BÙI THỊ THƠM NGHIÊN cứu CHIẾT XUẤT APIGENIN và LUTEOLIN từ QUẢ cây cần tây với sự hỗ TRỢ của CYCLODEXTRIN KHÓA LUẬN tốt NGHIỆP dược sĩ

BỘ Y TẾ
TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

BÙI THỊ THƠM
1701546

NGHIÊN CỨU CHIẾT XUẤT
APIGENIN VÀ LUTEOLIN
TỪ QUẢ CÂY CẦN TÂY
VỚI SỰ HỖ TRỢ CỦA CYCLODEXTRIN
KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ

Người hướng dẫn:
PGS.TS. Nguyễn Thu Hằng
Nơi thực hiện:
Bộ môn Dược liệu

HÀ NỘI – 2022


LỜI CẢM ƠN
Lời đầu tiên, tơi xin bày tỏ lịng kính trọng và biết ơn sâu sắc tới PGS.TS. Nguyễn
Thu Hằng – Trưởng bộ môn Dược liệu, Trường Đại học Dược Hà Nội, người cô tâm
huyết đã ân cần chỉ bảo và hướng dẫn tơi trong suốt q trình làm khóa luận tại bộ mơn
Dược liệu. Cơ khơng chỉ là một người truyền lửa mang lại niềm đam mê với dược liệu cho
tơi mà cịn là người chia sẻ những bài học vơ cùng q báu giúp tơi có thể hồn thiện bản
thân và có một hành trang vững chắc cho công tác sau này.
Tôi xin gửi lời cảm ơn sâu sắc nhất tới ThS. Nguyễn Văn Phương- Giảng viên bộ
môn Dược liệu, Trường Đại học Dược Hà Nội, người thầy ln đồng hành, dìu dắt và
hướng dẫn tơi trong những ngày đầu tiên làm nghiên cứu tại bộ môn. Với tơi, thầy cịn như
một người anh ln quan tâm, chia sẻ, truyền đạt những kiến thức, kỹ năng cho tơi trong

suốt q trình học tập và nghiên cứu tại bộ môn.
Tôi xin chân thành cảm ơn các thầy cô và các anh chị đang công tác tại bộ môn Dược
Liệu đã tạo điều kiện và hỗ trợ nhiệt tình cho tơi trong suốt q trình nghiên cứu. Bên cạnh
đó, tơi cũng xin cảm ơn sự động viên và khích lệ từ các bạn K72 cùng làm nghiên cứu tại
bộ môn, đặc biệt là bạn Hằng người bạn đồng hành và ln sẵn sàng giúp đỡ tơi trong bất
kỳ hồn cảnh khó khăn nào trong q trình làm nghiên cứu.
Tơi cũng xin trân trọng cảm ơn Ban Giám hiệu Nhà trường, cùng tồn thể các thầy
cơ Trường Đại học Dược Hà Nội luôn tạo điều kiện thuận lợi cho tôi trong cả quá trình học
tập và nghiên cứu tại trường.
Cuối cùng, tôi xin gửi lời cảm ơn đặc biệt nhất tới bố mẹ, anh chị em và bạn bè đã
luôn là chỗ dựa tinh thần vững chắc cho tơi có thể yên tâm học tập và hoàn thành đề tài
nghiên cứu này.
Tôi xin chân thành cảm ơn!
Hà Nội, ngày 27 tháng 6 năm 2022
Sinh viên

Bùi Thị Thơm


MỤC LỤC
DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT .........................................................
DANH MỤC CÁC BẢNG .....................................................................................................
DANH MỤC CÁC HÌNH VÀ ĐỒ THỊ .................................................................................
ĐẶT VẤN ĐỀ ...................................................................................................................... 1
CHƯƠNG I. TỔNG QUAN ................................................................................................. 3
1.1. Tổng quan về quả cần tây .......................................................................................... 3
1.1.1. Thành phần hóa học ........................................................................................... 3
1.1.2. Tác dụng sinh học ............................................................................................... 4
1.2. Các nghiên cứu chiết xuất apigenin và luteolin từ quả cần tây ................................. 5
1.3. Tổng quan về cyclodextrin và β- cyclodextrin (β-CD) ............................................. 6

1.3.1. Cấu trúc của cyclodextrin .................................................................................. 6
1.3.2. Tính chất vật lý của cyclodextrin ....................................................................... 8
1.3.3. Tính chất hóa học của cyclodextrin ................................................................... 9
1.3.4. Tính an tồn của β- cyclodextrin ...................................................................... 10
1.3.5. Các dẫn xuất của β- cyclodextrin ..................................................................... 10
1.3.6. Một số phức chất của cyclodextrin với các hợp chất flavonoid ....................... 11
1.3.7. Ứng dụng của β- cyclodextrin trong lĩnh vực chiết xuất dược liệu.................. 13
CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ................................. 14
2.1. Nguyên liệu và thiết bị ............................................................................................ 14
2.1.1. Nguyên liệu ....................................................................................................... 14
2.1.2. Hóa chất, thiết bị và phần mềm ........................................................................ 14
2.2. Nội dung nghiên cứu ............................................................................................... 15
2.3. Phương pháp nghiên cứu ......................................................................................... 16
2.3.1. Quy trình chiết xuất dự kiến ............................................................................. 16
2.3.2. Phương pháp định lượng apigenin và luteolin trong dịch chiết quả cần tây .. 16
2.3.3 Phương pháp khảo sát một số yếu tố ảnh hưởng đến quá trình chiết xuất ....... 17
CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ BÀN LUẬN .............................................. 20


3.1. Kết quả khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình chiết xuất ............................ 20
3.1.1. Khảo sát thời gian chiết xuất............................................................................ 20
3.1.2. Khảo sát nồng độ β-CD trong dung môi .......................................................... 21
3.1.3. Khảo sát tỷ lệ dung môi/ dược liệu ................................................................... 22
3.2. Kết quả khảo sát và lựa chọn điều kiện tối ưu cho quá trình chiết xuất.................. 23
3.2.1. Kết quả thiết kế thí nghiệm ............................................................................... 23
3.2.2. Kết quả xây dựng mơ hình ................................................................................ 24
3.2.3. Kết quả đánh giá mơ hình ................................................................................ 27
3.2.4. Lựa chọn điều kiện tối ưu cho các biến đầu vào .............................................. 29
3.2.5. Kết quả thẩm định mơ hình .............................................................................. 30
3.3. Kết quả so sánh khả năng chiết xuất apigenin và luteolin từ quả cần tây của β-CD

với các dung môi thông thường ...................................................................................... 31
3.4. Bàn luận ................................................................................................................... 32
3.4.1. Về việc sử dụng dung môi chiết xuất ................................................................ 32
3.4.2. Về kết quả so sánh khả năng chiết xuất apigenin va luteolin từ quả cần tây của
β-CD với các dung môi khác nhau ............................................................................. 34
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ............................................................................................ 35
TÀI LIỆU THAM KHẢO .................................................................................................. 36


DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT
ANOVA

Phương pháp phân tích phương sai (Analysis of variance)

CD

Cyclodextrin

α-CD

α- cyclodextrin

β-CD

β- cyclodextrin

γ-CD

γ- cyclodextrin

β-HP-CD

Hydroxylpropyl- β- cyclodextrin

DES

Hệ dung môi eutectic

DSC

Nhiệt lượng quét vi sai

FT-IR

Quang phổ hồng ngoại biến đổi Fourier

HPLC

Hệ thống sắc ký lỏng hiệu năng cao
(High Performance Liquid Chromatography)

MLR

Hồi quy tuyển tính đa biến (Multivariable Linear Regression)

MS

Khối phổ

OFAT

Phương pháp thay đổi một yếu tố (One factor at a time)

RSD

Độ lệch chuẩn tương đối (Relative Standard Deviation)

RSM

Phương pháp bề mặt đáp ứng (Response surface methodology)

SD

Độ lệch chuẩn (Standard Deviation)

SEM

Kính hiển vi điện tử quét

STT

Số thứ tự

TGA

Phân tích nhiệt trọng lượng

TLTK

Tài liệu tham khảo

UV-VIS

Quang phổ tử ngoại khả kiến

XO

Xanthin oxidase

XRD

Phân tích nhiễu xạ tia X


DANH MỤC CÁC BẢNG
STT

Kí hiệu

Tên bảng

Trang

1

1.1

Một số tính chất vật lý của các cyclodextrin

8

2

1.2

Phân loại các dẫn xuất của β- cyclodextrin

11

3

1.3

Phức hợp của các flavonoid với cyclodextrin

12

4

2.1

Hệ số góc (a) và hệ số chặn (b) của đường chuẩn apigenin
và đường chuẩn luteolin

17

5

3.1

Kết quả mã hóa biến đầu vào ở 3 mức -1; 0; 1

23

6

3.2

Thiết kế thí nghiệm và kết quả thực nghiệm

24

7

3.3

Kết quả phân tích ANOVA của mơ hình xây dựng được

8

3.4

Kết quả một số thông số đánh giá chất lượng của mơ hình

9

3.5

27, 28
28

Kết quả kiểm tra khả năng dự đốn của mơ hình ở điều
kiện tối ưu

31


DANH MỤC CÁC HÌNH VÀ ĐỒ THỊ
Tên hình và đồ thị

STT

Kí hiệu

Trang

1

1.1

Cấu trúc hóa học của apigenin và luteolin

3

2

1.2

Cấu trúc của cyclodextrin

7

3

1.3

Cấu trúc của các loại cyclodextrin tự nhiên

8

4

1.4

Sự tạo phức của cyclodextrin với phân tử khách theo tỷ lệ
1:1

9

5

2.1

Sơ đồ thiết kế nghiên cứu

15

6

3.1

Kết quả khảo sát thời gian chiết xuất

20

7

3.2

Kết quả khảo sát nồng độ β-CD trong dung môi

21

8

3.3

Kết quả khảo sát tỷ lệ dung môi/ dược liệu

22

9

3.4

hàm lượng luteolin vào các yếu tố của quá trình chiết xuất

26

10

3.5

Kết quả tối ưu điều kiện chiết xuất

30

3.6

Kết quả so sánh hàm lượng apigenin và luteolin trong
dịch chiết quả cần tây chiết xuất với các dung môi khác

31

Đồ thị biểu thị sự phụ thuộc của hàm lượng apigenin và

11

nhau


ĐẶT VẤN ĐỀ
Cần tây (Apium graveolens L.) được biết đến là loại rau ăn được trồng phổ biến trên
thế giới và đã được di thực về trồng tại Việt Nam [5], [6]. Đồng thời, cần tây cũng đã được
biết đến như một loại cây thuốc ở một số quốc gia để chữa bệnh gút và các bệnh về khớp
cho hiệu quả điều trị tốt [6], [22]. Quả cần tây được đánh giá là dược liệu tiềm năng để
phòng và điều trị bệnh gút với các tác dụng như hạ acid uric [47], [65], ức chế enzym
xanthin oxidase [65], chống viêm [2] và giảm đau [2]. Thành phần hóa học chính của quả
cần tây là flavonoid, trong đó chủ yếu là apigenin và luteolin. Hai hợp chất này đã được
chứng minh tác dụng ức chế enzym xanthin oxidase và hạ acid uric qua nhiều nghiên cứu

[28], [30]. Vì vậy, việc nghiên cứu chiết xuất apigenin và luteolin từ quả cần tây là cần thiết
trong phát triển các sản phẩm để phòng và điều trị bệnh gút.
Trong những năm gần đây, nghiên cứu chiết xuất apigenin và luteolin từ các dược
liệu tăng lên đáng kể, chủ yếu vẫn sử dụng các dung môi hữu cơ thông thường như
methanol, ethanol, hexan. Mặc dù những dung môi này đem lại hiệu quả chiết tương đối
cao hơn so với với nước, tuy nhiên chúng vẫn còn tồn tại một số nhược điểm như dễ cháy
nổ, gây ô nhiễm môi trường và ảnh hưởng tới sức khỏe con người [71]. Ngày nay, với các
mối quan tâm ngày càng tăng về sinh thái và kinh kế, ứng dụng hóa học xanh ngày càng
trở nên quan trọng trong nhiều lĩnh vực, đặc biệt là lĩnh vực chiết xuất dược liệu. Trong đó,
sử dụng dung mơi xanh để chiết các hoạt chất có hoạt tính sinh học từ tự nhiên theo hướng
tiếp cận hóa học xanh đặc biệt được quan tâm, nhằm giảm thiểu những ảnh hưởng đối với
môi trường và tác hại đối với sức khỏe con người [51].
Trong một nghiên cứu gần đây của nhóm tác giả Nguyễn Thu Hằng và cộng sự năm
2021 về chiết xuất cao đặc giàu apigenin và luteolin từ quả cần tây đã sử dụng hệ dung môi
eutectic (DES) [9]. Đây được coi là hệ dung môi xanh thế hệ mới, không độc hại, thân thiện
với môi trường, đem lại hiệu quả chiết cao hơn dung môi hữu cơ thông thường, song chúng
vẫn tồn tại một số hạn chế như áp suất hơi thấp và độ nhớt cao gây khó khăn trong quá trình
tinh chế sản phẩm [9]. Để tiếp nối con đường tìm kiếm dung mơi xanh mới trong chiết xuất
apigenin và luteolin, β- cyclodextrin đã được lựa chọn với nhiều ưu điểm vượt trội như tăng
khả năng hòa tan, cải thiện độ ổn định, an toàn và thân thiện với mơi trường [19].
Mặc dù đã có một số nghiên cứu ứng dụng β- cyclodextrin chiết xuất những hợp
chất có hoạt tính sinh học từ dược liệu nhưng vẫn cịn rất hạn chế. Đặc biệt chưa có nghiên
cứu nào sử dụng β- cyclodextrin để chiết xuất apigenin và luteolin từ quả cần tây.
Vì vậy, đề tài khóa luận tốt nghiệp “Nghiên cứu chiết xuất apigenin và luteolin từ
quả cần tây với sự hỗ trợ của cyclodextrin” được thực hiện với 2 mục tiêu sau:
1


1. Khảo sát các yếu tố ảnh hưởng và lựa chọn điều kiện tối ưu cho quá trình chiết xuất
apigenin và luteolin từ quả cần tây với sự hỗ trợ của β- cyclodextrin.

2. So sánh khả năng chiết xuất apigenin và luteolin từ quả cần tây của β- cyclodextrin
với các dung môi thông thường như methanol, ethanol 70% và nước.

2


CHƯƠNG I. TỔNG QUAN
1.1. Tổng quan về quả cần tây
Dược liệu là quả chín đã phơi hay sấy khơ của cây cần tây (Apium graveolens L.),
họ Cần (Apiaceae) [3].
1.1.1. Thành phần hóa học
Quả cần tây có chứa tinh dầu, flavonoid, courmarin, saponin, lipid, carotenoid và
đường khử [33]. Trong đó flavonoid, tinh dầu và coumarin là các nhóm hợp chất quan trọng
và được quan tâm nhiều nhất trong các nghiên cứu gần đây [1].
1.1.1.1. Flavonoid
Flavonoid là một trong những nhóm hợp chất quan trọng nhất liên quan đến nhiều
tác dụng sinh học của quả cần tây.
Theo các tài liệu thu thập được, cho đến nay phát hiện được 19 hợp chất flavonoid
trong quả cần tây [33], [39], [78], chủ yếu là dẫn xuất của apigenin và luteolin. Đây cũng
là 2 flavonoid được quan tâm nhiều nhất trong quả cần tây với nhiều tác dụng sinh học quan
trọng như tác dụng ức chế enzym xanthin oxidase [28], [30], chống viêm [49], [60], giảm
đau [79], bảo vệ tim mạch [29], chống ung thư [23], [63].
Cấu trúc hóa học của apigenin và luteolin được trình bày ở hình 1.1.

Apigenin

Luteolin

Hình 1.1. Cấu trúc hóa học của apigenin và luteolin
1.1.1.2. Tinh dầu

Hàm lượng tinh dầu trong quả cần tây là 1,5 - 3 %, trong đó chủ yếu là các terpen,
phthalid và các dẫn chất khác [8], [31]. Sử dụng phương pháp sắc kí khí kết hợp khối phổ
(GC/MS), 30 thành phần trong tinh dầu quả cần tây đã được phát hiện bao gồm limonen
(76,9%), β-selinen (9,7%), sedanenolid (3,4%), 3-butyl phthalid (3,6%) và α-selinen (1,4%)
và một số hợp chất khác [31]. Trong đó, đáng chú ý là các hợp chất thuộc nhóm dẫn xuất
phthalid như 3-n-butyl phthalid, sedanolid, sedanenolid là những thành phần đem lại mùi
hương đặc trưng và nhiều tác dụng sinh học cho quả cần tây [6], [8].

3


1.1.1.3. Courmarin
Theo các tài liệu thu thập được, có khoảng 20 hợp chất furanocoumarin đã được phát
hiện trong quả cần tây [6], [75], điển hình trong số đó là: umbelliferon [43], psoralen [17],
bergapten [7], [17], xanthotoxin [7], [17] và isopimpinellin [57].
1.1.2. Tác dụng sinh học
1.1.2.1. Tác dụng ức chế enxym xanthin oxidase (XO) và hạ acid uric
Trên mơ hình gây tăng acid uric bằng cao nấm men trên chuột nhắt, cao chiết nước
từ quả cần tây ở mức liều 75 mg/kg, 300mg/kg và tinh dầu quả cần tây ở mức liều 0,058
ml/kg và 0,233 ml/kg có tác dụng làm hạ nồng độ xanthin oxidase và nồng độ acid uric
cũng như hoạt độ enzym xanthin oxidase thấp hơn rõ rệt so với nhóm chứng (p< 0,05) [65].
Trên mơ hình gây tăng acid uric cấp bằng kali oxonat trên chuột nhắt, cao ethanol
chiết từ quả cần tây ở cả 3 liều 250 mg/kg, 500 mg/kg và 1000 mg/kg, uống liên tục trong
5 ngày đều có tác dụng làm giảm nồng độ acid uric huyết thanh có ý nghĩa thống kê so với
lơ chứng (p < 0,01) với tỷ lệ giảm lần lượt là 59,3%, 52,6% và 43,8%. Bên cạnh đó, cao
ethanol chiết từ quả cần tây với liều 250 mg/kg và 500 mg/kg làm giảm đáng kể hoạt độ
xanthin oxidase gan chuột thí nghiệm với tỷ lệ giảm tương ứng là 12,1% và 10,5% [47].
1.1.2.2. Tác dụng chống viêm
Trên mơ hình gây phù bàn chân chuột cống trắng bằng carrageenan: cao ethanol
chiết từ quả cần tây liều 250 mg/ kg và 500 mg/ kg đều có tác dụng ức chế phù chân chuột

so với lô chứng tại thời điểm 1 giờ sau khi gây viêm (p< 0,05), tỷ lệ ức chế phù so với
chứng lần lượt là 37,6% và 60,6% [2].
Trên mô hình gây viêm màng hoạt dịch khớp gối chuột cống trắng bằng tinh thể
natri urat. Cao chiết quả cần tây liều 250 mg/kg thể hiện tác dụng chống viêm tại thời điểm
4 giờ và 5 giờ sau tiêm, điểm viêm tại các thời điểm giảm có ý nghĩa so với lô chứng, lần
lượt là 2 (2-2) với p< 0,01 và 3 (3-4) với p< 0,05. Cao chiết quả cần tây liều 500 mg/kg thể
hiện tác dụng chống viêm trong suốt quá trình quan sát, điểm viêm tại 3 thời điểm giảm rõ
rệt so với lô chứng tương ứng là 2 (1-2) với p< 0,01, 2 (1-3) với p<0,01 và 2 (1-3) với p<
0,05 [2].
1.1.2.3. Tác dụng giảm đau
Trên mơ hình đau cấp tính được sử dụng dựa trên mơ hình tiêu chuẩn của Randell
và Selitto 1957 trên bàn chân chuột khi tiêm carrageenan, cao chiết ethanol từ quả cần tây
liều 500 mg/kg và cao chiết siêu tới hạn từ quả cần tây liều 70 mg/kg có tác dụng giảm đau
tương đương với ibuprofen liều 200 mg/kg. Bên cạnh đó, mơ hình gây đau mãn tính trên
chuột khi tiêm M. butyricum cho thấy sử dụng cao ethanol chiết từ quả cần tây liều 1500
4


mg/kg sau 10 ngày điều trị có tác dụng giảm đau tương đương với naproxen 30 mg/kg và
ibuprofen liều 100 mg/kg [44].
Mơ hình gây đau quặn chuột nhắt trắng bằng acid acetic: cao chiết ethanol từ quả
cần tây liều 250 mg/kg làm giảm số cơn đau quặn của chuột nhắt trắng so với lô chứng
trong khoảng thời gian từ phút thứ 10 đến 15 (p< 0,01); từ phút 15 đến 20 (p< 0,05); từ
phút 20 đến 25 (p< 0,01); từ phút 15 đến 20 (p< 0,01) [2].
1.1.2.4. Các tác dụng khác
Ngồi ra, quả cần tây cịn thể hiện một số tác dụng khác như hạ đường huyết [70],
bảo vệ tim mạch, hạ huyết áp [20], [42], bảo vệ dạ dày [80], bảo vệ gan [10], bảo vệ thần
kinh [26], chống oxy hóa [16], ngưng kết tập tiểu cầu [4], chống ung thư [36], [52], kháng
khuẩn [61], chống côn trùng [62], [76].
1.2. Các nghiên cứu chiết xuất apigenin và luteolin từ quả cần tây

Nhóm nghiên cứu của Qian Zhang và cộng sự đã tiến hành chiết xuất apigenin và
luteoin từ quả cần tây bằng phương pháp siêu âm có sự hỗ trợ của enzym pectinase. Kết
quả tối ưu hóa cho quá trình thủy phân bằng pectinase thu được hàm lượng apigenin và
luteolin trong dịch chiết lần lượt là 42,5 mg/g và 25,3 mg/g [53].
Một nghiên cứu khác của Dandan Han và Kyung Ho Row đã sử dụng chất lỏng ion
và sự hỗ trợ của sóng siêu âm để chiết xuất apigenin và luteolin từ quả cần tây. Kết quả
khảo sát cho thấy cao chiết bằng các chất lỏng ion đều có hàm lượng apigenin và luteolin
cao hơn đáng kể so với cao chiết bằng ethanol 70% [59]. Tuy nhiên, chất lỏng ion vẫn chưa
được coi là dung mơi xanh bởi vì khả năng phân hủy sinh học, tương thích sinh học và tính
bền vững kém, chi phí sản xuất và tinh chế cao [14].
Bên cạnh đó, năm 2021, nhóm tác giả Nguyễn Thu Hằng và cộng sự đã tiến hành
nghiên cứu ứng dụng hệ dung môi eutectic (DES) để chiết xuất cao đặc giàu apigenin và
luteolin từ quả cần tây. Kết quả khảo sát cho thấy, hầu hết các hệ DES đều có khả năng
chiết xuất apigenin và luteolin tốt hơn nước, methanol và ethanol 70%, trong đó hệ có thành
phần betain và propylen glycol có tỷ lệ 1: 8 có khả năng chiết xuất tốt nhất. Các điều kiện
ảnh hưởng đến quá trình chiết xuất cũng đã được tối ưu hóa để thu được cao cần tây với
hàm lượng apigenin và hàm lượng luteolin lớn nhất [9]. Dung môi eutectic được coi là thế
hệ mới của chất lỏng ion bởi vì chúng có chung một số đặc tính, tính chất với chất lỏng ion.
Do vậy, DES mang đầy đủ các ưu điểm và nhược điểm giống với chất lỏng ion. DES chỉ
vượt trội hơn chất lỏng ion về mặt chi phí sản xuất rẻ hơn, an tồn và thân thiện với mơi
trường hơn [14], song chúng vẫn cịn tồn tại một số nhược điểm như độ nhớt cao và áp suất

5


hơi thấp gây khó khăn trong q trình tinh chế và cản trở q trình dung mơi thấm vào dược
liệu.
Nhìn chung, các nghiên cứu gần đây về chiết xuất apigenin và luteolin đều mang lại
hiệu quả chiết xuất cao hơn đáng kể so với chiết xuất bằng dung môi thông thường, song
chúng vẫn còn tồn tại một số nhược điểm. Vì vậy, việc tiếp tục nghiên cứu tìm kiếm các

dung mơi mới thân thiện với mơi trường để có thể thay thế và khắc phục những hạn chế
của các dung môi truyền thống là cần thiết. Trong số các dung môi mới, cyclodextrin đang
được chú ý nhiều trong chiết xuất dược liệu và được coi là dung mơi có khả năng thay thế
các dung môi truyền thống với nhiều ưu điểm vượt trội.
1.3. Tổng quan về cyclodextrin và β- cyclodextrin (β-CD)
Cyclodextrin (CD) được phát hiện ra đầu tiên vào năm 1891 bởi Antoine Viller khi
nghiên cứu quá trình thủy phân tinh bột khoai mì bằng enzym thu được từ vi khuẩn Bacillus
amylobacter [69].
1.3.1. Cấu trúc của cyclodextrin
Cyclcodextrin là các oligosaccharid mạch vòng cấu tạo từ các tiểu đơn vị Dglucopyranose nối với nhau bằng liên kết 1-4 glycosid. CD có cấu trúc đặc biệt với bộ
khung rỗng, phía bên ngồi ưa nước, khoang bên trong kỵ nước và có thể tạo phức với
nhiều loại phân tử khác nhau gọi là phân tử khách [13], [37], [58], [69]. Cụ thể, phía bên
ngồi có các nhóm hydroxyl C2-OH và C3-OH hướng về phía vành rộng và các nhóm C6OH hướng về phía vành hẹp do đó dễ tạo liên kết hydro với phân tử ưa nước [13], [18].
Điều đó giúp cho CD có khả năng hịa tan trong nước. Khoang bên trong kỵ nước, được
cấu tạo từ các nhóm khơng phân cực với liên kết glycosid C3-O4 ( như ether) và liên kết C5C(H) [13]. Khoang kỵ nước này có khả năng bao bọc một hoặc toàn bộ các phân tử hữu cơ
nhỏ. Vì cấu trúc đặc biệt này mà CD có thể làm thay đổi độ tan, tính ổn định hoặc khả năng
phản ứng của các phân tử được tạo phức trong khoang [19]. Cấu trúc của CD được trình
bày ở hình 1.2.

6


Hình 1.2. Cấu trúc của cyclodextrin
Hiện nay, các cyclodextrin tự nhiên được dùng phổ biến là α-CD, β-CD, γ-CD với
cấu tạo lần lượt chứa 6, 7, 8 tiểu đơn vị D- glucopyranose [37], [58]. Trong đó, β-CD được
ứng dụng nhiều hơn cả do giá thành hợp lý và kích thước lỗ trống thích hợp bao bọc được
nhiều loại phân tử khách từ đó tăng cường khả năng hịa tan, cải thiện độ ổn định và tăng
cường sinh khả dụng của các chất có hoạt tính [19] (hình 1.3).

Hình 1.3. Cấu trúc của các loại cyclodextrin tự nhiên

7


1.3.2. Tính chất vật lý của cyclodextrin
CD thường tồn tại dưới dạng tinh thể màu trắng, không mùi, vị hơi ngọt. Các CD
tan được trong nước, dimethyl formamid, ethylen glycol, pyridin, dimethyl sulfoxit và
không tan trong alcol, ceton, ether, hydrocarbon no và hydrocarbon thơm [45], [77].
Về khả năng hòa tan trong nước, trong phân tử CD, các nhóm hydroxyl (-OH) đều
hướng ra bên ngồi nên CD có khả năng tan tốt trong nước. Các cyclodextrin khác nhau thì
có khả năng tan trong nước khác nhau. Cụ thể, độ tan trong nước của β-CD thấp hơn so với
α-CD và γ-CD. Tuy nhiên khi tạo phức các phân tử khách thì độ tan này có thay đổi do
tương tác giữa dung mơi CD với phân tử khách. Một số nghiên cứu đã chỉ ra β-CD khi tạo
phức với phân tử khách có thể làm tăng độ tan của β-CD nhiều hơn so với các CD khác
[38], [67], [73].
Một số tính chất vật lý của các cyclodextrin tự nhiên được tóm tắt ở bảng 1.1 [68].
Bảng 1.1. Một số tính chất vật lý của các cyclodextrin
α-CD

β-CD

γ-CD

Số đơn vị glucose

6

7

8

Công thức phân tử

C36H60O30

C42H70O35

C48H80O40

Phân tử khối (g/mol)

972,85

1134,99

1297,14

Chiều cao của lỗ trống (Å)

7,9- 8

7,9- 8

7,9- 8

Đường kính trong (Å)

4,7- 5,3

6,0- 6,6

7,5- 8

Đường kính ngồi Å)

14,6- 15

15,4- 15,8

17,5- 17,9

174

262

472

12,332

12,202

12,081

275

280

275

14,5

1,85

23,2

6- 7

10- 12

7- 13

Thơng số

Thể tích lỗ trống (ml/mol)
pKa ở 25 oC
Nhiệt độ nóng chảy (oC)
Độ tan trong nước (g/ 100ml,
25 0C)
Số phân tử nước được ngậm

Từ bảng 1.1 có thể thấy thể tích các lỗ trống của cyclodextrin tăng dần theo thứ tự:
α-CD< β-CD< γ-CD. Thông số này liên quan mật thiết đến khả năng tạo phức bọc: α-CD
thường chỉ tạo phức với phân tử khách có kích thước phân tử nhỏ. γ-CD có thể tích lỗ trống
lớn nhất nhưng chi phí sản xuất và giá thành cao nên cịn ứng dụng hạn chế. β-CD có thể
tích lỗ trống trung bình phù hợp với nhiểu loại phân tử khách, chi phí sản xuất thấp nên
hiện đang được sử dụng nhiều nhất [38], [68].
8


1.3.3. Tính chất hóa học của cyclodextrin
1.3.3.1. Khả năng tạo phức

Do sự hình thành cấu tạo ghế của các đơn vị glucopyranose nên các phân tử
cyclodextrin có hình dạng giống như chóp cụt [13]. Cyclodextrin có khả năng tạo phức bao
bọc các phân tử khách vào trong lỗ trống của nó nhờ cấu trúc kỵ nước của khoang bên trong
có thể giúp CD dễ dàng bắt lấy các phân tử khách kị nước. Đồng thời với mặt ngoài ưa
nước sẽ làm tăng khả năng hòa tan trong nước của phức hợp.
CD có khả năng tạo phức với nhiều loại phân tử bao gồm alkyl glycosid, các hợp
chất bất đối, các hợp chất alkyl mạch nhánh hoặc mạch vòng, hợp chất thơm và protein tạo
ra một phức chất ổn định và hằng số cân bằng cao [13].

Hình 1.4. Sự tạo phức của cyclodextrin với phân tử khách theo tỷ lệ 1:1
Đối với mỗi phân tử khách, CD có thể tạo thành nhiều loại phức theo nhiều tỷ lệ
khác nhau. Thường thì sự hình thành phức hợp CD: phân tử khách theo tỷ lệ 1:1 là phổ biến
nhất (Hình 1.4). Ngồi ra, các kiểu tạo phức khác theo tỷ lệ 1:2, 2:1, 2:3 cũng đã được xác
nhận trong một số nghiên cứu [13].
Sự tạo phức của CD với phân tử khách chịu ảnh hưởng của một số yếu tố như kích
thước và hình dạng khoang CD, khả năng tạo liên kết của phức, tính chất hóa học của phân
tử khách và khả năng loại phân tử nước có năng lượng cao (áp dụng cho phức trong dung
dịch nước) [13].
Phức hợp của CD được ổn định thông qua liên kết Van der Waals, liên kết hydro,
liên kết kỵ nước và hiện tượng dịch chuyển điện tích. Trong đó, liên kết Van der Waals là
động lực chính của q trình tạo phức [13]. Đối với phức liên kết theo tỷ lệ 1:1, sự tạo phức
diễn ra nhanh chóng trong vịng mili giây. Q trình hình thành phức là một phản ứng tỏa
nhiệt, nhiệt độ tăng thì độ ổn định của phức giảm [77].
Nhìn chung, sự tạo phức của CD với phân tử khách mang lại nhiều ưu điểm như cải
thiện độ tan của các chất kém tan trong nước từ đó nâng cao hiệu suất của quá trình chiết
9


xuất; tăng độ ổn định bằng cách bảo vệ các phân tử khách khỏi những tác động vật lý như
nhiệt, ánh sáng và các q trình hóa học như thủy phân, oxy hóa; tăng tính thấm qua màng

tế bào từ đó nâng cao tác dụng điều trị; ngăn ngừa sự tương kị hay khơng tương tích và che
dấu mùi vị [19].
1.3.3.2. Độ bền hóa học
Các CD dễ dàng bị thủy phân bởi tác nhân acid mạnh như acid clohydric tạo ra hỗn
hợp các oligosaccharid khác nhau. Tốc độ thủy phân tăng khi nhiệt độ tăng nhưng chậm
hơn 3-5 lần so với các oligosaccharid mạch thẳng tương ứng. Mặt khác, CD không bị thủy
phân trong môi trường acid yếu, acid hữu cơ và bền trong mơi trường kiềm mạnh. Bên cạnh
đó, CD cũng không thủy phân bởi enzym β- amylase, trừ γ-CD dễ bị thủy phân bởi enzym
α- amylase [77].
Các CD cũng dễ bị mở vịng bởi các nhân oxy hóa nhưng không tạo thành
formadehyd hay acid formic do CD không có tính khử. Điều này giúp cho CD trở nên an
tồn hơn [77].
Phân tử CD có nhiều nhóm hydroxy linh động có thể thay thế bằng các nhóm khác
như methyl, amin, este, ete…Khi đó đường kính CD khơng bị thay đổi nhưng kích thước
lỗ trống sẽ giảm xuống. Việc biến đổi này giúp thay đổi độ hòa tan, khả năng tạo phức cũng
như độ chọn lọc của CD đối với phân tử khách [45], [46].
1.3.4. Tính an tồn của β- cyclodextrin
Các nghiên cứu cho thấy, β-CD thực tế khơng có độc tính khi hấp thu qua đường
uống. Bằng cách tạo phức bao bọc các hoạt chất ở bên trong, β-CD giúp tăng hiệu quả điều
trị từ đó làm giảm độc tính của chất do chỉ sử dụng ở liều thấp nhất [73]. Theo Cục quản lý
thực phẩm và dược phẩm Hoa Kỳ (FDA), cả 3 cyclodextrin tự nhiên đều an toàn (GRAS).
Hơn nữa, β-CD được chấp thuận ở Châu Âu như một phụ gia thực phẩm (E459) với lượng
ăn vào hàng ngày (ADI) có thể chấp nhận được là 5 mg/kg mỗi ngày [68]. Ngoài ra, khi
được bao bọc bởi β-CD, các chất hạn chế tiếp xúc trực tiếp với màng sinh học, do đó làm
giảm tác dụng khơng mong muốn và sự kích ứng tại chỗ mà khơng ảnh hưởng đến hiệu quả
điều trị [19].
1.3.5. Các dẫn xuất của β- cyclodextrin
Để cải thiện độ hòa tan trong nước và tăng tính thân nước của β-CD, người ta biến
đổi β-CD thành các dẫn xuất khác nhau. Một số dẫn xuất của CD được trình bày ở bảng
1.2 [45-46].

10


Bảng 1.2. Phân loại các dẫn xuất của β- cyclodextrin
Dẫn xuất của β- cyclodextrin

Ví dụ
Hydroxypropyl- β- cyclodextrin (HP-β-CD)

Dẫn xuất hydroxyalkyl

Hydroxyethyl- β- cyclodextrin (HE-β-CD)
Hydroxybutenyl- β- cyclodextrin (HBU-β-CD)
Methyl- β- cyclodextrin (M-β-CD)

Dẫn xuất
ưa nước

Dẫn xuất methyl hóa

Dimethyl- β- cyclodextrin (DM-β-CD)
Trimethyl- β- cyclodextrin (TM-β-CD)

Dẫn xuất phân nhánh

Glucosyl- β- cyclodextrin (G1-β-CD)
Maltosyl- β- cyclodextrin (G2-β-CD)
Triacetyl- β- cyclodextrin (TA-β-CD)

Dẫn xuất

Dẫn xuất acyl hóa

Tributanoyl- β- cyclodextrin (TB-β-CD)
Trivaleryl- β- cyclodextrin (TV-β-CD)

kị nước
Dẫn xuất alkyl hóa

Diethyl- β- cyclodextrin (DE-β-CD)
Triethyl- β- cyclodextrin (TE-β-CD)
Carboxymethyl- ethyl- β-cyclodextrin (CME-β-

Dẫn xuất
có thể ion
hóa

CD)
Dẫn xuất anion

Sulfobutyl ether- β- cyclodextrin (SBE-β-CD)
β- cyclodextrin sulfat (β-CD sulfat)

Trong những năm gần đây, các nghiên cứu về khả năng tạo phức của các dẫn xuất
cyclodextrin như HP-β-CD đang tăng lên ngày càng nhanh chóng [27], [32], [64]. Có thể
dễ dàng nhận thấy cấu trúc không gian của β-CD và HP-β-CD giống nhau (đều là hình nón
cụt rỗng), song HP-β-CD có kích thước lớn hơn, dẫn đến khoảng không gian trống của HPβ-CD lớn hơn β-CD. Điều này giúp HP-β-CD có lợi thế hơn trong việc tạo phức hợp bao,
vì các hoạt chất khác có thể dễ dàng đi vào khơng gian rỗng [11]. Khơng những thế, HP-βCD cịn được chứng minh với khả năng hòa tan trong nước được cải thiện và độ an toàn
tương đương so với các CD tự nhiên [32], [64]. Từ đó giúp HP-β-CD có nhiều điểm nổi

trội và mang lại nhiều triển vọng hơn trong tương lai.
1.3.6. Một số phức chất của cyclodextrin với các hợp chất flavonoid
Với kích thước lỗ trống trung bình, β- cyclodextrin đã được báo cáo có đặc điểm khá
chọn lọc với các hợp chất flavonoid [68]. Sự tạo phức của các hợp chất flavonoid với
cyclodextrin có thể được phát hiện bằng các phương pháp như phân tích nhiệt trọng lượng
11


(TGA), phân tích nhiễu xạ tia X (XRD), nhiệt lượng quét vi sai (DSC), quang phổ cộng
hưởng từ hạt nhân (NMR), quang phổ hồng ngoại biến đổi Fourier (FT-IR), kính hiển vi
điện tử quét (SEM), quang phổ tử ngoại khả kiến (UV-VIS), khối phổ (MS). Theo các tài
liệu thu thập được, phát hiện 16 hợp chất flavonoid có khả năng tạo phức với cyclodextrin,
được trình bày ở bảng 1.3 [12], [55], [74].
Bảng 1.3. Phức hợp của các flavonoid với cyclodextrin
STT

Flavonoid

Chất tạo phức

Phương pháp phân
tích
FT-IR, DSC, XRD,
UV-VIS, TGA, SEM,
NMR

1

Curcumin

β-CD, HP- β-CD, γ-CD,
HP-γ- CD, α- CD

2

Genistein

γ- CD, HP-β-CD

XRD, DSC, SEM,
TGA

3

Naringenin

HP-β-CD, SBE-β-CD

XRD, DSC, NMR,
FTIR

4

Rutin

β-CD, HP-β-CD

FT-IR, DSC, XRD,
UV-VIS

5

Baicalein

β-CD

NMR, UV-VIS, SEM,
XRD, MS

6

Biochanin A

HP- β-CD

FT-IR, NMR, XRD,
DSC, SEM

7

Myricetin

HP- β-CD

FT-IR, XRD, TGA,
UV-VIS

8

Luteolin

β-CD, HP-β-CD, HE-β-CD,
G-β-CD

FT-IR, UV, SEM,
DSC, XRD

9

Fisetin

HP- β-CD

FT-IR, DSC, XRD,
NMR

10

Chrysin

β-CD

SEM, TGA, DSC,
XRD, NMR

11

Hesperidin

β-CD, HP-β-CD

NMR, FT-IR, DSC,
XRD

12

Acid gallic

HP-β-CD

SEM, DSC, XRD,
TGA, NMR

β-CD, HP-β-CD

SEM, XRD, DSC,
UV-VIS, MS, NMR

113 Quercetin

12


14

Apigenin
115 Acid ferulic

16

Formononetin

β-CD, HP-β-CD

FT-IR, NMR, XRD,
DSC, TGA, SEM

β-CD, HP-β-CD

XRD, DSC, FT-IR,
SEM, MS

β-CD, Me-β-CD

SEM, XRD, DSC

1.3.7. Ứng dụng của β- cyclodextrin trong lĩnh vực chiết xuất dược liệu
Một trong những xu hướng hiện nay trong lĩnh vực chiết xuất bền vững là việc sử
dụng các dung môi thay thế dung môi hữu cơ thơng thường. Trong đó, dung dịch β-CD
trong nước được đánh giá là một dung môi tiềm năng với khả năng chiết xuất tốt và thân
thiện với môi trường. β-CD đã được ứng dụng để chiết xuất nhiều nhóm hợp chất khác nhau
như flavonoid, alcaloid, carotenoid...[15], [48].
Những ưu điểm của CD có thể kể đến như nâng cao hiệu suất chiết xuất, giảm thiểu
thời gian chiết xuất, cải thiện tác dụng, độ ổn định và sinh khả dụng của sản phẩm chiết
xuất. Đặc biệt, trong số các CD hiện nay, β-CD được sử dụng phổ biến hơn cả do chi phí
sản xuất thấp và an tồn cho người sử dụng [73].
Một số nghiên cứu đã sử dụng β-CD trong chiết xuất các hợp chất có hoạt tính sinh
học từ các dược liệu có thể kể đến như nghiên cứu chiết xuất flavonoid từ lá Chè (Camellia
sinensis) [40], Cỏ ba lá (Trigolium pretense) [34], Thổ phục linh (Smilax glabra) [35],
nghiên cứu chiết xuất alcaloid từ Củ dền (Beta vulgaris) [50], lá Ngón (Gelsemium elegans)

[54], nghiên cứu chiết xuất carotenoid từ Tầm xuân (Rosa canina) [56], Ớt chuông
(Capsicum annuum) [48]… Các nghiên cứu trên đều giúp nâng cao hiệu quả chiết xuất và
có nhiều ý nghĩa trong thực tế.

13


CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1. Nguyên liệu và thiết bị
2.1.1. Nguyên liệu
Dược liệu là quả cần tây được thu hái từ Hải Hậu, Nam Định, Việt Nam. Sau khi thu
hoạch được phơi khô, bảo quản trong túi ni lơng để ở nơi khơ ráo, thống mát.
Mẫu cần tây có hoa được ép tiêu bản, lưu trữ tại Phịng tiêu bản- Bộ mơn Thực
vật- Trường Đại học Dược Hà Nội với số hiệu tiêu bản HNIP/18542/19.
Căn cứ vào đặc điểm hình thái của mẫu nghiên cứu, sử dụng khóa phân loại chi
Apium và đối chiếu với bản mơ tả theo lồi tài liệu Thực vật chí Trung Quốc, mẫu cần tây
nghiên cứu đã được xác định tên khoa học là Apium graveolens L., họ Cần (Apiaceae).
2.1.2. Hóa chất, thiết bị và phần mềm
2.1.2.1. Hóa chất
Hóa chất sử dụng trong q trình nghiên cứu đạt chuẩn phân tích bao gồm:
-

Dung môi: methanol, ethanol 70%, nước cất 2 lần, acetonitril (đạt tiêu chuẩn HPLC)

-

Hóa chất: β- cyclodextrin độ tinh khiết ≥ 98 % (Trung Quốc), acid phosphoric (Trung
Quốc)

2.1.2.2. Dụng cụ

-

Cân phân tích Precisa (Thụy Sĩ), độ chính xác 0,1 mg

-

Bể siêu âm Elmasonic (Đức)
Máy ly tâm Universad 320 (Đức)

-

Hệ thống sắc ký lỏng hiệu năng cao của Shimadzu của Nhật Bản gồm bơm LC-20AD,
detector DAD SPD-M20A, hệ thống tiêm mẫu tự động SIL-20C, bộ phận điều nhiệt
CTO-20A, cột sắc ký Phenomenex C18 (kích thước 250 mm × 4,6 mm; kích thước hạt
5µm).

-

Tủ sấy Menmert (Đức)
Máy đo hàm ẩm Ohaus (Trung Quốc)

-

Các dụng cụ khác: pipet pasteur, pipet chính xác (5ml, 10ml), màng lọc 0,45 µm, ống

nghiệm, cốc có mỏ, quả bóp cao su, ống vial.
2.1.2.3. Phần mềm: Design Expert 13 (Stat- Ease.Inc, tái bản lần thứ 13)

14

2.2. Nội dung nghiên cứu
Để giải quyết mục tiêu đề ra, khóa luận được thực hiện với những nội dung sau:
-

Nội dung 1: Khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình chiết xuất apigenin và luteolin
từ quả cần tây với sự hỗ trợ của β-cyclodextrin.

-

Nội dung 2: Khảo sát và lựa chọn điều kiện tối ưu hóa cho quá trình chiết xuất apigenin
và luteolin từ quả cần tây với sự hỗ trợ của β- cyclodextrin.

-

Nội dung 3: So sánh khả năng chiết xuất apigenin và luteolin từ quả cần tây của βcyclodextrin với các dung môi thông thường như methanol, ethanol 70% và nước.
Sơ đồ thiết kế nghiên cứu được trình bày ở hình 2.1.

Quả cần tây
Dung mơi
β- cyclodextrin /nước
Quy trình chiết xuất dự kiến

Khảo sát các yếu tố ảnh hưởng
và lựa chọn điều kiện chiết xuất
tối ưu

So sánh khả năng chiết xuất của
β-CD với các dung môi thơng
thường

Phương pháp OFAT
Phương pháp RSM

Nước, Ethanol 70%

Hình 2.1. Sơ đồ thiết kế nghiên cứu

15

và Methanol


2.3. Phương pháp nghiên cứu
2.3.1. Quy trình chiết xuất dự kiến
Quả cần tây được xay nhỏ và rây qua rây có kích thước mắt rây là 250 µm, thu lấy
phần bột chui qua rây để đem đi chiết xuất. Cân chính xác khoảng 0,2000 g bột dược liệu
cho vào ống nghiệm, thêm chính xác 4 ml dung dịch β- cyclodextrin (β-CD) trong nước.
Tiến hành chiết siêu âm ở nhiệt độ thường trong 15 phút, rồi ly tâm dịch chiết với tốc độ
3000 vòng/ phút trong 10 phút, thu lấy phần dịch chiết.
2.3.2. Phương pháp định lượng apigenin và luteolin trong dịch chiết quả cần tây
Dịch chiết quả cần tây sau khi ly tâm, được lọc qua màng lọc 0,45 µm và tiến hành
định lượng bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) với điều kiện sắc ký như sau [9]:
-

Cột sắc ký: Shim-pack GIS C18 (250 x4,6 mm; 5 µm)
Pha động: acetonitril- acid phosphoric 0,1 % tỉ lệ 40: 60

-

Bước sóng phát hiện: 335 nm

-

Tốc độ dịng: 0,5 ml/ phút

-

Thể tích tiêm mẫu: 20 µl
Từ kết quả sắc ký đồ thu được, tiến hành xác định hàm lượng apigenin và hàm lượng

luteolin trong dịch chiết dựa trên diện tích pic tương ứng theo cơng thức:
X=

(S−b).V.100
a.m.(100−A%).1000

(mg/g)

Trong đó:
X: hàm lượng apigenin (hoặc luteolin) trong dịch chiết (mg/g)
S: diện tích pic (µAU.s)
V: thể tích dung mơi chiết (ml)
m: khối lượng dược liệu (g)
A%: độ ẩm dược liệu được xác định bằng phương pháp mất khối lượng do làm
khô, kết quả đo hàm ẩm đã được xác định: A% =9,37%
b: hệ số chặn của đường chuẩn
a: hệ số góc của đường chuẩn
Hệ số góc và hệ số chặn của các đường chuẩn được trình bày ở bảng 2.1

16


Bảng 2.1. Hệ số góc (a) và hệ số chặn (b) của đường chuẩn apigenin và đường chuẩn
luteolin
Hệ số

Đường chuẩn apigenin

Đường chuẩn luteolin

a

116907,3427

68121,9382

b

107787,6691

41266,6025

Phương pháp định lượng apigenin và luteolin trong dịch chiết quả cần tây đã được
thẩm định đạt yêu cầu về độ đặc hiệu, độ đúng, độ lặp lại, khoảng tuyến tính và đường
chuẩn, sự phù hợp của hệ thống dựa trên các điều kiện sắc ký được lựa chọn [9].
2.3.3 Phương pháp khảo sát một số yếu tố ảnh hưởng đến quá trình chiết xuất
2.3.3.1. Phương pháp thay đổi một yếu tố (One factor at a time- OFAT)
OFAT được thực hiện bằng cách thay đổi một yếu tố trong khi các yếu tố còn lại sẽ
được giữ cố định và khơng thay đổi giữa các thí nghiệm. Việc thay đổi được thực hiện lần

lượt đến khi khảo sát hết các yếu tố. Kết quả thu được sẽ được đánh giá và lựa chọn cho
thử nghiệm tiếp theo.
Trong nghiên cứu này, 3 yếu tố có ảnh hưởng lớn nhất đến quá trình chiết xuất
apigenin và luteolin từ quả cần tây được lựa chọn là thời gian chiết, nồng độ β-CD trong
dung môi và tỷ lệ dung môi/ dược liệu với các giá trị khảo sát lần lượt như sau:
-

Thời gian chiết xuất: 10 phút, 15 phút, 20 phút, 30 phút, 45 phút, 60 phút

-

Nồng độ β-CD trong dung môi: 5mg/ml, 10 mg/ml, 20 mg/ml, 30 mg/ml

-

Tỷ lệ dung môi/ dược liệu: 15 ml/g, 20 ml/g, 25 ml/g, 30 ml/g
Thông số đánh giá là hàm lượng apigenin và hàm lượng luteolin trong dịch chiết từ quả

cần tây.
2.3.3.2. Phương pháp bề mặt đáp ứng (Response Surface Methodology- RSM)
a. Lựa chọn biến đầu vào
Từ kết quả khảo sát các yếu tố ảnh hưởng bằng phương pháp thay đổi một yếu tố
(OFAT) lựa chọn 3 biến đầu vào là thời gian chiết, nồng độ β-CD trong dung môi, tỷ lệ
dung môi/ dược liệu được mã hóa lần lượt là X1, X2, X3 với các khoảng khảo sát như sau:
- Thời gian chiết xuất (X1): 30 phút- 60 phút
-

Nồng độ β-CD trong dung môi (X2): 10 mg/ml- 30mg/ml
Tỷ lệ dung môi/ dược liệu (X3): 15- 25 (ml/g)

Các biến đầu vào được mã hóa thành 3 mức -1; 0; 1 từ giá trị thực tế theo công thức:
-

Thời gian chiết xuất: X1=

𝐺𝑖á 𝑡𝑟ị 𝑡ℎự𝑐− 45
15

17


-

Nồng độ β-CD trong dung môi: X2=

-

Tỷ lệ dung môi/ dược liệu: X3=

𝐺𝑖á 𝑡𝑟ị 𝑡ℎự𝑐− 20

5
𝐺𝑖á 𝑡𝑟ị 𝑡ℎự𝑐− 20
5

b. Lựa chọn biến đầu ra
-

Hàm lượng apigenin trong dịch chiết (Y1)

- Hàm lượng luteolin trong dịch chiết (Y2)
c. Thiết kế thí nghiệm
Sử dụng phần mền Design expert 13, lựa chọn thiết kế thí nghiệm Box-Behnken để
xác định mối quan hệ giữa ba biến độc lập đầu vào X1, X2, X3 với hai biến đầu ra Y1, Y2.
Kết quả thu được 18 thí nghiệm bao gồm 6 thí nghiệm tại điểm trung tâm.
d. Xây dựng và đánh giá tính phù hợp của mơ hình
18 thí nghiệm được tiến hành và thu được kết quả của các giá trị của biến đầu ra Y1,
Y2. Từ kết quả đó, phân tích mơ hình dựa trên phương pháp hồi quy đa biến (Multivariable
Linear Regression- MRL) sử dụng phần mềm Design Expert 13.
Mơ hình biểu thị sự ảnh hưởng giữa thời gian chiết X1 , nồng độ β-CD trong dung
môi X2, tỷ lệ dung môi/ dược liệu X3 với hàm lượng apigenin (Y1 ) và hàm lượng luteolin
(Y2 ) trong dịch chiết quả cần tây được tính tốn theo phương trình đa biến bậc 2 như sau:
Y= 0 + ∑ki=1 𝑖 𝑋𝑖 × + ∑ki=1 𝑖𝑖 𝑋𝑖2 +∑𝑘𝑖>𝑗 𝑖𝑗 𝑋𝑖 𝑋𝑗 + ɛ
Trong đó:
Y là biến đầu ra
Xi, Xj là biến đầu vào
o, i, ii, ij là các hệ số của phương trình hồi quy
k là số biến đầu vào
ɛ: sai số. Sai số này càng lớn càng khiến cho khả năng dự đốn của
phương trình hồi quy kém chính xác hơn hay sai lệch nhiều hơn so với
thực tế
Sự phù hợp của mơ hình dựa trên kết quả thực nghiệm được đánh giá dựa vào giá trị
p của mơ hình, hệ số p càng nhỏ thì mơ hình càng có ý nghĩa. Ngồi ra, việc đánh giá chất
lượng của mơ hình cịn được xem xét bởi hệ số xác định R2, hệ số R2 hiệu chỉnh (R2adjusted),
hệ số R2 dự đoán (R2predicted), hệ số lack of fit.
e. Tiến hành tối ưu điều kiện chiết xuất

18