạc.
-

Trải vi sinh vật (đường 1)

-

Hơ lửa kim cấy cho các vi sinh vật trên kim cấy chết bớt.

-

Vẽ đường 2 cắt ngang đường 1.

-

Hơ lửa kim cấy và tiếp tục vẽ đường 3.

- Vi sinh vật được kéo rời rạc qua các đường cấy, và cuối đường 3 sẽ còn vài tế

bào rời phát triển thành khuẩn lạc độc lập.
Cách 1

Đường 1
Đường 2
Đường 3

Cách 2

23


4.5. Cấy truyền
Vi sinh vật khi được phân lập có số lượng rất ít, khơng đủ cho các nghiên cứu
định danh, xác định các đặc điểm sinh lý, sinh hóa, tính chất gây bệnh của chúng. Vì
vậy cần phải ni cấy để làm gia tăng số lượng của chúng. Mặt khác, vi sinh vật sau
khi định danh thường sẽ được giữ giống trong môi trường nhân tạo. Các môi trường
nhân tạo tuy có đầy đủ các chất dinh dưỡng cần thiết cho sự sinh trưởng và phát triển
của vi sinh vật, nhưng khi vi sinh vật được giữ giống trong mơi trường thì đây là một
hệ kín (vi sinh vật không được cung cấp dinh dưỡng mới trong suốt thời gian giữ
giống), do đó sau một thời gian giữ giống, các chất dinh dưỡng trong môi trường sẽ
nghèo đi. Hơn nữa các sản phẩm của quá trình trao đổi chất của vi sinh vật tích tụ
ngày càng nhiều trong mơi trường. Tất cả những yếu tố đó đã làm ức chế, kìm hãm,
giết chết vi sinh vật hoặc làm thay đổi các đặc tính sinh lý - sinh hóa, cũng như độc lực
của những vi sinh vật được nuôi cấy lâu ngày trên môi trường nhân tạo. Điều này gây
ảnh hưởng rất lớn đến việc nghiên cứu chúng. Để khắc phục tình trạng này người ta
phải cấy truyền vi sinh vật.
4.5.1. Mục đích của việc cấy truyền
- Nhằm gia tăng số lượng vi sinh vật để thực hiện việc nghiên cứu chúng sau khi
phân lập được.

- Tái sinh các chủng vi sinh vật sau thời gian nuôi cấy bảo quản chúng trên môi
trường nhân tạo (phục hồi số lượng, các đặc tính sinh lý - sinh hóa, độc lực… của vi
sinh vật)
4.5.2. Cấy truyền vi sinh vật
Có thể cấy truyền vi sinh vật trên môi trường lỏng hay môi trường thạch
nghiêng, tùy theo tình trạng sinh lý của vi sinh vật cũng như mục đích nghiên cứu. Ghi
rõ ký hiệu của loại vi sinh vật được cấy truyền, ngày, tháng cấy trên ống nghiệm..
Dùng kim cấy mềm lấy một ít vi khuẩn hay nấm men chuyển sang môi trường
mới với các thao tác như sau:
1. Cấy truyền từ môi trƣờng đặc sang môi trƣờng đặc
a. Trên đĩa petri:
Từ môi trường thạch đĩa, chọn những khuẩn lạc riêng biệt, quan sát kỹ bề
mặt, rìa, màu sắc, kích thước…ghi lại trong sổ theo dõi, đánh dấu khuẩn lạc (đánh dấu
24


ở mặt đáy của đĩa petri) hoặc môi trường thạch nghiêng, dùng que cấy vịng vơ trùng
lấy một ít vi khuẩn cấy sang ống môi trường đã được chuẩn bị sẵn. Đối với vi khuẩn thì
cấy theo đường zigzag, với vi nấm cấy dọc thành hàng hoặc cấy điểm. Đặt úp đĩa petri
thứ 2 (ghi ký hiệu và chủng cấy, ngày cấy) và ủ ở 30-37oC/24 giờ.

b. Ống nghiệm:
- Tay phải cầm kim cấy (bằng ngón cái, trỏ và giữa), tay trái cầm 2 ống nghiệm
(phần đáy ống nghiệm nằm trong lịng bàn tay được giữ chặt bởi ngón tay cái, 2 đầu
ống nghiệm vạt ra theo hình chữ V với 2 thân ống nghiệm nằm giữa 2 ngón tay trỏ +
giữa và tay giữa + ngón áp út).
- Mở lỏng 2 nắp ống nghiệm, hơ nóng kim cấy gần đến cán, dùng các kẻ giữa
ngón tay giữa + ngón áp út và ngón út + lịng bàn tay phải để kẹp 2 nắp ống nghiệm.
- Hơ lửa 2 miệng ống nghiệm trên ngọn đèn cồn, đưa kim cấy vào, cấy theo
đường zigzag hoặc cấy thẳng (hình 3), cấy xong thì hơ miệng ống nghiệm và đóng nắp

lại.
2. Gieo cấy từ môi trƣờng đặc sang môi trƣờng lỏng:
Kỹ thuật này thường sử dụng trong trường hợp các vi sinh vật đã được giữ
quá lâu trong môi trường nhân tạo, số lượng của chúng khơng cịn nhiều, vi sinh vật

25


được giữ giống trong môi trường đất, môi trường lỏng có glycerin bảo quản ở 20 oC hoặc
ở dạng đơng khô…hoặc trong trường hợp cần thực hiện xét nghiệm liên quan đến khả
năng di động của vi sinh vật. Trong môi trường lỏng vi sinh vật sẽ phát triển dễ dàng
hơn nhất là những cấu trúc dạng chiên mao hoặc tiêm mao (lông di động, lông kết bám…)
- Cách 1: Hơ kim cấy vòng trên ngọn lửa, chấm trên khuẩn lạc chứa trong đĩa
Petri hay ống nghiệm, chuyển kim cấy sang ống nghiệm chứa môi trường lỏng.
- Cách 2: cho 1 ít nước cất tiệt trùng vào đĩa Petri hay ống nghiệm chứa vi sinh
vật, dùng kim cấy vòng đã khử trùng như mô tả ở trên, cọ nhẹ cho vi sinh vật tách ra
khỏi môi trường agar (dung dịch huyền phù). Dùng micropipette hút dung dịch huyền
phù chuyển sang môi trường lỏng.
Môi trường vừa cấy được ủ ở 37oC/24 giờ để vi sinh vật phát triển. Sau đó có
thể thực hiện việc cấy truyền tiếp tục sang môi trường lỏng khác và giữ giống.
3. Gieo cấy từ môi trƣờng lỏng sang môi trƣờng đặc:
- Cách 1: Chấm kim cấy vào môi trường lỏng ở ống nghiệm rồi cấy lên mặt
môi trường agar trong đĩa petri hay ống nghiệm theo đường zigzag (không làm rách
mặt agar).
- Cách 2: Dùng ống hút đã khử trùng hút dung dịch huyền phù từ ống
nghiệm rồi nhỏ lên mặt môi trường đặc.
4. Gieo cấy từ môi trƣờng lỏng sang môi trƣờng lỏng:
Trường hợp này dùng micropipette hút 1 lượng dung dịch huyền phù từ ống
nghiệm chuyển sang môi trường dinh dưỡng mới.
4.6. Thực hành

-

Cấy vi khuẩn từ nốt rễ đậu nành hoặc nốt rễ cây điên điển và vi khuẩn đường
ruột (Biolactyl).

- Cấy chuyển nấm men từ môi trường đặc sang môi trường đặc (đĩa petri), môi
trường lỏng sang môi trường đặc.
-

Phân lập vi khuẩn đậu nành hoặc điển điển và nấm men.

26


CÂU HỎI

1. So sánh sự giống và khác nhau giữa phương pháp cấy phân lập và cấy truyền?
2. Tại sao phải hơ lửa miệng ống nghiệm trước khi đưa kim cấy vào lịng ống
nghiệm?
3. Có thể xác định độ rịng (thuần) của vi khuẩn hoặc nấm men bằng mắt được
không?

27


Chương 5

CÁC PHƢƠNG PHÁP NHUỘM VI KHUẨN
Nhuộm vi khuẩn có rất nhiều phương pháp nhuộm như nhuộm đơn, nhuộm Gram,
nhuộm Ziehl-Nelsen và nhuộm bào tử… trong đó nhuộm đơn và nhuộm Gram là phương

pháp nhuộm đơn giản và cơ bản nhất trong vi khuẩn học. Phương pháp nhuộm đơn chỉ
sử dụng một loại phẩm màu duy nhất; nhuộm Gram còn gọi là nhuộm kép vì trong
phương pháp này ta sẽ dùng 2 loại phẩm nhuộm tương phản nhau về màu sắc, đó là tím
gentian và đỏ Fuchsin hoặc Safranin.
5.1. Mục đích - yêu cầu
- Trang bị cho sinh viên kỹ năng thực hành nhuộm tế bào vi khuẩn để phục vụ cho
việc phân loại và điều trị bệnh do vi khuẩn gây ra
- Yêu cầu sinh viên nắm vững nguyên lý của các kỹ thuật nhuộm:
+ Tế bào vi khuẩn chứa acid nhân nên muốn nhuộm vi khuẩn ta phải dùng các
phẩm nhuộm có tính base
+ Chất rượu (alcohol) sẽ tẩy được màu của hợp chất “tím gentian-Iod” của vi
khuẩn gram âm.
+ Sinh viên biết chuẩn bị mẫu vật và tiến hành phương pháp nhuộm đơn,
nhuộm kép (nhuộm Gram)
5.2. Nguyên, vật liệu, dụng cụ
5.2.1. Dụng cụ
-

Đèn cồn

-

Kim cấy vịng

-

Bình tia chứa nước cất, 1 bình xịt chứa cồn 70o

-

Kính hiển vi

-

Lam

-

Bút lơng dầu hoặc bút chì sáp

28


5.2.2. Vật liệu
-

Ống nghiệm chứa mẫu vi khuẩn (lactobacillus, Rhizobium, bacillus subtilis)
nuôi cấy 24 giờ ở 37oC

-

Bông thấm nước cắt nhỏ, giấy lọc cắt miếng nhỏ

5.2.3. Hóa chất
-

Nước cất tiệt trùng trùng

-

Dung dịch tẩy màu (Ethanol + acetone)

- Phẩm nhuộm: blue methylen, crystal violet, dung dịch Iod, Ethanol 95 oC,
Fuchsin hay Safranin
5.3. Điều chế phẩm nhuộm
a. Phẩm nhuộm đơn
- Blue methylen (a)

0,3g

- Ethanol (95o) (b)

30ml

- Nước cất

100ml

Cách điều chế:
- Hòa tan (a) trong (b) rồi thêm vào hổn hợp 100ml nước cất
- Dung dịch phẩm nhuộm pha chế xong được trử trong chai có nắp thủy tinh
b. phẩm nhuộm Gram
 Crystal violet
Dung dịch 1: - Crystal violet (85%)
- Ethanol (95o)

20g
100ml

Dung dịch 2: - Ammonium oxalate

- Nước cất

1g
100ml

Cách điều chế:
- Pha dung dịch (1) trong nước cất với tỷ lệ 1:10 ta có hổn hợp (c)
- Pha dung dịch (2)

29


- Trộn dung dịch (2) với (1) theo tỷ lệ 4:1
- Trữ dung dịch phẩm nhuộm trong lọ có nắp thủy tinh
 Dung dịch Iod
- Iod (dạng tinh thể)

1g

- Potassium iodin

2g

- Sodium bicarbonat (5%)

60ml

- Nước cất

245 ml

Cách điều chế:
- Hòa tan Iod và potassium iodin trong 5ml nước cất
- Thêm vào hổn hợp vừa pha xong 240ml nước cất và 60ml sodium
bicarbonat
- Hịa tan thật đều các hóa chất và trữ trong lọ thủy tinh có màu nâu
 Dung dịch rƣợu để tẩy màu crystal violet
- Ethanol (95o)

250ml

- Aceton

250ml

Cách điều chế:
Lắc đều 2 hóa chất trên và trữ trong lọ thủy tinh
 Dung dịch safranin
- Safranin

2,5g

- Ethanol (95o)

100ml

Cách điều chế:
- Hịa tan 2 hóa chất trên rồi pha với nước cất tỉ lệ 1:10
- Trử 2 dung dịch pha xong trong chai có nắp thủy tinh
* Lƣu ý: có thể thay dung dịch safranin bằng dung dịch fuchsin như sau:

- Fuchsin
- Ethanol (95o)

1g
100ml

30


- Dung dịch phenol 5%

100ml

Cách điều chế:
Lắc trộn đều các hóa chất trên và trử trong lọ thủy tinh
5.4 . Mục đích của việc nhuộm vi khuẩn
-

Phân biệt vi khuẩn dựa trên tính chất bắt màu của chúng nhằm phục vụ cho việc
phân loại và điều trị

-

Nghiên cứu hình thái, cấu tạo đặc biệt của vi khuẩn (giáp mô, bào tử) để dùng
trong phân loại chúng

-

Bảo tồn tiêu bản vi khuẩn để nghiên cứu, chụp hình

5.5. Phƣơng pháp nhuộm
5.5.1. Chuẩn bị mẫu vật
a. Làm vết bơi
- Làm sạch lame kính: lame kính trước khi sử dụng phải được lau chùi sạch bằn g
cồn và lau lại bằng bông khô
- Đánh dấu vị trí vết bơi: nếu vết bơi mỏng, thường sau khi nhuộm xong rất khó
nhận ra vị trí của vết bơi. Do đó trước khi làm vết bơi cần phải đánh dấu vị trí mà
chúng ta sẽ bơi trên lame. Dùng bút lơng khoanh 1 vịng vừa phải trên 1 mặt của lame
kính, vết bơi sẽ được làm ở mặt bên kia của lame, ngay vị trí được đánh dấu.
- Ghi ký hiệu cho tiêu bản: để tránh nhầm lẫn kết quả xét nghiệm vi khuẩn của
các mẫu khác nhau, có thể gây nên những hậu quả nghiêm trọng, khi làm tiêu bản nhuộm
phải ghi ký hiệu tương ứng cho từng mẫu được xét nghiệm. Ký hiệu ghi ở phần đầu của
lame kính, ở mặt có vết bơi.
- Từ mơi trường lỏng: dùng que cấy vịng vơ trùng, bằng các thao tác vơ trùng lấy
1 ít dịch vi khuẩn cho lên lame kính chỗ đã khoanh làm dấu (mặt trái với mặt làm dấu)
rồi dàn đều giọt dịch vi khuẩn. Chú ý dàn càng mỏng càng tốt.
- Từ môi trường đặc: nhỏ 1 giọt nước cất lên lame kính ở vị trí mặt trái của lame
nơi đã khoanh làm dấu. Dùng que cấy vịng vơ trùng lấy 1 ít vi khuẩn mọc trên bề mặt
môi trường chấm vào giọt nước vừa nhỏ trên lame và dàn đều chúng ở khu vực được
đánh dấu. Chú ý dàn càng mỏng càng tốt.

31


b. Cố định tiêu bản
-

Mục đích của việc cố định tiêu bản là:
+ Giết chết vi khuẩn để đảm bảo an tồn, khơng lây lan
+ Gắn chặt vi khuẩn trên lame kính, khơng bị rửa trơi trong q trình tẩy rửa

+ Làm cho sự bắt màu của vi khuẩn trở nên tốt hơn (vi khuẩn chết bắt màu tốt
hơn vi khuẩn sống)
-

Các phương pháp cố định, có thể sử dụng một trong 2 cách:
+ Cố định bằng nhiệt độ (phương pháp lý học): hơ nhanh trên ngọn lửa đèn cồn
3-4 lần (lam kính cách ngọn lửa khoảng 10cm)
+ Cố định bằng hóa chất (cồn, aceton…): nhỏ vài giọt cồn lên vết bôi, để khô.

5.5.2. Nhuộm đơn
Là phương pháp nhuộm tiêu bản đơn giản nhất trong vi khuẩn học. Mục đích
nhuộm đơn là làm cho mẫu vật ăn màu 1 loại phẩm nhuộm để dễ quan sát dưới kính
hiển vi. Phẩm nhuộm là xanh methylen hay Fuchsin.
Kết quả của phương pháp này chỉ trả lời cho ta biết trong mẫu thí nghiệm có vi
khuẩn hay khơng, cùng với hình dạng và cách sắp xếp của vi khuẩn đó.
Cách nhuộm:
- Nhỏ 1-2 giọt phẩm nhuộm lên mẫu vật đã cố định trong 1 phút
- Rửa dưới vịi nước (nhẹ) cho trơi hết phẩm nhuộm thừa
- Dùng giấy thấm chậm hoặc hơ trên ngọn lửa đèn cồn cho khô, nhỏ lên vết nhuộm
1 giọt dầu cèdre.
- Quan sát trên kính hiển vi với vật kính nhúng dầu: quan sát màu sắc, cách sắp
xếp của từng loại vi khuẩn.
5.5.3. Nhuộm Gram (nhuộm kép)
Mục đích giúp ta xác định mẫu vật nghiên cứu là Gram dương (G+) hay Gram
âm (G-). Để công tác nhuộm cho kết quả chính xác ta phải có mẫu vi sinh vật ở giai
đoạn mẻ cấy đang phát triển mạnh nhất (giai đoạn log) vì nếu sử dụng mẫu vi khuẩn
già thì kết quả bị sai lệnh do 1 số tế bào vi khuẩn già sẽ đổi từ G + sang G-

32

Cách nhuộm:
- Nhỏ Crystal violet lên miếng giấy lọc sao cho đủ thấm xuống vết bôi, để 1-2
phút, Rửa nhẹ dưới vịi nước 2-3 giây, chậm nhẹ cho khơ bớt nước.
- Nhỏ dung dịch Iod (lugol) lên vết bôi vừa được nhuộm để khoảng 1’, Rửa nhẹ
dưới vòi nước, chậm bớt nước.
- Rửa bằng cồn 96 o + aceton thật nhanh, khoảng 30 giây để tẩy màu từ đầu đến
cuối phiến kính, khi giọt cồn và aceton khơng cịn màu tím nữa. Rửa nhẹ dưới vịi
nước, chậm nhẹ.
- Nhỏ thuốc nhuộm Fuchsin kiềm lỗng hoặc safranin lên vết bơi, để khoảng 1
phút.
-

Rửa nhẹ dưới vịi nước.

-

Thấm khơ tiêu bản để quan sát dưới kính hiển vi, ở vật kính nhúng dầu.
Kết quả:

-

Tế bào vi khuẩn có màu tím xanh: G+

-

Tế bào vi khuẩn có màu hồng đỏ: G-

5.6. Thực hành

- Sinh viên thực hiện 2 mẫu nhuộm đơn và 2 mẫu nhuộm kép các vi khuẩn đã cấy.

CÂU HỎI
1. Mô tả qui trình nhuộm Gram và nêu kết quả của các mẫu nhuộm.
2. Quan sát và vẽ lại vi khuẩn đã nhuộm với màu sắc và đặc điểm riêng của chúng.

33


Hình 4. Sơ đồ phƣơng pháp nhuộm Gram

34


Chương 6

PHƯƠNG PHÁP ĐẾM SỐ LƯƠNG TẾ BÀO VI SINH VẬT
Đếm số lượng tế bào vi sinh vật có một ý nghĩa quan trọng trong việc đánh giá
chất lượng vi sinh các chế phẩm sinh học, lương thực, thực phẩm (thức ăn, nước
uống…), đồng thời đánh giá điều kiện môi trường nuôi cấy vi sinh vật thu sinh khối…
Việc đếm số lượng tế bào vi sinh vật thường được thực hiện theo 2 phương pháp
chủ yếu là đếm trực tiếp và đếm gián tiếp.
6.1. Mục đích
- Trang bị cho sinh viên kỹ năng thực hành đếm số lượng tế bào vi sinh vật trong
dung dịch hoặc môi trường nuôi cấy.
- Yêu cầu sinh viên phải hiểu được ý nghĩa và nguyên tắc của việc đếm số lượng
tế bào vi sinh vật
- Sinh viên phải nắm vững qui trình, cách thức tiến hành và thao tác đếm số lượng
tế bào vi sinh vật từ các loại mẫu khác nhau
6.2. Vật liệu và thiết bị

6.2.1. Thiết bị và dụng cụ thủy tinh
- 1 kính hiển vi
- 1 kim cấy và 1 đèn cồn
- 1 Buồng đếm hồng cầu Thomas hoặc Neubaur
- 3 kính đậy vật
- 2 micropipette và 4 đầu col 1ml vô trùng, 4 đầu col 0, 1-0,2ml
- 3 vial đã khử trùng
- 6 ống nghiệm 10ml, 7 đĩa petri đã khử trùng.
6.2.2. Vật liệu và hóa chất
- Mẫu vi sinh vật (mẫu vi sinh vật cấy trên môi trường đặc, mẫu sữa, mẫu nước…)
- Môi trường dinh dưỡng (TSA, NA, PCA…)

35


- 1 chai chứa 1lít nước cất đã khử trùng
6.3.

Đếm số tế bào vi sinh vật

6.3.1. Đếm trực tiếp
Số tế bào vi sinh vật được xác định bằng cách đếm trực tiếp dưới kính hiển vi.
Phương pháp đếm này cho kết quả nhanh. Nhưng chúng ta không thể phân biệt được tế
bào sống với tế bào chết, vì thế kết quả đếm trực tiếp thường cao hơn phương pháp
đếm sống (đếm gián tiếp). Phương pháp đếm trực tiếp có ưu điểm là nhanh, đơn giản,
rẻ tiền nhưng không áp dụng được trong các trường hợp cần xác định số lượng tế bào
cịn sống có trong mẫu (kiểm định chất lượng sản phẩm…)
Phƣơng pháp dùng buồng đếm hồng cầu
Cấu tạo buồng đếm: đó là một buồng hình vng nhỏ, có kích thước cạnh đáy là
1mm và chiều cao là 0,1mm, được khắc trên một phiến kính dày, trong suốt. Trên

phiến kính dày còn khắc thêm các rãnh nhỏ để dịch vi sinh vật cần đếm theo đó đi vào
trong buồng đếm. Buồng đếm tùy theo loại, có thể được chia thành 16 hoặc 25 ơ lớn
hình vng. Nếu là loại có 16 ơ lớn thì mỗi ơ lớn được chia thành 25 ơ hình vng nhỏ.
Nếu là loại 25 ơ lớn thì mỗi ơ lớn lại được chia thành 16 ơ hình vng nhỏ, như vậy dù
là loại buồng đếm nào (16 hoặc 25 ơ lớn) cũng đều có số ơ nhỏ bằng nhau và bằng 400
ô nhỏ (16 x 25 = 25 x 16). Do đó diện tích của mỗi ô nhỏ là như nhau và bằng
1/400mm2 và thể tích của chúng là 1/4.000 mm3.

Hình 5. Buồng đếm hồng cầu

36


Cách tiến hành
- Dùng nước đã khử trùng pha loãng mẫu vật. Độ pha loãng thế nào để khi đếm,
số tế bào trong 1 ô vuông không quá 15 tế bào.
- Chuẩn bị buồng đếm: dùng giấy mềm thấm cồn-aceton lau sạch buồng đếm.
Đặt buồng đếm lên bàn kính và di chuyển buồng đếm vào đúng vị trí quan sát. Dùng
vật kính x10, điều chỉnh để nhìn rõ buồng đếm, sau đó chuyển sang vật kính x40 và
chỉnh rõ buồng đếm lại một lần nữa. Đặt một miếng lamelle ngay lên trên buồng đếm.
Dùng micropipette lấy và nhỏ dịch vi khuẩn cần đếm vào rãnh nhỏ trên phiến kính sao
cho khơng có bọt khí, ngay mép của miếng lamelle. Để yên 3-5 phút để dịch đếm tự
dàn đều lên khắp buồng đếm. Dùng núm vi cấp điều chỉnh cho rõ các ơ nhỏ và tiến
hành đếm (cũng có thể dùng vật kính x10 để đếm nếu kích thước tế bào đủ lớn để nhìn
thấy)
- Cách đếm: Đếm số lượng tế bào vi sinh vật có trên 5 ơ lớn, bất kể đó là loại
buồng đếm nào. Chọn 4 ơ lớn ở 4 góc và 1 ơ ở giữa. Như vậy, nếu là loại buồng đếm
16 ơ lớn thì số lượng ô nhỏ được đếm là 125 ô. Nếu là loại buồng đếm 25 ơ lớn thì số ơ
nhỏ được đếm chỉ có 80 ơ. Các ơ nhỏ trong 1 ơ lớn được đếm theo kiểu hình chữ chi.
Đối với mỗi ô nhỏ, đếm tất cả số tế bào trong ô vng, kể cả những tế bào có hơn phân

nửa nằm trong ô đếm.
Cộng tất cả số lượng vi sinh vật đếm được ở các ô nhỏ (80 hoặc 125 ô nhỏ) để
tính ra số lượng vi sinh vật trung bình có trong 1 ơ nhỏ.

37


Ô lớn phải đếm


Chiều đếm tế bào vi sinh vật

: trong ô nhỏ số 1 đếm được 3 tế bào, ô nhỏ 2 đếm được 2 tế bào, ô nhỏ 3 có 4 tế
bào, ơ nhỏ 4 đếm được 3 tế bào …
- Cách tính số lượng vsv có trong 1ml dịch mẫu theo công thức sau:
Số tế bào/1ml = a x 4000 x1000 x h

Trong đó:
* a: số vi sinh vật trung bình có trong 1 ơ nhỏ =

ai
n

ai: số vsv đếm được trong từng ô nhỏ
n: số ô nhỏ đếm được (80 nếu buồng đếm có 25 ơ lớn hoặc 125 nếu buồng
đếm có 16 ơ lớn
* h = hệ số pha loãng =

1

38


độ pha loãng
* 4.000= hệ số chuyển thành 1 mm3 =

1
Thể tích của 1 ơ nhỏ

=

1
1/4.000 mm3

* 1.000 = hệ số chuyển mm3 thành ml (1ml =1.000mm3)

Hình 6. Phƣơng pháp dùng hộp đếm
6.3.2. Phương pháp đếm sống (đếm gián tiếp)
Đếm gián tiếp người ta khơng nhìn thấy và khơng đếm trực tiếp từng tế bào vi
sinh vật. Số lượng vi sinh vật trong mẫu được xác định một cách gián tiếp thông qua sự
sinh trưởng và phát triển của chúng trên môi trường dùng để nuôi cấy chúng.
39


- Nguyên tắc: phương pháp đếm gián tiếp số lượng tế bào vsv trên môi trường
thạch đĩa dựa trên việc đếm số lượng khuẩn lạc vsv mọc trên môi trường sau thời gian
nuôi cấy vsv cần đếm ở 37oC/24 giờ. Nguyên tắc căn bản trong phương pháp này là
mỗi một khuẩn lạc được tính như là một tế bào vsv có trong mẫu ban đầu.
- Chuẩn bị dịch mẫu: Pha loãng dịch mẫu với nước cất tiệt trùng hoặc nước muối
sinh lý, pha 3 độ loãng liên tiếp 1/10 1/100 1/1.000 dung dịch chứa vi sinh vật bằng

cách chuyển 1ml của chai này sang chai kia chứa 9ml nước cất đã khử trùng (hình 6).
Sau mỗi lần chuyển phải lắc đều trước khi chuyển lần 2, vi sinh vật phân phối đều
trong chai. Tiếp tực pha loãng cho đến khi nào có được khoảng 100-300 tế bào trong
1ml
- Lắc đều 25 lần chai pha loãng cuối cùng, dùng ống hút vô trùng hút 1ml và
chuyển vào đĩa petri đã khử trùng, mỗi độ pha loãng cần 2-3 đĩa. Ghi tên mẫu, ngày lấy
mẫu lên mặt đáy của đĩa Petri để tránh nhầm lẫn khi mở ra đếm.
- Dùng thủ thuật vô trùng cho khoảng 20ml môi trường agar lỏng ở nhiệt độ
khoảng 45-50oC vào đĩa petri (đường kính 8cm). Trộn đều môi trường với mẫu đếm
bằng cách xoay nhẹ đĩa petri theo hình số 8, xoay nhẹ để agar khơng văng lên thành đĩa
petri
- Để môi trường đặc và đem vào cất trong tủ ủ. Quan sát kết quả sau 24- 48 giờ ủ
ở 37 C.
o

40