Tải bản đầy đủ (.pdf) (40 trang)

PCR (POLYMERASE CHAIN REACTION)

Bạn đang xem bản rút gọn của tài liệu. Xem và tải ngay bản đầy đủ của tài liệu tại đây (1.98 MB, 40 trang )

PCR (POLYMERASE CHAIN
REACTION)
ThS. Nguyễn Thị Mỹ Nương
Email: ntmnuong@hcmus.edu.vn

1


1. Mục tiêu, nguyên lý

Nội dung

2. Các thành phần phản ứng, thiết lập phản ứng
3. Một số biến thể của PCR:
➢ Reverse transcriptase PCR (RT-PCR)
➢ Hot-start PCR
➢ Assembly PCR

➢ Nested/semi-nested PCR
➢ Allele-specific PCR
➢ Methylation – specific PCR
➢ Quantitative PCR (qPCR)

2


Tài liệu tham khảo

[1] Buckingham, L. (2007). Molecular
diagnostics: Fundamentals, methods, and clinical
applications (1st ed.). Philadelphia: F.A. Davis Co.


3


Nguyên lý PCR
Kary Mullis, Nobel 1993

1969 : Thermus
aquaticus –
Yellowstone National
Park
1976 : Taq polymerase
(Cetus)

1987 : Máy PCR đầu
tiên (Perkin Elmer –
Cetus)
4


Vì sao cần PCR?
Khả năng nhân bản đặc hiệu:
 Gene hiện diện với hàm lượng rất thấp trong mẫu,
không thể phát hiện bằng bất cứ phương pháp nào
 Để “nhìn thấy” gene trong gel agarose, cần  10-20 ng
DNA
Một trình tự 500 bp, 660g/mol bp, sẽ cần 109/500x660
mol (hằng số Avogadro = 6.0223)
→ 1.810 bản sao
Nghĩa là để “nhìn thấy” gene, cần nhân DNA từ 100 tế bào
lên 180 triêu lần

 Khả năng phát hiện và định lượng đặc hiệu một trình tự DNA xác
định trong tập hợp nhiều trình tự DNA
 Phân lập trình tự DNA mục tiêu
Đơn giản

Nhanh
5


Các thành phần của PCR?

6


CÁC THÀNH PHẦN CỦA PHẢN ỨNG PCR
1. Primer (mồi)
Mồi phải thỏa một số điều kiện cơ bản : (1) dài khoảng 18-24 base, (2)
Tm của 2 primer gần nhau, (3) [G:G] 40-60%, (4) không hình thành
primer dimer, (5) không phải là trình tự lặp lại.
2. DNA bản mẫu (template)
Hàm lượng đủ nhưng không quá cao, tinh sạch – không chứa các chất
ức chế phản ứng (SDS, chất ức chế từ mẫu (hemoglobin, sắc tố, ..),
heparin, ..)
3. Nồng độ MgCl2
Cần cho hoạt động của Taq polymerase ; hàm lượng quá cao sẽ tạo
nhiều sản phẩm ký sinh, quá thấp thì làm giảm hiệu quả nhân bản
của enzyme
4. dNTP
Thành phần 4 loại dNTP phải cân bằng ; hàm lượng thường không đổi
nhưng có thể thay đổi tùy điều kiện thực tế

7


CÁC THÀNH PHẦN CỦA PHẢN ỨNG PCR (tiếp)
5. Enzyme
Được chọn tùy mục đích sử dụng :
 Taq DNA polymerase (Thermus aquaticus) : thông dụng nhất, hoạt tính
polymerase khá mạnh (35-100 nu/giây), có hoạt tính 5’3’ exonuclease
Stoffel DNA polymerase : tính chịu nhiệt cao hơn, không có hoạt tính 5’-3’
exonuclease, hoạt động được ở phổ MgCl2 rộng  multiplex PCR
Taq và Stoffel DNA polymerase thêm 1 3’dA vào sản phẩm PCR
 Vent/DeepVent DNA polymerase (Thermococcus litoralis) : tính chịu nhiệt
rất cao, nhân bản được những đọan DNA rất dài, có hoạt tính 3’-5’
exonuclease  tính trung thực cao hơn Taq pol 5-15 lần, tạo sản phẩm “đầu
bằng”
 Pfu DNA polymerase (Pyrococcus furiosus) : có cả 2 hoạt tính 5’-3’ và
3’-5’ exonuclease, tính trung thực cao hơn Taq pol 12 lần, thường dùng trong
cycle sequencing
 Tth DNA polymerase (Thermus thermophilus) : vừa có chức năng
polymerase vừa có chức năng phiên mã ngược (RT)  dùng trong phản ưng
RT-PCR
 UlTma DNA polymerase (Thermotoga maritima) : tính chịu nhiệt rất cao,
có hoạt tính 3’-5’ exonuclease  tính trung thực rất cao

8


CÁC THÀNH PHẦN CỦA PHẢN ỨNG PCR (tiếp)
5. Chương trình PCR :
 Nhiệt độ : biến tính – 94-95C ; lai < Tm của các primer ~ 5C ; kéo

dài - 72C
 Thời gian của từng chu kỳ tùy thuộc thiết bị và kích thước sản phẩm
 Số lượng chu kỳ thường  40

Ví dụ : 1 chu kỳ - 95C – 5‘
35 chu kyø – 94C – 30”
55C – 30”
72C – 45”
1 chu kỳ – 72C – 10’

6. Thiết bị : Những cải tiến máy luân nhiệt liên quan đến (1) microtiter plate
96 giếng, (2) các block nhiệt riêng biệt trong 1 máy, (3) block dùng cho lam
kính để tiến hành in situ PCR.
7. Dụng cụ : Ống Eppendorf “thành mỏng” (thin-wall), đầu tip có phin lọc

9


NHỮNG HẠN CHẾ CỦA KỸ THUẬT PCR – CÁCH KHẮÊC PHỤC
1. Ngoại nhiễm cao do khả năng nhân bản DNA mạnh
2. Sai sót của DNA polymerase trong quá trình tổng hợp
➔ Lặp lại phản ứng PCR nếu cần thiết, sử dụng loại polymerase có tính
trung thực cao như Pfu, DeepVent, UlTma polymerase.
3. Kết quả phụ thuộc rất lớn vào toàn bộ thao tác
➔ Kỹ thuật viên cần được đào tạo tốt, tự động hóa, sử dụng hóa chất pha
sẳn (kit) đã được chuẩn hóa
4. Thiết bị đắt tiền
10



CÁC BIỆN PHÁP THẬN TRỌNG KHI SỬ DỤNG PCR
Một giọt phản ứng PCR chứa 106 bản sao trình tự mục tiêu !!!
1. Tách biệt các khu vực thí nghiệm : pha chế, đặt phản ứng,
phân tích kết quả. Di chuyển theo 1 chiều
2. Sử dụng thiết bị, dụng cụ, vật liệu tiêu hao riêng cho từng
khu vực. Sử dụng tip có phin lọc
3. Thay găng tay, áo blouse, ….
4. Làm sạch khu vực thí nghiệm bằng dung dịch sodium hypochlorite 10 % và làm sạch lại
bằng ethanol
5. Aliquot hóa chất
6. Thiết lập chứng (-)
7. Khử nhiểm
 Chiếu UV 254 – 300 nm, 5-20’, dụng cụ và
hóa chất (trừ bản mẫu)
 Sử dụng UNG (Uracil-N-glycosylase) +
dUTP

11


CÁC PHƯƠNG PHÁP PCR

12


Real-time PCR

• Mục tiêu?

Như PCR, Real-time PCR nhân bản

một trình tự DNA đặc hiệu

• Ngun lý?

• Quy trình - Thiết bị?
• Kết quả?

Cho phép theo dõi tiến trình phản ứng
theo thời gian.
Cho phép định lượng số lượng trình
tự DNA mục tiêu trong mẫu

13


Real-time PCR được sử dụng phổ biến
trong:
• Phân tích biểu hiện gene
• Nghiên cứu ung thư
• Nghiên cứu thuốc,…

Ví dụ: phân tích sự
biểu hiện của gene
BRCA1 trong ung
thư vú

• Chẩn đốn và theo dõi bệnh
• Định lượng virus
Ví dụ: Định lượng
virus HIV trong điều trị


• Xét nghiệm trong thực phẩm
• GMO

…..

Ví dụ: Phát hiện và
định lượng % GMO
14


Tác nhân đánh dấu
Chất nhuộm DNA

Mẫu dò (probe)

Taqman probe

15


Quy trình – thiết bị
• Thành phần phản ứng: tương tự PCR
+ tác nhân phát huỳnh quang
• Quy trình thực hiện: tương tự PCR

• Eppendorf thành mỏng và trong
• Máy Real-time PCR có thêm hệ thống
đọc tín hiệu huỳnh quang liên kết với
máy tính => khơng cần điện di


16


Kết quả

Baseline : tín hiệu huỳnh quang nền
Threshold : nằm phía trên baseline, ở đầu vùng
nhân bản theo hàm mũ
CT (Cycle Threshold) : chu kỳ ngưỡng

17


KẾT QUẢ PCR REAL-TIME
A

B

C

Ct (Cycle threshold - chu kỳ ngưỡng) :
chu kỳ PCR ở đó tín hiệu đặc hiệu vượt
khỏi tín hiệu nền

Ghi chú : đường màu đỏ là t1n hiệu nền

Dựng đường chuẩn (standard
curve) với một chất chuẩn có
nồng độ đã biết.

Hàm lượng của thành phần cần
phát hiện được tính dựa trên
đường chuẩn này

101 bản sao

101 bản sao

18


ĐỊNH LƯỢNG TƯƠNG ĐỐI VÀ TUYỆT ĐỐI
ĐỊNH LƯỢNG TƯƠNG ĐỐI

ĐỊNH LƯỢNG TUYỆT ĐỐI

So sánh hàm lượng giữa hai
trình tự mục tiêu, thông qua tỷ
lệ hàm lượng của chúng

Dựng đường chuẩn (standard curve) với
những nồng độ pha loãng đã biết của 1
amplicon.

Phương pháp : 2

PCR efficiency : được tính dựa trên giá trị
“slope”: -3.32 tương ứng 100 % efficiency.
Slope (-) hơn :  100 % efficiency, (+) hơn :
phản ứng bị ức chế, sai lầm do hút nhả, ..


-C
T

CT = CT mục tiêu – CTtham khảo

CT = CT mẫu thí nghiệm - CTmẫu chứng

19


PHÂN TÍCH ĐƯỜNG CONG NĨNG CHẢY
(MELTING CURVE ANALYSIS)

Đánh giá đặc điểm biến tính của 1 trình tự DNA mạch đơi khi gia nhiệt.
Nhiệt độ ở đó 50 % trình tự DNA biến tính : điểm “nóng chảy”.

Có thể được dùng phối hợp với chất “nhuộm” DNA mạch đôi để phát hiện đặc hiệu 1 sản
phẩm nhân bản xác định.

20


RT-PCR
Gồm 2 bước :
1. RT (Phiên mã
ngược) : tạo cDNA

2. PCR : nhân bản
cDNA

Dùng để nhân bản
RNA

21


Hot-start PCR

HOT-START PCR & PCR “LẮP RÁP”

Nhằm giảm nhân bản
không đặc hiệu xảy ra
trước khi phản ứng
PCR
khởi
động.
Polymerase bị vơ hiệu
hóa do liên kết với
kháng thể (trái), với
một số chất ức chế
enzyme hoặc do bị thu
giữ Mg2+ (phải)

PCR “lắp ráp) (Assembly PCR)
Nhằm tổng hợp 1 trình tự DNA dài từ
một hỗn hợp primer có mang một phần
trình tự chồng lắp

22



Nested / Semi-nested PCR

Nested / Semi-nested PCR : sử
dụng 1 cặp mồi “ngoài” và 1
mồi/1 cặp mồi “trong” để tăng
tính đặc hiệu và độ nhạy của
phản ứng PCR

23


Multiplex PCR
Multiplex PCR : sử dụng
nhiều hơn 1 cặp mồi
trong 1 phản ứng PCR
để phát hiện đồng thời
nhiều trình tự DNA của 1
tác nhân (A) hay nhiều
tác nhân (B

24


AS (Allele-specific) PCR
Nhân bản với nhiệt độ bắt
cặp primer “khắc nghiệt”,
primer có đầu 3’ khơng bổ
sung (mismatch) sẽ khơng
bắt cặp

khơng nhân bản

Nhằm phát hiện SNV (SingleNucleotide Variations)

25


Tài liệu bạn tìm kiếm đã sẵn sàng tải về

Tải bản đầy đủ ngay
×