VŨ THU HUYỀN NGHIÊN cứu xây DỰNG QUY TRÌNH ĐỊNH LƯỢNG AZITHROMYCIN BẰNG PHƯƠNG PHÁP QUANG PHỔ HỒNG NGOẠI với kỹ THUẬT đo PHẢN xạ TOÀN PHẦN SUY GIẢM (ATR) LUẬN văn THẠC sĩ dược học

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

BỘ Y TẾ

TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

VŨ THU HUYỀN

NGHIÊN CỨU XÂY DỰNG QUY TRÌNH
ĐỊNH LƯỢNG AZITHROMYCIN
BẰNG PHƯƠNG PHÁP QUANG PHỔ
HỒNG NGOẠI VỚI KỸ THUẬT
ĐO PHẢN XẠ TOÀN PHẦN SUY GIẢM
(ATR)
LUẬN VĂN THẠC SĨ DƯỢC HỌC
CHUYÊN NGÀNH:KIỂM NGHIỆM THUỐC VÀ ĐỘC CHẤT
MÃ SỐ: 8720210
Người hướng dẫn khoa học:
PGS.TS. Lê Đình Chi, Trường Đại học Dược Hà Nội
NCS. ThS. Bùi Văn Trung, Trường Đại học Dược Hà Nội

HÀ NỘI 2022


LỜI CẢM ƠN
Tơi xin được bày tỏ sự kính trọng và lòng biết ơn sâu sắc tới PGS. TS. Lê Đình
Chi và NCS. ThS. Bùi Văn Trung đã dành tâm huyết và tận tình chỉ bảo, hướng dẫn
tơi trong suốt thời gian thực hiện và hồn thành luận văn.
Tơi xin được gửi lời cảm ơn sâu sắc và chân thành tới PGS. TS. Lê Đình Chi đã
cho tơi những lời khuyên quý báu, dành nhiều thời gian và tạo điều kiện tối đa giúp đỡ
tơi hồn thành luận văn này.

Tơi xin chân thành cảm ơn NCS. ThS. Bùi Văn Trung cùng các anh chị ở Viện
kiểm nghiệm thuốc Trung ương đã tạo điều kiện và nhiệt tình giúp đỡ tơi trong thời gian
thực hiện luận văn.
Tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành tới Ban Giám Hiệu, phòng Sau đại học, bộ
mơn Hóa phân tích và độc chất – trường Đại học Dược Hà Nội, cùng các thầy cô đã
giảng dạy và giúp đỡ tơi trong q trình học tập tại trường.
Cuối cùng, tôi xin gửi lời cảm ơn đến gia đình và bạn bè – những người đồng
hành khơng thể thiếu trong học tập và cuộc sống đã luôn động viên và khích lệ tơi.
Tơi xin chân thành cảm ơn!
Hà Nội, ngày

tháng năm 2022

Học viên

Vũ Thu Huyền


MỤC LỤC
DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT .........................................................i
DANH MỤC CÁC HÌNH ........................................................................................... iii
DANH MỤC CÁC BẢNG........................................................................................... iii
ĐẶT VẤN ĐỀ.................................................................................................................1
Chương 1. TỔNG QUAN ............................................................................................3
1.1. Tổng quan về Azithromycin ..................................................................................3
1.1.1. Cơng thức cấu tạo ...........................................................................................3
1.1.2. Tính chất .........................................................................................................3
1.1.3. Dược động học ................................................................................................4
1.1.4. Cơ chế và tác dụng dược lý.............................................................................4
1.1.5. Tác dụng không mong muốn ..........................................................................4

1.1.6. Chỉ định ...........................................................................................................4
1.1.7. Dạng bào chế...................................................................................................4
1.2. Các phương pháp định lượng Azithromycin .......................................................5
1.2.1. Phương pháp vi sinh vật..................................................................................5
1.2.2. Phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao với detector điện hóa ......................5
1.2.3. Phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao với detector UV ..............................5
1.3. Quang phổ hồng ngoại và khả năng ứng dụng trong phân tích thuốc ..............6
1.3.1. Nguyên lý của phổ quang phổ hồng ngoại .....................................................6
1.3.2. Các kỹ thuật đo bằng quang phổ hồng ngoại ................................................10
1.3.3. Ưu điểm của phương pháp quang phổ hồng ngoại .......................................15
1.3.4. Nhược điểm của phương pháp quang phổ hồng ngoại .................................16
1.4. Một số phương pháp tốn hóa (Chemometrics) thường được sử dụng trong
phân tích quang phổ ....................................................................................................16
1.4.1. Ứng dụng thống kê đa biến trong định tính thuốc bằng phương pháp quang
phổ hồng ngoại ........................................................................................................16


1.4.2. Ứng dụng hồi quy tuyến tính đa biến trong xây dựng quy trình định lượng
thuốc bằng quang phổ hồng ngoại ..........................................................................20
Chương 2. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ............................26
2.1. Nguyên vật liêu, thiết bị và đối tượng nghiên cứu .............................................26
2.1.1. Nguyên vật liệu .............................................................................................26
2.1.2. Thiết bị và dụng cụ .......................................................................................26
2.1.3. Đối tượng nghiên cứu ...................................................................................26
2.2. Phương pháp nghiên cứu .....................................................................................27
2.2.1. Xác định hàm lượng Azithromycin trong mẫu đối chiếu .............................27
2.2.2. Xây dựng qui trình định lượng Azithromycin bằng quang phổ hồng ngoại.27
2.3. Thẩm định phương pháp phân tích đã xây dựng ..............................................28
2.4. Phương pháp xử lý số liệu bằng phần mềm TQ Analyst ..................................28
Chương 3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU .......................................................................34

3.1. Định lượng Azithromycin trong mẫu đối chiếu bằng phương pháp HPLC ...34
3.2. Xây dựng phương pháp định lượng bằng quang phổ IR .................................36
3.2.1. Khảo sát phổ hồng ngoại chất chuẩn nội ......................................................36
3.2.2. Khảo sát điều kiện đo phổ .............................................................................46
3.2.3. Xác định tỉ lệ phối trộn giữa bột viên và chuẩn nội ......................................46
3.2.4. Xây dựng mơ hình định lượng bằng phần mềm TQ Analyst .......................50
3.2.5. Kết quả các mô hình định lượng các mẫu viên được xây dựng....................57
3.2.6. Định lượng Azithromycin trong các mẫu viên bằng mơ hình đã xây dựng .61
3.3. Thẩm định các mơ hình định lượng đã xây dựng..............................................63
3.3.1. Độ đặc hiệu ...................................................................................................63
3.3.2. Độ tuyến tính.................................................................................................63
3.3.3. Độ đúng .........................................................................................................64
3.3.4. Khoảng xác định ...........................................................................................68
3.3.5. Độ chính xác trung gian ................................................................................68


3.3.6. So sánh kết quả định lượng Azithromycin bằng phương pháp quang phổ
hồng ngoại và phương pháp HPLC.........................................................................70
Chương 4. BÀN LUẬN ...............................................................................................74
4.1. Lựa chọn kỹ thuật đo ...........................................................................................74
4.2. Về quy trình định lượng Azithromycin trong các chế phẩm viên nén bằng
phương pháp quang phổ hồng ngoại với kỹ thuật đo phản xạ tồn phần suy giảm
(ATR) ............................................................................................................................74
4.2.1. Xây dựng mơ hình định lượng bằng phần mềm TQ Analyst .......................74
4.2.2. Thẩm định phương pháp ...............................................................................75
4.2.3. So sánh kết quả định lượng Azithromycin bằng phương pháp quang phổ
hồng ngoại với kỹ thuật đo phản xạ toàn phần suy giảm và phương pháp sắc ký
lỏng hiệu năng cao ..................................................................................................75
4.3. Ứng dụng về phương pháp quang phổ hồng ngoại với kỹ thuật đo phản xạ toàn
phần suy giảm (ATR) trong định lượng Azithromycin trong các chế phẩm thương

mại…………………………………………………………………………………….76
KẾT LUẬN ..................................................................................................................79
TÀI LIỆU THAM KHẢO
PHỤ LỤC


DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT
Viết tắt

Tiếng Anh

Tiếng Việt

Artificial neuron network

Mạng nơron nhân tạo

Association of Official Analytical

Hiệp hội các nhà hố phân

Chemists

tích chính thống

ATR

Attenuated Total Refelectance

Phản xạ tồn phần suy giảm

AZI

Azithromycin

CA

Cluster analysis

CLS

Classical least square

DA

Discriminant analysis

Phân tích biệt thức

EMA

European Medicines Agency

Cơ quan Y tế châu Âu

FIR

Far Infrared

Hồng ngoại xa

ANN
AOAC

HPLC

Phân tích nhóm
Bình phương tối thiểu thơng
thường

High Performance Liquyd

Sắc ký lỏng hiệu năng cao

Chromatography

Hội nghị quốc tế về hài hòa
ICH

International Council for Harmonisation hóa các thủ tục đăng ký dược
phẩm sử dụng cho con người

IR
LC-MS

Infrared

Hồng ngoại

Liquid chromatography-mass

Sắc ký lỏng khối phổ

spectrometry

MIR

Mid Infrared

Hồng ngoại giữa

MLS

Multiple linear regression

Hồi quy đa biến tuyến tính

NIR

Near Infrared

Hồng ngoại gần

PCA

Principal component analysis

Phân tích thành phần chính

i

PCR

Principal component regression

Hồi quy thành phần chính

PLS

Partial Least Square

Bình phương tối thiểu

RMSEC

Root mean square error of calibration

Căn bậc hai sai số trung bình
của hiệu chuẩn

Root mean square error of cross

Căn bậc hai sai số trung bình

validation

của đánh giá chéo

RSD

Relative Standard Deviation

Độ lệch chuẩn tương đối

UV

Ultraviolet

Tia cực tím

RMSEV

ii


DANH MỤC CÁC HÌNH
Hình 1.1. Mơ hình các kiểu dao động hóa trị của phân tử ..............................................7
Hình 1.2. Mơ hình các kiểu dao động uốn của phân tử ...................................................8
Hình 1.3. Giản đồ phân bố thế năng dao động trong phân tử .........................................9
Hình 1.4. Kỹ thuật đo truyền qua (a) và phản xạ truyền qua (b) ...................................10
Hình 1.5. Kỹ thuật đo phản xạ truyền qua .....................................................................12
Hình 1.6. Kỹ thuật đo phản xạ khuếch tán ....................................................................14
Hình 1.7. Mơ hình xử lý số liệu của phương pháp ANN ..............................................20
Hình 2.8. Giao diện mục Desciption trong phần mềm TQ Analyst ..............................29
Hình 2.9. Giao diện mục Pathlength trong phần mềm TQ Analyst ..............................29
Hình 2.10. Giao diện mục Components trong phần mềm TQ Analyst .........................30
Hình 2.11. Giao diện mục Standards trong phần mềm TQ Analyst ..............................30
Hình 2.12. Giao diện mục Spectra trong phần mềm TQ Analyst .................................31
Hình 2.13. Giao diện mục Regions trong phần mềm TQ Analyst ................................31

Hình 2.14. Giao diện mục Corrections trong phần mềm TQ Analyst ...........................32
Hình 2.15. Giao diện mục Other trong phần mềm TQ Analyst ....................................32
Hình 2.16. Giao diện mục Report trong phần mềm TQ Analyst...................................33
Hình 3.17. Phổ hồng ngoại FT-IR-ATR của Paracetamol và Azithromycin số sóng từ
400 cm-1 đến 2000 cm-1..................................................................................................38
Hình 3.18. Phổ hồng ngoại FT-IR-ATR của Paracetamol và Azithromycin số sóng từ
1300 cm-1 đến 1750 cm-1................................................................................................39
Hình 3.19. Phổ hồng ngoại FT-IR-ATR của Azithromycin và Aziwok 500 số sóng từ
400 cm-1 đến 2000 cm-1..................................................................................................40
Hình 3.20. Phổ hồng ngoại FT-IR-ATR của Azithromycin và Aziwok 500 số sóng từ
1300 cm-1 đến 1750 cm-1................................................................................................41
Hình 3.21. Phổ hồng ngoại FT-IR-ATR của Azithromycin và Cadiazith 500 số sóng từ
400 cm-1 đến 2000 cm-1..................................................................................................42
Hình 3.22. Phổ hồng ngoại FT-IR-ATR của Azithromycin và Cadiazith 500 số sóng từ
1300 cm-1 đến 1750 cm-1................................................................................................43

iii


Hình 3.23. Phổ hồng ngoại FT-IR-ATR của Azithromycin và Pyme Azi 500 số sóng từ
400 cm-1 đến 2000 cm-1..................................................................................................44
Hình 3.24. Phổ hồng ngoại FT-IR-ATR của Azithromycin và Pyme Azi 500 số sóng từ
1300 cm-1 đến 1800 cm-1................................................................................................45
Hình 3.25. Phổ hồng ngoại FT-IR-ATR của Azithromycin, Paracetamol và một số tá
dược nghiên cứu số sóng từ 400 cm-1 đến 2000 cm-1 ....................................................48
Hình 3.26. Phổ hồng ngoại FT-IR-ATR của Azithromycin, Paracetamol và một số tá
dược nghiên cứu số sóng từ 1300 cm-1 đến 1800 cm-1 ..................................................49
Hình 3.27. Phổ hỗn hợp bột Aziwok 500 và Paracetamol ở các giá trị α khác nhau số
sóng từ 400 cm-1 đến 2000 cm- ......................................................................................51
Hình 3.28. Phổ hỗn hợp bột Aziwok 500 và Paracetamol ở các giá trị α khác nhau số

sóng từ 1300 cm-1 đến 1750 cm-1 ..................................................................................52
Hình 3.29. Phổ hỗn hợp bột Cadiazith 500 và Paracetamol ở các giá trị α khác nhau số
sóng từ 400 cm-1 đến 2000 cm-1 ....................................................................................53
Hình 3.30. Phổ hỗn hợp bột Cadiazith 500 và Paracetamol ở các giá trị α khác nhau số
sóng từ 1300 cm-1 đến 1750 cm-1 ..................................................................................54
Hình 3.31. Phổ hỗn hợp bột Pyme Azi 500 và Paracetamol ở các giá trị α số sóng từ 400
cm-1 đến 2000 cm-1 ........................................................................................................55
Hình 3.32. Phổ hỗn hợp bột Pyme Azi 500 và Paracetamol ở các giá trị α khác nhau số
sóng từ 1300 cm-1 đến 1750 cm-1 ..................................................................................56
Hình 3.33. Mơ hình định lượng Aziwok bằng phương pháp quang phổ hồng ngoại ...58
Hình 3.34. Mơ hình định lượng Cadiazith 500 bằng phương pháp quang phổ hồng ngoại
.......................................................................................................................................59
Hình 3.35. Mơ hình định lượng Pyme Azi 500 bằng phương pháp quang phổ hồng ngoại
.......................................................................................................................................61
Hình 3.36. Kết quả xác định giá trị α từ mô hình định lượng Azithromycin trong mẫu
viên Aziwok 500 ............................................................................................................62

iv


DANH MỤC CÁC BẢNG
Bảng 1.1. Điều kiện sắc ký lỏng hiệu năng cao định lượng Azithromycin .....................5
Bảng 2.2. Thông tin các mẫu nghiên cứu ......................................................................26
Bảng 3.3. Độ thích hợp hệ thống định lượng Azithromycin bằng HPLC .....................34
Bảng 3.4. Kết quả xác định hàm lượng dược chất trong viên nén Aziwok 500 ...........35
Bảng 3.5. Kết quả xác định hàm lượng dược chất trong viên nén Cadiazith 500 (lô
0020720) ........................................................................................................................35
Bảng 3.6. Kết quả xác định hàm lượng dược chất trong viên nén PYME-Azi 500 ......36
Bảng 3.7. Khoảng phổ nghiên cứu của các mẫu viên ...................................................57
Bảng 3.8. Giá trị α sử dụng để xây dựng mơ hình định lượng Aziwok 500 .................58

Bảng 3.9. Giá trị α sử dụng để xây dựng mơ hình định lượng Cadiazith 500 ..............59
Bảng 3.10. Giá trị α sử dụng để xây dựng mơ hình định lượng Pyme Azi 500 ............60
Bảng 3.11. Kết quả đánh giá độ tuyến tính của các mơ hình định lượng Azithromycin
.......................................................................................................................................63
Bảng 3.12. Kết quả đánh giá nội mơ hình của các mơ hình định lượng Azithromycin 64
Bảng 3.13. Độ đúng và độ lặp lại Aziwok 500 .............................................................65
Bảng 3.14. Độ đúng Pyme Azi 500 ...............................................................................66
Bảng 3.15. Độ đúng Cadiazith 500 ...............................................................................67
Bảng 3.16. Độ chính xác trung gian Aziwok 500 .........................................................68
Bảng 3.17. Độ chính xác trung gian Pyme Azi 500 ......................................................68
Bảng 3.18. Độ chính xác trung gian Cadiazith 500.......................................................69
Bảng 3.19. Độ thích hợp hệ thống phương pháp HPLC (đánh giá mẫu sau 1 tháng) ...70
Bảng 3.20. Kết quả định lượng dược chất trong các chế phẩm sau 1 tháng bằng phương
pháp HPLC ....................................................................................................................70
Bảng 3.21. Kết quả định lượng dược chất trong các chế phẩm sau 1 tháng bằng phương
pháp quang phổ hồng ngoại ...........................................................................................71
Bảng 3.22. Bảng so sánh kết quả thu được từ phương pháp HPLC và phương pháp quang
phổ hồng ngoại (FT – IR) ..............................................................................................73

v


ĐẶT VẤN ĐỀ
Kiểm sốt chất lượng thuốc lưu hành ngồi thị trường là một nhu cầu cấp thiết vì
nó cho phép nâng cao hiệu quả điều trị cho người bệnh đồng thời giảm thiểu hậu quả
của việc người bệnh sử dụng thuốc giả, thuốc kém chất lượng. Đặc biệt, với công nghệ
ngày càng phát triển, thuốc giả, thuốc kém chất lượng đang là một mối nguy hiểm
thường trực ảnh hưởng tới sức khỏe cộng đồng cũng như đe dọa đến lợi ích và uy tín
của các cơng ty sản xuất dược phẩm.
Phương pháp thường qui được sử dụng đang được sử dụng để kiểm soát chất lượng

thuốc như sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC), sắc ký lỏng khối phổ (LC – MS)… cho
kết quả với độ chính xác cao. Tuy nhiên các phương pháp trên có nhược điểm tốn nhiều
thời gian, dung mơi hóa chất và nhân lực. Để kiểm soát được chất lượng tất cả các thuốc
đang lưu hành trên thị trường cũng như kiểm soát được thuốc ở các khâu trong quá trình
sản xuất là vấn đề rất khó khăn.
Khoảng 10 năm gần đây, các phương pháp quang phổ như quang phổ cận hồng
ngoại, phổ Raman, phổ hồng ngoại đo phản xạ toàn phần suy giảm (IR-ATR) đang được
khai thác nhiều nhờ khả năng phân tích nhanh, ít phải chuẩn bị mẫu, ít tốn kém và ít
nguy hại đến con người cũng như môi trường. Các phương pháp này hiện tại đang được
ứng dụng chủ yếu để định tính và bán định lượng các dược chất trong mẫu thuốc hoặc
kiểm soát nguyên liệu đầu vào trong sản xuất [3, 4, 5, 6].
Phương pháp quang phổ hồng ngoại với kiểu đo phản xạ toàn phần suy giảm đảm
bảo được độ chọn lọc, sự đặc trưng tín hiệu của mẫu phân tích như phổ hồng ngoại với
kiểu đo truyền qua, nhưng nhờ cách đo phản xạ, việc chuẩn bị mẫu trở nên đơn giản,
gọn nhẹ hơn nhiều so với kiểu đo truyền qua. Để vừa tận dụng được ưu thế của phương
pháp quang phổ này, vừa nâng cao được độ chính xác trong các ứng dụng định lượng,
cần phải có những cải thiện về phương pháp chuẩn bị mẫu cũng như trong phương pháp
xử lý dữ liệu phân tích.
Đề tài luận văn thạc sĩ “Nghiên cứu xây dựng quy trình định lượng Azithromycin
bằng phương pháp quang phổ hồng ngoại với kỹ thuật đo phản xạ toàn phần suy giảm
(ATR)” được triển khai nhằm minh chứng cho khả năng áp dụng phương pháp quang
phổ hồng ngoại với kỹ thuật đo phản xạ toàn phần suy giảm, so sánh với phương pháp
1


định lượng Azithromycin truyền thống bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC), vừa cho
thấy những cải tiến nhằm nâng cao độ chính xác của phương pháp này trong định lượng
Azithromycin ở một số chế phẩm viên nén đang lưu hành trên thị trường.
Đề tài được thực hiện với các mục tiêu sau:
1. Xây dựng và thẩm định quy trình định lượng Azithromycin bằng phương pháp

quang phổ hồng ngoại với kỹ thuật đo phản xạ toàn phần suy giảm (ATR) trên một số
nền chế phẩm viên nén.
2. So sánh kết quả định lượng Azithromycin trong một số chế phẩm viên nén
thương mại bằng phương pháp quang phổ hồng ngoại với kỹ thuật đo phản xạ toàn phần
suy giảm (ATR) và phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC).

2


Chương 1. TỔNG QUAN
1.1. Tổng quan về Azithromycin
1.1.1. Công thức cấu tạo

Công thức cấu tạo của Azithromycin [41]
Công thức cấu phân tử: C38H72N2O12. x H2O
Tên khoa học: (2R,3S,4R,5R,8R,10R,11R,12S,13S,14R)-13-[(2,6-Dideoxy-3-Cmethyl-3-O-methyl- -L-ribo-hexopyranosyl)oxy]-2-ethyl-3,4,10-trihydroxy-3,5,6,8,
10,12,14-heptamethyl-11-[[3,4,6-trideoxy-3-(dimethylamino)-β-D-xylohexopyranosyl
]oxy]-1-oxa-6-azacyclopentadecan-15-one.
1.1.2. Tính chất
* Tính chất vật lý: AZI tinh khiết có dạng bột, màu trắng (hoặc trắng ngà), không
mùi, vị đắng. AZI không tan trong nước, dễ tan trong dung môi hữu cơ như ethanol,
methanol, aceton, diethyl ether, chloroform và dung dịch acid hydrochloric lỗng [10].
* Tính chất hóa học: AZI có tính base yếu (pKa khoảng 8,7), tạo muối dễ tan trong
nước với các acid vơ cơ và hữu cơ, có khả năng tạo phản ứng màu với các acid như HCl,
H2SO4 [10].

3


1.1.3. Dược động học

AZI hấp thu nhanh và sinh khả dụng đường uống đạt khoảng 40%, thức ăn làm
giảm hấp thu thuốc.
Phân bố: Phân bố rộng khắp cơ thể.
Chuyển hóa – thải trừ: Một lượng nhỏ AZI bị khử methyl trong gan, được đào thải
qua mật ở dạng không biến đổi và một phần ở dạng chuyển hóa [2].
1.1.4. Cơ chế và tác dụng dược lý
AZI tác động bằng cách gắn vào tiểu đơn vị 50S của ribosom và qua đó ức chế sự
tổng hợp protein của vi khuẩn. AZI có phổ kháng khuẩn rộng và sau khi uống nồng độ
đỉnh trong huyết tương đạt sau 2-3 giờ.
AZI là một kháng sinh có phổ rộng, có tác dụng tốt trên các vi khuẩn Gram (+)
như Streptococcus, Pneumococcus, Staphylococcus aureus, v.v. và Gram (-) như
Haemophilus influenza, Neissria gonorrhoreae, v.v. [2].
1.1.5. Tác dụng không mong muốn
AZI được dung nạp tốt, tỷ lệ gặp tác dụng không mong muốn thấp, hay gặp nhất
là chứng rối loạn tiêu hóa với các triệu chứng như đau bụng, buồn nơn…
Ảnh hưởng tới thính giác: AZI sử dụng liều cao, lâu dài có thể ảnh hưởng giảm
sức nghe có phục hồi ở một số người bệnh [2].
1.1.6. Chỉ định
AZI được chỉ định trong các trường hợp nhiễm khuẩn như nhiễm khuẩn đường hô
hấp dưới (viêm phổi, viêm phế quản, các nhiễm khuẩn da và mô mềm, viêm tai giữa),
nhiễm khuẩn đường hô hấp trên (viêm xoang, viêm họng, viêm amidan), nhiễm khuẩn
đường hô hấp trên (viêm xoang, viêm họng, viêm amidan), nhiễm khuẩn đường sinh
dục chưa biến chứng do các chủng vi khuẩn nhạy cảm. [2].
1.1.7. Dạng bào chế
Viên nang AZI dihydrat tương đương AZI 250 mg và 500 mg.
Bột pha hỗn dịch uống AZI dihydrat tương đương 200 mg AZI/ 5 ml, lọ bột đông
khô pha tiêm 500 mg.
Viên nén và viên nén bao phim tương đương AZI 125 mg, 250 mg, 500 mg [2].

4

1.2. Các phương pháp định lượng Azithromycin
1.2.1. Phương pháp vi sinh vật
Khuếch tán trên đĩa thạch, nuôi cấy và chế tạo nhũ dịch, đo đường kính vịng vơ
khuẩn. Có thể định lượng dùng chủng vi khuẩn sau [8, 36]:
- Bacillus pumilus CMCC (B) 63202
- Bacillus pumilus NCTC 8241
- Micrococcus luteus ATCC 9341
1.2.2. Phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao với detector điện hóa
Định lượng theo chương trình sau [40]:
- Cột L29 (5mm x 4,6cm x 5µm).
- Detector điện hóa.
- Tốc độ dịng: 1,5 ml/ phút.
- Thể tích tiêm: 50 µl.
- Pha động: 5,8g kalidihydrophosphat trong 2130 ml nước và 870 ml acetonitril.
Dùng khoảng 6 ml dung dịch kali hydroxyd 10N điều chỉnh đến pH 11,0 ± 0,1. Lọc qua
giấy lọc có kích thước lỗ 0,5 µm.
- Pha dung dịch chuẩn và dung dịch thử ở nồng độ 0,0033 mg/ml trong pha động.
Lọc qua giấy lọc có kích thước lỗ 0,5 µm.
1.2.3. Phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao với detector UV
Bảng 1.1. Điều kiện sắc ký lỏng hiệu năng cao định lượng Azithromycin
TLTK

[18]

[41]

[6]

Cột: Octadecylsilyl vinyl Cột Inertsil ODS-3 (150 Cột C18 (250 x 4,6 mm x
polymer (250 x 4,6 mm x 5 x 4,6 mm x 5 µm)
Điều

5 µm)

µm), nhiệt độ 40°C

kiện sắc Detector UV 215 nm
ký
Tốc độ dịng: 1,0 ml/phút
Thể tích tiêm mẫu: 10 µl

Detector UV: 215 nm

Detector UV: 210 nm

Tốc độ dòng: 1,0 ml/phút Tốc độ dịng: 2,0 ml/phút
Thể tích tiêm mẫu: 20 µl Thể tích tiêm: 100 µl

5


[18]

TLTK

Pha động: Acetonitril - Pha
dung

dịch

[41]

[6]
động:

Đệm Pha động: Acetonitril –

dikalihydro phosphate – acetonitril – Đệm (65:35). Đệm: hòa

phosphat 6,7 g/l điều chỉnh methanol

(35:45:20), tan 4,6g kali phosphat

tới pH 11,0 bằng kali điều chỉnh pH=8 bằng trong 900 ml nước, điều
hydroxid (60 : 40)
amoniac
hay
acid chỉnh pH=7,5 bằng natri
phosphoric. Điều chỉnh hydroxyd và pha lỗng với
tỷ lệ nếu cần
Nồng

nước tới thể tích 1L

Dung dịch thử và dung Dung dịch chuẩn và dung Dung dịch chuẩn và dung

độ làm dịch chuẩn được pha ở dịch thử được pha ở nồng dịch thử được pha ở nồng
việc

nồng độ 1 mg/ml trong hỗn độ 2 mg/ml bằng pha độ 1 mg/ml bằng pha
hợp dung môi acetonitril – động. Lắc đều và lọc qua động. Lắc đều và lọc qua
dung

dịch

dikalihydro màng lọc 0,5 µm

màng lọc 0,45 µm

phosphat 6,7 g/l điều chỉnh
tới pH 11,0 bằng acid
phosphoric (40:60)
Định lượng Azithromycin bằng các phương pháp thường qui như sắc ký lỏng hiệu
năng cao đều phải sử dụng dung môi hữu cơ như acetonitril gây độc hại cho con người
và môi trường, tốn nhiều thời gian chuẩn bị mẫu chuẩn và mẫu thử.
1.3. Quang phổ hồng ngoại và khả năng ứng dụng trong phân tích thuốc
1.3.1. Nguyên lý của phổ quang phổ hồng ngoại
Phổ hồng ngoại (Infrared – IR) là phổ dao động phân tử, trong phân tích nó được
chia thành ba vùng, hồng ngoại gần (Near-Infrared - NIR), hồng ngoại giữa (MidIntrared - MIR) và hồng ngoại xa (Far-Infrared – FIR). Trong đó, phổ hồng ngoại giữa
là được sử dụng nhiều nhất, nhắc đến phổ hồng ngoại thường người ta sẽ nghĩ đến phổ
hồng ngoại giữa, tiếp đến là hồng ngoại gần mới được phát triển khoảng cuối thế kỉ XX,
vùng hồng ngoại xa ít được ứng dụng trong phân tích [4].
Trong phân tử, các liên kết và các nhóm chức có các kiểu dao động như sau:

6


- Dao động duỗi: Dao động duỗi làm thay đổi khoảng cách giữa các nguyên tử

trong phân tử. Gồm dao động duỗi đối xứng và khơng đối xứng (Hình 3.1). Dao động
này cịn được gọi là dao động hóa trị.

Hình 1.1. Mơ hình các kiểu dao động hóa trị của phân tử
- Dao động uốn: Dao động uốn làm thay đổi góc liên kết giữa các nguyên tử trong
phân tử. Có dao động uốn trong mặt phẳng và ngồi mặt phẳng (Hình 1.2).
Trong phân tử, dao động của các nguyên tử cũng tồn tại ở các trạng thái khác nhau,
được xếp theo bậc dựa vào các mức năng lượng của chúng. Ở điều kiện thường, chúng
dao động ở trạng thái cơ bản (bậc 0) và càng lên bậc cao, năng lượng dao động của phân
tử càng lớn. Khi hai nguyên tử có khối lượng lần lượt m1 và m2 thì tần số dao động của
liên kết được xác định bởi công thức:

7


Trong đó: k là hệ số đàn hồi của liên kết và m được xác định từ m1 và m2 theo cơng
thức

.

Hình 1.2. Mơ hình các kiểu dao động uốn của phân tử
Năng lượng dao động thực tế của phân tử được ngoại suy từ phép tính gần đúng
của phương trình Schrodinger, cịn được gọi là phương trình thế năng Morse. Biểu diễn
phương trình thế năng ấy dưới dạng số sóng như sau:

Ở phương trình trên,
cách hai ngun tử là re;

là tần số góc dao động tương ứng với trạng thái mà khoảng
là số thứ tự của bậc năng lượng đang xét;

là các hằng

số, trong đó
Khi làm gần đúng thêm bước nữa, bỏ bớt số hạng từ thứ ba trở đi, phương trình có
dạng là:

8


Đây là phương trình gần đúng của biểu thức thế năng dao động của phân tử thường
được sử dụng trong các tài liệu.
Giản đồ phân bố năng lượng như sau:

Hình 1.3. Giản đồ phân bố thế năng dao động trong phân tử
Từ giản đồ trên có thể thấy khi tương tác với các bức xạ IR thích hợp, phân tử sẽ
hấp thụ một phần năng lượng để chuyển lên trạng thái dao động cao hơn, kết quả là tạo
nên các dải dịch chuyển trên phổ đồ của chất phân tích. Các chuyển dịch xảy ra từ mức
năng lượng cơ bản (bậc 0) lên trạng thái dao động bậc 1 thì gọi là các dải chuyển dịch
cơ bản. Các dịch chuyển xảy ra giữa trạng thái dao động cơ bản và các mức năng lượng
có bậc cao hơn (từ bậc 2 trở lên) được gọi là các overtone.
Các dao động rung lắc, uốn và xoay dễ xảy ra hơn các dao động dọc theo trục và
chúng cần năng lượng nhỏ hơn năng lượng tạo các overtone. Các bức xạ trong vùng
MIR và FIR tạo nên các dịch chuyển cơ bản. Bức xạ vùng FIR có bước sóng dài, năng
lượng yếu, ít làm thay đổi trạng thái dao động, có chăng chỉ làm thay đổi được các trạng
thái rung lắc đơn giản. Phổ FIR ít được ứng dụng trong phân tích [11].
Các bức xạ vùng MIR có năng lượng phù hợp với nhiều loại liên kết nên rất dễ bị
hấp thụ, cường độ các dải hấp thụ lớn. Mỗi liên kết hấp thụ một dải sóng đặc trưng khác
nhau và tách biệt nhau rõ ràng. Vì thế, mỗi dải trong phổ MIR đặc trưng cho từng kiểu
dao động khác nhau của mỗi liên kết khác nhau. Tập hợp các dải trong phổ MIR đặc

trưng cho một chất khác nhau. Trong phân tích, phổ MIR được xem là phổ vân tay để
xác định các chất. Phân tích phổ MIR cịn có thể xác định được cấu trúc phân tử các chất
phân tích.
9


Đối với các bức xạ trong vùng NIR, do có năng lượng lớn nên khi tương tác với
phân tử chất phân tích sẽ có hai khả năng xảy ra:
- Làm thay đổi trạng thái dao động phân tử từ cơ bản lên các bậc cao 2,3,4… tạo
nên overtone.
- Làm các dao động cơ bản khác nhau trong phân tử xảy ra đồng thời.
1.3.2. Các kỹ thuật đo bằng quang phổ hồng ngoại
* Kỹ thuật đo truyền qua

a)

b)

Hình 1.4. Kỹ thuật đo truyền qua (a) và phản xạ truyền qua (b)
Kỹ thuật đo truyền qua có thể chia ra làm hai kỹ thuật nhỏ là kỹ thuật đo truyền
qua đơn thuần và kỹ thuật phản xạ truyền qua. Hai kỹ thuật trên có một vài điểm khác
nhau nhưng chúng có cùng bản chất, đều dựa trên việc xác định tỉ lệ cường độ của chùm
bức xạ trước (Io) và sau khi truyền qua mẫu phân tích (I). Khi bức xạ đi qua mẫu, tỉ lệ
này phụ thuộc vào độ hấp thụ riêng của phân tử ε, nồng độ chất phân tích C, quang trình
l và tuân theo định luật Lambert – Beer:

Trong kỹ thuật truyền qua đơn thuần, bức xạ hồng ngoại truyền một lần duy nhất
qua mẫu đo và tới detector (Hình 1.4 a). Cịn trong kỹ thuật phản xạ truyền qua, người
ta cho bức xạ tới truyền nhiều lần qua mẫu đo bằng cách đựng mẫu đo trong các dụng
cụ đựng mẫu dạng sợi cáp quang, bố trí thiết bị đựng mẫu sao cho ánh sáng tới mẫu đo

được phản xạ tồn phần nhiều lần (Hình 1.4 b). Kỹ thuật này áp dụng cho những mẫu
hấp thụ hồng ngoại ít hoặc nồng độ của nó quá thấp, cần tăng quang trình của mẫu lên
để tăng tín hiệu hấp thụ. Bằng cách sử dụng kỹ thuật phản xạ truyền qua người ta có thể

10


tăng quang trình lên nhiều lần theo mục đích sử dụng dựa vào cách bố trí độ dài và góc
chiếu bức xạ tới [21, 25].
Các kỹ thuật này có ưu điểm là sẽ cố định được quang trình của mẫu đo, do đó
cường độ phổ sẽ ổn định. Chính vì vậy khi thiết kế hệ thống thích hợp người ta hồn
tồn có thể định lượng trực tiếp được mẫu đo. Tuy nhiên, các kỹ thuật này vẫn còn nhiều
vấn đề cần phải khắc phục khi phân tích. Cụ thể như sau:
❖ Nếu sử dụng các kỹ thuật đo này để định tính, phải lựa chọn được quang trình
và tỉ lệ chất phân tích thích hợp cho các mẫu đo. Khi hàm lượng hoặc mật độ phân tử
chất phân tích lớn và quang trình lớn, bức xạ IR bị hấp thụ nhiều sẽ xảy ra các trường
hợp sau: Khi tỉ lệ chất phân tích q nhiều hoặc quang trình q lớn (ở mức độ cao),
toàn bộ phổ đồ sẽ bị mất, khi đó người phân tích dễ dàng nhận ra để điều chỉnh và tất
nhiên việc chuẩn bị mẫu phải thực hiện lại từ đầu. Ở mức độ thấp, các đỉnh hấp thụ sẽ
tù hoặc một phần bức xạ vùng năng lượng thấp sẽ bị che phủ khiến chúng ta rất khó phát
hiện và thậm chí dẫn đến việc kết luận sai về kết quả phân tích. Cịn khi quang trình nhỏ
hoặc mật độ chất phân tích quá nhỏ, độ hấp thụ của tất cả các đỉnh sẽ thấp, các đỉnh hấp
thụ thấp của chất phân tích sẽ bị mất hoặc bị nhầm lẫn với các tín hiệu nhiễu của thiết
bị và cũng dẫn đến khả năng đánh giá sai về tình trạng mẫu đo. Để nhận ra và xử lý được
các tình huống trên cán bộ phân tích phải thực sự có kinh nghiệm phân tích trong lĩnh
vực này.
❖ Nếu muốn áp dụng các kỹ thuật trên để định lượng ngồi việc đảm bảo các hoạt
động bình thường của thiết bị, cịn có nhiều yếu tố cần phải chuẩn hóa.
Trước tiên, phải ổn định được quang trình trong suốt quá trình đo. Yếu tố làm ảnh
hưởng đến quang trình cần chú ý là độ dày mẫu. Khi đo truyền qua phải đựng mẫu trong

các cốc đo cố định. Nếu đo nhiều mẫu ở các cốc khác nhau cần phải kiểm tra độ tương
đồng giữa các cốc về bề dày. Khi đo phản xạ truyền qua cần căn chỉnh được độ dày giữa
các vùng trong mẫu và độ dày của các mẫu đo giữa các lần đo khác nhau. Bên cạnh đó,
góc chiếu cũng là vấn đề quan trọng cần được quan tâm, nhất là trong kỹ thuật đo phản
xạ truyền qua. Rõ ràng góc chiếu thay đổi sẽ làm cho quang trình thay đổi và cường độ
hấp thụ thay đổi và dẫn đến kết quả đo khơng chính xác [14, 16].

11


Dù khắc phục được tất cả các yếu tố trên, phổ IR nếu đo bằng kỹ thuật này vẫn
không thể hiện được ưu điểm hơn các phương pháp quang phổ khác [11].
Nhờ áp dụng các thành tựu khoa học công nghệ, từ phổ hồng ngoại đo truyền qua
(kỹ thuật đo phức tạp, phải chuẩn bị mẫu nhiều thời gian và phép đo bị ảnh hưởng bởi
nhiều yếu tố khác) phổ hồng ngoại đã được phát triển để thành phép đo trực tiếp với
nhiều ưu điểm nổi bật. Cụ thể, các kỹ thuật đo hồng ngoại hiện đại sẽ được sử dụng để
nghiên cứu trong đề tài đó là kỹ thuật đo phản xạ toàn phần suy giảm (Attenuated Total
Reflectance - ATR) và phản xạ khuếch tán (Diffuse Reflection)[4, 42].
* Kỹ thuật đo phản xạ toàn phần suy giảm
Kỹ thuật đo phản xạ toàn phần suy giảm là kỹ thuật mà người ta đặt mẫu đo lên bề
mặt một dụng cụ có cấu tạo bằng các chất đặc biệt gọi là các tinh thể ATR. Các tinh thể
ATR thỏa mãn các điều kiện sau: không hấp thụ bức xạ IR, cho phép bức xạ IR từ tinh
thể đi vào mẫu đo và bề mặt khơng tiếp xúc với mẫu đo thì được phản xạ tồn phần.

a)

b)
Hình 1.5. Kỹ thuật đo phản xạ truyền qua

12

Khi bức xạ IR đi vào lòng các tinh thể ATR, nó sẽ phản xạ một hoặc nhiều lần qua
mẫu đo. Sau mỗi lần phản xạ qua mẫu đo, các bức xạ thích hợp sẽ bị hấp thụ dần và làm
suy giảm cường độ của bức xạ sau khi ra khỏi mẫu phân tích. Vì lý do ấy người ta gọi
đây là kỹ thuật đo phản xạ toàn phần suy giảm. Sau nhiều lần tương tác với mẫu phân
tích như vậy, các đặc trưng phổ của chất phân tích được thể hiện rõ ràng hơn. So sánh
cường độ đầu vào với cường độ đầu ra ta sẽ được phổ IR của mẫu phân tích. Kỹ thuật
này có lợi thế hơn kỹ thuật đo truyền qua vì đã tiến đến việc phân tích trực tiếp mẫu đo,
ít ảnh hưởng bởi các điều kiện trang thiết bị, quang trình… Tuy nhiên, các tinh thể ATR
thường rất đắt dẫn đến giá thành của các thiết bị này cao. Kỹ thuật này cần phải đảm
bảo sự tiếp xúc tốt giữa các tinh thể ATR và mẫu đo [34].
Việc đo phản xạ nhiều lần để tăng cường các đặc tính phổ của chất phân tích chỉ
cần thiết đối với các bức xạ vùng hồng ngoại giữa vì các bức xạ vùng hồng ngoại giữa
có năng lượng thấp, khả năng đâm xuyên kém, không mang được nhiều đặc tính của
mẫu sau 1 lần phản xạ. Ngược lại, đối với bức xạ NIR, năng lượng lớn nên khả năng
đâm xuyên tốt, sau một lần phản xạ đã thể hiện được rất nhiều đặc tính của mẫu, do đó
có thể thu phổ bằng cách cho bức xạ NIR phản xạ trực tiếp trên mẫu đo mà không cần
đến công cụ hỗ trợ nào khác như các tinh thể ATR [35].
Kỹ thuật ATR tạo bước đột phá cho các phép phân tích vùng MIR vì chúng giúp
phân tích mẫu trực tiếp, không cần chuẩn bị mẫu. Đối với vùng NIR, kỹ thuật đo phản
xạ khuếch tán được ưu tiên dùng hơn vì bức xạ NIR có thể chiếu trực tiếp lên mẫu đo
mà không cần tiếp xúc với mẫu qua màng kim cương, không bị tinh thể kim cương hấp
thụ. Đây là lý do mà đa số các ứng dụng của ATR đều được sử dụng cho vùng MIR
[36].
* Kỹ thuật đo phản xạ khuếch tán
Kỹ thuật đo phản xạ khuếch tán là kỹ thuật đo phổ trực tiếp và đơn giản nhất trong
tất cả các kỹ thuật đo phổ IR. Do kỹ thuật đo đơn giản nên thiết bị không cần cấu tạo
đặc biệt. Bức xạ cận hồng ngoại từ thiết bị chiếu trực tiếp vào mẫu đo, detector sẽ được
bố trí hợp lý để thu tín hiệu khuếch tán (khơng phải tín hiệu phản xạ trực tiếp như trong

kỹ thuật ATR) [15, 42]. Những tín hiệu khuếch tán ấy thể hiện đặc trưng của các chất
phân tích. Cấu tạo thiết bị sẽ được trình bày ở mục sau.

13


Hình 1.6. Kỹ thuật đo phản xạ khuếch tán
Trong kỹ thuật đo phản xạ khuếch tán, người ta xây dựng phổ dựa trên tỷ lệ R của
cường độ ánh sáng sau khi phản xạ qua mẫu đo I với cường độ ánh sáng phản xạ qua bề
mặt nền chuẩn hoặc nền mẫu IR:

Khi thâm nhập vào chất phân tích, bức xạ IR truyền một phần năng lượng làm thay
đổi trạng thái dao động của phân tử. Phần năng lượng còn lại được truyền đến detector.
Sự chênh lệch cường độ giữa ánh sáng phản xạ bởi nền mẫu và ánh sáng phản xạ thu
được từ mẫu phân tích tạo nên “độ hấp thụ giả” (lg(IR/I)) ở từng bước sóng tương ứng.
Phổ đồ được xây dựng từ sự thay đổi “độ hấp thụ giả” theo bước sóng của mẫu phân
tích là phổ IR của chất đó.
So với các kỹ thuật trên, kỹ thuật đo phản xạ khuếch tán đang cho thấy nhiều ưu
thế hơn, đó là:

14


- Phép đo phản xạ khuếch tán không phụ thuộc vào độ dày, quang trình của chất
phân tích mà chỉ phụ thuộc vào bản chất và tỉ lệ của chất phân tích trong mẫu phân tích.
Đối với các mẫu đo rắn, người ta chiếu trực tiếp bức xạ IR vào mẫu để đo. Đối với các
mẫu lỏng, người ta thêm các hạt nhỏ phản xạ ánh sáng (quycksand) vào dung dịch, bức
xạ IR khi chiếu vào dung dịch, sau khi tương tác với chất phân tích ở dạng dung dịch,
tín hiệu đầu ra được phản xạ lại và vẫn mang thơng tin về chất phân tích. Điều này cho
phép có thể phân tích nhanh mà khơng cần chuẩn bị hoặc chỉ phải chuẩn bị mẫu rất ít

trong q trình phân tích, tiết kiệm thời gian, chi phí, khơng cần nhiều phụ kiện trợ giúp
(cu vét, cốc đo…), giảm sai số do các yếu tố ngoại lai và tăng độ chính xác của phép đo.
- Các phần mềm phân tích phổ hiện nay có áp dụng các thuật tốn tốn hóa để xử
lý phổ như phổ đạo hàm, PLS, MLR hay PCR. Các phương pháp này cho phép định
lượng được các thành phần chất phân tích dựa vào sự thay đổi tỉ lệ đáp ứng của nó trong
nền mẫu. Khi thay đổi nồng độ chất phân tích, tỉ lệ “độ hấp thụ” của nền mẫu và của
chất phân tích tại các điểm khác nhau cũng thay đổi theo. Kể cả khi có sự thay đổi về
điều kiện đo như thay đổi quang trình, thay đổi độ nén của mẫu… thì tỉ lệ cường độ giữa
các đỉnh vẫn không thay đổi nhiều nên đường chuẩn được xây dựng khá chính xác, ít bị
ảnh hưởng bởi các thay đổi nhỏ trong quá trình đo. Dựa vào sự thay đổi ấy, sử dụng phổ
đạo hàm có thể định tính được mẫu đo. Dựa vào các thuật tốn định lượng PLS, MLR
và PCR có thể thiết lập được đường chuẩn từ phổ chất phân tích và nồng độ tương ứng.
Sử dụng đường chuẩn ấy, đo phổ của chất phân tích và có thể xác định được hàm lượng
của chất phân tích trong mẫu.
Kỹ thuật đo phản xạ khuếch tán được ứng dụng chủ yếu cho các thiết bị đo phổ
cận hồng ngoại.
1.3.3. Ưu điểm của phương pháp quang phổ hồng ngoại
Phổ hồng ngoại về cơ bản là phổ dao động phân tử nên mang nhiều thơng tin về
mẫu phân tích, phương pháp phân tích phổ hồng ngoại có độ chọn lọc cao.
Do là phổ dao động và là tương tác để dịch chuyển năng lượng dao động từ trạng
thái cơ bản của các liên kết trong phân tử nên nó rất đặc trưng cho các liên kết cũng như
tương tác giữa các liên kết [11]. Đặc điểm là các đỉnh phổ nhọn, số lượng đỉnh và vị trí

15