Tài liệu môn Kĩ thuật di truyền

LAI PHÂN TỬ
ThS. Nguyễn Thị Mỹ Nương
Email:

1


Nội dung
1. Mục tiêu, nguyên lý
2. Đánh dấu mẫu dò
3. Các kiểu lai:
1. Lai trong pha lỏng
2. Lai trong pha rắn
3. Lai tại chổ

4. Ứng dụng
2


Tài liệu tham khảo
[1] Buckingham, L. (2007). Molecular
diagnostics: Fundamentals, methods, and clinical
applications (1st ed.). Philadelphia: F.A. Davis Co.
Chương 6

3


Mục tiêu – nguyên lý
1. Mục tiêu: phát
hiện một trình tự

nucleic acid trong
một hỗn hợp dựa
theo nguyên tắc
bắt cặp bổ sung

Eastern blot
4


Mục tiêu – nguyên lý
2. Thành phần:
- Trình tự mục tiêu
- Mẫu dò (probe):
+ Đặc điểm: (1) bắt cặp bổ sung
trình tự mục tiêu; (2) đánh dấu
+ Phân loại: DNA; RNA; oligo

Làm sao biết được trình tự mẫu dị?

5


CÁC PHÂN TỬ DÙNG ĐÁNH DẤU HOÁ HỌC
Có ái lực với antiDigoxigenin
Dùng phối hợp với
dATP, dCTP, dGTP,
dTTP

Có ái lực với
streptavidin

Dùng phối hợp với
dATP, dCTP, dGTP,
dTTP
6


ĐÁNH DẤU BẰNG BIOTIN

Đánh dấu mẫu dò (probe) → Lai với trình tự mục tiêu → Phát hiện phân tử lai
thông qua phức hợp avidin/chất phát huỳnh quang

7


PHƯƠNG PHÁP NICK TRANSLATION
 “Đục lỗ” trên 2 mạch của DNA
bằng Dnase I
 DNA polymerase I sử dụng hoạt
tính 5’-3’ exonuclease “gặm” mạch
DNA theo chiều 5’-3’
 DNA polymerase I vừa thủy
phân vừa tổng hợp mạch mới bù vào
lỗ trống với các dNTP (dATP,
dCTP, dGTP, dTTP, dUTP đánh
dấu)
 Kết quả là probe được đánh dấu

8

PHƯƠNG PHÁP RANDOM PRIMING

 Biến tính mạch đôi DNA
 Bắt cặp tổ hợp “ mồi“ ngẫu
nhiên trên 2 mạch
64 = 1296 primers
 DNA polymerase tổng hợp bù
vào chỗ trống bằng các dNTP
trong đó có nucleotide đánh dấu
 Kết quả là probe đánh dấu

9


PHƯƠNG PHÁP ĐÁNH DẤU
OLIGONUCLEOTIDE
PHẢN ỨNG
PHOSPHATASE

PHẢN ỨNG KINASE

10


PHƯƠNG PHÁP ĐÁNH DẤU OLIGONUCLEOTIDE
SỬ DỤNG TERMINAL TRANSFERASE

11

TỔNG HP MẪU DÒ RNA
BẰNG PHIÊN MÃ IN VITRO
 Trình tự sẽ dùng làm probe được tạo
dòng vào vector biểu hiện
 Tùy mạch muốn dùng làm probe sẽ
sử dụng promoter tương ứng
 RNA polymerase nhận biết
promoter đặc hiệu, gắn vào và tổng hợp
RNA
 Nucleotide tự do dùng trong quá
trình phiên mã có mang một phần
nucleotide đánh dấu

 Kết quả là mẫu dò RNA đánh dấu
(riboprobe)
12


TỔNG HP MẪU DÒ RNA BẰNG PCR VÀ PHIÊN
MÃ IN VITRO
gene A

PCR

T7 promoter

Phiên mã in vitro với T7 RNA
polymerase
Mẫu dò RNA
Thay vì tạo dòng thì sử dụng PCR để gắn thêm trình tự promoter phù hợp

Quá trình tiếp theo giống như tạo dòng

13


Các dạng lai
• Lai trong pha lỏng
• Lai trong pha rắn
• Lai tại chổ

Eastern blot
14


LAI TRONG PHA LỎNG
Kit HC2 phát hiện HPV (Human Papillomavirus) trong bệnh phẩm, dựa vào nguyên tắc lai trong pha lỏng

Thu nhận
bênh phẩm.
Tách chiết
DNA

Biến tính
DNA

Lai với mẫu
dị HPV
RNA

Bắt giữ

phân tử lai
DNA-RNA
bằng kháng
thể nhận
biết phân tử
lai DNARNA

Phát hiện
phân tử lai
bằng kháng
thể nhận
biết phân tử
lai DNARNA

Bổ sung cơ
chất, và đọc
kết quả

15


SOUTHERN BLOT

16


LAI TRÊN PHA RẮN
SOUTHERN BLOT – CHUYỂN THẨM

Điện chuyển thẩm

Chuyển thẩm thụ động theo lực mao dẫn


SOUTHERN BLOT (tiếp)

Tách chiết & cắt DNA
bằng enzyme giới hạn

Điện di

Chuyển lên màng lai

Biến tính DNA

Lai và phát hiện phân tử lai

Tiền lai

18


LAI TRÊN PHA RẮN & PHÁT
HIỆN PHÂN TỬ LAI BẰNG
ĐỒNG VỊ PHÓNG XẠ
Cố định
DNA lên
màng lai

Lai với mẫu

dò đánh dấu
phóng xạ

Rửa màng lai

Thực hiện phóng
xạ tự ghi

19


SOUTHERN NORTHERN BLOT

20


KẾT QUẢ NORTHERN BLOT

Ghi chú : UN : Mẫu chứng không cảm ứng, 48h : mẫu cảm ứng tạo -globin sau 48 giờ, 96h
: mẫu cảm ứng tạo -globin sau 96 giờ. Mẫu dò đồng vị phóng xạ

21


DOT BLOT
Tách chiết DNA, RNA → Biến tính
(nếu có) → Đặt lên màng lai → Tiền lai
→ Lai với mẫu dò (trình tự đã biết) →
Phát hiện phân tử lai

Dùng để phát hiện, hoặc định lượng
tương đối khi so với thang hàm lượng đã
biết

Phương pháp cải biên là reverse dot
blot. Trình tự đã biết được cố định trên
giá thể còn trình tự cần biết (mục tiêu)
được đánh dấu

22


WESTERN BLOT

Điện di trên gel
polyacrylamide

Chuyển
lên màng
lai

Liên kết với kháng thể 1 &
2. Rửa để loại kháng thể
thừa

Phát hiện màu
thông qua phản ứng
enzyme
23

KẾT QUẢ LAI TRÊN NHIỄM SẮC THỂ

24


CẮT MẪU CHO LAI “TẠI CHỖ” (IN SITU
HYBRIDIZATION)

25