BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
BỘ QUỐC PHÒNG
HỌC VIỆN QUÂN Y
ĐÀM THỊ HẬU
PHÁT HIỆN MỘT SỐ GEN LIÊN QUAN ĐẾN ĐỘC
TỐ VÀ KHÁNG KHÁNG SINH Ở VI KHUẨN
ACINETOBACTER BAUMANNII GÂY NHIỄM
TRÙNG BỆNH VIỆN
KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ ĐẠI HỌC
HÀ NỘI - 2022
BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
BỘ QUỐC PHÒNG
HỌC VIỆN QUÂN Y
ĐÀM THỊ HẬU
PHÁT HIỆN MỘT SỐ GEN LIÊN QUAN ĐẾN ĐỘC
TỐ VÀ KHÁNG KHÁNG SINH Ở VI KHUẨN
ACINETOBACTER BAUMANNII GÂY NHIỄM
TRÙNG BỆNH VIỆN
KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ ĐẠI HỌC
Cán bộ hướng dẫn
1. TS. Hoàng Văn Tổng
2. TS. Quách Thị Hà Vân
HÀ NỘI - 2022
LỜI CẢM ƠN
Lời đầu tiên, từ tận đáy lịng mình, em xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc
đến TS. Hoàng Văn Tổng và TS. Quách Thị Hà Vân. Cảm ơn các thầy cơ vì
đã hết lịng quan tâm, hướng dẫn tận tình và động viên em trong suốt quá trình
làm khóa luận.
Em xin gửi lời cảm ơn chân thành đến Ban Giám đốc Học viện Quân y,
Viện Đào tạo Dược, Hệ Quản lý học viên dân sự, Phòng Đào tạo, các phịng
ban chức năng và Bộ mơn Hóa dược - Dược lâm sàng đã tạo điều kiện cho em
được học tập, rèn luyện trong 5 năm qua và trong q trình thực hiện khóa luận
này.
Em xin gửi lời cảm ơn đến Ban lãnh đạo Viện Nghiên cứu Y Dược học
Quân sự - Học viện Quân Y đã tạo điều kiện giúp đỡ em và các bạn/ anh/ chị
trong phòng An tồn Sinh học đã tận tình hướng dẫn sử dụng máy móc và thao
tác phịng thực hành sinh học phân tử.
Cuối cùng, với lịng biết ơn vơ hạn em xin được gửi tới bố mẹ, anh chị
em, bạn bè và những người thân yêu nhất luôn bên cạnh em và ủng hộ em hết
lòng trên con đường học tập cũng như trong suốt q trình làm khóa luận.
Xin chân thành cảm ơn!
Hà Nội, ngày tháng năm 2022
Học viên
Đàm Thị Hậu
MỤC LỤC
ĐẶT VẤN ĐỀ ............................................................................................... 1
CHƯƠNG 1 - TỔNG QUAN ......................................................................... 3
1.1. VI KHUẨN ACINETOBACTER BAUMANNII ........................................ 3
1.1.1. Lịch sử phát hiện .................................................................................. 3
1.1.2. Đặc điểm sinh học của Acinetobacter baumannii ................................. 3
1.1.3. Khả năng gây bệnh của Acinetobacter baumannii ................................ 4
1.1.4. Con đường lây truyền ........................................................................... 6
1.2. KHÁNG SINH VÀ KHÁNG KHÁNG SINH CỦA VI KHUẨN
ACINETOBACTER BAUMANII ..................................................................... 7
1.2.1. Kháng sinh và phân loại kháng sinh ..................................................... 7
1.2.2. Kháng kháng sinh ................................................................................. 9
1.2.3. Tình hình kháng kháng sinh của Acinetobacter baumannnii ................. 9
1.2.4. Cơ chế kháng kháng sinh .................................................................... 11
1.2.5. Kháng kháng sinh liên quan đến sự hình thành màng sinh học ........... 14
1.3. MỘT SỐ PHƯƠNG PHÁP XÁC ĐỊNH GEN ĐỘC TỐ VÀ GEN KHÁNG
KHÁNG SINH Ở VI KHUẨN ACINETOBACTER BAUMANNII ................ 17
CHƯƠNG 2 – ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ........... 19
2.1. Đối tượng nghiên cứu ............................................................................ 19
2.2. Thời gian và địa điểm nghiên cứu.......................................................... 19
2.3. Sơ đồ nghiên cứu ................................................................................... 19
2.4. Thiết bị hóa chất và sử dụng .................................................................. 20
2.5. Các kỹ thuật sử dụng ............................................................................. 21
2.5.1. Tách chiết DNA từ mẫu khuẩn lạc và dịch nuôi chủng vi khuẩn......... 21
2.5.2. Đo nồng độ DNA ............................................................................... 22
2.5.3. Khuếch đại đoạn gen bằng phương pháp PCR .................................... 22
2.5.4. Điện di gel Agarose ............................................................................ 25
2.5.5. Xử lý và phân tích số liệu ................................................................... 26
2.5.6. Đạo đức nghiên cứu ............................................................................ 26
CHƯƠNG 3 – KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ BÀN LUẬN ....................... 27
3.1. KẾT QUẢ PHÁT HIỆN GENE ĐỘC TỐ Ở CHỦNG VI KHUẨN
ACINETOBACTER BAUMANNII................................................................. 27
3.1.1. Kết quả phát hiện và xác định tỷ lệ mang ompA ................................. 27
3.1.2. Kết quả phát hiện và xác định tỷ lệ mang epsA .................................. 28
3.1.3. Kết quả phát hiện và xác định tỷ lệ mang gen bap .............................. 29
3.1.4. Kết quả phát hiện và xác định tỷ lệ mang gen bfmS ........................... 30
3.2. KẾT QUẢ PHÁT HIỆN CÁC GENE KHÁNG KHÁNG SINH Ở CHỦNG
ACINETOBACTER BAUMANNII................................................................. 31
3.2.1. Kết quả phát hiện và xác định tỷ lệ mang gen parC ............................ 31
3.2.2. Kết quả phát hiện và xác định tỷ lệ mang gen ant(2”)- Ia.................... 32
3.2.3. Kết quả phát hiện và xác định tỷ lệ mang gen blaPER ........................ 34
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ...................................................................... 36
TÀI LIỆU THAM KHẢO
DANH MỤC BẢNG
Bảng Tên bảng
Trang
2.1 Danh mục thiết bị ............................................................................... 20
2.2 Danh mục hóa chất ............................................................................. 20
2.3. Trình tự cặp mồi sử dụng trong nghiên cứu .......................................... 23
2.4
Thành phần phản ứng PCR phát hiện các gen ...................................... 24
2.5
3.1
Nhiệt độ gắn mồi và thời gian kéo dài mồi cho phản ứng PCR ............ 25
Khảo sát tỷ lệ mẫu nghiên cứu của gen ompA ..................................... 27
3.2
3.3
Khảo sát tỷ lệ mẫu nghiên cứu của gen epsA ....................................... 28
Khảo sát tỷ lệ mẫu nghiên cứu của gen bap ......................................... 29
3.4
3.6
3.7
3.8
Khảo sát tỷ lệ mẫu nghiên cứu của gen bfmS ...................................... 30
Khảo sát tỷ lệ mẫu nghiên cứu của gen parC ....................................... 31
Khảo sát tỷ lệ mẫu nghiên cứu của gen ant(2”)- Ia............................... 33
Khảo sát tỷ lệ mẫu nghiên cứu của gen blaPER ................................... 34
DANH MỤC HÌNH
Hình
Tên hình
Trang
1.1 Hình thái và tính chất nhuộm gram của A. baumannii ............................ 4
1.2 Phân bố căn nguyên gây VAP theo mức thu nhập của các nước ........... 5
1.3 Tỷ lệ kháng kháng sinh Acinetobacter spp............................................ 10
1.4 Liên kết quinolone-topoisomerase thông qua cầu nối ion nước-kim loại
..................................................................................................................... 11
1.5 Cấu trúc hóa học của kanamycin A và các vị trí bị AMEs của vi khuẩn tấn
cơng ............................................................................................................. 12
1.6 (A) AAC(3) acetyl hóa gentamicin. (B) APH(3’) phosphoryl hóa
Amikacin. (C) ANT(2’’) adenyl hóa kanamycin A ....................................... 13
1.7 Cơ chế đề kháng nhóm β-lactam.......................................................... 14
1.8 Sự thẩm thấu các hợp chất phân tử nhỏ qua màng OmpA .................... 16
2.1 Sơ đồ nghiên cứu ................................................................................. 19
2.2
Chu trình nhiệt của phản ứng PCR ...................................................... 25
3.1
Sản phẩm PCR của gen ompA có kích thước 531bp ............................ 27
3.2
3.3
Sản phẩm PCR của gen epsA có kích thước 451bp .............................. 28
Sản phẩm PCR của gen bap có kích thước 1449bp .............................. 29
3.4
3.5
Sản phẩm PCR của gen bfmS có kích thước 1428bp ........................... 30
Sản phẩm PCR của gen parC có kích thước 327bp .............................. 31
3.6
3.7
Sản phẩm PCR của gen ant(2”)- Ia có kích thước 719bp ..................... 32
Sản phẩm PCR của gen blaPER có kích thước 925bp .......................... 34
DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU VÀ CHỮ VIẾT TẮT
Viết đầy đủ
TT
Viết tắt
1
AME
Aminoglycoside-Modifying Enzyme (enzym sửa
đổi aminoglycosid)
2
ARN
Acid ribonucleic
3
ATP
Adenosine triphosphate
4
BV
Bệnh viện
5
BVĐK
6
bp
7
CAP
Community-acquired pneumonia (viêm phổi cộng
đồng)
8
CDC
Centers for Disease Control and Prevention
Bệnh viện đa khoa
Base pair
(Trung tâm kiểm sốt và phịng ngừa dịch bệnh)
9
DDD
Defined Daily Dose (liều xác định trong ngày)
10
DNA
Deoxyribonucleic acid
11
ICU
Intensive care unit (đơn vị chăm sóc đặc biệt)
12
LPS
Lipopolysaccharide
13
MIC
Minimum Inhibitory Concentration (nồng độ ức
chế tối thiểu)
14
NKBV
Nhiễm khuẩn bệnh viện
15
PAE
Post-Antibiotic Effect (tác dụng hậu kháng sinh)
16
PCR
Polemerase Chain Reaction (phản ứng chuỗi
polymerase)
17
QRDR
18
RMT
Quinolone resistance-determining region (vùng
xác đinh kháng quinolone)
rARN 16S methyltransferases
19
VAP
Ventilator Associated Pneumonia (viêm phổi do
thở máy)
20
VSV
Vi sinh vật
21
WHO
World Health Organization (Tổ chức Y tế thế giới)
ĐẶT VẤN ĐỀ
Nhiễm trùng bệnh viện là loại nhiễm khuẩn xảy ra trong q trình người
bệnh được chăm sóc, điều trị tại cơ sở y tế mà không xuất hiện triệu chứng hoặc
ủ bệnh tại thời điểm nhập viện. Tình trạng nhiễm trùng này thường biểu hiện
triệu chứng khoảng 48 giờ từ khi nhập viện, 3 ngày sau khi xuất viện, 30 ngày
kể từ khi phẫu thuật [1].
Nhiễm khuẩn bệnh viện (NKBV) là một trong những thách thức và mối
quan tâm hàng đầu tại Việt Nam cũng như trên toàn thế giới, do làm tăng tỷ lệ
tử vong, tăng phát sinh đề kháng kháng sinh và tăng chi phi điều trị tại bệnh
viện. Tổ chức Y tế Thế Giới (World Health Organization- WHO) ước tính
NKBV chiếm 3,5-10%, theo đó thì ở bất cứ thời điểm nào trên thế giới cũng có
trên 1,4 triệu người đang mắc NKBV. Tại Việt Nam, theo kết quả điều tra của
Cục Quản lý khám - chữa bệnh năm 2010, tỷ lệ NKBV hiện mắc là 3-7% tùy
theo tuyến và hạng bệnh viện [2]. Nếu cơ sở khám chữa bệnh không tuân thủ
nghiêm ngặt các quy định thực hành vơ khuẩn cơ bản trong chăm sóc, chẩn
đoán, điều trị bệnh và ở những cơ sở mà nhân viên y tế còn hạn chế về kiến
thức, thái độ về kiểm sốt nhiễm khuẩn thì tỷ lệ NKBV sẽ cao hơn [3].
Các căn nguyên gây NKBV có mức độ đa kháng kháng sinh cao hơn các
căn nguyên gây nhiễm khuẩn trong cộng đồng, trong đó đứng đầu là vi khuẩn
Gram âm (Acinetobacter baumannii, Pseudomonas aeruginosa và Klebsiella
pneumoniae) chiếm tỷ lệ 78%, Acinetobacter baumannii là mối đe dọa sức
khỏe cộng đồng trên tồn thế giới do tình trạng kháng kháng sinh ở mức đáng
báo động.
Cơ chế đề kháng chính ở Acinetobacter baumannii do mang gen kháng
kháng sinh hoặc do sự hình thành màng sinh học. Khả năng sinh sống và hình
thành màng sinh học góp phần gây ra các bệnh nhiễm khuẩn mãn tính, kháng
kháng sinh và chống lại các biện pháp khử khuẩn trong môi trường bệnh viện
[4]. Khả năng kháng kháng sinh trong màng sinh học được cho là cao hơn 1000
lần so với sinh vật phù du, điều này đặt ra mối quan tâm về sức khỏe toàn cầu
[5].
1
Nghiên cứu xác định các gen kháng kháng sinh của Acinetobacter
baumannii phân lập được từ bệnh nhân giúp hiểu sâu hơn về mức độ nguy hiểm
của loài vi khuẩn này bởi vì ngồi khả năng kháng kháng sinh thì chúng cịn có
thể chuyển gen kháng thuốc cho các lồi vi khuẩn khác. Ngoài ra, nghiên cứu
các gen kháng kháng sinh góp phần giúp chúng ta hiểu được cơ chế kháng
kháng sinh, từ đó tìm ra các thuốc mới trong điều trị nhiễm khuẩn Acinetobacter
baumannii.
Hiện nay, đã có nhiều nghiên cứu về một số gen kháng carbapenem qua
cơ chế sinh carbapenemase. Nghiên cứu các gen kháng kháng sinh khác và các
gen độc lực liên quan đến màng sinh học còn hạn chế. Do đó, chúng tơi thực
hiện nghiên cứu đề tài "Phát hiện một số gen liên quan đến độc tố và gen
kháng kháng sinh ở vi khuẩn Acinetobacter baumannii gây nhiễm trùng
bệnh viện" với 2 mục tiêu chính:
1. Phát hiện được một số gen độc tố, xác định được tỷ lệ vi khuẩn
Acinetobacter baumannii mang gen độc tố gây nhiễm trùng bệnh viện ở
Bệnh viện K cơ sở Tân Triều.
2. Phát hiện được một số gen kháng kháng sinh, xác định được tỷ lệ ở vi
khuẩn Acinetobacter baumannii mang gen kháng kháng sinh gây nhiễm
trùng bệnh viện ở Bệnh viện K cơ sở Tân Triều.
2
CHƯƠNG 1 - TỔNG QUAN
1.1. VI KHUẨN ACINETOBACTER BAUMANNII
Acinetobacter baumannii (A. baumannii), một loại vi khuẩn gram âm, là
một mầm bệnh có khả năng sống sót trong nhiều mơi trường khắc nghiệt đang
là một vấn đề nan giải trong các cơ sở bệnh viện. Một khi nhiễm trùng được
hình thành, nguy cơ tử vong cao: lên đến 26% đối với bệnh nhân nhập viện và
lên đến 43% đối với bệnh nhân tại đơn vị chăm sóc đặc biệt (Intensive care
unit- ICU) [6].
1.1.1. Lịch sử phát hiện
Chi Acinetobacter được phát hiện đầu tiên vào năm 1911 bởi Beijerinck,
nhà vi sinh vật học người Hà Lan, thời điểm đó nó được đặt tên là Micrococcus
calcoaceticus. Sau đó 43 năm, Brisou và Prevot đã đề xuất đặt tên chi
Acinetobacter, tên này xuất phát từ tiếng Hy Lạp “akinetos” có nghĩa là khơng
di động. Năm 1971, Ủy ban Quốc tế về danh pháp của vi khuẩn chính thức cơng
nhận chi Acinetobacter dựa trên nghiên cứu của Baumann năm 1968. Theo các
nghiên cứu phân loại gần đây nhất, chi Acinetobacter thuộc phân lớp
Gammproteobacteria, bộ Pseudomonadales, họ Moraxellaceae. Hiện nay, chi
Acinetobacter bao gồm hơn 60 loài đã được đặt tên, một số loài đang được
nghiên cứu và chưa được cơng bố [7]. Trong số các lồi thuộc chi Acinetobacter
thì A. baumannii là đại diện quan trọng nhất, là tác nhân gây bệnh ở các bệnh
viện trên thế giới [8].
1.1.2. Đặc điểm sinh học của Acinetobacter baumannii
A. baumannii là vi khuẩn Gram âm, có hình thái cầu trực khuẩn, kích
thước khoảng 1,0- 1,5 x 2,0- 2,5 µm, thường đứng thành đôi hoặc đám. A.
baumannii không lên men đường, hiếu khí tuyệt đối, dễ mọc trên các mơi
trường ni cấy thơng thường. Chúng có thể phát triển được ở nhiệt độ từ 15 –
44⁰C, nhiệt độ tối ưu là 33 - 35⁰C. A. baumannii là vi khuẩn duy nhất trong chi
Acinetobacter có thể phát triển ở nhiệt độ 44⁰C [9]. Hình thái và tính chất
nhuộm gram được quan sát dưới kính hiển vi điện tử trong nghiên cứu của
Visca và cộng sự [10] (hình 1.1)
3
Hình 1.1. Hình thái và tính chất nhuộm gram của A. baumannii
Chú thích: (A). Hình ảnh A. baumannii trên tiêu bản nhuộm Gram.
(B) và (C): Hình ảnh A. baumannii dưới kính hiển vi điện tử A. baumannii
Khuẩn lạc của A. baumannii trên mơi trường tryptocasein có hình trịn,
lồi, trơn, hơi nhầy, màu xám đục hoặc vàng nhạt. Đường kính khuẩn lạc từ 2 3 mm sau 18-24 giờ nuôi cấy. Đôi khi, vi khuẩn gây tan huyết ở môi trường
thạch máu cừu, ngựa [11].
Các tính chất sinh hóa khác: Vi khuẩn sinh catalase; có thể sinh acid yếu
từ glucose, lactose, manose, galactose; thử nghiệm Citrat Simmon (dương tính);
Red methyl và Voges-Proskauer (Âm tính), khơng có khả năng sinh oxidase,
indole, khơng di động.
1.1.3. Khả năng gây bệnh của Acinetobacter baumannii
Trong chi Acinetobacter, A. baumannii là loài gây bệnh phổ biến nhất
trên toàn thế giới. Trước đây, A. baumannii được coi là một loại vi khuẩn gây
bệnh cơ hội có độc lực thấp. Tuy nhiên, những năm gần đây, đã có sự gia tăng
nhanh chóng tỷ lệ nhiễm khuẩn A. baumannii trên toàn thế giới. Đặc biệt, A.
baumannii là một trong những tác nhân chính gây nhiễm khuẩn bệnh viện và
đã trở thành mầm bệnh “báo động đỏ”.
Nhiễm khuẩn do A. baumannii ngày càng trở nên phổ biến ở những bệnh
nhân nặng điều trị tại các đơn vị chăm sóc tích cực. Điều này một phần liên
quan đến các quy trình chẩn đoán, điều trị xâm lấn được sử dụng ngày càng
nhiều ở ICU. Với rất nhiều các yếu tố độc lực giúp A. baumannii tồn tại lâu và
trở thành một tác nhân thường trú trong mơi trường bệnh viện, có khả năng phát
tán và lây lan gây các đợt nhiễm khuẩn bùng phát.
A. baumannii có thể gây ra nhiều loại bệnh nhiễm khuẩn cấp tính liên
quan đến NKBV như: Nhiễm khuẩn đường hô hấp, nhiễm khuẩn huyết, nhiễm
4
khuẩn đường tiết niệu, nhiễm khuẩn da và mô mềm, viêm nội tâm mạc, viêm
màng não và viêm tủy xương…[12]. Các yếu tố nguy cơ khiến bệnh nhân dễ bị
nhiễm khuẩn và nhiễm A. baumannii bao gồm: mắc bệnh mạn tính, phẫu thuật,
thủ thuật, chấn thương lớn, sinh non hoặc cao tuổi, nhập viện, điều trị kháng
sinh cũng như các can thiệp điều trị y tế bao gồm thở máy, ống thông nội mạch,
ống thông tiểu và dẫn lưu…
Trong số các NKBV do A. baumannii, nhiễm khuẩn đường hô hấp đặc
biệt là viêm phổi thở máy ( Ventilator Associated Pneumonia –VAP) chiếm tỷ
lệ cao nhất. Ở các nước phát triển, A. baumannii thường đứng thứ 2 (khoảng
14%) sau P. aeruginosa gây VAP [13]. Trong khi đó, ở các nước thu nhập thấp
và trung bình, A. baumannii thường đứng đầu (26 >50%) trong số căn nguyên
gây VAP (hình 1.2) [14].
Hình 1.2. Phân bố căn nguyên gây VAP theo mức thu nhập của các nước
A. baumannii cũng là một nguyên nhân phổ biến gây nhiễm khuẩn huyết
trên bệnh nhân điều trị tại ICU. Các nguồn phổ biến nhất của nhiễm khuẩn
huyết do A. baumannii là nhiễm trùng đường hô hấp dưới và nhiễm trùng ống
thông, nhiễm trùng đường tiểu. Các nghiên cứu gần đây cho thấy, tỷ lệ nhiễm
A. baumannii cao trong các đơn vị bỏng đã nhấn mạnh tầm quan trọng của A.
baumannii trong quần thể bệnh nhân này.
Ngoài khả năng gây ra các nhiễm khuẩn liên quan đến NKBV, đã có
nhiều báo cáo về nhiễm khuẩn cộng đồng do A. baumannii đặc biệt là viêm
phổi cộng đồng (community-acquired pneumonia-CAP) [15]. Mặc dù tỷ lệ
5
CAP do A. baumannii khơng cao nhưng nó là ngun nhân hàng đầu gây CAP
nặng và có tỷ lệ tử vong cao. Trong một tổng hợp các nghiên cứu liên quan
đến nhiễm A. baumannii mắc phải trong cộng đồng cho thấy, trong 80 bệnh
nhân có 51 người bị viêm phổi, 29 người bị nhiễm khuẩn huyết và 45 người
trong số họ đã tử vong do nhiễm khuẩn [15]. Tương tự, theo kết quả nghiên
cứu trên 13 bệnh nhân được chẩn đoán CAP do A. baumannii, mặc dù tất cả
các chủng A. baumannii phân lập được đều nhạy cảm với imipenem nhưng tỷ
lệ tử vong vẫn rất cao (62%) [16]. Những bệnh nhân này thường mắc bệnh
nặng như bệnh phổi tắc nghẽn mãn tính, tiểu đường, suy giảm miễn dịch hoặc
hút thuốc lá nặng. Ngoài ra, A. baumannii được coi là tác nhân chính gây CAP
liên quan đến lạm dụng rượu dẫn đến tỷ lệ tử vong cao > 50% [15].
1.1.4. Con đường lây truyền
A. baunannii thường lây nhiễm cho bệnh nhân thông qua bề mặt môi
trường nơi bệnh nhân tiếp xúc hoặc qua tay của nhân viên y tế. Cũng có báo
cáo phát hiện thấy vi khuẩn lây qua khơng khí (khí dung) từ người nhiễm. Một
vài trường hợp nhân viên y tế bị viêm phổi do nhiễm A. baumannii trong q
trình hút dịch ở ống nội khí quản cho bệnh nhân [17]. Một nghiên cứu khác chỉ
ra rằng khoảng một phần tư số mẫu khơng khí trong phịng bệnh nhân nhiễm
A. baumannii đề kháng carbapenem. Những phòng này gồm các bệnh nhân
nhiễm A. baumannii, bên cạnh đó khơng phân lập được vi khuẩn này từ các ống
dẫn khí. Do đó, vi khuẩn có trong khơng khí là từ bệnh nhân bị nhiễm [18].
Rock và cộng sự (2013) báo cáo rằng chỉ có 1/12 mẫu khơng khí ở các buồng
bệnh nhiễm A. baumannii. Điều này chỉ ra rằng tỷ lệ mẫu khơng khí ở buồng
bệnh nhiễm A. baumannii là khác nhau. Mức độ khơng khí nhiễm vi khuẩn phụ
thuộc vào tần suất thay đổi khơng khí trong phịng và tình trạng của bệnh nhân
[19].
Khả năng lây nhiễm qua đường không khí chỉ ra rằng cơng tác khử khuẩn
bề mặt khơng thể làm giảm tỷ lệ lây nhiễm một cách triệt để mà phải kết hợp
với khử khuẩn khơng khí buồng bệnh. Lây nhiễm vi khuẩn qua đường khơng
khí tạo ra thách thức trong cơng tác phịng chống lây lan lồi vi khuẩn này.
Kiểm soát sớm bệnh nhân nhiễm khuẩn đường hơ hấp, nâng cao chất lượng
khơng khí có tầm quan trọng không kém trong công tác khử khuẩn bề mặt trong
6
buồng bệnh. Một số công nghệ cho phép làm sạch khơng khí trong buồng bệnh
như cơng nghệ tạo sương, chiếu tia UV, công nghệ bay hơi. Tuy nhiên dữ liệu
lâm sàng về vấn đề này cho đến hiện nay vẫn cịn thiếu. Acinetobacter spp. có
khả năng đề kháng tự nhiên với điều kiện khơ hanh, do đó chúng có thể tồn tại
lâu ở ngồi mơi trường. Máy hút ẩm và bồn tắm là mơi trường chứa các lồi
Acinetobacter, độ ẩm cao cũng là yếu tố góp phần sinh trưởng nhanh cho loài
vi khuẩn này [20].
Từ các kết quả nghiên cứu trên cho thấy rằng Acinetobacter có mặt ở
nhiều mơi trường khác nhau, tuy nhiên tỷ lệ thì khác nhau tùy theo nghiên cứu.
Do đó, nghiên cứu tỷ lệ nhiễm lồi vi khuẩn này trong môi trường buồng bệnh
là cần thiết để có biện pháp dự phịng cũng như làm giảm tỷ lệ lây nhiễm.
1.2. KHÁNG SINH VÀ KHÁNG KHÁNG SINH CỦA VI KHUẨN
ACINETOBACTER BAUMANII
1.2.1. Kháng sinh và phân loại kháng sinh
Kháng sinh được phát hiện vào thế kỷ 20, là những chất kháng khuẩn
được tạo ra bởi các chủng vi sinh vật hoặc có nguồn gốc tổng hợp, có tác dụng
kìm hãm sự sinh trưởng và phát triển hoặc tiêu diệt vi sinh vật khác. Thuốc
kháng sinh được sử dụng rộng rãi trong điều trị và phòng ngừa nhiễm khuẩn.
Cùng với việc cải thiện điều kiện vệ sinh, nhà ở, dinh dưỡng và mở rộng các
chương trình tiêm chủng đã góp phần quan trọng trong việc giảm tỷ lệ tử vong
do các bệnh truyền nhiễm và tăng tuổi thọ. Tuy nhiên, tỷ lệ vi khuẩn kháng
kháng sinh trong bệnh viện và cộng đồng tiếp tục gia tăng là vấn đề quan trọng
hàng đầu trên thế giới cần được nghiên cứu và tìm ra giải pháp phịng chống
một cách hiệu quả.
Hiện nay có nhiều các phân loại kháng sinh nhưng cách phân loại phổ
biến nhất là dựa trên cấu trúc phân tử, cơ chế tác động và phổ hoạt động của
từng kháng sinh. Kháng sinh trong cùng nhóm cấu trúc sẽ thể hiện các đặc tính
tương tự nhau về hiệu quả tác dụng, độc tính và tác dụng khơng mong muốn.
Nhóm phân loại kháng sinh theo cấu trúc hóa học được thể hiện ở bảng 1.1.
7
Bảng 1.1. Phân loại kháng sinh theo cấu trúc hóa học
STT
Tên nhóm
Phổ kháng
Phân nhóm
khuẩn
Penicillin
Đại điện
Gram âm,
Penicillin G –
Gram dương
V, ampicillin,...
Có hoạt tính
trên vi khuẩn
Gram âm giảm
dần và trên vi
khuẩn Gram
Cephalosporin
Cephalexin,
cefixim,
cefepim,...
dương tăng dần
1
Beta- lactam
Phổ kháng
Imipenem,
khuẩn mạnh, có
doripenem,
hoạt tính mạnh
meropenem,
trên vi khuẩn
ertapenem,...
Gram âm
Carbapenem
Chỉ có tác dụng
Monobactam
trên vi khuẩn
aztreonam
Gram âm
Khơng kháng
khuẩn, có khả
Các chất ức
năng ức chế
enzyme betalactamase
chế betalactamase
2
3
Sulbactam,..
Vi khuẩn Gram Gentamycin,
Aminoglycosid
âm
amikacin,...
Vi khuẩn Gram
Erythromycin,..
dương và một
Macrolid
số loại vi khuẩn
8
khơng điển
hình
4
Lincosamid
5
Quinolon
Gram dương và
Lincomycin,...
kỵ khí
Glycopeptid
6
Peptid
Ofloxacin,
Gram âm
ciprofloxacin,..
Gram dương
Vancomycin
Trực khuẩn
Polypeptid
Gram âm
Gram âm hiếu
Lipopeptid
7
Mạnh trên
khí và kỵ khí
Các nhóm
kháng sinh
Colistin
daptomycin
Tetracyclin,
penicol,...
khác
1.2.2. Kháng kháng sinh
Một vi khuẩn được gọi là đề kháng khi nồng độ ức chế tối thiểu
(Minimum Inhibitory Concentration- MIC) của vi khuẩn đó cao hơn nồng độ
ức chế đa số các chủng vi khuẩn khác của cùng lồi đó. Các mức độ của MIC
xác định cho tính nhạy cảm, tính trung gian và tính đề kháng đối với mỗi lồi
vi khuẩn được một phịng thí nghiệm độc lập xác định và được Viện nghiên
cứu các Tiêu chuẩn Phịng thí nghiệm và Lâm sàng cập nhật đều đặn. Thực tế,
một chủng được gọi là “đề kháng” khi nồng độ kháng sinh mà vi khuẩn có thể
chịu đựng được tăng cao hơn nồng độ kháng đạt được trong cơ thể sau khi dùng
thuốc
1.2.3. Tình hình kháng kháng sinh của Acinetobacter baumannnii
Theo số liệu báo cáo của 15 bệnh viện trực thuộc Bộ, bệnh viện đa khoa
tỉnh ở Hà Nội, Hải Phòng, Huế, Đà Nẵng, Hồ Chí Minh,… về sử dụng kháng
sinh và kháng kháng sinh giai đoạn 2008 - 2009 cho thấy: năm 2009, 30 - 70%
vi khuẩn gram âm đã kháng với cephalosporin thế hệ 3 và thế hệ 4, gần 40-60%
9
kháng với aminoglycosid và fluoroquinolon. Gần 40% chủng vi khuẩn
Acinetobacter giảm nhạy cảm với imipenem [21].
Theo kết quả phân tích kháng sinh đồ trong báo cáo tình hình đề kháng
kháng sinh năm 2019 khu vực Củ Chi, trong các mẫu dương tính với A.
baumannii, tỷ lệ kháng trên 90% với kháng sinh nhóm cephalosporin thế hệ thứ
3 (cefotaxim, ceftriaxon), trên 80% đối với ceftazidim, amoxicillin/ acid
clavulanic; 60% đối với kháng sinh nhóm carbapenem (imipenem,
meropenem), nhóm quinolon (ciprofloxacin, levofloxacin) và ticarcillin/ acid
clavulanic [22].
Trên 60% các chủng Acinetobacter phân lập tại một số bệnh viện lớn
như Bệnh viện Bạch Mai, Bệnh viện Chợ Rẫy và Bệnh viện Bệnh Nhiệt đới
TW là các chủng đa kháng. Bệnh viện Xanh Pôn (thuộc khu vực phía Bắc), có
tỉ lệ kháng cao nhất với cả 4 loại kháng sinh trong đó, ceftazidime và gentamicin
bị kháng hồn tồn và có tới hơn 80% các chủng khơng cịn nhạy cảm với
ciprofloxacin và imipenem. Với các bệnh viện còn lại, tỉ lệ giảm nhạy cảm với
imipenem dao động từ 18% ở một số bệnh viện chuyên khoa như BV Phổi TW,
BV Việt Đức hay BV tuyến tỉnh như BV ĐK Tỉnh Bình Định đến 70% ở một
số bệnh viện đa khoa tuyến trung ương (BV Bạch Mai, BV Chợ Rẫy) và BV
Bệnh Nhiệt đới TW. Các kết quả này là đáng báo động do các kháng sinh này
đã từng là các lựa chọn rất hiệu quả trong điều trị nhiễm Acinetobacter [21].
Các kết qủa này được thể hiện trong hình 1.3.
Hình 1.3. Tỷ lệ kháng kháng sinh Acinetobacter spp.
10
1.2.4. Cơ chế kháng kháng sinh
1.2.4.1. Thay đổi đích tác dụng của kháng sinh
Sự thay đổi này có thể là về số lượng hoặc ái lực gắn của kháng sinh với
đích tác dụng. Cơ chế này có thể gặp với tất cả các nhóm kháng sinh. Nguyên
nhân thường là do tự đột biến gen quy định tổng hợp đích tác dụng đó, hoặc lấy
gen đột biến đó từ một vi khuẩn khác.
Đối với đề kháng nhóm quinolone, đây là cơ chế phổ biến nhất. Bằng
cách đột biến gen quy định tổng hợp hai enzyme đích mà kháng sinh tấn cơng,
được mã hóa bởi các gen gyrA và parC. Cụ thể là thơng qua cơ chế phá vỡ liên
kết phối trí giữa ion kim loại và nước. Các nghiên cứu gần đây phân tích chức
năng và cấu trúc đã chỉ ra rằng liên kết của quinolon với các enzym
topoisomerase loại II của vi khuẩn là thông qua cầu nối ion kim loại- nước [23].
Tương tác này được thực hiện bởi một ion Mg 2+ được phối hợp với bốn phân
tử nước, tạo thành cầu nối cho các liên kết hydro giữa quinolon liên kết với vị
trí hoạt động serine và các gốc axit. Tương tác này được quan sát trong một
nghiên cứu của Aldred và cộng sự [24], được thể hiện trong hình 1.4.
Hình 1.4. Liên kết quinolone-topoisomerase thơng qua cầu nối ion nướckim loại
1.2.4.2. Hình thành bơm tống thuốc (Efflux Pump)
Các bơm tống thuốc này có tác dụng đưa kháng sinh ra khỏi tế bào vi
khuẩn khi chúng đã vào trong tế bào. Cơ chế này cũng chỉ phổ biến ở các vi
khuẩn gram âm.
11
1.2.4.3. Giảm tính thấm của màng tế bào
Cơ chế này chỉ phổ biến ở các vi khuẩn gram âm. Để qua được màng tế
bào vi khuẩn, kháng sinh thường phải khuếch tán qua các kênh protein đặc biệt
xuyên màng tế bào, gọi là porin. Các vi khuẩn có thể thích nghi bằng cách giảm
số lượng hoặc đột biến các kênh porin trên màng tế bào, làm kháng sinh khó có
thể vào được bên trong tế bào vi khuẩn và thể hiện tác dụng của nó.
1.2.4.4. Tổng hợp hoặc sửa đổi các enzyme bất hoạt kháng sinh
Cơ chế này đặc biệt quan trọng ở các vi khuẩn đề kháng với các kháng
sinh thuộc nhóm β-lactam, aminoglycosid chúng tiết ra một enzyme được gọi
là các β-lactamase, AMEs (AMEs: Aminoglycoside-Modifying Enzymes). Các
β-lactamase và AMEs là các enzyme quan trọng bậc nhất và cũng được quan
tâm nhiều nhất trên thực hành lâm sàng.
Enzym AMEs:
Các AME này có khả năng biến đổi thuốc và từ đó làm mất hoạt tính
kháng sinh [25]. Chúng được phân loại dựa trên khả năng acetyl hóa,
phosphoryl hóa hoặc adenyl hóa phân tử kháng sinh. Hai nhóm hóa học chủ
yếu của aminoside bị tấn cơng là nhóm amino (-NH2) hoặc nhóm hydroxyl (OH). Các AMEs này lần lượt có tên gọi như sau: AACs (Aminoglycoside Nacetyltransferases), ANTs (Aminoglycoside O-nucleotidyltransferases) và
APHs (Aminoglycoside O-phosphotransferases). Cấu trúc hóa học của
kanamycin A và các vị trí bị AMEs của vi khuẩn tấn cơng được thể hiện trong
hình 1.5 [26] và phản ứng hóa học được thể hiện trong hình 1.6 [26].
Hình 1.5. Cấu trúc hóa học của kanamycin A và các vị trí bị AMEs của vi
khuẩn tấn công
12
Hình 1.6. (A) AAC(3) acetyl hóa gentamicin. (B) APH(3’) phosphoryl hóa
Amikacin. (C) ANT(2’’) adenyl hóa kanamycin A
Enzym β-lactamase:
Enzyme phá hủy phân tử kháng sinh β-lactam có tên gọi chung là các βlactamase. Chúng phá vỡ cấu trúc vòng β-lactam, đây là cấu trúc đóng vai trị
quan trọng trong hoạt tính của kháng sinh. Các β-lactamase có khả năng phá
hủy cấu trúc vòng β-lactam của Cephalosporin thế hệ III trở lên được gọi là βlactamases phổ mở rộng (extended-spectrum β-lactamases- ESBL).
Trong những năm gần đây, các họ mới của ESBL đã xuất hiện trên khắp
thế giới, bao gồm blaPER (đối với Pseudomonas kháng kéo dài) và VEB (đối
với beta – lactamase phổ mở rộng ở Việt Nam) [27]. Sự phổ biến của các kiểu
gen ESBL có liên quan về mặt địa lý.
Peptidoglycan là một polymer liên kết chéo, có cấu trúc mạng lưới phức
tạp và rất bền vững. Mấu chốt trong cơ chế tác dụng của các kháng sinh nhóm
cephalosporin nằm ở bước hình thành liên kết chéo giữa các monomer. Để hình
thành liên kết chéo giữa các monomer với nhau, các vi khuẩn cần có một
enzyme có tên gọi là transpeptidase, hay cịn có tên gọi khác là Protein gắn
Penicillin (Penicillin-Binding Protein: PBP). Enzyme này chịu trách nhiệm cho
13
sự kết nối 2 chuỗi peptide ở 2 monomer chéo nhau, thông qua phản ứng cắt đi
một amino acid ở phía đầu chuỗi là D-Ala. Cơ chất của enzyme trong phản ứng
này chính là đầu D-Ala-D-Ala của chuỗi peptide. Các kháng sinh nhóm
cephalosporin có cấu trúc hóa học tương đồng với đầu D-Ala-D-Ala. Kết quả
là, các phân tử kháng sinh trở thành một “cơ chất thứ hai” cạnh tranh với DAla-D-Ala. Các phân tử kháng sinh hình thành liên kết cộng hóa trị bền vững
với amino acid serine trong trung tâm hoạt động của enzyme, làm bất hoạt
enzyme. Các liên kết chéo giữa các monomer khơng được hình thành làm vách
tế bào vi khuẩn trở nên yếu ớt và dễ dàng bị phá hủy từ chính áp suất thẩm thấu
bên trong.
Hình 1.7. Cơ chế đề kháng nhóm β-lactam
1.2.5. Kháng kháng sinh liên quan đến sự hình thành màng sinh học
Màng sinh học là cấu trúc gồm các tế bào vi khuẩn được bao bọc trong
một chất nền cao phân tử tự sản sinh bám dính vào một bề mặt trơ hoặc sống.
Màng sinh học có ý nghĩa to lớn đối với sức khỏe cộng đồng, bởi vì các vi sinh
vật liên quan đến màng sinh học thể hiện tính nhạy cảm với các chất kháng
khuẩn giảm đi đáng kể. Tính nhạy cảm này có thể là nội tại (là kết quả tự nhiên
của sự phát triển trong màng sinh học) hoặc có được (do chuyển các yếu tố
ngoại nhiễm sắc thể sang các sinh vật nhạy cảm trong màng sinh học).
14
Có ít nhất 3 cơ chế chịu trách nhiệm về sự kháng thuốc ở các sinh vật
tạo ra màng sinh học. Đầu tiên, các chất kháng khuẩn phải khuếch tán qua chất
nền exopolysccharide (EPS) để tiếp xúc và bất hoạt các sinh vật trong màng
sinh học. EPS làm chậm sự khuếch tán bằng cách phản ứng hóa học với các
phân tử kháng khuẩn hoặc bằng cách hạn chế tốc độ vận chuyển của chúng..
Thứ hai, các sinh vật liên kết với màng sinh học đã giảm tốc độ tăng trưởng,
giảm tốc độ mà kháng sinh được đưa vào tế bào và do đó ảnh hưởng đến động
học bất hoạt. Thứ ba, các thay đổi sinh lý khác do phương thức tăng trưởng của
máng sinh học.
Các yếu tố độc lực quan trọng nhất được xác định bằng cách xác định
kiểu gen và kiểu hình là porin màng ngồi (mã hóa bởi gen ompA),
exopolysccharide ngoại bào (mã hóa bởi gen epsA), protein liên kết màng (mã
hóa bởi gen bap), hệ thống 2 thành phần (mã hóa bởi gen bfmS).
1.2.5.1. Outer membrane protein A
Có hai cách để thiết kế các chất kháng khuẩn mới. Một là ức chế sản xuất
các chất cần thiết cho sự tồn tại của vi khuẩn [28]; hai là ức chế các yếu tố độc
lực hoặc gen kháng kháng sinh của vi khuẩn gây bệnh nhằm ngăn chặn khả
năng gây bệnh hoặc cải thiện độ nhạy cảm của chúng với kháng sinh [29]. Tuy
nhiên, việc ức chế thành phần đơn lẻ sẽ gây ra áp lực tiến hóa lớn đối với vi
khuẩn và thúc đẩy sự phát triển của các chủng kháng thuốc ở mức độ cao. Do
đó, chiến lược can thiệp mới nhằm vào các gen không thiết yếu là cách để vượt
qua sự kháng thuốc của vi khuẩn. Một số cơ chế đề kháng góp phần vào kiểu
hình kháng đa thuốc ở A. baumannii: giảm tính thấm của protein màng ngoài,
biểu hiện quá mức của các máy bơm tống thuốc và thu nhận các yếu tố di truyền
mang các yếu tố quyết định tính kháng, chẳng hạn như plasmid, tích phân,
chuyển vị. Sản xuất quá mức OmpA là một yếu tố nguy cơ độc lập đối với tỷ
lệ tử vong do viêm phổi bệnh viện và nhiễm khuẩn huyết do A. baumannii [30].
Sự thẩm thấu của các hợp chất phân tử nhỏ được báo cáo trong nghiên cứu của
Iyer và cộng sự, được thể hiện trong hình 1.8 [31].
15
Hình 1.8. Sự thẩm thấu các hợp chất phân tử nhỏ qua màng OmpA
Khả năng vi khuẩn mang gen ompA nhạy cảm hơn với kháng sinh do
những thay đổi không đặc hiệu trong tính thấm màng ngồi do thiếu biểu hiện
của thành phần này. Kết quả này gợi ý rằng việc tối ưu hóa sự xâm nhập của
kháng sinh thơng qua OmpA có thể là một giải pháp hóa dược để tìm ra chất
kháng khuẩn trong tương lai.
1.2.5.2. Exopolysccharide
Chất nền exopolysccharide được hình thành khi các phân tử sinh học tích
tụ xung quanh các vi sinh vật cư trú, đóng vai trò như một hàng rào bảo vệ.
Được cấu tạo chủ yếu từ polysaccharid, protein và DNA. Nói chung, hai đặc
tính thường liên quan đến vi khuẩn tạo màng sinh học, đó là tăng tổng hợp EPS
và phát triển khả năng kháng thuốc kháng sinh [32]. Tăng sản xuất EPS ở A.
baumannii có khả năng tạo ra một mơi trường bảo vệ gây khó khăn cho sự xâm
nhập của kháng sinh dẫn đến sự phát triển của đề kháng. Điều này sẽ cung cấp
khả năng đề kháng hiệu quả cho các tế bào màng sinh học chống lại các phân
tử lớn như protein kháng khuẩn lysozyme và bổ thể. EPS tích điện âm rất hiệu
quả trong việc bảo vệ tế bào khỏi các kháng sinh aminoglycoside tích điện
dương bằng cách hạn chế sự thẩm thấu [33], [34].
1.2.5.3. Protein (bap) liên kết màng
Bap đóng một vai trị trong việc kết dính tế bào và cần thiết cho sự phát
triển của các cấu trúc bậc cao trên các vật liệu liên quan đến y tế, chẳng hạn
như polystyrene và titan [35]. Các thành viên trong họ bap được định nghĩa là
các protein có trọng lượng phân tử cao hiện diện trên bề mặt vi khuẩn, chứa
vùng lõi và tạo cho vi khuẩn khả năng hình thành màng sinh học. Bap có cấu
16